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Kapitel 6. Ergebnisse

6.1 Untersuchungen an Pflanzen mit bereits ausgeprägtem, photodynamisch verursachtem Phänotyp

6.1.1 Der Phänotyp der Pflanzen

Tabakpflanzen, die Antisense-Konstrukte für UROD (Mock et al. 1995, Mock und Grimm 1997) bzw. CPO ( Kruse et al. 1995a, Kruse et al. 1995b) exprimieren, zeichnen sich unter Gewächshausbedingungen (16 h ca. 400 µE m^-2 s^-1, ca. 25°C) durch einen nekrotischen Phänotyp aus ( Abb. 6 , Abb. 7 ). Bereits frisch pikierte Pflanzen weisen Blattgewebe auf, das schnell austrocknet und nachfolgend in Form von gelbbraunen Läsionen bestehen bleibt. Nur die jeweils jüngsten Blätter sind WT-artig. Dabei unterscheiden sich die UROD- von den CPO-AS-Pflanzen durch die Form der Nekrosen: Während diese an den UROD-AS-Pflanzen eher großflächige Bereiche toten Gewebes innerhalb der Intercostalfelder ausmachen ( Abb. 6 B), zeigen CPO-AS-Pflanzen hingegen netzartig auftretende Nekrosen, die sich entlang der Leitgefäße entwickeln ( Abb. 7 ). Wegen des unterschiedlichen Wassergehaltes in totem, gerade austrocknendem und grünem Gewebe kommt es zu Spannungen innerhalb des Blattes, die zu Verformungen der Blattoberfläche führen.

Abb. 6 Phänotyp transgener Pflanzen, die Antisense-RNA für UROD exprimieren. A Acht Wochen alte Primärtransformanten der Linie 35/2 (links) und 35/12 (Mitte) im Vergleich mit WT (rechts). B Aufsicht auf die Primärtransformante 35/2. C Wurzeln der in A gezeigten Pflanzen. D Nachkommen der F₁-Generation der Primärtransformante 35/2 nach acht Wochen Wachstum auf Erde. (Abb. entnommen aus Mock und Grimm 1997)

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Im Vergleich der transgenen Linien fallen deutliche Unterschiede beim Grad der Schädigung auf. Unter den Primärtransformanten fanden sich sowohl Pflanzen, die nicht vom WT zu unterscheiden waren als auch Individuen, die aufgrund der extremen Schäden die Reife nicht erreichten und daher keinen Samen produzierten. Mit dem Grad der Ausprägung von Läsionen an den Blättern geht auch ein genereller Entwicklungsrückstand im Vergleich zum WT oder phänotypisch gering betroffenen Pflanzen einher, was auch für das Wurzelsystem gilt ( Abb. 6 C). Der nekrotische Phänotyp wird auf die folgenden Generationen vererbt, wobei unter den kanamycin-resistenten Nachkommen eine Aufspaltung in Individuen mit schwächerer oder stärkerer Ausprägung des Phänotyps zu beobachten ist ( Abb. 6 D). Für die hier vorgestellten Analysen dienten F₂-Nachkommen vor allem der UROD-AS-Linie 35/2 bzw. der CPO-AS-Linie 1/3 und 1/41 als Untersuchungsobjekt. Diese heterozygoten Linien zeichnen sich durch eine hohe Konstanz des Phänotyps aus, der im Vergleich mit den beobachteten Extrema als intermediär zu bezeichnen ist.

Abb. 7 Phänotyp von transgenen Tabakpflanzen, die Antisense-RNA für CPO exprimieren. Links: Aufsicht auf einen Nachkommen der F₂-Generation der Linie 1/41. Rechts: Detailansicht eines Blattes eines anderen Nachkommens der gleichen Linie. Die Pflanzen wurden für 8 Wochen auf Erde unter kontrollierten Umweltbedingungen kultiviert, welche die Ausbildung von Nekrosen fördern (25°C, 16 h: 200 µE m^-2 s^-1).

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6.1.2 Molekulare Ursachen für den nekrotischen Phänotyp

Sowohl für CPO-AS- als auch für UROD-AS-Pflanzen konnte gezeigt werden, daß die Expression der Antisense-RNA zur starken Reduktion an translatierbarer RNA in Sense-Orientierung und daraus resultierend zur verringerten Akkumulation des jeweiligen Zielenzyms führte. Damit einher ging eine deutliche Erniedrigung der meßbaren Enzymaktivität. In den jüngsten sechs Blättern der CPO-AS-Linie 1/3 konnten noch 29 % (bezogen auf Proteingehalt) bzw. 40 % Restaktivität (bezogen auf Chlorophyllgehalt) im Vergleich zum WT ermittelt werden ( Kruse et al. 1995b). In der UROD-AS-Linie 35/2 waren in diesem Enwicklungszustand der Blätter noch ca. 60 % der WT-Aktivität nachweisbar ( Mock und Grimm 1997).

Die Verringerung der Aktivität dieser Enzyme der Tetrapyrrolbiosynthese hat keine weitreichenden Konsequenzen für den Gehalt an Endprodukten des Stoffwechselweges wie Chlorophyll und Häm. In der CPO-AS-Linie 1/3 betrug die maximale Reduktion in der Chlorophyllkonzentration ca. 20 % im Vergleich zum WT, und der Hämgehalt war in diesen Pflanzen eher erhöht als erniedrigt ( Kruse et al. 1995b). Auch in den UROD-AS-Pflanzen kommt es weder zu einer schwerwiegenden Abnahme im Chlorophyll- noch im Hämgehalt (jeweils max. 10-15 %, Mock und Grimm 1997). Das Verhältnis von Chlorophyll a zu b ist in allen Fällen unverändert.

