Keetman , Ulrich: Untersuchungen zu den Folgen der Photosensibilisierung durch akkumulierende Tetrapyrrole in transgenen Tabakpflanzen

Aus dem Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben
Direktor Prof. Dr. U. Wobus


Dissertation
Untersuchungen zu den Folgen der Photosensibilisierung durch akkumulierende Tetrapyrrole in transgenen Tabakpflanzen

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Ulrich Keetman ,
geb. am 13.01.1972 in Guben

Dekan: Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr. T. Börner
Prof. Dr. T. Buckhout
Prof. Dr. B. Grimm

Eingereicht am: 17.05.2000

Datum der Promotion: 27.09.2000

Zusammenfassung

Transgene Tabakpflanzen, in denen wegen der Expression von Antisense-RNA für zwei Enzyme der Tetrapyrrolbiosynthese die Aktivität der Uroporphyrinogen-Decarboxylase bzw. Coproporphyrinogen-Oxidase vermindert ist, akkumulieren in starkem Ausmaß die Substrate der betroffenen Enzyme. Diese Porphyrinogene werden bei Anwesenheit von Sauerstoff autoxidativ oder durch unspezifische Peroxidasen in ihre photosensibilisierenden Derivate (Porphyrine) umgewandelt, welche die Ursache für zelluläre Schäden darstellen, die sich makroskopisch in Form von Blattläsionen zeigen.

Im Verlauf der durch die angehäuften Porphyrine ausgelösten Reaktionen, die u.a. den Folgen der Behandlung von Pflanzen mit photodynamisch wirksamen Herbiziden und auch den Symptomen von Porphyria-Erkrankungen des Menschen ähneln, werden Membranlipide durch Peroxidation geschädigt und alle lichtexponierten Zellen massivem oxidativen Streß ausgesetzt. Dieser läßt sich anhand der kompartiment-übergreifenden und alle Ebenen der Expression umfassenden Aktivierung des antioxidativen Schutzsystems belegen. So können die Transkriptakkumulation und verstärkte Anhäufung der Proteine sowie der damit verbundene Anstieg der Aktivität von Superoxid-Dismutase und Ascorbat-Peroxidase nachgewiesen werden. Die erhöhte Aktivität der Schutzenzyme führt zu beschleunigtem Umsatz und größerem Bedarf an niedermolekularen Antioxidantien wie Ascorbat und Tocopherol.

Gleichzeitig kommt es lokal beschränkt auf Blattgewebe in der Umgebung von Nekrosen zur Kreuzinduktion von pathogenese-assoziierten Prozessen, wie der Akkumulation von "pathogenesis related" (PR)-Proteinen, Salicylsäure und der antimikrobiell wirksamen phenolischen Verbindung Scopolin. Diese Aktivierung der Pathogenabwehr wird durch die verminderte Ausbreitung einer Infektion der Pflanzen mit dem Tabak Mosaikvirus (TMV) widergespiegelt.

Der Prozeß der Photosensibilisierung ist stark licht- und sauerstoffabhängig und wird außerdem durch erhöhte Temperaturen beschleunigt. Wird eine bestimmte Lichtdosis überschritten, werden die Porphyrine durch die dann rasch irreversibel geschädigten Plastiden freigesetzt, und es kommt wegen des nachfolgenden Absterbens von Gewebe zur Ausbildung der Blattläsionen. Dieser Effekt wurde ausgenutzt, um die Kinetik von Prozessen der antioxidativen und Pathogenabwehr in den Pflanzen zu untersuchen. Mittels Subtraktiver Suppressions-Hybridisierung (SSH) wurde eine subtrahierte cDNA-Bank angelegt, in der Gene vertreten sind, deren Expression bereits sehr früh als Reaktion auf die Photosensibilisierung induziert wird. Unter diesen Genen sind auch vermutete Komponenten von Signaltransduktionskaskaden einschließlich Transkriptionsfaktoren. Etwas überraschend war die Erkenntnis, daß vor allem pathogenese- und zelltod-assoziierte Prozesse frühzeitig aktiviert werden, die klassischen Enzyme der antioxidativen Streßabwehr aber erst später reagieren. Bei letzteren kommt es vor Veränderungen in der Expression zuerst zu einem Anstieg der Aktivität, der sich in verändertem Gehalt und Redoxstatus der niedermolekularen Antioxidantien niederschlägt.

Insgesamt stellt sich die durch Antisense-Expression verursachte Deregulation der Tetrapyrrolbiosynthese und die daraus resultierende Photosensibilisierung als komplexes System dar, in dem antioxidative und Pathogenabwehr kreuzinduziert werden und welches als Modell zur Aufklärung von Mechanismen der Streßabwehr wertvolle Aussagen liefert.

Schlagwörter:
Tetrapyrrolbiosynthese, Photosensibilisierung, antioxidative und Pathogenabwehr, differentielle Genexpression

Abstract

Transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for two enzymes of the tetrapyrrole biosynthetic pathway are characterized by decreased enzyme activity of either uroporphyrinogen decarboxylase or coproporphyrinogen oxidase and accumulate the substrates of these enzymes in large amounts. If oxygen is present the accumulated porphyrinogens are transformed either by autoxidation or unspecific peroxidases into their photosensitizing derivatives (porphyrins). They are the molecular basis for cellular damage which eventually becomes visible as leaf lesions. During photosensitization membrane lipids are damaged due to peroxidation reactions and most of the symptoms observed are similar to the effects caused by the treatment of plants with photodynamic herbicides, or resemble the characteristics of porphyria diseases in human. These plants suffer from oxidative stress which is concluded from the general and intercompartimental activation of the antioxidative stress defense system. Transcripts and proteins of superoxide dismutase and ascorbate peroxidase accumulate and the corresponding enzyme activities are increased. This increase leads to accelerated turnover and enhanced demand of low molecular weight antioxidants like ascorbate and tocopherol.

Simultaneously, cross induction of pathogenesis-related responses is observed in the plants, like the accumulation of PR proteins, salicylic acid and the antimicrobial phenolic compound scopolin. The activation of the pathogen defense system leads to restricted spread of Tobacco Mosaic Virus (TMV) infection in the transgenic plants.

