Diskussion

Zentraler Befund

Zentraler Befund der vorliegenden Arbeit ist eine Zellzyklusaktivierung postmitotischer neuronaler Zellen nach milder fokaler Ischämie. Als mögliches initiierendes Ereignis wurde die spezifische Herunterregulierung der CDK-Inhibitoren p16^INK4a bzw. p27^Kip1 identifiziert. Hierbei fanden wir Anhalt für eine Progression in die G1- bzw. S-Phase des Zellzyklus in den Neuronen. Zumindest ein kleiner Anteil (ca. 1%) der untergehenden Neurone war in die S-Phase eingetreten. Da keine in der G₂-bzw. M-Phase befindlichen Neurone detektiert wurden, kann man aufgrund dieser Daten annehmen, daß die neuronale Aktivierung von Zellzyklus-relevanten Molekülen nach einem ischämischen Insult nicht zur Zellproliferation sondern zum Zelltod führt. Somit stellt die Zellzyklusaktivierung einen möglichen Mechanismus des verzögerten neuronalen Zelltodes nach Ischämie dar.

Unterstützend zu den in vivo-Daten fanden wir Hinweise für Aktivierung des Zellzyklus ebenfalls in vitro im Modell der Sauerstoff-Glukose-Deprivation der primären neuronalen Zellkultur. Hierbei konnte nicht nur die Expression von zellzyklusaktivierenden Enzymen sondern auch direkt ihre katalytische Aktivität gemessen werden. Die nach OGD detektierte Aktivitätszunahme konnte mit dem synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine fast vollständig blockiert werden. Die Applikation von Olomoucine in gleicher Konzentration konnte die hypoxischen Neurone nach OGD signifikant schützen. Diese Daten weisen darauf hin, daß die Aktivierung von CDKs nach Hypoxie bzw. Ischämie zum neuronalen Schaden beiträgt.

Unserer Meinung nach haben die Ergebnisse Bedeutung für das Verständnis der Zellzyklusbiologie postmitotischer Zellen, für die Pathophysiologie des verzögerten neuronalen Zelltodes sowie therapeutische Optionen nach Schlaganfall.

Einordnung des Befundes in die Biologie von postmitotischen Neuronen

Neurone des adulten Gehirns sind terminal differenzierte postmitotische Zellen. Die terminale Differenzierung setzt den Ausstieg aus dem Zellzyklus voraus (Ross, 1996), ein Vorgang, der klassischerweise als irreversibel betrachtet wird. Der genaue Mechanismus, der die Neurone im postmitotischen Zustand festhält, ist allerdings nicht geklärt (Raina et al., 1999). Unsere Daten legen die Vermutung nahe, daß die Expression von CKIs p16^INK4a in vivo bzw. p27^Kip1 in vitro zumindest einen Bestandteil dieses Mechanismus darstellt. Zwei Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin:

Alle Neurone im intakten Striatum in vivo und in der primären neuronalen Zellkultur in vitro exprimieren diese CKIs.
Der Verlust des jeweiligen CKI geht der Zellzyklusaktivierung unmittelbar voraus. In der Tat wurde die spezifische p16^INK4a-Herunterregulierung in den Neuronen zeitlich vor dem Eintritt in die S-Phase detektiert. Analog wurde der p27^Kip1-Verlust vor der CDK-Aktivierung in der Zellkultur festgestellt.

Der Verlust des entsprechenden CKI ist also für die Zellzyklusaktivierung (mit)verantwortlich. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Beobachtung von Miyazawa und Mitarbeitern, daß p27^Kip1 in zerebellären Körnervorläuferzellen kurz vor dem „Ausstieg“ aus dem Zellzyklus akkumuliert (Miyazawa et al., 2000). Die Expression von p27^Kip1 bleibt hoch im adulten Zerebellum. Die gleiche Arbeitsgruppe dokumentierte signifikant größere Zerebella von der Kip1^+/- - und der Kip1^-/- -Maus im Vergleich zum Wildtyp (Miayzawa et al., 2000).

Roussel und Mitarbeitern gelang es, eine Knock-out-Maus zu generieren, der sowohl p27^Kip1als auch p19^INK4d fehlen (Zindy et al., 1999). Diese Maus entwickelt am 10. postnatalen Tag (P10) schwerwiegende neurologische Symptome (Paresen, epileptische Anfälle, etc) und stirbt am 19. postnatalen Tag (P19). Somit muß sich die Untersuchung dieser Maus auf die ersten 19 Tage nach der Geburt beschränken. Die Kip1^-/-, INK4d^-/- -Maus weist auffällig hohe neuronale Zellproliferation am P18 in verschiedenen Hirnarealen auf. Zu diesem Entwicklungszeitpunkt findet sich in diesen Hirnregionen im Wildtyp keine Zellproliferation mehr statt. Diese Ergebnisse untermauern die Bedeutung von CKIs p27^Kip1 und p19^INK4d als physiologische Proliferationsinhibitoren.