Die Ursache für den nekrotischen Phänotyp wird vielmehr in der sowohl Blätter als auch Wurzeln betreffenden massiven Akkumulation und Autoxidation des jeweiligen Substrates der Enzyme gesehen. So kommt es in der CPO-AS-Linie 1/3 zur vielhundertfachen Akkumulation von Coproporphyrin(ogen) I und III, zwei Intermediaten der Tetrapyrrolsynthese, die im WT nur in Spuren nachzuweisen sind (Kruse et al. 1995b). In den UROD-AS-Pflanzen beobachtet man folgerichtig die massive Anhäufung von Uroporphyrin(ogen) III, wobei auch hier die stärkste Akkumulation (ca. 300x) in den jüngsten Blättern eintritt. Da aus technischen Gründen die Extrakte oxidiert werden müssen, damit ein fluorimetrischer Nachweis möglich ist (s. - ), kann auf diese Weise nicht zwischen den reduzierten (Porphyrinogene) und den oxidierten Formen (Porphyrine) unterschieden werden.

Porphyrine wirken photosensibilisierend ( Salin 1987; s. - ) und führen bei ihrer Akkumulation in vielen experimentellen Systemen zur massenhaften Generierung von ROS, zur Zellschädigung und letztendlich zum Zelltod, der in Form von Nekrosen sichtbar wird (s. - ). Nachdem in ersten Untersuchungen sowohl in den UROD- als auch in den CPO-AS-Pflanzen deutliche Hinweise auf oxidativen Streß und eine Aktivierung der antioxidativen Schutzsysteme erhalten worden waren ( Keetman 1995, Kruse et al. 1995b), sollten diese Befunde mit der vorliegenden Arbeit bestätigt und die Analysen vertieft werden. Wesentliche Ergebnisse dieser Untersuchung wurden bereits veröffentlicht ( Mock et al. 1998, Mock et al. 2000) und sollen an

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6.1.3 Oxidativer Streß und antioxidatives Schutzsystem in UROD- und CPO-AS-Pflanzen

6.1.3.1 Aktivierung des antioxidativen Schutzsystems infolge von photooxidativem Streß

6.1.3.1.1 Aktivitätsanstieg der SOD

Die SOD katalysiert die Dismutation von Superoxid, welches vor allem unter Streß vermehrt gebildet wird (s. S.12#LINKCONTENT#11#/LINKCONTENT#, Abb. 1 ). Dabei entsteht neben O₂ das ebenfalls gefährliche H₂O₂. Nachdem schon durch Kruse et al. (1995b) gezeigt werden konnte, daß in CPO-AS-Pflanzen die Gesamtaktivität der SOD im Vergleich zum WT 80 % höher war, lag es nahe, die Aktivität der einzelnen Isoformen durch nicht-denaturierende PAGE und anschließende Färbung der Gele genauer zu analysieren. SOD-Banden bleiben hell, und die Gele können anschließend densitometrisch ausgewertet werden (s. - ).

Abb. 8 Aktivitätsanalyse der SOD-Isoformen in Blättern von WT und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Proteinextrakte wurden durch nicht-denaturierende PAGE aufgetrennt und SOD-Aktivität anschließend durch Anfärben der Gele nachgewiesen (s. - ). Die Quantifizierung der Banden mit SOD-Isoformaktivität mit Hilfe eines automatischen Bildauswertesystems wurde für n=9 Gele mit Extrakten aus drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (SD < 10%). Die ermittelte SOD-Aktivität ist in rel. Einheiten angegeben. mt. = mitochondriale; pl. = plastidäre, cyt. = cytosolische Isoform (modifiziert nach Mock et al. 1998).

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6.1.3.1.2 Aktivierung der meisten Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus

Die enzymatische Kette des Ascorbat-Glutathion-Zyklus übernimmt in Pflanzen in jenen Kompartimenten, in denen H₂O₂ durch Catalase nicht wirksam entgiftet werden kann, den überwiegenden Teil dieser essentiellen Aufgabe (s. - ).

Im ersten Schritt wird durch die Ascorbat-Peroxidase (APX) H₂O₂ unter Verbrauch von Ascorbat zu Wasser umgesetzt (s. S.12#LINKCONTENT#11#/LINKCONTENT#, Abb. 1 ). Auch aufgrund der erhöhten SOD-Aktivität war im untersuchten Blattgewebe von UROD- und CPO-AS-Pflanzen mit einer höheren Rate von H₂O₂-Bildung zu rechnen. Tatsächlich lag die gemessene Aktivität der löslichen APX-Isoformen in allen untersuchten Blättern der porphyrischen Pflanzen höher als in denen des WT ( Abb. 9 ). Im Gegensatz zur SOD beobachtete man hier allerdings besonders in den Blättern 7 und 9 einen zwei- bis dreifachen Aktivitätsanstieg, d.h. also in den stärker nekrotischen Blättern, in denen sich die SOD-Aktivität vor allem in den Plastiden schon wieder dem WT-Niveau annäherte (s. Abb. 8 ).

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Abb. 9 Vergleich der Aktivität von löslichen Isoformen der Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus APX, MDAR, DHAR und GR zwischen WT und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet.

Der Anstieg der APX-Aktivität und der damit verbundene höhere Verbrauch an reduziertem Ascorbat wurde durch eine Aktivierung des ascorbat-regenerierenden Enzyms Monodehydroascorbat-Reduktase (MDAR) begleitet ( Abb. 9 ). In der durch die MDAR katalysierten Reaktion wird aus dem Monodehydroascorbat-Radikal unter Verbrauch von NAD(P)H wieder Ascorbat gebildet, das dann für einen neuen Kreislauf zur Verfügung steht
(s. S.12#LINKCONTENT#11#/LINKCONTENT#, Abb. 1 ). Mit 160 % im Vergleich zum WT wurde auch hier der größte Anstieg in der Aktivität im Blatt 9 beobachtet, während in den anderen untersuchten Blättern mit ca. 30% eine geringere Aktivitätszunahme zu verzeichnen war. Dieses Ergebnis korreliert sehr gut mit dem ebenfalls im Blatt 9 gemessenen Maximum an APX-Aktivität.

