Experimentelle Untersuchungen zur neuronalen Fehlregulation des Zellzyklus beim SchlaganfallJuri Katchanov131.11.241.351.46480#36078910468#3511.511169#15312528#3961.6131.714215163173.13.1.13.1.23.1.3183.1.43.1.53.23.2.1193.2.23.2.3203.2.43.2.5213.2.63.2.6.13.2.6.23.2.6.3223.2.7519#511233.2.7.13.2.7.23.2.8243.2.8.13.2.8.225263.2.8.3273.2.8.43.2.8.5283.2.8.63.2.8.7293.2.93.2.10303.2.11313.2.123.2.13323.2.14333.2.154344.1353637551#2194.2384.34.3.13940580#6274.3.2414.3.342339#2284.3.4434.3.54.4444.4.14.4.24.4.3454.4.44.4.546475#2754.4.647373#2365485.15.249505.35.3.1515.3.2525.3.35.3.45354555.3.5565.3.65758492#3875.3.759605.461626637647.17.27.365 Abkürzungen12 Literaturverzeichnis66676869707172737475767778 Atlas der Farbabbildungen79818385878991939597 Danksagung99 LEBENSLAUF100101102103 Eidesstattliche Erklärung104deInhaltsverzeichnisHilfe Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin DISSERTATIONExperimentelle Untersuchungen zur neuronalen Fehlregulation des Zellzyklus beim SchlaganfallZur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlinvon

Juri Katchanov

aus Moskau, Russische Föderation Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen Prof. Dr. med. R. Haberl, München Prof. Dr. med. O. Witte, Jena PD Dr. med. M. Endres, Berlin Datum der Promotion: 25.04.03Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1 Schlaganfall

    • 1.2  Schlaganfallmodelle

    • 1.3 Verzögerter neuronaler Zelltod nach Ischämie

    • 1.4 Zellzyklus

    • 1.5  Synthetischer Zellzyklusinhibitor Olomoucine

    • 1.6 Dysregulation des Zellzyklus als Auslöser des neuronalen Zelltodes

    • 1.7  Zellzyklusregulation und Ischämie

  • 2  Herleitung der Aufgabenstellung und experimentelle Strategie

  • 3  Methodik

    • 3.1 Material

      • 3.1.1 Basispuffer

      • 3.1.2 Fixativa

      • 3.1.3 Antikörper

      • 3.1.4 Sera

      • 3.1.5 Zellkultur

    • 3.2 Methoden

      • 3.2.1 Filamentmodell

      • 3.2.2 BrdU-Applikation

      • 3.2.3 Primäre neuronale Zellkultur

      • 3.2.4 Sauerstoff-Glukose-Entzug

      • 3.2.5  Vorbehandlung der Zellkultur mit Olomoucine

      • 3.2.6 Gewebeaufarbeitung

        • 3.2.6.1 Transkardiale Fixation des Gewebes

        • 3.2.6.2 Einfrieren von unfixierten Maushirnen

        • 3.2.6.3 Schneiden und Lagerung des Gewebes

      • 3.2.7 In Situ-Markierung der nukleären DNA-Fragmentation

        • 3.2.7.1 TUNEL mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) als Chromagen

        • 3.2.7.2 TUNELmit Fluorescein als Chromogen

      • 3.2.8  Immunhistochemie

        • 3.2.8.1 Doppelfärbungen gegen TUNEL und Zellmarker

        • 3.2.8.2 Immunhistochemie gegen verschiedene striatale Neurone

        • 3.2.8.3 Immunhistochemie gegen Zellzyklusmarker

        • 3.2.8.4 Doppelfärbungen gegen Zellzyklusmarker und neuronale Marker

        • 3.2.8.5 Immunhistochemie gegen BrdU

        • 3.2.8.6 Doppelfärbungen gegen TUNEL und BrdU

        • 3.2.8.7 Immunzytochemie in Zellkultur

      • 3.2.9 Licht- und Fluoreszenzmikroskopie

      • 3.2.10 Konfokale Mikroskopie

      • 3.2.11 Western Blotting

      • 3.2.12 Histon-Kinase-Assay

      • 3.2.13 Elektronenmikroskopie

      • 3.2.14 Zellzählprotokolle

      • 3.2.15 Statistik

  • 4  Ergebnisse

    • 4.1 Charakterisierung des Modells der milden fokalen zerebralen Ischämie

    • 4.2  Expression von Zellzyklus-relevanten Proteinen im intakten adulten Maushirn

    • 4.3 Untersuchung von Zellzyklusproteinen nach milder Ischämie

      • 4.3.1 Expression des CDK-Inhibitors p16INK4a in Neuronen im ischämischen Striatum

      • 4.3.2  Expression von Cyclins D1 im ischämischen Striatum.