Photosensitization strongly depends on light and oxygen and is enhanced by elevated temperature. Porphyrins are only released from rapidly damaged plastids into other cellular compartments if a certain light dose is exceeded. Then cell death commences and dead tissue becomes visible as leaf lesions. This light dosage effect was exploited to investigate the kinetics of antioxidative and pathogen defense responses upon light shift. By the use of Suppression Subtractive Hybridization (SSH) a subtracted cDNA library was established that contains genes which are early induced in response to photosensitization. The library also contains putative components of signal transduction chains and transcription factors. Unexpectedly, the expression of genes related to pathogenesis and cell death is rather early induced while the cellular antioxidative stress defense system responds later. The activity of antioxidative enzymes is increased before changes in transcript or protein accumulation occur, resulting in changes of content and redox ratio of low molecular weight antioxidants.

In summary, photosensitization caused by the expression of antisense RNA and resulting in the deregulation of tetrapyrrole biosynthesis is a complex model system in which antioxidative and pathogen defense responses are induced. The approach can be used to further elucidate mechanisms of stress response.

Keywords:
tetrapyrrol biosynthesis, photosensitization, antioxidative and pathogen defense, differential gene expression


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [93] [92] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] [150] [151] [152] [153] [154] [155] [156] [157] [158] [159] [160] [161] [162]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zu den Folgen der Photosensibilisierung durch akkumulierende Tetrapyrrole in transgenen Tabakpflanzen
Einleitung
1 Zusammenfassung
2 Abstract
3 Einleitung
3.1Oxidativer Streß in Pflanzen
3.1.1Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und ihre Schadwirkung
3.1.1.1Photosensibilisierung und ROS-Erzeugung
3.1.2Antioxidative Schutzmechanismen in Pflanzen
3.1.2.1Nicht-enzymatische Schutzmechanismen
3.1.2.2Eine Kette von antioxidativen Schutzenzymen - Der Ascorbat-Glutathion-Zyklus
3.2Signaltransduktion bei oxidativem Streß und Pathogeninfektionen
3.2.1Die Rolle von H2O2 bei der Hypersensitivitätsreaktion (HR) und systemisch erworbener Resistenz (SAR)
3.2.2Weitere Signalüberträger bei Streß- und Abwehrreaktionen
3.2.3Oxidativer Streß und Kontrolle der Genexpression
3.3Generierung von ROS in experimentellen Systemen - Ausgewählte Untersuchungsergebnisse
3.3.1Blattläsionen infolge von programmiertem Zelltod in unterschiedlichen experimentellen Systemen
3.4Porphyrische Pflanzen und oxidativer Streß
3.4.1Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen
3.4.2Die Regulation der Tetrapyrrolbiosynthese
3.4.3Transgene Pflanzen und Mutanten mit beeinträchtigter Tetrapyrrolbiosynthese
3.5Neuere methodische Ansätze zur Untersuchung von zellulären Streß- und Abwehrreaktionen
4 Ziele dieser Arbeit
5 Material und Methoden
5.1Chemikalien und Enzyme
5.2Häufig verwendete Oligonukleotidprimer
5.3Nährmedien
5.4Pflanzenanzucht und Probennahme
5.4.1Transgene Pflanzen mit nekrotischem Phänotyp
5.4.2Induzierbares Zelltodsystem - „Lichtshift“-Experimente
5.4.3Lichtshift-Experiment bei niedrigem O2-Partialdruck
5.5Streßexperimente an ausgestochenen Blattscheiben
5.6Kreuzung von Tabakpflanzen
5.7Gentechnische Arbeiten
5.7.1Präparation von polyA+-RNA
5.7.2Transfertechniken für RNA und DNA (Northern und Southern Blot) und Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden
5.7.3Konstruktion einer subtrahierten cDNA-Bank mittels „Subtraktiver Suppressions- Hybridisierung“ (SSH)
5.7.3.1Allgemeine Ausführungen zum Prinzip der Methode
5.7.3.2Details der Durchführung
5.7.4Vergleich der Expression verschiedener Transkripte durch Reverse Northern Blots
5.7.4.1Erzeugen von Membranen mit regelmäßig angeordneter DNA (Arrays): Kolonie-PCR und Southern Blot, Kolonie-Lifts, Spot Blots
5.7.4.2Differentielles Durchmustern (Screening) der subtrahierten cDNA-Bank
5.7.5Erststrangsynthese zur Erzeugung von radioaktiv markierten einzelsträngigen cDNA-Sonden
5.7.6Durchmustern einer in Bakteriophagen verpackten Tabak-cDNA-Bank nach Vollängenklonen
5.7.7DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
5.7.8Erstellen von Antisense-Konstrukten für GRP und das Tabakhomologe zu Hap5b
5.7.9Pflanzentransformation und Regeneration von transgenen Pflanzen in Sterilkultur
5.7.10SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blots
5.7.11Durchmustern einer A. thaliana-cDNA-Bank im Shuttle-Vektor pfL61 - Allgemeine Methoden bei der Arbeit mit S. cerevisiae
5.8Biochemisch-analytische Methoden
5.8.1Quantitative Analyse von niedermolekularen Verbindungen
5.8.1.1Qualitative und quantitative Bestimmung der Chlorophyllvorstufen mittels HPLC
5.8.1.2Bestimmung von Chlorophyll- und Gesamtcarotinoidgehalt
5.8.1.3Bestimmung des Gehaltes an thiobarbitursäurereaktiven Substanzen (TBA-RS)
5.8.1.4Messung der Bildung von Ethan als weiteres Maß für Lipidperoxidation
5.8.1.5Niedermolekulare Antioxidantien: Ascorbat, Glutathion, Tocopherol
5.8.1.6Quantifizierung von H2O2