Wird das Monodehydroascorbat-Radikal (MDA) nicht hinreichend schnell durch die MDAR recycelt, entsteht in einer spontanen Disproportionierung Didehydroascorbat (DHA) und Ascorbat (ASA). Aus DHA kann unter Verbrauch von GSH in der Didehydroascorbat-Reduktase (DHAR)-Reaktion ebenfalls ASA regeneriert werden (s. S. 12#LINKCONTENT#11#/LINKCONTENT#, Abb. 1 ). Man könnte schlußfolgern, daß die Aktivität dieses Enzyms den Fluß durch den Reaktionskreislauf nicht limitiert, da in allen untersuchten Blättern der porphyrischen Pflanzen eine um ca. 15% geringere Aktivität im Vergleich zum WT festgestellt wurde ( Abb. 9 ). Eine andere

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Der letzte Schritt in der Ascorbat-regenerierenden Reaktionskette wird durch die Glutathion-Reduktase (GR) katalysiert (s. S.12#LINKCONTENT#11#/LINKCONTENT#, Abb. 1 ). Auch hier konnte ein Aktivitätsanstieg vor allem in den älteren Blättern der tetrapyrrol-akkumulierenden Pflanzen festgestellt werden ( Abb. 9 ). Alle den Ascorbat-Glutathion-Zyklus betreffenden Daten, die hier für UROD-AS-Pflanzen dargestellt wurden, gelten grundsätzlich auch für die untersuchten CPO-AS-Linien.

Abb. 10 Aktivität der Catalase in Blättern von WT- und UROD-AS-Pflanzen der Linie 35/2. Die Ergebnisse für Enzymextrakte aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet. (modifiziert nach Mock et al. 1998)

Im Gegensatz zum bisher, mit Ausnahme der DHAR, beschriebenen Anstieg der Aktivität von antioxidativen Schutzenzymen wurde für die Catalase (CAT) ein Aktivitätsverlust im Vergleich zum WT festgestellt. Während die Aktivität in den älteren WT-Blättern anstieg, blieb sie in den UROD-AS- bzw. CPO-AS-Pflanzen (Daten nicht gezeigt) mit fortschreitender Entwicklung und auf Proteingehalt bezogen relativ konstant ( Abb. 10 ).

6.1.3.1.3 Anstieg der Transkript- und Proteinakkumulation antioxidativer Schutzenzyme

Das antioxidative Schutzsystem der Pflanzen wird durch tetrapyrrol-induzierten oxidativen Streß nicht nur auf Aktivitäts- sondern auch auf den anderen Expressionsebenen beeinflußt. So kommt es zur Akkumulation von Transkripten fast aller untersuchter Isoformen der SOD und CAT sowohl in CPO- als auch in UROD-AS-Pflanzen ( Abb. 11 ). Während im WT die mRNA

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Abb. 11 Northern Blot-Analyse der RNA-Gehalte ausgewählter antioxidativer Schutzenzyme in unterschiedlich alten Blättern des WT, von UROD-AS 35/2 und CPO-AS 1/3. Gleiche Mengen von RNA (10 µg) wurden in formaldehydhaltigen Agararosegelen separiert und anschließend auf Nylonmembranen überführt. Diese wurden mit spezifischen Sonden für mitochondriale Mn-SOD (MnSOD), plastidäre Fe-SOD (FeSOD), cytosolische (cyt.) und plastidäre (pl.) Cu/Zn-SOD sowie für drei Isoformen der Catalase (CAT1-3) und Glutathion-Peroxidase (GPX) hybridisiert. Ein representatives Autoradiographie-Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt. Die Sonden wurden freundlicherweise von H. Willekens (Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt. Die Abb. ist der Veröffentlichung von Mock et al. (1998) entnommen.

Anders ist die Situation für die Catalase: Auch hier beobachtete man eine Akkumulation von CAT1- bzw. CAT2-Transkript vor allem in den älteren untersuchten Blättern ( Abb. 11 ), während die extrahierbare Aktivität des Enzyms in diesen Blättern niedriger war als im WT ( Abb. 10 ). Die Kombination beider Indizien spricht für einen beschleunigten Umsatz an Catalaseprotein, wobei der erhöhte Bedarf trotz der beobachteten Transkriptakkumulation offensichtlich nicht gedeckt werden kann.

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Der drastische Anstieg der mRNA-Akkumulation für die Glutathion-Peroxidase (GPX,
Abb. 11 ), die höchstwahrscheinlich eine Substratspezifität für Phospholipidhydroperoxide besitzt ( Willekens et al. 1994), weist auf einen akuten Bedarf zur Entgiftung solcher reaktiven Substanzen und damit auf tetrapyrrol-induzierte Membranschädigung hin (s. S. 10#LINKCONTENT#10#/LINKCONTENT#, - ). Im Gegensatz zum WT blieb das Transkript-Niveau in den porphyrischen Pflanzen über den gesamten betrachteten Blattentwicklungszeitraum hinweg sehr hoch.

Die deutlich erhöhte Aktivität der löslichen APX-Isoformen (s. - , Abb. 9 ) wurde nicht durch eine erhöhte Akkumulation der entsprechenden mRNA begleitet (Daten nicht gezeigt). Allerdings zeigen Western Blots für die cytosolische APX, daß der hohen Aktivität in den porphyrischen Pflanzen auch eine vergrößerte Menge an APX-Protein zugrunde liegt ( Abb. 12 ).