      • 4.3.3 BrdU-Inkorporation in die DNA als Marker der S-Phase

      • 4.3.4 Detektion von BrdU-positiven Neuronen

      • 4.3.5 Detektion von BrdU- und TUNEL-positiven Zellen

    • 4.4  In vitro-Experimente

      • 4.4.1 Expression der Zellzyklusproteine in vitro

      • 4.4.2 Schadensmodelle in vitro

      • 4.4.3  Expression von CDK-Inhibitoren in Neuronen nach OGD

      • 4.4.4 Expression von Cyclin D1 nach OGD

      • 4.4.5  Katalytische CDK-Aktivität nach OGD

      • 4.4.6  Pharmakologische Studien mit Olomoucine

  • 5  Diskussion

    • 5.1 Zentraler Befund

    • 5.2  Einordnung des Befundes in die Biologie von postmitotischen Neuronen

    • 5.3 Einordnung des Befundes in die Pathologie des neuronalen Zelltodes

      • 5.3.1 CKI-Verlust als initiierendes Ereignis

      • 5.3.2  Nukleäre Expression von Cyclin D1 als weiterer CDK-aktivierender Schritt

      • 5.3.3 CDK-Aktivierung nach Hypoxie

      • 5.3.4  DNA-Replikation als Hinweis für Eintritt in die S-Phase

      • 5.3.5 Protektive Wirkung des Zellzyklusinhibitors Olomoucine nach Hypoxie

      • 5.3.6 Zellzyklusaktivierung als Bestandteil neuronaler Todeskaskaden

      • 5.3.7 Beteiligung aberranter Zellzyklusaktivierung bei weiteren ZNS-Erkrankungen

    • 5.4 Schlaganfall-Therapie

  • 6  Zusammenfassung

  • 7  Publikationen

    • 7.1 Originalarbeiten

    • 7.2 Abstracts

    • 7.3  Weitere Publikationen

  • Abkürzungen

  • Literaturverzeichnis

  • Atlas der Farbabbildungen

  • Danksagung

  • LEBENSLAUF

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1:

  • Tabelle 2:

  • Tabelle 3:

  • Tabelle 4:

Bilder

  • Abb. 1: Schematische Darstellung der 4 Phasen des Zellzyklus

  • Abb. 2: Schematische Darstellung des Zellzyklus

  • Abb. 3: Chemische Struktur von Olomoucine

  • Abb. 4: Wirkung von Olomoucine auf den Zellzyklus

  • Abb. 5:

  • Abb. 6: Auszählung der Interneurone im ischämischen (weisse Balken) und kontralateralen (schwarze Balken) Striatum 72 h nach MCAo. Die Zahl der Interneurone auf der nicht-betroffenen (kontralateralen) Seite wurde gleich 100% gesetzt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt (p>0.05, n=3).

  • Abb. 7: Zeitverlauf der Herunterregulierung des CDK-Inhibitors p16INK4a (A) und des verzögerten neuronalen Zelltodes nach 30 min MCAo (B).

  • Abb. 8: Anzahl von BrdU- positiven Zellen im ischämischen Striatum 72 h nach MCAo pro LPF (vertikale Achse) nach täglicher BrdU-Injektion (linke Säule) bzw. Applikation mit Hilfe einer miniosmotischen Pumpe (rechte Säule) . N=4, **p<0.01

  • Abb. 9: CDK2-Aktivität in der primären neuronalen Zellkultur nach 90 minutiger OGD. Anti-CDK2-Immunpräzipitate wurden mit [γ-32 P]ATP und Histon HIIIS als Substrat inkubiert. Das radioaktive Signal wurde dann mit einem Phosphoimager und TINA software quantifiziert. N=3, *p<0.01, **p<0.001 vs Kontrolle.

  • Abb. 10: Protektion einer primären neuronalen Zellkultur nach OGD mit dem synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine. Quantitative Messung des neuronalen Zellschadens mittels LDH-Konzentration im Medium 24 h nach OGD. N=3, *p<0.05, **p<0.01 vs Vehikel (Veh)

  • Abb. 11: Hypothetisches Modell der zellulären Todeskaskade nach der ischämisch bedingten CDK-Aktivierung (In Anlehnung an Stefanis et al., 1999)