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Kapitel 3. Einleitung

3.1 Oxidativer Streß in Pflanzen

Höhere Pflanzen sind als sessile Lebewesen im Lauf ihrer Entwicklung einer ganzen Reihe von verschiedenen abiotischen und biotischen Umwelteinflüssen ausgesetzt, denen sie nicht ausweichen, sondern durch entsprechende Anpassung begegnen müssen. Deshalb haben sich in Pflanzen eine Vielzahl von komplexen, stark spezialisierten, aber auch integrativen Systemen zur Erfassung (Perzeption), Weiterleitung (Transduktion) und Verarbeitung von Signalen evolviert. Über dieses Netzwerk von Signalen werden Reaktionen („Response“) ermöglicht, durch die sich die Pflanze den veränderten Bedingungen optimal anpassen kann.

Wichtige abiotische Impulse, die die Pflanze als photosynthetisierendes Lebewesen von außen erfährt, sind vor allem Veränderungen von Lichtqualität und -quantität, Temperatur, Wasser- und Mineralstoffangebot, aber auch das Vorhandensein von Luftschadstoffen, wie z.B. Schwefeldioxid (SO₂) oder Ozon (O₃), wobei letztere im wesentlichen auf anthropogene Einflüsse zurückzuführen sind. Im Boden werden toxische Wirkungen vor allem durch Schwermetalle und andere Xenobiotika hervorrufen. Auch die zur Kontrolle von Pflanzenbeständen eingesetzten Herbizide gehören zur Gruppe der Xenobiotika. Zu den biotischen Umweltfaktoren zählen Pathogene und Symbionten sowie um Ressourcen konkurrierende Nachbarn ( Scheel et al. 1999).

Überschreiten die negativen Umwelteinwirkungen auf die Pflanze einen bestimmten Schwellenwert, spricht man - in Anlehnung an die medizinische Terminologie - von Streß. In Studien der letzten Jahre hat sich herausgestellt, daß die den gesamten Organismus Pflanze betreffenden Streßsymptome vor allem auf oxidativen Streß und die durch freie Radikale eingeleitete Schädigung von Zellen zurückgeführt werden können.

3.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und ihre Schadwirkung

Unter oxidativem Streß versteht man ein Ungleichgewicht zwischen der Erzeugung und Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Zu den ROS zählen der Singulett-Sauerstoff (¹O₂), das Superoxid-Radikal (^•O₂¯), Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und andere Peroxide (ROOH) sowie das extrem reaktive und deshalb kurzlebige Hydroxyl-Radikal (^•OH). Diese im Vergleich zum „normalen“ Sauerstoff sehr reaktionsfreudigen Sauerstoffderivate entstehen als Nebenprodukte auch im üblichen Stoffwechsel der Zellen in verschiedenen Organellen, werden

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Durch die Übertragung von nur einem Elektron je O₂-Molekül kann Sauerstoff zum Superoxid-Radikal (^•O₂¯) mutieren, wenn im zellulären Metabolismus Elektronenakzeptoren in ungenügender Konzentration zur Verfügung stehen. Dies geschieht enzymatisch über Flavoprotein-Dehydrogenasen oder auch ohne Enzymeinfluß durch Autoxidation von Substraten wie z.B. Ferredoxinen, Hydrochinonen, Thiolen oder reduzierten Hämproteinen ( Fridovich 1976). Eine wichtige Quelle der univalenten Sauerstoffreduktion im Chloroplasten stellt die stromaexponierte reduzierende Seite des PS I dar, wo vor allem die Eisen-Schwefel-Proteine X und A/B Anteil an der Bildung von Superoxid haben ( Asada 1994, Alscher et al. 1997).

Wichtig in diesem Zusammenhang ist die sog. Mehler-Reaktion ( Mehler 1951), die auch pseudo-zyklischer Elektronentransport genannt wird. Hier werden, vor allem dann, wenn die Verfügbarkeit von NADP wegen z.B. geringer interner CO₂-Konzentration und gleichzeitiger hoher Lichtintensität eingeschränkt ist, die Elektronen von reduziertem Ferredoxin (Fd) direkt auf Sauerstoff übertragen (Gl. 1).

O₂ + Fd (red.) ^•O₂^¯ + Fd (ox.) (Gl. 1)

Das resultierende Superoxid kann nun einerseits selbst Schäden hervorrufen, z.B. durch die Bildung von Lipidperoxiden und die daraus resultierende Membranschädigung oder durch das verstärkte Auftreten von DNA-Einzelstrangbrüchen ( Fridovich 1986). Das Superoxid-Radikal stellt andererseits durch die Möglichkeit seiner schrittweisen weiteren Reduktion und damit Umwandlung in andere Vertreter von ROS eine zusätzliche große Gefahr dar (Gl. 2, 3).

^•O₂^¯ + e^¯ + 2 H⁺ H₂O₂ (Gl. 2)

H₂O₂ + e^¯ + 2 H^{+ •}OH + H₂O (Gl. 3)

Während H₂O₂ durch seine relativ lange Halbwertszeit und ein hohes Oxidationspotential
(+1,77 V) vor allem durch die mögliche Oxidation von Thiol-Gruppen schädigend wirkt, zeichnet sich das Hydroxyl-Radikal durch eine ganz besonders hohe Reaktivität aus, welche durch die fast diffusionskontrollierte Rate (K > 109 M-1s-1) illustriert wird, mit der es mit den meisten organischen Verbindungen zu reagieren vermag. Es gibt in der Zelle zwei Möglichkeiten für die Bildung dieses Radikals. Die erste ist die Reduktion von H₂O₂ durch in

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H₂O₂ + Me^{2+ •}OH + OH ^¯ + Me³⁺ (Gl. 4)

Eine zweite Möglichkeit besteht in der gemeinsamen Redoxreaktion von H₂O₂ und ^•O2¯ (Gl. 5), welche auch Haber-Weiss-Reaktion genannt wird ( Haber und Weiss 1934).