In einer vor kurzem erschienenen Arbeit untersuchten Legrier und Kollegen die Expression von Zellzyklusinhibitoren in verschiedenen Regionen des adulten Maushirns (Legrier et al., 2001). Sie detektierten p15^INK4b im Kortex und Striatum, während im Zerebellum die Expression von p27^Kip1 dominant war. Diese Daten divergieren insofern von unseren Ergebnissen, als wir p16^INK4a als den prominenten CKI im Mausstriatum feststellten. Der Grund für diese Diskrepanz ist nicht ganz klar. Es erscheint unwahrscheinlich, daß die unterschiedlichen Ergebnisse auf die unterschiedlichen Mausstämme (OF1 bei Legrier et al. und SV129 in unserem Labor) zurückgeführt werden können.

Eine andere interessante Besonderheit in der Expression von CKIs besteht darin, daß in unseren Modellen in vivo und in vitro CKIs in unterschiedlichem Ausmaß exprimiert wurden. Der Grund dafür kann am unterschiedlichen Alter von untersuchten Neuronen liegen. Die neuronale Zellkultur besteht nämlich aus embryonalen (am embryonalen Tag E17 entnommenen) Zellen, die 10-14 Tage in der Petrischale reifen. Gerade für den Zellzyklusausstieg von noch undifferenzierten neuralen Zellen scheint p27^Kip1 von großer Bedeutung zu sein (Zindy et al., 1999; Miayzawa et al., 2000). p16^INK4a wird aber in adulten Zellen hochreguliert (Zindy et al., 1997a). Seine Expression ist verbunden mit der Seneszenz und könnte den Ausdruck eines „reiferen“ Zustandes der Zelle darstellen (Huschtscha und Reddel, 1999).

Einordnung des Befundes in die Pathologie des neuronalen Zelltodes CKI-Verlust als initiierendes Ereignis

Unsere Ergebnisse legen nah, daß ein frühzeitiger Verlust von CDK-Inhibitoren (CKI) Zyklusprogression und daraufhin neuronalen Zelltod triggert. Die Herunterregulierung des jeweiligen CKI war spezifisch und nicht einfach ein Ausdruck des allgemeinen Proteinabbaus im Rahmen der Ischämie/ Hypoxie, denn p16^INK4a- bzw. p27^Kip1-negative Neurone waren morphologisch intakt und exprimierten das Zytoskelettprotein MAP2 („microtubule-associated protein 2“). MAP2 befindet sich in neuronalen Somata und Dendriten (Matus et al., 1981; Caceres et al., 1984; Bernhardt und Matus, 1984). Nach Ischämie wird MAP2 in untergehenden Neuronen frühzeitig herunterreguliert und gilt somit als sensitiver Marker der Ischämie-induzierten Neurodegeneration (Kitawaga et al., 1989; Matesic und Lin, 1994). Somit findete in unseren Modellen die spezifische Herunterregulierung von CKIs in (noch) intakten Neuronen statt.

In vivo fand die Herunterregulierung von p16^INK4a zu den Zeitpunkten 9 h und 18 h statt, während die ersten untergenden TUNEL-positiven Zellen zum Reperfusionszeitpunkt 24 h im Striatum erschienen. Analog regulierten hypoxische Neurone p27^Kip1 zum Zeitpunkt 2 h bzw. p16^INK4a zum Zeitpunkt 4 h nach OGD herunter; die maximale Schädigung wurde in diesem Modell zum Zeitpunkt 24 h erreicht. Somit ging die Herunterregulierung von CKIs dem neuronalen Zelltod voraus. Der Verlust des jeweiligen CKI könnte als ein prädiktiver Faktor des verzögerten neuronalen Zelltodes angesehen werden. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigten Park und Kollegen, daß eine Überexpression von p16^INK4a und p27^Kip1 mit Hilfe eines rekombinanten Sindbis-Virus kortikale und sympathische neuronale Zellkulturen gegenüber NGF-Deprivation sowie DNA-Schädigung durch UV-Licht und Cytosin Arabinosid (AraC) signifikant schützt (Park et al., 1997a, 1998). Ein weiterer Hinweis der protektiven Wirkung von p16^INK4a lässt sich aus den Studien von Gill und Windebank ableiten (1998), die die Cisplatin-Toxizität auf sensible Ganglienneuronen untersucht haben. Der neuronale Wachstumsfaktor NGF konnte über die Hochregulation von p16^INK4a die Cisplatin-induzierte Apoptose dieser Zellen verhindern.