5.8.1.7Quantifizierung der phenolischen Verbindungen Salicylat, Chlorogensäure und Scopolin
5.8.2Nachweis der Aktivität von Enzymen - Enzymassays
5.8.2.1Bestimmung des Gehaltes an löslichem Protein in Extrakten
5.8.2.2Trennung und Visualisierung von Isoformen der Superoxid-Dismutase durch nicht-denaturierende PAGE
5.8.2.3Bestimmung der Gesamtaktivitäten von APX, MDAR, DHAR und GR
5.9Weitere Methoden
5.9.1Bestimmung der Photosynthese- und Atmungsraten durch Gaswechselmessungen
6 Ergebnisse
6.1Untersuchungen an Pflanzen mit bereits ausgeprägtem, photodynamisch verursachtem Phänotyp
6.1.1Der Phänotyp der Pflanzen
6.1.2Molekulare Ursachen für den nekrotischen Phänotyp
6.1.3Oxidativer Streß und antioxidatives Schutzsystem in UROD- und CPO-AS-Pflanzen
6.1.3.1Aktivierung des antioxidativen Schutzsystems infolge von photooxidativem Streß
6.1.3.1.1Aktivitätsanstieg der SOD
6.1.3.1.2Aktivierung der meisten Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus
6.1.3.1.3Anstieg der Transkript- und Proteinakkumulation antioxidativer Schutzenzyme
6.1.3.1.4Verringerte Reduktionskapazität der niedermolekularen Antioxidantien
6.1.3.1.5Verstärkte Lipidperoxidation als Anzeichen für Membranschädigung
6.1.4Physiologische Auswirkungen von tetrapyrrol-induziertem oxidativen Streß auf die CO2-Assimilation
6.1.4.1CO2-Assimilationsraten in Abhängigkeit der photosynthetisch aktiven Strahlung (Lichtkurven)
6.1.4.2Nettoassimilation in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration (A-ci-Kurven)
6.1.5Aktivierung von pathogenese-assoziierten Prozessen in porphyrischen Pflanzen
6.2Untersuchungen an porphyrischen Pflanzen, in denen der nekrotische Phänotyp durch die Veränderung von Umweltbedingungen induziert wird
6.2.1Umweltabhänigkeit der Ausbildung von Blattläsionen
6.2.1.1Abhängigkeit der Bildung von Nekrosen von der Lichtmenge - das Lichtshift-Experiment
6.2.1.2Verstärkung der Lichtabhängigkeit der Nekrosenbildung durch erhöhte Temperaturen
6.2.1.3Strikte Abhängigkeit der Bildung von Blattläsionen in porphyrischen Pflanzen vom Sauerstoffpartialdruck
6.2.2Identifizierung von frühzeitig induzierten Genen als Reaktion auf photodynamisch erzeugten oxidativen Streß durch Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH)
6.2.2.1Daten zur Effizienz der Subtraktion mittels SSH
6.2.2.1.1Allgemeine Angaben zur Größe der differentiellen cDNA-Bank
6.2.2.1.2Angaben zur Redundanz von cDNA-Klonen
6.2.2.1.3Sequenzierung der cDNA-Inserts
6.2.2.1.4Erneutes Überprüfen der differentiellen Expression durch Reverse und konventionelle Northern Blots
6.2.2.2Liste der differentiell exprimierten Gene
6.2.2.3Northern Blot-Analyse ausgewählter, im Lichtshift-Experiment induzierter Gene
6.2.2.4Northern Blot-Analyse der Expression von Genen des antioxidativen Schutzsystems im Lichtshift-Experiment
6.2.2.5Northern Blot-Analyse ausgewählter Gene aus der subtrahierten cDNA-Bank unter dem Einfluß anderer Stressoren
6.3Untersuchungen zum Gly-reichen Protein (GRP) und Charakterisierung von GRP-AS-Pflanzen
6.4Alternativer Ansatz zur Isolation von pflanzlichen Genen, die Streßtoleranz bzw. -resistenz vermitteln
6.5Ergebnisse der begleitenden biochemischen Analyse während des Lichtshift-Experiments
6.5.1Veränderungen von Chlorophyll- und Carotinoidgehalt
6.5.2Aktivität ausgewählter antioxidativer Schutzenzyme und Gehalt an niedermolekularen Antioxidantien während des Lichtshift-Experiments
6.5.2.1Analyse der Aktivität verschiedener Isoformen der SOD mittels nicht-denaturierender PAGE
6.5.2.2Aktivität ausgewählter Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus: APX und GR
6.5.2.3Einfluß des Lichtshift-Experiments auf die Proteinmenge von APX und Catalase
6.5.2.4Niedermolekulare Antioxidantien im Lichtshift-Experiment: Ascorbat, Glutathion und Tocopherol
6.5.2.5Indikatoren für Lipidperoxidation und Membranschädigung im Lichtshift-Experiment: Nachweis von Ethan und TBA-RS
6.5.3Kinetik der Akkumulation von pathogenese-assoziierten Substanzen im Lichtshift-Experiment
6.5.3.1Untersuchungen zur phenolischen Verbindung Scopolin, H2O2 und Salicylsäure
6.5.3.2Western Blot-Analyse von pathogenese-assoziierten Proteinen im Lichtshift-Experiment
6.5.4Versuche zur Detektion von prä-nekrotischen Veränderungen im Blattgewebe porphyrischer Pflanzen durch noninvasive Techniken
6.5.4.1Analyse von räumlich aufgelösten Chlorophyll-Fluoreszenzparametern an Blättern (Leaf fluorescence imaging)
6.5.4.2Infrarot (IR)-Photographie von Blättern (Thermographie)
6.5.4.3Gaswechselmessungen während des Lichtshift-Experiments
6.6Untersuchungen an Kreuzungsprodukten zwischen porphyrischen Pflanzen und transgenen Linien, die antioxidative Schutzenzyme überexprimieren
7 Diskussion
7.1Photosensibilisierung durch Deregulation der Tetrapyrrolbiosynthese - photodynamisch erzeugter oxidativer Streß in Pflanze und Mensch
7.2Porphyrin-akkumulierende Tabakpflanzen als Modellsystem der Photosensibilisierung
7.3Identifizierung und Charakterisierung von Genen, deren Expression frühzeitig als Reaktion auf die Photosensibilisierung induziert wird
7.4Chronologische Betrachtung der Folgen von Photosensibilisierung in porphyrin-akkumulierenden Tabakpflanzen
7.5Die wichtigsten Ergebnisse der Arbeit im Überblick
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Anhang A Liste der Veröffentlichungen