Abb. 12 Western Blot-Analyse von Blattextrakten des WT (SNN) und von porphyrischen Pflanzen der Linien UROD-AS 35/2 (URODAS) sowie CPO-AS 1/3 (CPOAS). Gleiche Mengen an Protein (10 µg) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Der zum Anfärben der APX verwendete monoklonale Antikörper, der gegen cytosolische APX aus Spinat erzeugt wurde, war freundlicherweise durch H. Saji (Onagawa, Japan) zur Verfügung gestellt worden. (Abb. entnommen aus Mock et al. 1998)

6.1.3.1.4 Verringerte Reduktionskapazität der niedermolekularen Antioxidantien

Bereits durch Kruse et al. (1995b) konnte gezeigt werden, daß sich oxidativer Streß in CPO-AS-Pflanzen u.a. durch stark erniedrigte Gehalte an -Tocopherol widerspiegelt; ein Befund der in Richtung eines deutlich erhöhten und unbefriedigten Bedarfs an Membran-Schutzpotential interpretiert wurde (s. - ). Besonders in jüngeren Blättern der porphyrischen Pflanzen trat ein dramatisches Defizit an verfügbarem Tocopherol zu Tage (nur 25% der WT-Menge in
Blatt 4), welches im Lauf der weiteren Blattentwicklung eine der Ursachen für die aufkommenden Läsionen zu sein scheint ( Kruse et al. 1995b). Auch für die UROD-AS-Pflanzen konnte ein Mangel an Tocopherol bestätigt werden, der hier allerdings erst in älteren Blättern auftritt, wo z.B. im Blatt 11 weniger als 10% des aus dem vergleichbaren WT-Blatt

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Abb. 13 Vergleich des Tocopherolgehalts zwischen WT und UROD-AS Linie 35/2. Tocopherol wurde mittels HPLC quantifiziert (s. - ), und Mittelwerte aus den Ergebnissen dreier unabhängiger Experimente wurden berechnet (SD < 10%) (H.-P. Mock, unveröffentlichte Daten).

Trotz der moderat erhöhten Kapazität des ASA-regenerierenden Zyklus (s. - ) ist vermutlich der vielfach vergrößerte Bedarf an ASA (u.a. für die verstärkte APX-Reaktion) Ursache für den im Vergleich zum WT verringerten Gesamtgehalt an reduziertem und oxidiertem Ascorbat und das absinkende Redoxverhältnis von reduziertem zu Gesamt-Ascorbat ( Abb. 14 ). So standen im Blatt 5 nur 60% und im Blatt 11 der UROD-AS-Pflanzen nur ca. 50% des in WT-Pflanzen verfügbaren ASA bereit. Diese Daten weisen vor dem Hintergrund von erhöhten Enzymaktivitäten des Ascorbat-Glutathion-Systems deutlich auf einen vergrößerten Umsatz an Antioxidantien und damit auf oxidativen Streß hin.

Die photometrisch (s. - ) ermittelten Verluste an Gesamt-Glutathion in den UROD-AS-Pflanzen im Vergleich zum WT waren weniger stark ausgeprägt als die für Ascorbat ( Abb. 14 ). Auch gab es keine Unterschiede im Redoxverhältnis, welches über den untersuchten Entwicklungszeitraum hinweg auf höchstem Niveau bemerkenswert konstant blieb. Der aus einer leicht erhöhten GR-Aktivität (s. - ) resultierende gesteigerte Bedarf an GSH zeigte hier offenbar nur geringe Auswirkungen.

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Abb. 14 Links: Reduziertes (oben) und Gesamtascorbat (Mitte) sowie daraus berechnetes Redoxverhältnis (unten) im Vergleich zwischen Blättern von WT und UROD-AS 35/2. Rechts: Gesamt-Glutathion-Gehalt (oben) und Redoxverhältnis (unten) der gleichen Blattproben, aus denen auch Ascorbat bestimmt wurde. Weil praktisch 100% des Glutathions in der reduzierten Form vorliegen, wurde auf eine entsprechende Teilgrafik verzichtet. Glutathion wurde in diesen Experimenten in einem photometrischen Test (und nicht mittels HPLC; s. - , Smith et al. 1984) gemessen, und Mittelwert sowie Standardabweichung von drei unabhängigen Versuchen wurden berechnet.

6.1.3.1.5 Verstärkte Lipidperoxidation als Anzeichen für Membranschädigung

Die Menge an thiobarbitursäurereaktiven Substanzen (TBA-RS) gilt als Indikator für das Ausmaß an Membranschädigung infolge von Lipidperoxidation (s. - ). In der Tat wiesen die Blätter 7 und 9 der UROD-AS-Pflanzen 50% mehr an TBA-RS auf als vergleichbare WT-Blätter ( Abb. 15 ). Auch in den anderen untersuchten Blättern wurden erhöhte TBA-RS-Gehalte ermittelt. Diese Befunde treffen gleichfalls auf die CPO-AS-Pflanzen zu (Daten nicht gezeigt). Das Ergebnis dieser Analyse wird indirekt durch die Induktion der GPX-Expression unterstützt (s. - ), was ebenfalls auf massiven oxidativen Streß innerhalb oder im Umfeld von Membranen hindeutet.

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Abb. 15 Vergleich der Gehalte an thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBA-RS) als Indikator für Lipidperoxidation in WT und UROD-AS Linie 35/2. Mittelwerte und Standardabweichungen für drei unabhängige Experimente sind gezeigt.

6.1.4 Physiologische Auswirkungen von tetrapyrrol-induziertem oxidativen Streß auf die CO₂-Assimilation

Werden Reduktionsäquivalente in verstärktem Maß für die Regenerierung des antioxidativen Schutzsystems benötigt (s. - ), sollte ein geringerer Anteil für die Fixierung von CO₂ zur Verfügung stehen. Diese Annahme wurde in Gaswechselmessungen überprüft.