Mehrere Studien an Hirntumoren belegen, daß der Verlust von endogenen CDK-Inhibitoren eine hinreichende Bedingung für unkontrollierte Zellproliferation darstellt (Nishikawa et al., 1995; Ueki et al., 1996). Besonders häufig wird ein mutationsbedingter Verlust der p16^INK4a- Expression in hochgradig malignen Gliomen festgestellt (Nishikawa et al., 1995). Diese Tumore sind nicht-neuronaler Herkunft. Diese Daten können also nicht ohne weiteres auf adulte Neurone direkt übertragen werden, weisen jedoch auf eine besondere Rolle von p16^INK4a als Zellzyklusinhibitor im adulten zentralen Nervensystem hin.

Nukleäre Expression von Cyclin D1 als weiterer CDK-aktivierender Schritt

Die Herunterregulierung von p16^INK4a bzw. p27^Kip1 führt zur Dysinhibition von CDKs. Allerdings bedarf es eines weiteren –wohl davon unabhängigen- Schrittes, um die G1→S- Progression zu gewährleisten, und zwar die Cyclin-abhängige Aktivierung von CDKs (Sherr, 1993). Tatsächlichlich wurde von uns nukleäre Hochregulation von Cyclin D1 sowohl in vivo nach Ischämie als auch in vitro nach Hypoxie dokumentiert (Farbabb. 8, s.Seite 90, Farbabb. 13 und 14, s.Seite 96). Die Translokation in den Nukleus spielt insbesondere in unserem in vitro–Modell eine entscheidende Rolle. Cyclin D1 wird nämlich im Zytoplasma unter Ruhebedingungen in intakten Neuronen detektiert, wo es aber wahrscheinlich in Bezug auf den Zellzyklus keine funktionelle Bedeutung hat (Padmabhan et al., 1999; Yang und Kornbluth, 1999). Diese nukleäre Expression von Cyclin D1 nach Ischämie/ Hypoxie aktiviert - nach dem Verlust von p16^INK4a/ p27^Kip1 - die Zellzyklusmaschinerie. Unsere Daten erweitern dabei frühere Berichte über Hochregulation von Cyclin D1 nach Ischämie/ Hypoxie (Guègan et al., 1997; Li et al., 1997a, 1997b, 1998; Timsit et al., 1999; Sakurai et al., 1999; Osuga et al., 2000).

CDK-Aktivierung nach Hypoxie

Um eine mögliche G1→S-Transition weiter zu untersuchen, wurde die Aktivität der CDK4 und CDK2 nach OGD in Zellkultur gemessen. Der wichtigste Vorteil der Serum-freien neuronalen Zellkutur besteht darin, daß der Anteil glialer Zellen gering ist (Lautenschlager et al., 2000). So kann bei Messung der enzymatischen Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen in den hypoxischen Neuronen der störende Einfluß von nicht-neuronalen Zellen minimiert werden. Diese Mitbeteiligung von Gliazellen am Gesamtsignal macht eine selektive Untersuchung der neuronalen CDK-Aktivität in vivo praktisch nicht durchführbar. Es wurde eine deutliche Zunahme der katalytischen Aktivität der Kinasen CDK2 zu den Zeitpunkten 12 h nach OGDdetektiert. Unseres Wissens stellen diese Daten den ersten Hinweis einer CDK-Aktivierung in der primären neuronalen Zellkultur dar. Diese Aktivierung wurde fast vollständig durch Applikation vom synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine blockiert (Abb. 10, s. Seite 49).