H₂O₂ + ^•O₂^{¯ •}OH + OH ^¯ + O₂ (Gl. 5)

Eine wichtige Quelle von ROS in Pflanzen stellt das in der Troposphäre vorhandene Ozon (O₃) dar, dessen Konzentration in den industriell entwickelten Ländern in den letzten Jahren, vor allem durch die Zunahme des Autoverkehrs, stark angestiegen ist. Ozon reagiert in wäßriger Umgebung mit Thiol-Gruppen, Aminen, und phenolischen Verbindungen der Zellwand, aber auch mit ungesättigten Fettsäuren der Zellmembran und produziert auf diese Weise ROS, Aldehyde und organische Radikale. Makroskopisch werden ozonbedingte Schäden vor allem durch das Auftreten von punktförmigen Nekrosen infolge von lokal begrenztem Zelltod sichtbar ( Pell et al. 1997, Langebartels et al. 2000).

3.1.1.1 Photosensibilisierung und ROS-Erzeugung

Zusätzlich entstehen durch pigmentvermittelten Energietransfer (Photosensibilisierung) Vertreter der ROS, die für das in dieser Arbeit untersuchte Modellsystem von besonderer Bedeutung sind (s. - ). Dies tritt vor allem dann auf, wenn eine adäquate Nutzung der durch die photosynthetisch aktiven Pigmente absorbierten Energie verhindert oder vermindert ist. Pigmentmoleküle wie z.B. Chlorophyll, Protochlorophyllid, Uro- oder Coproporphyrinogen III können unter solchen Umständen verstärkt photosensibilisierend wirken, indem sie aus dem reaktionsträgen Grund- (Singulett, ⁰S) zuerst in den angeregten Singulett- (¹S) (Gl. 6) und nachfolgend in den sehr reaktiven Triplett-Zustand (¹T) übergehen (Gl. 7). In diesem Zustand sind solche Moleküle über einen sog. Typ I-Mechanismus in der Lage, auch Radikale direkt zu erzeugen, indem sie z.B. O₂ zu Superoxid reduzieren (Gl. 8). Außerdem können Thiole (R-SH) oxidiert (R-S) oder weitergehende Redoxketten der Pigmentmoleküle initiiert werden (Gl. 9, 10 u. 11, Salin 1987).

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S + Photon

¹S ¹T (Gl. 7)

¹T + O₂ ¹S⁺ + ^•O₂^¯ (Gl. 8)

¹T + R-SH ¹S-H + R-S (Gl. 9)

¹T + ⁰S ¹S¯ + ⁰S⁺ (Gl. 10)

¹T + ⁰S ¹S⁺ + ⁰S¯ (Gl. 11)

Andererseits können Photosensibilisatoren im angeregten Triplett-Zustand auch ihre Anregungsenergie auf O₂ übertragen, wobei dieser über den sog. Typ II-Mechanismus aus dem rel. reaktionsträgen Triplett (3O₂)- in den sehr reaktiven Singulett-Zustand (1O₂) übergeht
(Gl. 12, Foote 1968, Salin 1987).

¹T + ³O₂ ⁰S + ¹O₂ (Gl. 12)

Singulett-Sauerstoff reagiert sehr rasch mit verschiedenen organischen Molekülen und bildet durch Addition an ungesättigte Bindungen Hydroperoxide und Endoperoxide ( Foote 1979). So werden auch Doppelbindungen in Fettsäureresten von Membranlipiden angegriffen, was zu einer erhöhten Rigidität und damit zum Verlust an Funktionalität der Membran führt.

Zwei Beispiele sollen die Folgen von Photosensibilisierung illustrieren: Bei den verschiedenen Porphyria-Erkrankungen kommt es aufgrund genetischer Defekte zur Akkumulation von photosensitiven Porphyrinen, die zu schweren Gewebeschäden (Hautläsionen) bei den Patienten führen ( Elder 1993). Die hohe Toxizität der Kombination aus Singulett-Sauerstoff und radikalischen Verbindungen wird aber auch in der sog. photodynamischen Therapie (PDT) in der Tumormedizin ausgenutzt ( Sharman et al. 1999).

3.1.2 Antioxidative Schutzmechanismen in Pflanzen

Das unkontrollierte Auftreten von ROS hat die Peroxidation von Lipiden, daraus resultierende Membranschäden, die Denaturierung von Proteinen sowie Strangbrüche von DNA und

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Weil das Hydroxyl-Radikal aufgrund seiner Eigenschaften mit jedem verfügbaren Substrat in kürzester Zeit nach seiner Bildung reagiert, gibt es in diesem Falle allerdings keinen Schutz vor dessen aggressiver Wirkung. Die Entstehung dieses Radikals selbst muß also möglichst ausgeschlossen werden. Für die Detoxifizierung der anderen Vertreter von ROS stehen hingegen in den betroffenen Kompartimenten der Zelle enzymatische und nicht-enzymatische Schutzsysteme bereit ( Salin 1987, Asada 1994, Alscher et al. 1997, Noctor und Foyer 1998).

3.1.2.1 Nicht-enzymatische Schutzmechanismen

Ein wichtiger Mechanismus, der sehr weit am Ursprung der in Abschnitt - beschriebenen Prozesse der univalenten Elektronenübertragungen ansetzt, besteht im ungefährlichen Abführen der in Form von Triplett-Zuständen der Pigmente angestauten Energie. Xanthophylle als Vertreter der Carotinoide sind aufgrund ihrer Molekülstruktur zu strahlungsloser Energiedissipation in Form von Wärme fähig. Dieser Prozeß wird Auslöschen ("Quenching") der angeregten Zustände genannt. Auch Singulett-Sauerstoff, der mit Carotinoiden, aber auch mit -Tocopherol direkt reagiert, kann auf diese Weise deaktiviert werden ( Fryer 1992, Edge et al. 1997). Carotinoide und Hydrochinone können zusätzlich mit dem Superoxid-Radikal reagieren und es so entgiften. Tocopherol spielt eine besonders wichtige Rolle beim Schutz vor Lipid-Radikalen in Membranen, da hier das in wäßrigem Milieu operierende Ascorbat-Glutathion-System (s. - ) nicht effektiv ist. Sowohl reduziertes Ascorbat als auch Glutathion können nicht-enzymatisch mit den verschiedenen ROS reagieren ( Sies 1995).