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Bezeichnung und Sequenz häufig eingesetzter Oligonukleotidprimer
Tab. 2 Häufig verwendete Reagenzien- und Methodensysteme (Kits) verschiedener Hersteller
Tab. 3 Herkunft der verwendeten primären Antikörper
Tab. 4 Laufmittelzusammensetzung und -gradient bei der HPLC-Trennung der Porphyrine
Tab. 5 Laufmittelzusammensetzung und -gradient bei der HPLC-Trennung von Thiolen (Glutathion)
Tab. 6 Laufmittelzusammensetzung und -gradient bei der HPLC-Trennung der Tocopherole
Tab. 7 Laufmittelzusammensetzung und -gradient bei der HPLC-Trennung der phenolischen Verbindungen zur Quantifizierung von Salicylsäure
Tab. 8 Laufmittelzusammensetzung und -gradient bei der HPLC-Trennung der phenolischen Verbindungen zur Quantifizierung von Chlorogensäure und Scopolin
Tab. 9 Statistische Daten zur SSH. Weitere Informationen im Text.
Tab. 10 Liste der Klone in der subtrahierten cDNA-Bank. Angegeben ist jeweils die Anzahl aller cDNAs einer Klasse (inkl. redundanter Klone) und die Anzahl unikaler Genprodukte. Besonders redundante cDNAs (wie GRP, SAR8.2) sind in Tab. 9 bereits erwähnt worden. Bis auf 7 cDNA-Klone, für die entweder keine Sequenzinformation vorlag bzw. beim Sequenzvergleich keinerlei Homologien zu bereits beschriebenen Genen erkannt werden konnte, ist für jede cDNA der Homologiepartner mit dem wahrscheinlichsten BLAST-Ergebnis aufgelistet. Die in der Literatur bereits beschriebene Bedeutung oder Funktion einer Vielzahl der Genprodukte unter Streßbedingungen ist stichpunktartig angegeben. Die Länge der cDNA-Inserts ist in den meisten Fällen aus der Sequenz abgeleitet; nur bei langen Inserts bzw. stark fehlerhaften u./o. das Insert nicht komplett abdeckenden Sequenzen ist die Insertgröße nach Restriktionsabbau der Plasmide mit EcoRI und Agarosegel-Elektrophorese abgeschätzt worden. Die Induktion im Lichtshift bzw. durch andere Stressoren wurde wiederholt durch Reverse Northern Blots bzw. durch konventionelle Northern Blots überprüft (s. - ). Das Ergebnis dieser Überprüfung ist jeweils in Form von Abkürzungen angegeben: n.d.: nicht ermittelt; nein: kein differentielles Hybridisierungssignal für beide Spots (cDNA-Klone wurden als Duplikate gespottet, s. - , - ); (\|[check ]\|): schwach differentiell exprimiert (1,1< FS/RS < 1,5; s. - ); \|[check ]\|: differentiell (FS/RS > 1,5, s. - ); 0: kein eindeutiges Ergebnis (normalisiertes Signalverhältnis FS/RS beider Spots war umgekehrt zueinander, s. - ); andere Stressoren (s. - ): HL: Starklicht; MV: Methylviologen; AC: Acifluorfen; H2O2; SA: Salicylat; TR: Trockenstreß; K: Kältestreß