DNA-Replikation als Hinweis für Eintritt in die S-Phase
Die Expression von Zellzyklus-relevanten Proteinen wie Cyclin D1 sowie Aktivierung von Cyclin-abhängigen Kinasen müßte nicht zwangsläufig eine Zellzyklusprogression bedeuten und könnte lediglich einen Ausdruck ihrer zusätzlichen Funktion in der apoptotischen Kaskade darstellen (Stefanis et al., 1999). Um die Zellzyklusprogression weiter zu analysieren, wurde das Thymidinanalogon 5-Bromo-2’-deoxy-Uridin (BrdU) verwendet, welches an Stelle von Thymidin in die replizierende DNA eingebaut und immunhistochemisch nachgewiesen werden kann (Miller und Nowakowski, 1988; Nowakowski et al., 1993). Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten BrdU-Dosen (bis max. 50 µg/gm Körpergewicht/Tag) wurden in mehreren unabhängigen Studien als nicht toxisch eingeschätzt (Gage et al., 1995; Gould et al., 1997; Liu et al., 1998; Kempermann et al., 1998). Der immunhistochemische Nachweis von BrdU gilt als Marker für DNA-Replikation sowohl im embryonalen als auch adulten Nervensystem (Thomaidou et al., 1997; Kempermann et al., 1997; ElShamy et al., 1998, Kornack und Rakic, 1999). Eine wichtige Fehlerquelle bei der Interpretation der Ergebnisse des BrdU-Einbaus besteht jedoch darin, daß BrdU potentiell sowohl während der Replikation als auch Reparatur inkorporiert werden kann. Mehrere Hinweise aus in vivo- und in vitro-Experimenten belegen, daß die bei unseren Experimenten eingesetzte Detektionsmethode (BrdU-Applikation bis 50 µg/mg Körpergewicht/Tag und Immunhistochemie) für den Nachweis der DNA-Reparatur nicht ausreichend sensitiv ist und ausschließlich DNA-Replikation nachweist (Gobbel et al., 1998; Parent et al., 1999). Um die Frage eines möglichen Beitrages der DNA-Reparatur zur BrdU-Färbung gezielt zu beantworten, untersuchten Gage und Mitarbeiter nicht-mitotische mit 20 Gy bestrahlte Fibroblasten. In diesem Schadensparadigma entstehen nachweisbar DNA-Brüche, die innerhalb von 60 min repariert werden. Die Fibroblasten wurden dann der BrdU-Menge exponiert, die der Konzentration in vivo entsprach. Dabei konnte keine BrdU-Inkorporation detektiert werden (Palmer et al., 2000). Somit ist es wahrscheinlich, daß BrdU-Nachweis in unserem Modell ausschließlich DNA-Replikation widerspiegelt.

Eine weiterer variabler Faktor beim Nachweis von DNA-Replikation ist der Verabreicherungssmodus von BrdU: tägliche intraperitoneale BrdU-Injektion versus kontinuierliche BrdU-Applikation mittels einer subkutanen Pumpe. Momentan herrscht kein Konsensus darüber, welche Applikationsart sensitiver ist (PD Dr. Kempermann, Max-Delbrück-Centrum, Berlin, persönliche Mitteilung; Prof. Dr. Nowakowski, New Jersey Medical School, persönliche Mitteilung). In präliminären Experimenten wurde in der vorliegenden Arbeit festgestellt, daß die kontinuierliche Methode mehr BrdU-positive Zellen im ischämischen Striatum zum Vorschein bringt. Bei dieser Applikationsmethode ist die maximale BrdU-Konzentration im Blut -wegen fehlender Peaks- wesentlich niederiger als bei der Injektionsmethode, so daß der „falsch-positive“ Nachweis von DNA-Reparatur noch unwahrscheinlicher wird.

DNA-Replikation ist ein sicherer Marker der S-Phase (S für DNA-Synthese). Der elektronenmikroskopische Nachweis der neuronalen DNA-Replikation bestätigte den Eintritt von Neuronen in die S-Phase nach Ischämie. Insgesamt blieb jedoch der Eintritt von Neuronen in die S-Phase ein seltenes Ereignis. Elektronenmikroskopisch mußten im Durchschnitt 100 bis 200 Neurone untersucht werden, um eine BrdU-positive Nervenzelle nachzuweisen. Wie die Doppelfärbung des Zelltodmarkers TUNEL mit BrdU zeigte, sind die meisten Neurone bereits vor der DNA-Replikation untergegangen, so daß ca. 1% aller TUNEL-positiven Zellen BrdU-positiv waren.

NeuN-positive mitotische Figuren gelten als Marker der Neurogenese (Mullen et al., 1992; Zindy et al., 1999; Gu et al., 2000). Die Tatsache, daß in unserem Modell keine NeuN-positiven mitotischen Figuren identifiziert werden konnten, weist darauf hin, daß BrdU-positive Neurone nicht neugebildete Zellen sind. Nach dem heutigen Wissensstand erscheint es ebenfalls unwahrscheinlich, daß die hier festgestellten BrdU-positiven Neurone aus den Vorläuferzellen stammen. Da die längste Dauer der BrdU-Applikation 72 h betrug, müssten dann BrdU-positive Zellen - falls sie aus den Vorläuferzellen stammen - sich in diesen 72 h in Neurone differenziert haben. Nach dem heutigen Kenntnisstand erscheint dies unwahrscheinlich (Kuhn et al., 1996; Palmer et al., 2000; PD Dr. Kempermann, Max-Delbrück-Centrum, Berlin, persönliche Mitteilung; Prof. Dr. Caviness, Harvard Medical School, persönliche Mitteilung). Ein Hinweis auf eine Migration von BrdU-positiven Zellen aus der subventrikulären Zone (SVZ), einem der physiologischen Entstehungsorte der Vorläuferzellen im adulten Gehirn, konnte ebenfalls nicht detektiert werden. Die zu diesem Zwecke separat durchgeführten und hier nicht dargestellten Experimente konnten keine Einwanderung von den SVZ-Zellen ins Infarktgebiet zeigen.