Im folgenden soll aber vor allem auf die Bedeutung dieser beiden niedermolekularen Antioxidantien als Substrat von Enzymreaktionen eingegangen werden.

3.1.2.2 Eine Kette von antioxidativen Schutzenzymen - Der Ascorbat-Glutathion-Zyklus

Die Superoxid-Dismutasen (SOD, E.C. 1.15.1.1), die Kupfer- und Zink-, Eisen- bzw. Manganionen im aktiven Zentrum tragen und als verschiedene Isoformen im Cytosol und/oder Plastiden bzw. in den Mitochondrien vorkommen, beschleunigen enzymatisch die Disproportionierung des Superoxids in Wasserstoffperoxid und Sauerstoff ( Abb. 1 , Beauchamp

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Das dabei entstehende, ebenfalls schädliche H₂O₂ kann durch Catalasen (E.C. 1.11.1.6, Gl. 13) bzw. Peroxidasen (E.C. 1.11.1.7, Gl. 14) abgefangen werden. Beide Enzyme tragen ein Häm in ihrem aktiven Zentrum.

Catalase

H₂O₂ + H₂O₂ 2 H₂O + O₂ (Gl. 13)

Peroxidase

H₂O₂ + R(OH)₂ 2 H₂O + RO₂ (Gl. 14)

Weil die Catalase vor allem in den Peroxisomen vorkommt, nicht aber in den Chloroplasten gefunden wird ( Willekens et al. 1995), sind Peroxidasen von besonderer Bedeutung für den Abbau von Wasserstoffperoxid in diesem Organell der Pflanzenzelle. Obwohl in den Chloroplasten sowohl Glutathion als auch die zur Regeneration von reduziertem Glutathion notwendige Glutathion-Reduktase (E.C. 1.6.4.2) vorhanden sind (s.u.), scheint die Bedeutung der zuerst in tierischen Geweben identifizierten Glutathion-Peroxidase für die Entgiftung von H₂O₂ in der Pflanze eher gering zu sein. Allerdings deutet die Tatsache, daß auch in Pflanzen Phospholipidhydroperoxide durch dieses Enzym effektiv entgiftet werden können, vor allem auf eine Funktion beim antioxidativen Schutz von Membranen hin ( Drotar et al. 1985, Eshdat et al. 1997). Phospholipidhydroperoxide entstehen bei der Reaktion von Tocopherol mit Phospholipidperoxy-Radikalen.

Guajacol-Peroxidasen spielen durch ihre breite Cosubstratspezifität eine wichtige Rolle bei den Reaktionen in der Zelle, in welchen Wasserstoffperoxid vorrangig als Substrat dient, z.B. bei der Biosynthese von Lignin und Ethylen oder beim Abbau von Indolessigsäure ( Asada 1992).

Die Hauptlast bei der Entgiftung von H₂O₂ in den Chloroplasten und im Cytosol der Pflanzen tragen daher die verschiedenen Isoenzyme der Ascorbat-Peroxidase (APX, E.C. 1.11.1.11), die das zweite enzymatische Glied des sog. Ascorbat-Glutathion-Zyklus darstellen ( Abb. 1 , Foyer und Halliwell 1976, Foyer et al. 1994). Dabei wird reduziertes Ascorbat (ASA) in Monodehydroascorbat (MDA^•) umgesetzt, wobei gleichzeitig Wasser entsteht. Dieses erste, radikalische Oxidationsprodukt wird unter Verbrauch von NAD(P)H durch die Monodehydroascorbat-Reduktase (MDAR, E.C. 1.6.5.4) reduziert, wodurch ASA regeneriert werden kann. Durch Disproportionierung entsteht aus MDA^• hingegen Didehydroascorbat

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Letztendlich werden also Reduktionsäquivalente aufgewendet, um ROS zu entgiften. Der erhöhte Bedarf an NADPH trägt einerseits dazu bei, die Komponenten der Elektronentransportkette der Photosysteme länger oxidiert zu halten und verringert damit die Wahrscheinlichkeit einer anhaltenden Radikalbildung aufgrund von Elektronenstau. Andererseits stehen damit weniger Reduktionsäquivalente für die Fixierung von Kohlenstoff zur Verfügung. Über den Pentose-Phosphatweg kann NADPH unter Verbrauch von Glucose-6-Phosphat zusätzlich bereitgestellt werden. In Abb. 1 sind alle Reaktionen aus dem Ascorbat-Glutathion-Zyklus noch einmal schematisch zusammengefaßt.

Abb. 1 Der Ascorbat-Glutathion-Zyklus. Entgiftung von Superoxid und Wasserstoffperoxid unter Verbrauch von Ascorbat und Regenerierung von Ascorbat auf Kosten von Glutathion und NADPH; nach Foyer et al. (1994)

Neben den bisher erwähnten antioxidativen Schutzenzymen gibt es noch eine Reihe weiterer enzymatischer Antioxidantien und Entgiftungsenzyme in Pflanzen. Dazu zählt die Glutathion-S-Transferase (GST), die einerseits Glutathion auf Xenobiotika überträgt und sie auf diese Weise z.B. für eine dauerhafte Ablagerung in der Vakuole mobilisiert. Andererseits hat GST auch eine schwache GSH-abhängige Peroxidase-Aktivität ( Marrs 1996). Als eigenständige Gruppe unter den Peroxidasen haben 2-Cystein-Peroxiredoxine eine wichtige Aufgabe bei der Beseitigung von toxischen Alkylhydroperoxiden im Chloroplasten ( Baier und Dietz 1999a, b ).