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Der Ascorbat-Glutathion-Zyklus. Entgiftung von Superoxid und Wasserstoffperoxid unter Verbrauch von Ascorbat und Regenerierung von Ascorbat auf Kosten von Glutathion und NADPH; nach Foyer et al. (1994)
Abb. 2 Die zentrale Rolle der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Signaltransduktion bei abiotischem und biotischem Streß. Für die vorliegende Arbeit spielte die massenhafte Erzeugung von ROS, welche durch akkumulierende Chlorophyllvorstufen über photochemische Reaktionen (Photosensibilisierung) hervorgerufen wurde, die entscheidende Rolle. Andere Quellen von ROS sind daher nicht gezeigt. ROS können einerseits zelluläre Komponenten direkt angreifen und aufgrund dieser toxischen Wirkung zu massiven Schäden führen. Andererseits hat H2O2 auch eine Funktion als Signalmolekül in vielen Streßsituationen. Auf weitere Signaltransduktoren und die ausgelösten zellulären Reaktionen wird im Text näher eingegangen. Generell kann man hierbei zwischen lokalen und systemischen Antworten unterscheiden.
Abb. 3 Schema der Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen (C5-Weg, nach Grimm 1998). Werden die hervorgehobenen Enzymschritte (s. auch Abb. 4 ) durch die Expression von Antisense-Konstrukten in transgenen Pflanzen gehemmt, kommt es wegen der Akkumulation und Autoxidation der jeweiligen Substrate zur Photosensibilisierung der Pflanzen, die u.a. zur Ausprägung von Blattläsionen führt. Transgene Pflanzen, die Antisense-RNA für Uroporphyrinogen-Decarboxylase (UROD) bzw. Coproporphyrinogen-Oxidase (CPO) exprimieren, werden in dieser Arbeit detailiert vorgestellt.
Abb. 4 Trimming der Seitenketten der Tetrapyrrole auf dem Weg zum Protoporphyrin IX. Bei der dargestellten Reaktionssequenz wird das konjugierte Doppelbindungssystem der Porphyrine ausgebildet und damit wesentlich die optischen Eigenschaften der zyklischen Verbindungen beeinflußt. Akkumulieren die gezeigten Intermediate, kommt es zur Photosensibilisierung.
A = Acetat-, M = Methyl-, P = Propionat-, V = Vinylreste; nähere Erläuterungen im Text
Abb. 5 Schematische Darstellung der subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH). Die Abbildung wurde in modifizierter Form aus dem Handbuch zum PCR Select cDNA Subtraction Kit (Clontech, Heidelberg) entnommen. Weitere Erläuterungen befinden sich im Text.
Abb. 6 Phänotyp transgener Pflanzen, die Antisense-RNA für UROD exprimieren. A Acht Wochen alte Primärtransformanten der Linie 35/2 (links) und 35/12 (Mitte) im Vergleich mit WT (rechts). B Aufsicht auf die Primärtransformante 35/2. C Wurzeln der in A gezeigten Pflanzen. D Nachkommen der F1-Generation der Primärtransformante 35/2 nach acht Wochen Wachstum auf Erde. (Abb. entnommen aus Mock und Grimm 1997)
Abb. 7 Phänotyp von transgenen Tabakpflanzen, die Antisense-RNA für CPO exprimieren. Links: Aufsicht auf einen Nachkommen der F2-Generation der Linie 1/41. Rechts: Detailansicht eines Blattes eines anderen Nachkommens der gleichen Linie. Die Pflanzen wurden für 8 Wochen auf Erde unter kontrollierten Umweltbedingungen kultiviert, welche die Ausbildung von Nekrosen fördern (25°C, 16 h: 200 µE m-2 s-1).
Abb. 8 Aktivitätsanalyse der SOD-Isoformen in Blättern von WT und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Proteinextrakte wurden durch nicht-denaturierende PAGE aufgetrennt und SOD-Aktivität anschließend durch Anfärben der Gele nachgewiesen (s. - ). Die Quantifizierung der Banden mit SOD-Isoformaktivität mit Hilfe eines automatischen Bildauswertesystems wurde für n=9 Gele mit Extrakten aus drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (SD < 10%). Die ermittelte SOD-Aktivität ist in rel. Einheiten angegeben. mt. = mitochondriale; pl. = plastidäre, cyt. = cytosolische Isoform (modifiziert nach Mock et al. 1998).
Abb. 9 Vergleich der Aktivität von löslichen Isoformen der Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus APX, MDAR, DHAR und GR zwischen WT und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet.
Abb. 10 Aktivität der Catalase in Blättern von WT- und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Die Ergebnisse für Enzymextrakte aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet. (modifiziert nach Mock et al. 1998)
Abb. 11 Northern Blot-Analyse der RNA-Gehalte ausgewählter antioxidativer Schutzenzyme in unterschiedlich alten Blättern des WT, von UROD-AS 35/2 und CPO-AS 1/3. Gleiche Mengen von RNA (10 µg) wurden in formaldehydhaltigen Agararosegelen separiert und anschließend auf Nylonmembranen überführt. Diese wurden mit spezifischen Sonden für mitochondriale Mn-SOD (MnSOD), plastidäre Fe-SOD (FeSOD), cytosolische (cyt.) und plastidäre (pl.) Cu/Zn-SOD sowie für drei Isoformen der Catalase (CAT1-3) und Glutathion-Peroxidase (GPX) hybridisiert. Ein representatives Autoradiographie-Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt. Die Sonden wurden freundlicherweise von H. Willekens (Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt. Die Abb. ist der Veröffentlichung von Mock et al. (1998) entnommen.
Abb. 12 Western Blot-Analyse von Blattextrakten des WT (SNN) und von porphyrischen Pflanzen der Linien UROD-AS 35/2 (URODAS) sowie CPO-AS 1/3 (CPOAS). Gleiche Mengen an Protein (10 µg) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Der zum Anfärben der APX verwendete monoklonale Antikörper, der gegen cytosolische APX aus Spinat erzeugt wurde, war freundlicherweise durch H. Saji (Onagawa, Japan) zur Verfügung gestellt worden. (Abb. entnommen aus Mock et al. 1998)
Abb. 13 Vergleich des Tocopherolgehalts zwischen WT und UROD-AS Linie 35/2. Tocopherol wurde mittels HPLC quantifiziert (s. - ), und Mittelwerte aus den Ergebnissen dreier unabhängiger Experimente wurden berechnet (SD < 10%) (H.-P. Mock, unveröffentlichte Daten).
Abb. 14 Links: Reduziertes (oben) und Gesamtascorbat (Mitte) sowie daraus berechnetes Redoxverhältnis (unten) im Vergleich zwischen Blättern von WT und UROD-AS 35/2. Rechts: Gesamt-Glutathion-Gehalt (oben) und Redoxverhältnis (unten) der gleichen Blattproben, aus denen auch Ascorbat bestimmt wurde. Weil praktisch 100% des Glutathions in der reduzierten Form vorliegen, wurde auf eine entsprechende Teilgrafik verzichtet. Glutathion wurde in diesen Experimenten in einem photometrischen Test (und nicht mittels HPLC; s. - , Smith et al. 1984) gemessen, und Mittelwert sowie Standardabweichung von drei unabhängigen Versuchen wurden berechnet.