6.1.4.1 CO₂-Assimilationsraten in Abhängigkeit der photosynthetisch aktiven Strahlung (Lichtkurven)

Bei ambienter CO₂-Konzentration trat tatsächlich bereits bei relativ niedrigen Lichtintensitäten (ca. 400 µE m^-2 s^-1 PAR) eine deutliche Limitierung in der Assimilationsrate bei CPO- und UROD-AS-Pflanzen auf ( Abb. 16 ). Die Sättigung lag im unter gleichen Bedingungen
(300 µE m^-2 s^-1 PAR) kultivierten WT bei bedeutend höheren Quantenflußraten und trat erst bei ca. 1500 µE m^-2 s^-1 PAR ein. Die Messungen erfolgten an ausgewachsenen Blättern, bei denen an den porphyrischen Pflanzen ein nicht unerheblicher Teil der Blattfläche durch Nekrosen eingenommen wurde. Bezieht man die CO₂-Fixierungsraten hingegen auf den Chlorophyllgehalt der Blätter, relativieren sich die gemessenen Unterschiede zwischen WT- und tetrapyrrol-akkumulierenden Pflanzen ( Abb. 16 ).

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Abb. 16 Nettoassimilationsrate im Blatt 10 von WT- und porphyrischen Pflanzen der Linien CPO-AS 1/3 und UROD-AS 35/2 bei einer externen CO₂-Konzentration von 400 ppm in Abhängigkeit der eingestrahlten photosynthetisch aktiven Strahlung (PAR). Die Nettoassimilationsraten bei diesen ambienten CO₂-Bedingungen wurden sowohl auf Blattfläche (oben) als auch auf den Chlorophyllgehalt der Blätter bezogen (unten). Die Mittelwerte aus den Messungen an jeweils 5 Pflanzen sind gezeigt.

6.1.4.2 Nettoassimilation in Abhängigkeit von der CO₂-Konzentration (A-c_i-Kurven)

Durch die Variation der CO₂-Konzentration wurde versucht, eindeutige Unterschiede in der Assimilationsrate zwischen WT und den porphyrischen Pflanzen sichtbar zu machen ( Abb. 17 ). Zusätzlich wurde die Gaswechselrate sowohl bei 300 µE m^-2 s^-1 PAR (der Lichtintensität im Anzuchtraum) als auch bei 2000 µE m^-2 s^-1 PAR gemessen, um sowohl ambiente als auch maximal erreichbare Assimilationsraten der Pflanzen untereinander vergleichen zu können.

Bei diesen Messungen wurden große Differenzen zwischen Blättern mit unterschiedlich schweren Läsionen festgestellt: Blätter mit sehr stark ausgeprägten Nekrosen (UROD-AS in Abb. 17 A und B) erreichten auch nach Berechnung der Assimilationsrate auf Chlorophyllgehalt bei 300 µE m^-2 s^-1 PAR bei keiner CO₂-Konzentration die Raten von porphyrischen Pflanzen mit schwächer ausgeprägten Läsionen (CPO-AS in Abb. 17 A und B) bzw. vom WT. Mäßig nekrotische Pflanzen hingegen zeigten wiederum stark verminderte CO₂-Fixierungsraten unter Maximal-Photosynthese-Bedingungen (2000 µE m^-2 s^-1 PAR und Hoch-CO₂) im Vergleich zum WT, wenn auf Blattfläche bezogen wurde ( Abb. 17 C). Erfolgte die Berechnung auf Basis des Chlorophyllgehaltes, nivellierten sich diese Unterschiede ( Abb. 17 D).

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Abb. 17 Nettoassimilationsraten von Blättern des WT und der porphyrischen Linien CPO-AS 1/3 und UROD-AS 35/2 in Abhängigkeit von der internen CO₂-Konzentration (A-c_i-Kurven). Die Gaswechselmessungen wurden sowohl bei der Lichtintensität durchgeführt, an welche die Pflanzen seit Wochen adaptiert waren (A, B; 300 µE m^-2 s^-1), als auch bei 2000 µE m^-2 s^-1, (C, D), um photosynthetische Maximalraten zu bestimmen. Die Raten wurden auf Blattfläche (A, C) bzw. auf Chlorophyllgehalt der Blätter (B, D) bezogen. Gezeigt sind repräsentative, gemittelte Gaswechseldaten des jeweils 10. Blattes ausgewählter Pflanzen, die sowohl schwächer (UROD-AS in C und D sowie CPO-AS in A-D) als auch stärker ausgeprägte (UROD-AS 35/2 in A und B) Nekrosen aufwiesen.

Zusammengefaßt implizieren die Ergebnisse dieser Gaswechselanalysen eine fast vollständige photosynthetische Intaktheit der nicht-nekrotischen Bereiche, obwohl auch hier durch photosensibilisierende Prozesse oxidativer Streß ausgelöst werden sollte. In den untersuchten, ausgewachsenen Blättern läßt sich aber wegen der nur noch basalen Rate an Tetrapyrrolbiosynthese auf ein vergleichsweise niedriges Niveau der Porphyrinanhäufung schließen.

6.1.5 Aktivierung von pathogenese-assoziierten Prozessen in porphyrischen Pflanzen

Zusätzlich zu den bisher dargelegten Anzeichen für eine deutliche Aktivierung der antioxidativen Schutzsysteme in deren Zuge es wahrscheinlich zu einer Limitierung an niedermolekularen Antioxidantien kommt (s. - ), wurde in den tetrapyrrol-akkumulierenden Pflanzen auch die Induktion von Pathogenabwehr-Programmen beobachtet ( Mock et al. 1999). Dazu zählen sowohl die verstärkte Bildung und Anhäufung von PR-

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6.2 Untersuchungen an porphyrischen Pflanzen, in denen der nekrotische Phänotyp durch die Veränderung von Umweltbedingungen induziert wird

Neben der Analyse der antioxidativen Schutzsysteme von porphyrischen Pflanzen mit bereits vollständig ausgeprägtem nekrotischen Phänotyp stand die Untersuchung von Prozessen während der Ausbildung von Blattläsionen im Vordergrund dieser Dissertation. Dafür wurde die Abhängigkeit der Nekrosenformation von den Umweltbedingungen ausgenutzt.