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3.2 Signaltransduktion bei oxidativem Streß und Pathogeninfektionen

Die Schutzreaktionen der Pflanze, die sich gegen die Auswirkungen von Streß richten, sind auf verschiedenen Ebenen reguliert. Die Regelmechanismen müssen dabei einerseits der Komplexität einer Vielzahl von verschiedenen Stressoren gerecht werden. Andererseits münden fast alle Abwehrreaktionen in der aktiven Kontrolle der Gleichgewichtskonzentration („steady state level“) von ROS, weshalb die Verarbeitung von Streßsignalen gleichzeitig integrativ wirken muß.

Abb. 2 Die zentrale Rolle der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Signaltransduktion bei abiotischem und biotischem Streß. Für die vorliegende Arbeit spielte die massenhafte Erzeugung von ROS, welche durch akkumulierende Chlorophyllvorstufen über photochemische Reaktionen (Photosensibilisierung) hervorgerufen wurde, die entscheidende Rolle. Andere Quellen von ROS sind daher nicht gezeigt. ROS können einerseits zelluläre Komponenten direkt angreifen und aufgrund dieser toxischen Wirkung zu massiven Schäden führen. Andererseits hat H₂O₂ auch eine Funktion als Signalmolekül in vielen Streßsituationen. Auf weitere Signaltransduktoren und die ausgelösten zellulären Reaktionen wird im Text näher eingegangen. Generell kann man hierbei zwischen lokalen und systemischen Antworten unterscheiden.

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3.2.1 Die Rolle von H₂O₂ bei der Hypersensitivitätsreaktion (HR) und systemisch erworbener Resistenz (SAR)

Sicher ist, daß H₂O₂ als Vertreter der ROS nicht nur als aggressives Agens wirkt, sondern aufgrund seiner relativen Langlebigkeit und guten Durchdringungsfähigkeit auch als Signalmolekül eine wichtige Rolle spielt. Dies betrifft vor allem die Rolle des H₂O₂ als Wegbereiter von Reaktionen, in denen sich die Pflanze gegenüber Pathogenen zur Wehr setzt.

Bisher nur in Ansätzen sind die Mechanismen der Pathogenerkennung verstanden, bei der u.a. pflanzliche Resistenzfaktoren (R-Genprodukte) mitwirken. Diese interagieren nach einem strikten Gen-für-Gen-Prinzip mit den vom Pathogen kodierten Avirulenzfaktoren (Avr-Genprodukte), woraus auf eine direkte Wechselwirkung zwischen Ligand und seinem spezifischem Rezeptor geschlossen wurde. Nur wenn beide Partner vorhanden sind, kann die Resistenz der Pflanze gegenüber dem wirtsspezifischen Pathogen aufrechterhalten werden ( Nürnberger 1999). In der Folge kommt es zur Induktion von Abwehrmechanismen, woran H₂O₂ wesentlich beteiligt ist.

Wasserstoffperoxid wird am Infektionsort in größeren Mengen durch die resistente Wirtspflanze aktiv erzeugt („oxidative burst“) und dient daraufhin mehreren Funktionen ( Mehdy 1994, Mehdy et al. 1996, Alvarez et al. 1998): Erstens wirkt es, vor allem im Verbund mit Lipidperoxiden, toxisch gegenüber den invasiven Schädlingen. Zweitens ist Wasserstoffperoxid Substrat bei der Quervernetzung von Zellwandbestandteilen und damit Voraussetzung für die Verstärkung von Zellwänden, wodurch einem weiteren Vordringen des Schädlings eine verbesserte physikalische Barriere entgegengesetzt wird. Drittens führt H₂O₂ in Konzentrationen über einem bestimmten Schwellenwert zusammen mit anderen Signalen zum sog. programmierten Zelltod (Programmed Cell Death, PCD), einem Vorgang, der der in tierischen Organismen beschriebenen Apoptose gleicht ( Dangl et al. 1996, Greenberg 1996). An der Infektionsstelle wird also von der Pflanze lokal Gewebe „geopfert“, um Pathogene am weiteren

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Gleichzeitig spielt H₂O₂ eine Signalrolle im umliegenden Gewebe und bewirkt hier durch die Aktivierung von geeigneten Abwehrprogrammen, daß die Resistenz gegenüber dem Pathogen systemisch, d.h. durch die ganze Pflanze hindurch verbreitet wird ( Dangl et al. 1996, Alvarez et al. 1998). Zu den Vorgängen, die man als Folge dieser systemisch erworbenen Resistenz (Systemic Aquired Resistance, SAR, Ryals et al. 1996) beobachtet, zählen u.a. die Akkumulation von pathogenese-assoziierten Proteinen (Pathogenesis-related (PR)- Proteins), zu denen vor allem lytische Enzyme wie Chitinasen oder Glucanasen gehören. Außerdem kommt es zur Anhäufung von antimikrobiell wirksamen Coumarinen, wie z.B. dem Scopolin, das zur großen Klasse der phenolischen Verbindungen gehört ( Jurd et al. 1971, Ahl Goy et al. 1993, Sharan et al. 1998). Die Induktion dieser Schutzmechanismen führt zur Eingrenzung bzw. zum Zurückdrängen von Infektionen und kann die Pflanze gegebenenfalls auch gegenüber andersartigen Stressoren resistenter machen („Kreuzresistenz“, „Kreuzinduktion“).