Abb. 15 Vergleich der Gehalte an thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBA-RS) als Indikator für Lipidperoxidation in WT und UROD-AS Linie 35/2. Mittelwerte und Standardabweichungen für drei unabhängige Experimente sind gezeigt.
Abb. 16 Nettoassimilationsrate im Blatt 10 von WT- und porphyrischen Pflanzen der Linien CPO-AS 1/3 und UROD-AS 35/2 bei einer externen CO2-Konzentration von 400 ppm in Abhängigkeit der eingestrahlten photosynthetisch aktiven Strahlung (PAR). Die Nettoassimilationsraten bei diesen ambienten CO2-Bedingungen wurden sowohl auf Blattfläche (oben) als auch auf den Chlorophyllgehalt der Blätter bezogen (unten). Die Mittelwerte aus den Messungen an jeweils 5 Pflanzen sind gezeigt.
Abb. 17 Nettoassimilationsraten von Blättern des WT und der porphyrischen Linien CPO-AS 1/3 und UROD-AS 35/2 in Abhängigkeit von der internen CO2-Konzentration (A-ci-Kurven). Die Gaswechselmessungen wurden sowohl bei der Lichtintensität durchgeführt, an welche die Pflanzen seit Wochen adaptiert waren (A, B; 300 µE m-2 s-1), als auch bei 2000 µE m-2 s-1, (C, D), um photosynthetische Maximalraten zu bestimmen. Die Raten wurden auf Blattfläche (A, C) bzw. auf Chlorophyllgehalt der Blätter (B, D) bezogen. Gezeigt sind repräsentative, gemittelte Gaswechseldaten des jeweils 10. Blattes ausgewählter Pflanzen, die sowohl schwächer (UROD-AS in C und D sowie CPO-AS in A-D) als auch stärker ausgeprägte (UROD-AS 35/2 in A und B) Nekrosen aufwiesen.
Abb. 18 Lichtshift-Experiment (s. auch - ). WT- (SNN), CPO-AS- (Linie 1/41) und UROD-AS-Pflanzen (Linie 35/2) wurden für 8 Wochen bei 200 µE m-2 s-1 und einer Photoperiode von 6 h angezogen (oben). Die Photoperiode wurde anschließend auf 16 h verlängert (unten), was innerhalb von 24-48 h zur Ausbildung von Blattnekrosen an den transgenen, porphyrischen Pflanzen führt. Das jeweils 6. Blatt von repräsentativen Pflanzen ist gezeigt. Werden porphyrische Pflanzen in den Kurztag zurückgeführt, stoppt die Nekrosenbildung beim erreichten Stand.
Abb. 19 Lichtshift-Experiment mit teilweise durch Aluminiumfolie abgedeckten Blättern. A) Vor der Vergrößerung der Lichtperiode von 6 h auf 16 h bei 200 µE m-2 s-1 wurden Blätter der WT- (links) und der porphyrischen Pflanzen der Linie CPO-AS 1/41 (rechts) jeweils zur Hälfte abgedeckt und erst nach 3 Tagen erhöhter Lichdosis zum Fotografieren wieder freigelegt. B) Detailansicht von Blättern der Pflanzen aus (A) nach Entfernen der Abdeckung. Die lichtexponierten Blatthälften sind dunkler und weisen im Falle der CPO-AS-Pflanze (rechts) Nekrosen auf.
Abb. 20 Lichtshift-Experiment bei erhöhter Temperatur. WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 wurden für 7 Wochen bei 25°C und 6 h 200 µE m-2 s-1 angezogen und die Temperatur daraufhin für 1 Woche auf 32°C erhöht. Unter dem Einfluß der erhöhten Temperatur bildet sich im Lichtshift-Experiment (16 h 200 µE m-2 s-1) innerhalb von 2-3 Tagen ein sehr viel massiverer („super“)nekrotischer Phänotyp der CPO-AS-Pflanzen heraus, während an den WT-Pflanzen keine Veränderungen beobachtet werden (nicht gezeigt).
Abb. 21 Lichtshift-Experiment mit WT-Pflanzen (links) und Pflanzen der CPO-AS Linie 1/41 (rechts) unter niedrigem O2-Partialdruck. A) Blatt 6 nach 8 Wochen Anzucht in der Klimakammer (6 h: 200 µE m-2 s-1; 21% O2); B) Lichtshift: nach einer weiteren Woche unter geänderten Lichtbedingungen (16 h: 200 µE m-2 s-1) und erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck (< 1%) bzw. C) Lichtshift unter normoxischen Bedingungen (16 h: 200 µE m-2 s-1; 21% O2). Deutlich ist die Ausbildung von Nekrosen am porphyrischen Blatt bei 21% O2 zu erkennen (C), während diese bei Niedrigsauerstoffbedingungen ausbleibt (B).
Abb. 22 Reverser Northern (Spot) Blot zur Überprüfung von differentieller Genexpression. Aliquots von Plasmid-Mini-Präparationen wurden in vierfacher Ausführung an Nylonmembranen gebunden. Die zwei Nylonmembranen, auf denen die cDNA-haltigen Plasmide jeweils als Duplikat vorhanden waren, wurden zuerst mit den FS-(A) und RS-Sonden (B) und anschließend, nach vollständigem Strippen der Membranen, mit einer vektorspezifischen Sonde hybridisiert (C, D), um quantitative Auftragefehler auszugleichen und die digital-radiometrische Auswertung der Hybridisierungssignale am Phosphorimager zu ermöglichen. Einige der am stärksten differentiell exprimierten cDNA-Klone sind markiert.
Tab. 10 und unter den gleichen Oberbegriffen geordnet. Zu den Abkürzungen: 14-3-3: 14-3-3-ähnliches Protein; NADH-DH: NADH-Dehydrogenase; GRP: Gly-reiches Protein; PR: Pathogenesis-related (Protein); SAR: Salicylic Acid Responsive (Protein); PAR: Photoassimilate-responsive (Protein). Alle Blots wurden nach Entfernen der cDNA-Sonden mit einer Sonde für die 18S rRNA hybridisiert, um zu kontrollieren, ob gleiche Mengen an RNA aufgetragen wurden.
Abb. 24 Northern Blot-Analyse von Genen der antioxidativen Schutzenzyme Fe-SOD, plastidären bzw. cytosolischen Cu/Zn-SOD, mitochondrialen Mn-SOD, cytosolischen APX, einer Peroxidase mit breiter Substratspezifität (keine APX) und zweier Catalase-Isofomen während des Lichtshift-Experiments. Die vier dargestellten Zeitpunkte entsprechen dem Beginn des Lichtshift-Experiments (0h), dem Zeitpunkt der Probennahme für die Konstruktion der subtrahierten cDNA-Bank (12h) und dem Beginn der Lichtphase am 2. bzw. 5. Tag des Lichtshift-Experiments
(24 bzw. 96h), an dem die sichtbare Bildung von Nekrosen an den Blättern der CPO-AS-Pflanzen (Linie 1/41) gerade beginnt bzw. abgeschlossen ist. Die methodischen Einzelheiten entsprechen den Angaben aus Abb. 23 . Die Sonden wurden freundlicherweise von D. Inzé (Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt.
Tab. 10 ). Blattscheiben von 8 Wochen alten WT-Pflanzen wurden zu Beginn (Experiment I) bzw. zum Ende der Lichtphase (Experiment II) im Gewächshaus ausgestochen und für die angegebenen Zeiten auf