Der Nachweis von BrdU-positiven jedoch nicht neugebildeten Neuronen nach Ischämie liefert ein weiteres Argument dafür, daß neuronale DNA-Replikation nicht immer mit Neurogenese gleichzusetzen ist (Neve et al., 2000; Copani et al., 2001; Yang et al., 2001). In einem kürzlich erschienen Review weist Rakic – auch in Bezug auf unsere Arbeit - darauf hin, daß diese von vielen Autoren praktizierte Gleichsetzung möglicherweise zur Überschätzung der Beteiligung der Neurogenese sowohl im intakten als auch degenerierenden zentralen Nervensystem geführt hat (Rakic, 2002). Somit liefert die vorliegende Arbeit weitere Hinweise zur Interpretation der BrdU-Positivität in den neuronalen Zellen.
Protektive Wirkung des Zellzyklusinhibitors Olomoucine nach Hypoxie
Zur Klärung, ob Zellzyklusaktivierung nach Ischämie/Hypoxie nun protektiv oder schädlich ist, wurde die Wirkung vom CDK-Inhibitor Olomoucine in vitro nach OGD untersucht. Im Vergleich zu unserem in vivo-Modell bietet die primäre neuronale Zellkultur mehrere Vorteile für pharmakologische Studien: Zum einen wird das Problem der Blut-Hirn-Schranke für viele synthetische Zellzyklusinhibitoren wie z. B. Olomoucine durch direkte Applikation des Stoffs in das Inkubationsmedium umgangen. Die jeweils lokal wirkende Konzentration kann dabei genau dosiert werden. Zum anderen fallen Effekte, die primär nicht-neuronale Zellen betreffen, nicht mehr ins Gewicht. So zeigten Wiessner und Mitarbeiter z. B. eine Induktion von Cyclin D1-mRNA in Mikroglia nach globaler transienter Ischämie in der Ratte (Wiessner et al., 1996). Diese Induktion von Cyclin D1 in Mikroglia nach globaler transienter Ischämie in der Ratte wurde auf der Proteinebene bestätigt (Small et al., 2001). Unsere präliminären Daten zeigten ebenfalls Expression von Zellzyklus-relevanten Proteinen in Gliazellen. Proliferation sowie Einwanderung von Glia- bzw. Entzündungszellen findet nach Ischämie statt (Feuerstein et al., 1998; Lehrmann et al., 1997; Schroeter et al.,1999). Die Applikation von Olomoucine in vivo würde somit auch die inflammatorische Proliferation von diesen Zellen hemmen. Dies ist bei der Interpretation der schützenden Wirkung von Olomoucine insofern besonders relevant, als Entzündungshemmung nach Ischämie per se als protektiv gilt (Chen et al., 1994; Chopp et al., 1994; DeGraba, 1998).

In der vorliegenden Arbeit wurde eine signifikante Protektion von Neuronen durch Olomoucine nach OGD gezeigt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit bereits veröffentlichten Daten (s. Tabelle 4).

CDK-Inhibitoren

Zelltyp

Schadensmodell

Literatur

Olomoucine

Flavopiridol, Roscovitine

sympathetische Neurone

NGF-Deprivation

Park et al., 1996

Olomoucine, Flavopiridol

zerebelläre Körnerzellen

K⁺-Deprivation

Padmanabhan et al., 1999

Olomoucine

embryonale Vorderhirnneurone

Hypoxie

Bossenmeyer-Puorié et al., 1999

Tabelle 4:

Vor kurzem wurde der erste Nachweis einer protektiven Wirkung von synthetischen CDK-Inhibitoren nach Ischämie in vivo erbracht. Park und Mitarbeiter konnten nach einer fokalen transienten Ischämie in der Ratte eine signifikante Protektion mit Flavopiridol erzielen (Osuga et al., 2000). Die intraventrikuläre Applikation von Flavopiridol in der Konzentation von 100 µM bzw 500 µM reduzierte dramatisch die Anzahl von TUNEL-positiven Zellen um 75% bzw. 90 %. Die Messungen des absoluten Blutflußes konnten keine Unterschiede zwischen den mit dem CDK-Inhibitor bzw. Placebo-behandelten Tieren aufdecken, so daß die Autoren von einem direkt neuroprotektiven Effekt des synthetischen CDK-Inhibitor ausgingen. Insgesamt können also synthetische CDK-Inhibitoren zur Zeit –unter Berücksichtigung ihrer ebenfalls anti-inflammatorischen Wirkung- im Tierversuch als neuroprotektiv eingestuft werden.
Zellzyklusaktivierung als Bestandteil neuronaler Todeskaskaden
Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten liefern weitere Hinweise auf die Beteiligung des Zellzyklus beim neuronalen Zelltod. Theoretisch könnte es sich dabei aber lediglich um ein Epiphänomen handeln (Hayashi et al., 1999). Aus 2 Gründen belegt jedoch die vorliegende Arbeit eindeutig die funktionelle Bedeutung der Zellzyklusaktivierung beim neuronalen Tod:

Die Expression der Zellzyklus-relevanten Proteine sowie DNA-Replikation findet zeitlich vor dem zellulären Untergang statt.

Die Hemmung des Zellzyklus erzielt eine signifikante Protektion.

Allerdings muß diese in einer postmitotischen Zelle unerwartete Zellzyklusaktivierung nicht unbedingt eine obligatorische bzw. exklusive Todeskaskade darstellen (Stefanis et al., 1999; Copani et al., 2001). Vielmehr kann die hier berichtete Zellzyklusaktivierung als einer mehrerer Mechanismen angesehen werden, die zum Erreichen der „Todesschwelle“ beitragen („Threshold-Prinzip“, Copani et al., 2001).

Die eigentlichen zellulären bzw. molekularen Mechanismen, die der CDK-Aktivierung bzw. dem Eintritt in die S-Phase folgen und die Ausführung des neuronalen Zelltodes vermitteln, bleiben unklar. Als besonders attraktive Kanditaten für die exekutiven Funktionen erscheinen dabei pro-apoptotische Moleküle. In der Tat sind Zellzyklusregulation und Apoptose eng miteinander verknüpft (King und Cidlowski, 1995; Evan et al., 1995; Kasten und Giordano, 1998). Bereits 1993 stellte Heintz die Hypothese auf, daß eine aberrante Aktivierung des Zellzyklus in Neuronen zur Anschaltung des programmierten Zelltodes führen könnte (Heintz, 1993). Meikranzt und Schlegel sehen die Apoptose an als „aberranten Eintritt in die S-Phase, welcher anstelle der DNA-Replikation zur Chromatinkondensation und –spaltung führt“ (Meikrantz und Schlegel, 1995).

Stefanis und Kollegen detektierten die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom C sowie Aktivierung von Caspasen (Caspase-2 und –3) als Folge der CDK-Aktivierung im Modell der Camptothecin-induzierten Neurodegeneration. Die Applikation des CDK-Inhibitors Flavopiridol konnte sowohl Cytochrom-Freisetzung als auch Caspase-Aktivierung verhindern (Stefanis et al., 1999). Dies kann als Hinweis darauf interpretiert werden, daß Caspasen „downstream“ der CDK-Aktivierung agieren. Tatsächlich wurde die Aktivierung von Caspase-3 sowohl im Modell der transienten MCA-Okklusion in vivo (Namura et al., 1998; Endres et al., 1998) als auch nach OGD in vitro (Nath et al., 1998; Harms et al., 2000) nachgewiesen. Somit könnte die Caspase-Aktivierung eine Verbindung zwischen der CDK-Aktivierung und dem verzögerten neuronalen Zelltod darstellen (Abb. 11).

Abb. 11: Hypothetisches Modell der zellulären Todeskaskade nach der ischämisch bedingten CDK-Aktivierung (In Anlehnung an Stefanis et al., 1999)
Beteiligung aberranter Zellzyklusaktivierung bei weiteren ZNS-Erkrankungen
Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, daß Neurone Zellzyklus-relevante Moleküle nach Ischämie exprimieren (Guégan et al., 1997; Li et al., 1997; Li et al., 1998). Allerdings war unklar, welche mögliche funktionelle Bedeutung dieses Phänomen hat. Während Guègan und Kollegen von einem Zelltod-induzierenden Effekt dieser aberranten Expression von Zellzyklusmolekülen ausgingen, vertraten Li und Mitarbeiter die Meinung, daß die Expression dieser Molekülen vielmehr einen regenerationsfördenden Prozeß anzeigt. Wie oben erläutert, weisen unsere Befunde darauf hin, daß die nach Ischämie stattfindende Zellzykluswiederaktivierung zum neuronalen Zelltod führt. Interessanterweise sind vergleichbare Zusammenhänge bei der häufigsten neurodegenerativen Erkrankung Morbus Alzheimer dokumentiert worden (Vincent et al., 1997; Nagy et al., 1997; Nagy et al., 1998; Busser et al., 1998; McShea et al., 1999; Yang et al., 2001).