3.2.2 Weitere Signalüberträger bei Streß- und Abwehrreaktionen

Nicht nur H₂O₂ spielt bei solchen Streß- und Abwehrreaktionen eine wichtige Rolle in der Signalübertragung ( Levine et al. 1994), sondern auch die Streßhormone Ethylen und Jasmonsäure, Salicylsäure und deren flüchtiges methyliertes Derivat ( Ryals et al. 1996, Fodor et al. 1997, Moeder et al. 1999), sowie generelle Signalmoleküle wie Calcium (Ca²⁺, Pauls 1995) oder Stickstoffmonoxid (NO, Durner und Klessig 1999) sind beteiligt. Die Koordination der einzelnen Signalwege, die u.a. Rezeptor-ähnliche Protein-Kinasen ( Czernic et al. 1999), regulierte Ionenkanäle ( Zimmermann et al. 1999), das Ca²⁺/Calmodulinsystem ( Rudd und Franklin-Tong 1999), Kaskaden von reversiblen Proteinphosphorylierungen wie z.B. mitogen-aktivierte Protein- (MAP)-Kinase-Kaskaden ( Jonak et al. 1999) und GTP-bindende Proteine (G-Proteine) einschließen können ( Bischoff et al. 1999), ist noch weitgehend unklar. Es gibt allerdings viele Hinweise darauf, daß in Pflanzen eine ganze Reihe von Signalwegen existieren, die auch in anderen, bereits detaillierter untersuchten Systemen vorkommen ( Mulligan et al. 1997). So werden auch in Pflanzen offensichtlich einige Vorgänge über sog. Zwei-Komponenten-Systeme reguliert ( Urao et al. 2000), die in Bakterien und Hefen schon gut charakterisiert wurden ( Chang und Stewart 1998).

Dieser Mechanismus ist als Phosphat-Transfer-System anzusehen, bei dem die Phosphatgruppe von einem His-Rest der einen Komponente, der Sensor-Kinase, auf einen Asp-Rest der zweiten Komponente, dem Response-Regulator, übertragen wird. Die Sensor-Kinase wird durch die Veränderung eines zellulären Parameters (z.B. der Osmolarität im EnvZ/OmpR-System) in ihrer

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3.2.3 Oxidativer Streß und Kontrolle der Genexpression

Als Ergebnis (Output) der integrierten Signalketten steht die Anpassung des gestreßten biologischen Systems an die veränderten Umweltbedingungen. Dies kann durch die Modulation der zur Abwehr erforderlichen Menge und/oder Aktivität von bestimmten Genprodukten auf den verschiedenen Ebenen der Genexpression erfolgen. Meist beobachtet man dabei ein Umschalten des Aktivierungszustandes von Transkriptionsfaktoren, was zur Veränderung im Transkriptionsmuster führt. Die Transkription eines bestimmten Sortiments an Genen wird ein-, die eines anderen hingegen ausgeschaltet, wobei auf den jeweiligen Stressor (z.B. Hitze) spezialisierte Transkriptionsfaktoren (Hitzeschockfaktoren, HSF) eine wichtige Rolle spielen ( Grossman et al. 1984, Nover 1991). Diese binden nur an entsprechende Hitzeschockelemente (HSE) in der Promotorregion der Hitzeschockproteine (HSP). Auch die Promotoren von anderen Streßabwehrgenen wie z.B. Gene für PR-Proteine sind durch entsprechende Elemente gekennzeichnet, an die bestimmte, streßspezifische Transkriptionsaktivatoren binden können ( Lebel et al. 1998).

Neben der Neusynthese bestimmt auch die unter Streßbedingungen veränderte mRNA-Stabilität die Menge an verfügbaren Transkripten ( Mehdy und Brodl 1998). Auf der nächsten Regulationsebene hat die Translationskapazität der Zelle Einfluß auf die Synthese der Zielproteine ( Vayda und Webster 1998). Und letztendlich kann auch post-translational die Aktivität von Enzymen als Reaktion auf Streßbedingungen reguliert werden. Dies kann z.B. über die Veränderung des Redoxzustandes von Thiol-Gruppen der Proteine erfolgen. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die Redoxkontrolle von Enzymaktivitäten über das Thioredoxin-System.

Solche durch Streß hervorgerufenen adaptiven Veränderungen sind nicht lokal begrenzt, sondern können über systemische Aktivierung auch in nicht-gestreßten Geweben ausgelöst werden. Hierbei wird seit kurzer Zeit neben der SAR (s. - ) auch von einer systemisch erworbenen Anpassung (Systemic Aquired Acclimation, SAA) berichtet ( Karpinski et al. 1999).

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3.3 Generierung von ROS in experimentellen Systemen - Ausgewählte Untersuchungsergebnisse

ROS entstehen zu jeder Zeit als Nebenprodukt im Stoffwechsel der Pflanze. Die Rate der Erzeugung steigt aber unter Streß stark an ( Alscher et al. 1997). Für Analysen der direkten und indirekten Auswirkungen von ROS auf zelluläre Systeme wurden experimentelle Streßbedingungen genutzt, in denen Art und Menge der ROS definiert sind. So wurde die Konzentration von ROS in einer Reihe von experimentellen Modellsystemen durch die Anwendung von Chemikalien erhöht, die zur massiven Bildung von Superoxid, Wasserstoffperoxid oder Singulett-Sauerstoff führen. Einige dieser Chemikalien (z.B. Methylviologen = Paraquat™) sind gebräuchliche Herbizide, die in den Untersuchungen an ganzen Pflanzen, Organen oder Zellkulturen appliziert wurden ( Dodge 1994, Böger und Wakabayashi 1995). Auch die Anwendung von physikalischen Stressoren, wie z.B. erhöhte ( Faria et al. 1999) oder erniedrigte ( Prasad et al. 1994) Temperaturen, hohe Lichtintensität ( Karpinski et al. 1997, Karpinski et al. 1999), Wassermangel ( Loggini et al. 1999), Bestrahlung mit UV-Licht ( Langebartels et al. 2000) oder die Begasung mit den Luftschadstoffen Ozon ( Conklin und Last 1995, Pell et al. 1997 Langebartels et al 2000) sowie SO₂ ( Willekens et al. 1994) führten zu einer Anhäufung von ROS mit entsprechenden Konsequenzen für das komplexe Schutz- und Abwehrsystem der Pflanzen. Wie bereits dargestellt wurde (s. - ), findet man auch bei der Untersuchung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen Parallelen zu abiotischen Streßsituationen inklusive der Anhäufung von ROS, insbesondere von H₂O₂ ( Dangl et al. 1996).