6.2.1 Umweltabhänigkeit der Ausbildung von Blattläsionen

6.2.1.1 Abhängigkeit der Bildung von Nekrosen von der Lichtmenge - das Lichtshift-Experiment

Werden UROD- und CPO-AS-Pflanzen unter Bedingungen kultiviert, in denen sie einer relativ geringen Lichtmenge ausgesetzt sind, sind sie phänotypisch praktisch nicht vom WT zu unterscheiden ( Abb. 18 ). Dabei spielt es grundsätzlich keine Rolle, ob diese Lichtmenge innerhalb kurzer Zeit mit hohen Lichtintensitäten oder aber über eine längere Photoperiode mit einer niedrigen Quantenflußrate aufgebracht wird. Als nekrose-unterdrückende Bedingungen haben sich 200 µE m^-2 s^-1 über eine Photoperiode von 6 h bewährt. Wahrscheinlich aufgrund der besseren genetischen Homogenität läßt sich unter diesen Bedingungen in den Nachkommen der CPO-AS-Linie 1/41 besonders sicher die Formation von Nekrosen verhindern, weswegen diese Pflanzen bevorzugt in den im Folgenden dargestellten Analysen eingesetzt wurden. Allerdings weist auch ein großer Prozentsatz der Pflanzen der UROD-AS-Linien 35/2 und 35/12 diese

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Durch die Erhöhung der eingestrahlten Lichtmenge, was entweder durch die Verlängerung der Lichtperiode bei gleicher -intensität oder aber durch Erhöhung der Quantenflußrate bei unveränderter Photoperiode erfolgen kann, kommt es zur rapiden Ausbildung von Blattläsionen. Wird z.B. die Photoperiode von 6 auf 16 h bei gleicher Lichtintensität (200 µE m^-2 s^-1) verlängert, beobachtet man innerhalb der nächsten 24-48 h die Formation von Nekrosen an den porphyrischen Pflanzen, wohingegen WT-Pflanzen keinerlei Schaden nehmen ( Abb. 18 ).

Abb. 18 Lichtshift-Experiment (s. auch - ). WT- (SNN), CPO-AS- (Linie 1/41) und UROD-AS-Pflanzen (Linie 35/2) wurden für 8 Wochen bei 200 µE m^-2 s^-1 und einer Photoperiode von 6 h angezogen (oben). Die Photoperiode wurde anschließend auf 16 h verlängert (unten), was innerhalb von 24-48 h zur Ausbildung von Blattnekrosen an den transgenen, porphyrischen Pflanzen führt. Das jeweils 6. Blatt von repräsentativen Pflanzen ist gezeigt. Werden porphyrische Pflanzen in den Kurztag zurückgeführt, stoppt die Nekrosenbildung beim erreichten Stand.

Auch unter Kurztagbedingungen kommt es wegen des Antisense-Effektes in den transgenen Pflanzen während der Lichtphase zur Akkumulation von photosensitiven Porphyrin(ogen)en. Die Konzentration sinkt aber bereits in den ersten zwei Stunden der anschließenden Dunkelphase vermutlich wegen der relativ raschen Umwandlung in ungefährliche(re) Folgeprodukte wieder auf WT-Niveau ab (Hans-Peter Mock, persönliche Information). Wahrscheinlich gibt es daher einen bestimmten sub-toxischen Schwellenwert der Gleichgewichts („steady state“)-Konzentration der photosensibilisierenden Intermediate, der

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Bei zuvor mit 6h Licht pro Tag angezogenen UROD- und CPO-AS-Pflanzen, die anschließend in einem modifizierten Lichtshift-Experiment im Tagesgang dreimal dem Wechsel von 6h Licht und 2h Dunkel ausgesetzt sind, entwickelt sich ein sehr viel schwächerer nekrotischer Phänotyp als bei Pflanzen, welche einem 18h Licht/6h Dunkelrhythmus exponiert werden (Hans-Peter Mock, persönliche Mitteilung).

Werden porphyrische Pflanzen zu einem beliebigen Zeitpunkt während eines normalen Lichtshift-Experiments aus Langtag- (16h Licht) in Kurztagbedingungen zurückgeführt
(6h Licht), stoppt die bis dahin eingetretene Nekrosenformation im erreichten Stadium (Daten nicht gezeigt). Auch beobachtet man keine systemische Ausbreitung der Nekrosen in Gewebe hinein, die nicht der vergrößerten Lichtmenge ausgesetzt sind. Werden Blatthälften z.B. mit Aluminiumfolie abgedeckt, kommt es nur in den lichtexponierten Teilen zur Ausbildung der Läsionen. Die geschützten Blatthälften hingegen bleiben WT-artig ( Abb. 19 ).

Abb. 19 Lichtshift-Experiment mit teilweise durch Aluminiumfolie abgedeckten Blättern. A) Vor der Vergrößerung der Lichtperiode von 6 h auf 16 h bei 200 µE m^-2 s^-1 wurden Blätter der WT- (links) und der porphyrischen Pflanzen der Linie CPO-AS 1/41 (rechts) jeweils zur Hälfte abgedeckt und erst nach 3 Tagen erhöhter Lichdosis zum Fotografieren wieder freigelegt. B) Detailansicht von Blättern der Pflanzen aus (A) nach Entfernen der Abdeckung. Die lichtexponierten Blatthälften sind dunkler und weisen im Falle der CPO-AS-Pflanze (rechts) Nekrosen auf.