Die Degeneration im Rahmen der Alzheimer-Krankheit ist durch den selektiven Verlust von neuronalen Zellen in verschiedenenen Hirnarealen gekennzeichnet (Katzman, 1986). Dabei liegt eine für die Krankheit spezifische regionale Variabilität der Hirnatrophie vor (Mann, 1991). Ein wahrscheinlicher Pathomechanismus dieses Zellunterganges scheint ebenso die Zellzyklusaktivierung in postmitotischen Neuronen zu sein. Im Rahmen autoptischer Studien berichteten Vincent und Mitarbeiter 1997 über aberannte Expression von CDK1 in degenerierenden Neuronen in Gehirnen von Alzheimer-Patienten (Vincent et al., 1997). Herrup und Mitarbeiter detektierten selektive Expression von Cyclin D, CDK4 und Cyclin B1 im Hippocampus, Subiculum, Locus coeruleus und Raphe dorsalis, also in den Regionen, in denen bei der Alzheimer-Krankheit Neurodegeneration stattfindet (Busser et al., 1998). Im Gegensatz dazu wurde keine Immunreaktivität für diese Proteine in den entsprechenden Arealen von Kontrollhirnen gleichen Alters festgestellt. Außerhalb der betroffenen Hirnarealen konnte in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten ebenfalls keine Expression von diesen Molekülen nachgewiesen werden. Der gleichen Arbeitsgruppe gelang es vor kurzem, den Zellzyklus-Wiedereinstieg von postmitotischen Neuronen im Gehirn der Alzheimer-kranken Patienten direkt zu visualisieren (Yang et al., 2001). Mit Hilfe von „fluorescent in situ hybridization“ (FISH) konnten hippocampale polyploide Neurone ausschließlich in den Alzheimer-befallenen Gehirnen nachgewiesen werden. In diesen Neuronen lag das ganze Genom dupliziert vor. Dieser Befund belegt eindeutig eine stattgefundene DNA-Replikation und somit einen Eintritt in die S-Phase. Gleichzeitig konnten jedoch keine mitotischen Figuren dokumentiert werden. Die Autoren schlossen daraus, daß die betroffenen Neurone in die S-Phase eingetreten aber –noch vor dem Eintritt in die M-Phase- untergegangen sind. Diese Befunde stehen somit gänzlich im Einklang mit unseren Daten.

Interessanterweise wurde vor kurzem eine aberannte Expression von Zellzyklusproteinen -einschließlich E2F-1 und der hyperphosphorylierten Form des Retinoblastoma-Proteins- im ZNS von Patienten mit HIV-Enzephalitis detektiert (Jordan-Sciutto et al., 2002). Die Tatsache, daß Zellzyklusaktivierung bei solch unterschiedlichen zerebralen Pathologien wie akuter Ischämie (Mediainfarkt), langsamer Neurodegeneration (Alzheimer-Krankheit) und chronischer Entzündung (HIV-Enzephalitis) nachgewiesen wird, weist darauf hin, daß es sich hierbei um einen allgemeinen Pathomechanismus der neuronalen Schädigung handelt.

Ausgehend von diesen Daten könnte eine Hemmung dieser Zellzyklusaktivierung eine therapeutische Option des akuten Schlaganfalls darstellen.

Schlaganfall-Therapie
In der vorliegenden Arbeit wurde eine signifikante Protektion von kortikalen neuronalen Zellen nach einem hypoxischen Insult (OGD) durch Applikation vom synthetischen Zellzyklusinhibitor Olomoucine festgestellt. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigten Park und Mitarbeiter eine beeindruckende Neuroprotektion durch den Zellzyklusinhibitor Flavopiridol nach Ischämie in vivo (Osuga et al., 2000). Somit können synthetische Zellzyklusinhibitoren ein Therapeutikum in der akuten Behandlung vom Schlaganfall darstellen. Inbesondere könnte das Ausmaß der ischämischen Schädigung im Bereich der sog. Penumbra dadurch reduziert werden. Die Hypothese, daß Zellzyklusinhibition vor allem im Bereich der Penumbra eine protektive Wirkung entfaltet, erscheint besonders plausibel. In dieser Arbeit wurde die degenerative Wirkung der Zellzyklusaktivierung in postmitotischen Neuronen in einem Modell der „milden“ Ischämie in der Maus gezeigt. Diese milde Ischämie ist charakterisiert durch

selektiven neuronalen Zelluntergang von besonders vulnerablen Projektionsneuronen bei relativer Aussparung von Interneuronen und Gliazellen sowie

zeitliche Verzögerung des neuronalen Zelltodes mit einem Maximum bei 72 h nach der arteriellen Okklusion.