3.3.1 Blattläsionen infolge von programmiertem Zelltod in unterschiedlichen experimentellen Systemen

Als Folge der Akkumulation von ROS kommt es in vielen Fällen zur Ausbildung von Blattläsionen (Nekrosen), welche in Form und Umfang stark vom verwendeten experimentellen System und dem Ausmaß an oxidativem Streß abhängen. So weisen O₃-behandelte Pflanzen nach einiger Zeit punktförmige Nekrosen auf ( Langebartels et al. 2000), die jenen an transgenen Pflanzen ähneln, in welchen aus der weitgehenden Antisense-Inhibierung der Catalase-Aktivität eine erhöhte H₂O₂-Konzentration unter photorespiratorischen Bedingungen resultiert ( Chamnongpol et al. 1996, Takahashi et al. 1997). Auch nach TMV-Infektion entwickeln sich in resistenten Tabaksorten, die das N-Gen tragen, als Folge von programmiertem Zelltod lokal begrenzte Nekrosen an den Blättern („Local Lesion Host“, Mittler et al. 1997).

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In den Spezies Arabidopsis und Mais sind Mutanten bekannt, die durch das spontane Auftreten von Nekrosen gekennzeichnet sind, welche ebenfalls durch eine Deregulation des programmierten Zelltodes ausgelöst werden ( Dangl et al. 1996). In der „Lesion Simulating Disease“ (LSD)1-Mutante von A. thaliana ist ein Transkriptionsfaktor betroffen, der normalerweise als negativer Regulator des Zelltodes dient ( Dietrich et al. 1997).

3.4 Porphyrische Pflanzen und oxidativer Streß

In der vorliegenden Arbeit wurde ein experimentelles System zur Generierung von oxidativem Streß benutzt, in welchem es aufgrund des gewählten gentechnischen Ansatzes zur Deregulation der Tetrapyrrolbiosynthese und als Folge dessen zur Anhäufung von photosensibilisierenden Tetrapyrrolen kam. Dieser Stoffwechselweg ist von großer Bedeutung für alle Organismen und unterliegt daher einer strikten Kontrolle.

3.4.1 Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen

Chlorophyll ist sehr wahrscheinlich das häufigste Pigment in der Biosphäre, und man schätzt den jährlichen Umsatz auf ca. 1 x 10⁹ t ( Matile et al. 1996). Dabei gehört Chlorophyll, wie auch das u.a. im respiratorischen Stoffwechsel bedeutsame Häm, zu den Porphyrinderivaten. Der Porphyringrundkörper wird aus 8 Molekülen der nicht-proteinogenen Aminosäure
-Aminolävulinsäure (ALA) gebildet. Aktuelle Übersichten zum Thema geben z.B. Von Wettstein et al. (1995), Porra (1997) oder Grimm (1999).

Die Ausgangsverbindung ALA wird im sog. C5-Stoffwechselweg, der in den Chloroplasten der Pflanzen und Algen, aber auch in Cyanobakterien (z.B. Synechocystis) und in den meisten

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Die anschließenden Reaktionen der Chlorophyll- und Hämbiosynthese, bei denen aus jeweils 8 Molekülen ALA Uroporphyrinogen III und nachfolgend Protoporphyrin gebildet werden, sind generell in allen Organismen gleich. Unterschiede bestehen aber in der Lokalisation der einzelnen Biosyntheseschritte: Die Bildung von Chlorophyll findet ausschließlich in Chloroplasten statt, während die letzten beiden Schritte der Hämsynthese in Pflanzen sowohl in Chloroplasten als auch in Mitochondrien ablaufen. In Tieren hingegen startet die Biosynthese von Häm in Mitochondrien, wird im Cytoplasma bis zur Bildung des Coproporphyrinogens fortgesetzt und wiederum in den Mitochondrien abgeschlossen. Unabhängig von der Lokalisation sind aber alle involvierten Enzyme in Eukaryoten kerncodiert.

Aus 2 Molekülen ALA wird, durch die Aminolävulinat-Dehydratase (od. Porphobilinogen-Synthase, EC 4.2.1.24) katalysiert, der Porphobilinogen-Ring gebildet. Vier dieser Ringe werden nach Bildung des eigenen Cofaktors (Porphobilinogen-Dimer) durch die Porphobilinogen-Deaminase (od. 1-Hydroxymethylbilan-Synthase, EC 4.1.3.8) zum linearen Tetrapyrrol zusammengefügt. Der Ringschluß und die gleichzeitig Isomerisierung des Ringes IV werden durch die Uroporphyrinogen-Synthase (od. Co-Synthase, EC 4.2.1.75) bewirkt.

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Abb. 3 Schema der Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen (C5-Weg, nach Grimm 1998). Werden die hervorgehobenen Enzymschritte (s. auch Abb. 4 ) durch die Expression von Antisense-Konstrukten in transgenen Pflanzen gehemmt, kommt es wegen der Akkumulation und Autoxidation der jeweiligen Substrate zur Photosensibilisierung der Pflanzen, die u.a. zur Ausprägung von Blattläsionen führt. Transgene Pflanzen, die Antisense-RNA für Uroporphyrinogen-Decarboxylase (UROD) bzw. Coproporphyrinogen-Oxidase (CPO) exprimieren, werden in dieser Arbeit detailiert vorgestellt.

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Abb. 4 Trimming der Seitenketten der Tetrapyrrole auf dem Weg zum Protoporphyrin IX. Bei der dargestellten Reaktionssequenz wird das konjugierte Doppelbindungssystem der Porphyrine ausgebildet und damit wesentlich die optischen Eigenschaften der zyklischen Verbindungen beeinflußt. Akkumulieren die gezeigten Intermediate, kommt es zur Photosensibilisierung.
A = Acetat-, M = Methyl-, P = Propionat-, V = Vinylreste; nähere Erläuterungen im Text

Die aus drei Untereinheiten zusammengesetzte Mg-Chelatase ist für das Einfügen des Mg2+ als Zentralion der Komplexverbindung ´Chlorophyll´ verantwortlich. Parallel dazu wird in der Hämsynthese durch die Ferro-Chelatase (EC 4.99.1.1) Fe2+ eingebaut.