Trotz der Einschränkung, daß auch schon unter Bedingungen mit geringer Lichtdosis mit

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6.2.1.2 Verstärkung der Lichtabhängigkeit der Nekrosenbildung durch erhöhte Temperaturen

Werden porphyrische Tabakpflanzen unter erhöhten Temperaturen angezogen (32°C), kommt es auch unter Schwachlichtbedingungen zum verstärkten Auftreten von Blattläsionen. Wird zusätzlich die eingestrahlte Lichtmenge vergrößert (Lichtshift-Experiment bei 32°C) beobachtet man die im Vergleich zum Standard-Lichtshift bei 25°C extrem beschleunigte und in ihren Auswirkungen sehr viel massivere Formation von Nekrosen („super-nekrotischer Phänotyp“, Abb. 20 ). Sehr wahrscheinlich ist die bei 32°C erhöhte chemische Reaktivität der Porphyrine die Ursache für dieses Phänomen.

Abb. 20 Lichtshift-Experiment bei erhöhter Temperatur. WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 wurden für 7 Wochen bei 25°C und 6 h 200 µE m^-2 s^-1 angezogen und die Temperatur daraufhin für 1 Woche auf 32°C erhöht. Unter dem Einfluß der erhöhten Temperatur bildet sich im Lichtshift-Experiment (16 h 200 µE m^-2 s^-1) innerhalb von 2-3 Tagen ein sehr viel massiverer („super“)nekrotischer Phänotyp der CPO-AS-Pflanzen heraus, während an den WT-Pflanzen keine Veränderungen beobachtet werden (nicht gezeigt).

6.2.1.3 Strikte Abhängigkeit der Bildung von Blattläsionen in porphyrischen Pflanzen vom Sauerstoffpartialdruck

In einem weiteren Experiment wurde überprüft, ob Sauerstoff für die Formation von Nekrosen unabdingbar ist (s. - ). Wenn, wie vermutet, vor allem die massive, durch

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Abb. 21 Lichtshift-Experiment mit WT-Pflanzen (links) und Pflanzen der CPO-AS Linie 1/41 (rechts) unter niedrigem O₂-Partialdruck. A) Blatt 6 nach 8 Wochen Anzucht in der Klimakammer (6 h: 200 µE m^-2 s^-1; 21% O₂); B) Lichtshift: nach einer weiteren Woche unter geänderten Lichtbedingungen (16 h: 200 µE m^-2 s^-1) und erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck (< 1%) bzw. C) Lichtshift unter normoxischen Bedingungen (16 h: 200 µE m^-2 s^-1; 21% O₂). Deutlich ist die Ausbildung von Nekrosen am porphyrischen Blatt bei 21% O₂ zu erkennen (C), während diese bei Niedrigsauerstoffbedingungen ausbleibt (B).

6.2.2 Identifizierung von frühzeitig induzierten Genen als Reaktion auf photodynamisch erzeugten oxidativen Streß durch Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH)

Da das Entstehen von nekrotischem Gewebe an den porphyrischen UROD- bzw. CPO-AS-Pflanzen durch einfache Manipulation der eingestrahlten Lichtmenge gesteuert werden kann, bot sich dieses experimentelle System zur Identifizierung von frühzeitig induzierten Genen als Reaktion auf photodynamisch erzeugten oxidativen Streß an.

Nachdem mehrere erfolglose Versuche unternommen worden waren, eine subtrahierte cDNA-Bank mit Hilfe von an Latexkügelchen (Oligotex, Qiagen, Hilden) gebundenen Driver-cDNA- und in flüssiger Phase befindlichen Tester-cDNA-Einzelsträngen zu konstruieren ( Hara et al. 1991), wurde dieser Ansatz zugunsten der Subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH) aufgegeben ( Diatchenko et al. 1996, 1998 , 1999 ; s. - , - ). Die SSH erwies sich als effiziente Methode, um Expressionsunterschiede zwischen Pflanzen der CPO-AS-Linie 1/41 und dem WT ausfindig zu machen, welche als Folge einer vergrößerten Lichtmenge resultierten.

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6.2.2.1 Daten zur Effizienz der Subtraktion mittels SSH

6.2.2.1.1 Allgemeine Angaben zur Größe der differentiellen cDNA-Bank

Für die Erzeugung der subtrahierten cDNA-Bank wurde der PCR Select-Kit der Fa. Clontech verwendet, der auf der SSH-Technik beruht (s. - ). Dabei wurde die aus dem WT gewonnene cDNA als Driver genutzt, d. h. von der Tester-cDNA aus den Blättern der CPO-AS-Linie 1/41 abgezogen („vorwärts subtrahiert“, forward subtracted, FS). Im umgekehrten Versuch, der zur Erzeugung von „reverse subtrahierten (RS) Sonden diente, wurden Driver und Tester miteinander vertauscht (s. - ). In der FS-cDNA sollten also solche Vertreter angereichert sein, die spezifisch für diesen frühen Zeitpunkt von photodynamisch ausgelöstem oxidativen Streß sind, welcher wenig später zu Zelltodereignissen führt.

Die durch PCR amplifizierte und in den pCRII-Vektor ligierte FS-cDNA wurde in zwei Aliquots geteilt (Ansatz I und II) und durch Hitzeschock (Ansatz I) bzw. Elektroporation
(Ansatz II) in entsprechend präparierte E. coli-Zellen transformiert ( Tab. 9 ).

Die resultierenden 812 insertenthaltenden Kolonien aus Ansatz I wurden über Kolonie-PCR und anschließender Hybridisierung der „Reversen Northern Blots“ mit FS- und RS-Sonden auf wirkliche differentielle Expression getestet, wobei 81 Klone identifiziert wurden. Die 1181 Kolonien aus Ansatz II wurden hingegen direkt einer Koloniehybridisierung mit FS- und RS-Sonden unterworfen, einem Verfahren, in dem weitere 153 Klone identifiziert werden konnten (s. - ). Insgesamt enthielten also 234 aus 1993 E.coli-Kolonien Plasmide mit differentiell exprimierten cDNA-Inserts, was einem Anteil von 11,7 % entspricht ( Tab. 9 ).