10 mM K-Phosphat-Puffer (pH 7,0) mit folgenden Zusätzen inkubiert: 1 bzw. 10 µM Methylviologen (MV); 1 bzw. 10 µM Acifluorfen (AC); 1 mM H2O2; 10 bzw. 100 µM Salicylsäure (SA). Die Starklichtbehandlung erfolgte bei 1500 µE m-2 s-1, die Kältebehandlung bei 6°C, und beim Trockenstreßversuch wurden die Blattscheiben ohne Puffer inkubiert. Im Streßexperiment I wurden die Blattscheiben nach 24h Dunkel- (24D) sowie nach weiteren 5h Lichtinkubation (+5L; 200 µE m-2 s-1) eingefroren. Im Streßexperiment II schloß sich einer Inkubation von 12h im Dunkeln (12D) entweder ein um 6h verlängertes Verweilen im Dunkeln (+6D) oder im Licht an (+6L; 200 µE m-2 s-1), bevor die Blattscheiben ebenfalls in flüssigem N2 eingefroren wurden. Zusätzlich wurden zum Zeitpunkt 0h, d.h. beim Ausstechen der Blattscheiben, Proben als Kontrolle gewonnen. Je 10 µg der aus den Blattscheiben gewonnenen Gesamt-RNA wurden pro Spur auf formamid/formaldehydhaltige Agarose-Gele aufgetragen und diese elektrophoretisch getrennt. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Beladung der Gelspuren wurde die RNA in den Gelen mit Ethidiumbromid angefärbt. Das Blotten, Hybridisieren und Waschen entsprach den Angaben aus Abb. 23 . Zu weiteren experimentellen Details s. Abschnitt - .
Abb. 26 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in unterschiedlichen Organen von WT-Tabakpflanzen. Je 10 µg Gesamt-RNA aus den in der Mitte der Lichtperiode geernteten Organen von acht (Blätter 1-4, 5-8, Mittelrippe, Wurzel) bzw. zwölf Wochen alten Tabakpflanzen (alle übrigen Organe), die unter Gewächshausbedingungen angezogen worden waren, wurden elektrophoretisch in formamid/formaldehyd-haltigen Agarosegelen aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nylonmembranen wurde mit einem 297 bp langen und radioaktiv markierten cDNA-Fragment von GRP unter hoch-stringenten Bedingungen hybridisiert und die Filter anschließend gewaschen. Die autoradiografische Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Phosphorimagers. Als Kontrolle für die gleichmäßige Beladung des Gels mit RNA diente die Färbung mit Ethidiumbromid (s. auch - ).
Abb. 27 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in unterschiedlich alten Blättern von WT-Tabakpflanzen. Die Position der Blätter beim Zählen von der Spitze zur Basis ist angegeben. Die Proben wurden in der Mitte der Lichtperiode von Pflanzen geerntet, die seit acht Wochen unter Gewächshausbedingungen gewachsen waren. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .
Abb. 28 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) zu unterschiedlichen Tageszeiten im fünftjüngsten Blatt von WT-Tabakpflanzen. Die Pflanzen wurden für acht Wochen in einer Klimakammer unter kontrollierten Bedingungen angezogen (13.00-01.00 Uhr (12h): 400 µE m-2 s-1, durchgehend 25°C, 70% rel. Luftfeuchte). Die Proben wurden zu Beginn (0h), in der Mitte (6h) und zum Ende der Lichtperiode (12h) sowie in der Mitte der Dunkelperiode (18h) gewonnen. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .
Abb. 29 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in den Blättern 3, 5 und 7 (gezählt von der Spitze in Richtung Basis) von 3 WT-Pflanzen und 13 ausgewählten Primärtransformanten, die mit einem GRP-AS-Konstrukt transformiert sind (s. - , - ). Von den Pflanzen, die für 6 Wochen unter Gewächshausbedingungen angezogen worden waren, wurden in der Mitte der Lichtperiode Blattproben genommen und Gesamt-RNA präpariert. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .
Abb. 30 Southern Blot-Analyse der DNA von zwei WT-Pflanzen und von vier GRP-AS-Primärtransformanten. Je 10 µg genomische DNA wurden mit den Restriktionsendonukleasen Hind III, Sph I bzw. Xba I vollständig fragmentiert und die Fragmente anschließend in Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Transfer und Fixierung der DNA auf Nylonmembranen wurden diese unter stringenten Bedingungen mit einer radioaktiv markierten GRP-Sonde hybridisiert und gewaschen. Weitere Angaben in - .
Abb. 31 Ergebnis der Komplementationsversuche von Hefezellen mit einer cDNA-Bank aus A. thaliana. Das Wachstum des mit dem leeren Plasmid pFL61 transformierten Stamms YPH250 (jeweils obere Reihe) und des transformierten Stamms #3, bei dem das Plasmid die cDNA für eine Pectinacetyl-Esterase beinhaltet (jeweils untere Reihe) wurde auf unterschiedlichen Medien getestet: A) Minimalmedium (YNB + Glc - Uracil) und B) gleiches Minimalmedium mit 120 µM Menadion. Dieses Vitamin K-Derivat führt zur verstärkten Produktion von Superoxid. Die Flüssigkulturen beider Stämme in der frühen stationären Phase wurden nach photometrischer Bestimmung bei 600 nm durch die Zugabe von Medium auf gleiche Zelldichte eingestellt und anschließend mit sterilem Wasser schrittweise 1:10 verdünnt. Je 20 µl der Verdünnungen, die ca. 1 x 106, 1 x 105 ... 10 Zellen enthielten, wurden auf festes Minimalmedium getropft und die Petrischalen anschließend für 84 h bei 30°C inkubiert. Nur die Transformante #3 ist in der Lage, auch in Anwesenheit von erhöhten Menadionkonzentrationen zu wachsen.
Abb. 32 Chlorophyllgehalt und Verhältnis von Chlorophyll a/b in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 während des Lichtshift-Experiments. Chlorophyll- und Carotinoidgehalte (s. Abb. 33 ) wurden in methanolischen Extrakten photometrisch bestimmt und nach Formeln von Lichtenthaler und Wellburn (1983) berechnet (s. auch - ). Links sind die Gehalte in Bezug zum Frischgewicht, rechts auf der Basis von Blattfläche angegeben. Die Zeitachse beginnt am Anfang der ersten von 6 auf 16h verlängerten Lichtphase am Tag 1 des Lichtshift-Experiments und endet am Beginn der Lichtperiode am 5. Tag des Versuchs (96h). Am oberen Rand der Abb. wird durch schwarze die Dunkel- und durch weiße Rechtecke die Lichtphase symbolisiert. Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ergebnisse von sechs Blattextrakten aus mehreren Lichtshift-Versuchen sind gezeigt.
Abb. 33 Carotinoidgehalt und Verhältnis von Carotinoiden zu Gesamt-Chorophyll in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Verlauf des Lichtshift-Experiments. Weitere Details sind in der Legende zur Abb. 32 beschrieben.
Abb. 34 Enzymaktivität einzelner Isoformen der SOD in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Aliquots von Proteinextrakten mit je 40 µg Protein aus Blattproben von drei Lichtshift-Experimenten wurden gelelektrophoretisch unter nicht-denaturierenden Bedingungen aufgetrennt und die Enzymaktivität in den SOD-Banden durch Färbung sichtbar gemacht. Die Gele wurden anschließend densitometrisch ausgewertet (s. - ), und Mittelwerte sowie Standardabweichungen der anhand eines aufgetragenen Mn-SOD-Standards in Units/Aktivitätsbande berechneten Enzymaktivitäten sind angegeben. Die Abb. zeigt Daten für die Summe aller Isoenzym-Aktivitäten, die cytosolische bzw. plastidäre Cu/Zn-SOD, die mitochondriale Mn-SOD, die plastidäre Fe-SOD und eine zusätzliche Aktivitätsbande, die nur in den CPO-AS-Pflanzen auftrat. Die Angaben zum zeitlichen Rahmen des Experiments entsprechen den Details aus Abb. 32 .