Anschließend wird die Propionatseitenkette des Ringes III durch die Mg-Protoporphyrin-Methyltransferase (EC 2.1.1.11) SAM-abhängig verestert und damit die Voraussetzung für die Cyclisierungsreaktion bei der Bildung des Ringes V geschaffen. Bei dieser, durch die
Mg-Protoporphyrin-IX-Monomethylester-Cyclase katalysierten Reaktion entsteht Divinyl-Protochlorophyllid, welches dann durch die Vinyl-Reduktase in Protochlorophyllid umgesetzt wird. Die Reduktion von Protochlorophyllid wird in Angiospermen durch eine thylakoidgebundene, licht- und NADPH-abhängige Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR, EC 1.6.99.1) katalysiert, während in Gymnospermen, Moosen, Lebermoosen, Algen und photosynthetisch aktiven Bakterien zusätzlich ein lichtunabhängiges Enzym aktiv ist. POR macht den Hauptproteinbestandteil der Membranen des Prolamellarkörpers in Etioplasten aus und spielt eine wichtige Rolle bei der lichtabhängigen Regulation der

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Chlorophyll b (Chl b) besitzt an Position 7 eine Formyl- anstelle der Methylgruppe des Chlorophylls a, welche durch die Chlorophyllid-Oxygenase (CAO) auf der Stufe des Chlorophyllids a eingeführt wird, wobei ein 7-Hydroxymethylintermediat auftritt. Chl a selbst scheint kein Substrat für das Enzym zu sein. Die Interkonversion von Chl a und b über den sog. Chlorophyll-Zyklus ( Oster et al. 2000) dient der Einhaltung eines optimalen Verhältnisses zwischen den Komplexen des Reaktionszentrums der Photosysteme (Chl a) und den inneren („core“) und äußeren Antennenpigment-Komplexen (Chl b).

Der letzte Schritt der Biosynthese des Chl a ist die Veresterung des Propionatrests von Ring IV mit der hydrophoben Kette des Phytylpyrophosphats, welche durch die Chlorophyll-Synthase katalysiert wird. In Bacteriochlorophyll a (BChl a) übernimmt Geranylgeraniol die Aufgabe des Phytols, und in BChl b wird der Phytylrest durch Phytadienol ersetzt. Auch in Pflanzen wird in ganz jungem Gewebe geranylgeranyliertes Chl a gefunden.

3.4.2 Die Regulation der Tetrapyrrolbiosynthese

Die Tetrapyrrolbiosynthese unterliegt einer strikten und mehrstufigen Kontrolle sowohl durch innere Faktoren als auch durch Umwelteinflüsse ( Grimm 1998, Grimm 1999). Dadurch wird sichergestellt, daß einerseits Chlorophyll, Phytochrom, Häm und andere Produkte des Syntheseweges immer ausreichend zur Verfügung stehen. Dies ist deshalb von besonderer Bedeutung, da Tetrapyrrole, an ihre entsprechenden Apoproteine gebunden, wichtige metabolische Aufgaben erfüllen, so z.B. in der Energieversorgung der Pflanze (Chlorophylle in der Lichtreaktion der Photosynthese, Häm in den Atmungskomplexen), der Entgiftung von ROS (Häm in Catalase und Peroxidasen), der N₂-Fixierung (Häm im Leghämoglobin), der Versorgung mit reduzierten S- und N-Verbindungen (Sirohäm in Sulfit- bzw. Nitrit-Reduktase) oder der Lichtsignalperzeption (Phytochromobilin im Phytochrom). Andererseits sind die meisten Zwischenprodukte des Biosyntheseweges lichtempfindlich, können photosensibilisierend wirken (s. - ) und dadurch die Pflanze schwer schädigen. Schließlich muß die Aktivität der Tetrapyrrolbiosynthese an andere Stoffwechselflüsse und Synthesewege angepaßt werden, damit z.B. gewährleistet wird, daß in den sich entwickelnden Chloroplasten Chlorophylle, Carotinoide und pigmentbindende Proteine in entsprechendem Verhältnis zueinander vorhanden sind.

Zumindest drei Reaktionen des umfangreichen Syntheseweges dienen als Schlüsselstellen für die Regulation:

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1. Die Synthese von ALA ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der gesamten Reaktionssequenz, welcher durch Dunkelheit gehemmt und durch Licht stimuliert wird. Die Lichtregulation wird durch negative Rückkopplungsschleifen wahrscheinlich über die Menge der Zwischenprodukte Mg-Protoporphyrin, Protohäm und Protochlorophyllid realisiert.
2. In Angiospermen kann Protochlorophyllid (Pchlid) nur im Licht zu Chlorophyllid (Chlid) reduziert werden. In etiolierten Keimlingen akkumuliert Pchlid auf einem begrenzten Niveau bevor die o.a. Repression der ALA-Synthese eine weitere Anhäufung von Pchlid verhindert.
3. Das Endprodukt Häm zeigte in Hefe und tierischem Gewebe ebenfalls inhibitorische Wirkung auf die Synthese von ALA. Dabei scheint Häm sowohl direkt als Inhibitor als auch indirekt als transkriptioneller Corepressor der Glutamyl-tRNA-Reduktase, dem Eingangsenzym der Tetrapyrrolsynthese, zu wirken.

Umgeht man die natürlichen Rückkopplungsschleifen, z.B. in dem man etiolierte Pflanzen in ALA-Lösung inkubiert, kommt es zur exzessiven Anhäufung von photosensitivem Pchlid mit der Folge von massiven Schäden bei anschließender Belichtung.