Diesen Charakteristika nach entspricht dieses Modell teilweise dem Konzept der Penumbra bzw. elektiver Parenchymnekrose („incomplete infarction“; Lassen, 1982; Garcia et al., 1996; Heiss, 2000). Somit könnten die in dieser Arbeit vorgestellten Vorgänge auch beim humanen Schlaganfall eine Rolle spielen. Allerdings bestehen momentan folgende Einschränkungen im Hinblick auf einen baldigen klinischen Einsatz:

Neuroprotektive Wirkung von synthetischen CDK-Inhibitoren nach Ischämie wurden bis dato nur in der Maus untersucht. Weitere unabhängige Studien in anderen Spezies sind erforderlich, die diese Wirkung bestätigen würden.

Die Bedeutung von Zellzyklusvorgängen bei akuter Ischämie im Menschen wurde nocht nicht systematisch untersucht. Die Schwierigkeit solcher Studien besteht darin, daß –tierexperimentellen Daten nach- vor allem im Penumbrabereich eine Zellzyklusaktivierung zu erwarten wäre. Allerdings sind es ausgedehnte (vollständige) Mediainfarkte bzw. große Infarkte im hinteren Stromgebiet, die rasch letal verlaufen und somit autoptisch untersucht werden können (Victor und Ropper, 2001). Ob eine neuroprotektive Strategie bei solchen Infarkten ebenfalls Erfolge verspricht, ist noch nicht geklärt.

Die bis dato in der Forschung breit eingesetzten Zellzyklusinhibitoren Olomoucine, Roscovitine und Flavopiridol sind nicht Blut-Hirn-Schranken-gängig. Die Notwendigkeit einer intrathekalen bzw. intraventrikulären Verabreichung des Medikamenten würde den Einsatz beim Menschen aus praktischen Gründen nicht realisierbar machen. Zur Zeit wird an der Entwicklung Blut-Hirn-Schranken-gängiger Substanzen gearbeitet (Prof. Dr. Hajduch, Olomouc Medical School, persönliche Mitteilung).

Systemisch verabreichte Zellzyklusinhibitoren würden alle Zellen im Organismus erfassen. Nebenwirkungen, die vor allem prolifirierende Zellen betreffen würden, können gravierend sein. Erwartete Nebenwirkungen von Olomoucine beinhalten sowohl Frühreaktionen wie Erbrechen, Übelkeit und Schwitzen als auch Spätreaktionen, die insbesondere auf Beeinflussung der Erythro-, Leuko- und Thrombopoese, Beeinträchtigungen der Schleimhäute, hepatotoxische Wirkungen und teratogene bzw. mutagene Wirkungen beruhen (Diehl und Lathan, 1996). Das Ausmaß dieser bzw. weiterer bis dato nicht bekannter Nebenwirkungen könnte -bei systemischer Applikation- einen klinischen Einsatz verbieten.

Ein weiterer Aspekt ist die prinzipielle Schwierigkeit der Übertragbarkeit der im Tierversuch erhobenen Daten auf den Menschen. Während eine große Anzahl unterschiedlicher Substanzen im Tierversuch eine Reduktion des durch die Ischämie bedingten morphologischen Schadens bewirkt, konnte in über 80 größtenteils multizentrischen klinischen Studien mit über 30 Substanzen bisher kein neuroprotektiver Effekt nachgewiesen werden (De Keyser et al., 1999; Block und Schwarz, 1999; DeGraba und Pettigrew, 2000). Zum Teil ist diese ausgeprägte Divergenz der experimentellen und klinischen Forschung darauf zurückzuführen, daß jeweils unterschiedliche Spezies -Nagetiere versus Primaten- untersucht wurden. Weitere Faktoren, die diese Diskrepanz erklären könnten, sind unterschiedliche Zeitpunkte der Gabe des Therapeutikums sowie unterschiedliche Zeitpunkte und Art der Schadensevaluation im Tierversuch und in der klinischen Praxis. Trotz dieser Einwände sollen aber weiterhin die experimentellen Studien die Basis für klinische Studien bilden, da sie die am Zellschaden beteiligten pathophysiologischen Abläufe aufdecken (De Keyser et al., 1999).