Abb. 35 Aktivität der löslichen Isoformen von Ascorbat-Peroxidase (APX) und Glutathion-Reduktase (GR) in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Die Details zum zeitlichen Rahmen der Experimente sind in der Legende zur Abb. 32 beschrieben. Der letzte, hier dargestellte Zeitpunkt (88h) entspricht dem Ende der vierten verlängerten Lichtperiode. Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet.
Abb. 36 Repräsentatives Ergebnis der Western Blot-Analyse von Proteinextrakten aus Blättern von WT- (W) und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 (T) im Lichtshift-Experiment. Gleiche Mengen an Protein (10 µg) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Der zum Nachweis der APX verwendete monoklonale Antikörper, der gegen cytosolische (cyt.) APX aus Spinat erzeugt wurde, war freundlicherweise durch H. Saji (Onagawa, Japan) zur Verfügung gestellt worden. Das Serum gegen Catalase (CAT) aus Tabak stammt aus dem Labor von D. Klessig (Piscataway, USA). Zusätzlich zu den Daten für die 16h der ersten verlängerten Lichtperiode (0-16h) sind die Zeitpunkte 24, 48, 72, 96 und 168h nach Beginn des Lichtshift-Experiments gezeigt, die dem Beginn der Lichtperiode am Tag 2, 3, 4, 5 und 8 entsprechen. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)
Abb. 37 Reduziertes und Gesamtascorbat in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 in den ersten 88h des Lichtshift-Experiments. Mittelwerte und Standardabweichungen der Werte aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Für Details zu den Probennahmezeitpunkten
s. Abb. 32 .
Abb. 39 alpha- und beta+gamma-Tocopherol in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Die Abbildung zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 Extrakten aus Proben eines Lichtshift-Experiments. Tocopherol wurde durch HPLC bestimmt. Für Details zu den Zeitpunkten der Probennahme s. Abb. 32 .
Abb. 40 Bildung von Ethan (links) und TBA-RS (rechts) als Indikatoren der verstärkten Lipidperoxidation infolge der Veränderung der Lichtbedingungen in porphyrischen Pflanzen der Linie CPO-AS 1/41 und Vergleich mit Daten für WT-Pflanzen. In einem modifizierten Lichtshift-Experiment wurde die den Pflanzen verabreichte Lichtdosis durch Erhöhen der Intensität von
70 auf 650 µE m-2 s-1 vergrößert und das gebildetet Ethan gaschromatografisch quantifiziert. Der Versuch wurde dreimal wiederholt und Mittelwerte aus den Daten berechnet. Die Standardabweichungen waren < 10%. Die Details zu den Lichtshift-Experimenten, bei denen Probenmaterial für die Bestimmung der TBA-RS gewonnen wurde, sind in der Legende zur
Abb. 32 beschrieben. Die dargestellten Werte verkörpern Mittelwert und Standardabweichung für mehrere unabhänigige Lichtshift-Experimente.
Abb. 41 Gehalt von Scopolin und Chlorogensäure in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 bei Veränderung der Lichtbedingungen. Die Lichtshift-Experimente wurden in modifizierter Form durchgeführt: Nach achtwöchigem Wachstum unter Schwachlichtbedingungen (6h:200 µE m-2 s-1) wurden die Pflanzen in Klimakammern mit 12h: 400 µE m-2 s-1 überführt und die phenolischen Verbindungen in den methanolischen Blattextrakten durch HPLC analysiert. Der Zeitpunkt 0h entspricht dem Transfer der Pflanzen und damit gleichzeitig dem Beginn der veränderten Lichtbedingungen. Das repräsentative Ergebnis für die Extrakte eines Lichtshift-Experiments ist gezeigt. Mehrere Wiederholungen lieferten eine grundsätzlich gleiche Kinetik der Gehalte beider Substanzen mit allerdings stark schwankenden Absolutwerten, so daß auf die Berechnung von Mittelwerten verzichtet wurde. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)
Abb. 42 Wasserstoffperoxidgehalt in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 während des Lichtshift-Experiments. H2O2 wurde durch einen fluorimetrischen Test bestimmt ( - ), und Mittelwert und Standardabweichungen für drei unabhängige Lichtshift-Experimente wurden berechnet. Für die Details zum Lichtshift-Experiment s. Legende zu Abb. 32 .
Abb. 43 Gehalt von freier (links) und gebundener (konjugierter) Salicylsäure (rechts) in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Gezeigt werden repräsentative Einzelmessungen aus drei unabhängigen Versuchen, die zwar die gleiche Tendenz der Meßdaten aber stark differierende Absolutwerte aufwiesen. Deshalb wurde auf die Berechnung von Mittelwert und Standardabweichung aus den HPLC-Daten verzichtet. Zu den Details des zeitlichen Rahmens des Lichtshift-Experiments s. Legende zu Abb. 32 .
Abb. 44 Repräsentativer Western Blot von den zwei pathogenese-assoziierten Proteinen Sesquiterpen-Cyclase und PR-S in WT- (W) und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 (T). Die experiementellen Details entsprechen denen aus Abb. 36 . Der Antikörper gegen die Sesquiterpen-Cyclase wurde freundlicherweise von J. Chappel (Lexington, USA), der gegen PR-S von B. Fritig (Strasbourg, Frankreich) zur Verfügung gestellt. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)
Abb. 45 Fließschema der durch Photosensibilisierung ausgelösten Prozesse in transgenen Tabakpflanzen, die Antisense-RNA für UROD bzw. CPO exprimieren. Die Abfolge von schwarzen und weißen Balken auf der linken Seite stellt nicht-maßstäblich die Länge der Dunkel- bzw. Lichtphasen dar, unter denen die Pflanzen angezogen wurden. Der rote Querstrich symbolisiert den Beginn der ersten verlängerten Lichtphase im Lichtshift-Experiment. Mit dem dicker werdenden violetten Pfeil wird die zunehmende Photosensibilisierung und mit dem darin eingesetzten grauen Balken das verstärkte Auftreten von nekrotischem Blattgewebe dargestellt. Orange Färbung in den Balken auf der rechten Seite der Abb. symbolisiert die zuerst nur transiente, später aber permanente Akkumulation von Uro- bzw. Coproporphyrin(ogen) in den UROD- bzw. CPO-AS Pflanzen. Die über bzw. unter dem roten Trennstrich aufgezählten Symptome treten unter den entsprechenden experimentellen Bedingungen teilweise auch zeitgleich ein, weswegen aus der grafischen Reihenfolge nicht automatisch auf die zeitliche Abfolge der Ereignisse geschlossen werden kann. Weitere Erläuterungen im Text.

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Wed Feb 21 14:53:55 2001