3.4.3 Transgene Pflanzen und Mutanten mit beeinträchtigter Tetrapyrrolbiosynthese

Neben den sehr erfolgreich eingesetzten xantha- und albino-Mutanten ( Henningsen et al. 1993) trugen in den letzten Jahren zunehmend transgene Pflanzenlinien zur Aufklärung von metabolischen Kontrollmechanismen der Tetrapyrrolbiosynthese bei. Dabei lieferten vor allem Antisense (AS)-Pflanzen für einzelne Enzymschritte der Tetrapyrrolbiosynthese überraschende Erkenntnisse. Neben den chlorotischen Linien, wie z.B. für GSA-AT ( Höfgen et al. 1994), die sich durch eine erniedrigte Kapazität der Chlorophyllsynthese auszeichneten, wurden auch nekrotische transgene Linien erzeugt. Diese wiesen unter normalen Lichtbedingungen zwar kaum niedrigere Chlorophyll- oder Hämmengen dafür aber Läsionen an den Blättern auf, wie sie für die HR oder bestimmte abiotische Streßsituationen typisch sind (s. - ). Hierzu zählen AS-Linien für die Enzyme CPO ( Kruse et al. 1995b), UROD ( Mock und Grimm 1997) und PPO ( Molina et al. 1999, Lermontova et al., unveröffentlicht).

Als die hier vorliegende Arbeit 1996 begonnen wurde, waren bis dahin nur der Phänotyp der CPO- bzw. UROD-AS-Pflanzen beschrieben und erste Analysen der antioxidativen Schutzsysteme durchgeführt worden ( Kruse et al. 1995b, Keetman 1995). Es war bekannt, daß

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In der Literatur finden sich weitere Bespiele für photodynamisch hervorgerufenen oxidativen Streß. So weist die Les22-Mutante aus Mais einen „Disease Lesion Mimic“-Phänotyp auf, und es konnte gezeigt werden, daß in diesem Fall ein genetischer Defekt in der Uroporphyrin-Decarboxylase (UROD) vorliegt. Der Anstau von Uroporphyrinogen führt auch hier über Photosensibilisierungsreaktionen zur massiven Erzeugung von ROS und letztendlich zum Zelltod ( Hu et al. 1998). Ähnliche Symptome werden beim Einsatz von photodynamisch wirksamen Herbiziden beobachtet, welche die Protoporphyrinogen-Oxidase (PPO) hemmen und zum Anstau des photosensibilisierenden Substrates mit seinen fatalen Konsequenzen führen ( Böger und Wakabayashi 1995, Wakabayashi und Böger 1999).

Auch bei Patienten mit bestimmten Porphyria-Krankheitsformen kommt es zu lichtabhängigen Hautläsionen, die auf vererbbare genetische Defekte in der Hämbiosynthese, u.a. im UROD-Gen, zurückzuführen sind ( Elder 1993).

3.5 Neuere methodische Ansätze zur Untersuchung von zellulären Streß- und Abwehrreaktionen

In den letzten Jahren hat sich, bedingt auch durch die forcierte Entwicklung von entsprechenden Techniken, die gleichzeitige Durchmusterung der Expression einer großen Anzahl von Genen als effektive Methode erwiesen, um komplexe Veränderungen zu erfassen, die in einzelnen Zellen, Geweben, Organen oder auch ganzen Organismen durch Streß verursacht werden. Als einflußreiche Techniken auf der Ebene der Nukleinsäure haben sich hier verschiedene effektive Methoden der cDNA-Subtraktion (Diatchenko et al. 1999 ) und des sog. Differentiellen Displays (DD-RT PCR, Liang und Pardee 1992) sowie die Reverse Northern Blot Analyse von hoch-dicht aufgetragenen cDNAs auf festen Trägern (z.B. Glas) entwickelt (high density arrays; „Genomics“, Graner et al. 1999, Somerville und Sommerville 1999, Cushman und Bohnert 2000). Eine weitere wichtige Säule in diesem Methodengebäude ist die komplette Sequenzierung von pflanzlichen Modellgenomen wie z.B. von Synechocystis, A. thaliana, Reis oder Mais. Die umfangreichen Datenmengen, die durch solche Studien erzeugt werden, müssen

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Auf dem Niveau der Proteine wurde die Auflösung von zweidimensionalen Gelelektrophoresen immer weiter verbessert, was in Kombination mit der hoch sensitiven Massenspektrometrie bzw. der traditionellen Teilsequenzierung von isolierten Polypeptiden über den Edman-Abbau Informationen über die Gesamtheit der zu einem bestimmten Zeitpunkt oder Entwicklungszustandes als Protein („Proteom“) vorliegenden genetischen Information liefert ( Thiellement et al. 1999). Zusätzlich zu diesem als „Proteomics“ bekannten Ansatz wird neuerdings auch das komplexe, hoch-veränderliche aber ebenfalls als charakteristisch für bestimmte Zustände, Streßsituationen etc. angesehene Muster von metabolischen Zwischen- und Endprodukten durch Methoden mit großem Probendurchsatz untersucht („Metabolics“, „Metabolic Profiling“, Sauter et al. 1991).

Parallel zu diesen „high throughput“-Methoden, mit deren Hilfe wichtige Informationen geliefert werden, haben verschiedene Autoren im kleineren Maßstab versucht, unter Streßeinwirkung bisher unbekannte, differentiell exprimierte Gene in Pflanzen zu identifizieren. Dabei nahm vor allem die Suche nach früh-induzierten Genen der Pathogenabwehr einen großen Raum ein ( Herbers et al. 1995, Eckey-Kaltenbach et al. 1997, Lacomme und Roby 1999). Ebenso liefert die Analyse von Mutanten, die entweder hypersensitiv oder aber tolerant gegenüber Streß reagieren, wertvolle funktionelle Erkenntnisse über relevante Stoffwechsel- und Signalwege ( Cushman und Bohnert 2000).

Auch in der vorliegenden Schrift wurde versucht, durch die Kombination von molekularen, biochemischen und physiologischen Methoden die antioxidative und Pathogenabwehr von porphyrischen Tabakpflanzen zu analysieren. Dabei wurden sowohl frühe als auch spätere Zeitpunkte in der Ausbildung von Blattläsionen als Folge von Zelltod in die Untersuchung einbezogen.

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