6.2.2.1.2 Angaben zur Redundanz von cDNA-Klonen

Um die in Ansatz I sehr redundant auftretenden Klone des Gly-reichen Proteins (GRP) und des Salicylsäure-responsiven Proteins 8.2 („salicylic acid responsive; SAR8.2) in den 153 Klonen aus Ansatz II für die weitere Analyse auszuschließen, wurden die Koloniefilter mit Sonden für GRP bzw. SAR 8.2 hybridisiert. Dadurch konnten unter den 153 Klonen 15x GRP und 25x

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Weitere redundante cDNA-Klone unter den 234 analysierten Klonen waren PR-P bzw. Q mit insgesamt 11 Vertretern (4,7%), 9 ribosomale Protein (3,8%), die Hydroxymethyl-glutaryl-CoA-(HMG-CoA)-Reduktase mit 8 Klonen (3,4 %) sowie die 4 Hitzeschockprotein-cDNAs für HSP70/80 (1,7%). Ungefähr die Hälfte der differentiellen cDNA-Bank bestand aus unikalen bzw. niedrig redundanten cDNA-Klonen ( Tab. 9 ).

6.2.2.1.3 Sequenzierung der cDNA-Inserts

Für alle 81 cDNAs aus Ansatz I sowie 113 cDNAs aus Ansatz II (153 abzüglich der bereits als GRP bzw. SAR 8.2 identifizierten 15 bzw. 25 cDNAs), für insgesamt also 194 cDNA-Klone gab es Sequenzierbedarf. Für insgesamt 174 Klone konnten auswertbare DNA-Sequenzen bestimmt werden, die nicht in allen Fällen vollständig die komplette DNA abdecken. Für die restlichen 20 Klonen scheiterte die Sequenzierung aus unterschiedlichen (technischen) Gründen.

Für 11 der 70 im Reversen Northern Blot als differentiell bestätigten cDNA-Klone aus Ansatz II ist die Sequenz nicht bekannt bzw. konnten durch Sequenzvergleiche in den Datenbanken keine oder nur sehr schwache Homologien identifiziert werden ( Tab. 9 ).

6.2.2.1.4 Erneutes Überprüfen der differentiellen Expression durch Reverse und konventionelle Northern Blots

Vor allem anhand der Sequenzinformation wurden aus Ansatz I 35 und aus Ansatz II 106 cDNA-Klone ausgewählt, um deren differentielle Expression noch einmal im Reversen Northern Blot zu überprüfen (insgesamt 152). Die Filter zum Testen der Klone aus Ansatz I wurden in einem Gemeinschaftsprojekt innerhalb des IPK mit den AG Phytoantikörper (Dr. U. Conrad) und Molekulare Pflanzenphysiologie (Prof. U. Sonnewald) durch einen Spotting-Roboter erzeugt. Auf diesen Filtern wurden zusätzlich cDNAs für andere streß-induzierte Gene aufgetragen, die in o.a. AG isoliert worden waren.

Die ausgewählten 106 insertenthaltenden Plasmide aus Ansatz II wurden manuell auf jeweils 2 Nylonfilter doppelt gespottet ( Abb. 22 ). Einer der beiden Filter wurde dann mit der vorwärts

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Abb. 22 Reverser Northern (Spot) Blot zur Überprüfung von differentieller Genexpression. Aliquots von Plasmid-Mini-Präparationen wurden in vierfacher Ausführung an Nylonmembranen gebunden. Die zwei Nylonmembranen, auf denen die cDNA-haltigen Plasmide jeweils als Duplikat vorhanden waren, wurden zuerst mit den FS-(A) und RS-Sonden (B) und anschließend, nach vollständigem Strippen der Membranen, mit einer vektorspezifischen Sonde hybridisiert (C, D), um quantitative Auftragefehler auszugleichen und die digital-radiometrische Auswertung der Hybridisierungssignale am Phosphorimager zu ermöglichen. Einige der am stärksten differentiell exprimierten cDNA-Klone sind markiert.

Auf diese Weise konnten 16 aus 35 Klonen des Ansatz I (45,7%) und 70 aus 106 Klonen des Ansatz II (66,0%) als differentiell exprimiert bestätigt werden. Für Ansatz I und II zusammen ergab sich daraus eine Bestätigungsquote von 61,0 %. Unter den 70 bestätigten Klonen des Ansatz II waren 44 stärker differentiell exprimiert, d.h. das auf gleiche DNA-Menge normalisierte Verhältnis beider FS-Hybridisierungssignale zu den entsprechenden RS-Hybridisierungssignalen war größer als 1,5. Zu diesen kamen 26 schwächer differentiell exprimierte cDNAs, bei denen das normalisierte Verhältnis von FS/RS-Hybridisierungssignalen

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Für 36 ausgewählte cDNA-Klone wurde eine konventionelle Northern Blot-Analyse durchgeführt (s. Abb. 23 ). Diese umfaßte RNA-Proben, die über einen weiten Zeitrahmen des Lichtshift-Experiments gewonnen wurden. Die Ergebnisse der herkömmlichen Northern Blots waren nicht immer deckungsgleich mit denen der Reversen Northern Blots. Für 25 von 36 auf diese Weise überprüften Genen konnte eine differentielle Expression nachgewiesen werden. Da z.Zt. unter den Spezialisten für Reverse Northern Blots noch über die Aussagekraft des konventionellen Northern im Vergleich zum Reversen Northern Blot diskutiert wird
(L. Altschmied, IPK, persönliche Mitteilung), sollten nicht in allen Fällen eines fehlenden Nachweises der differentiellen Expression bestimmter Klone im konventionellen Northern Blot diese cDNA-Fragmente unbedingt und sofort als „falsch-positive“ verworfen werden.

Zusätzlich wurde im Northern Blot für eine kleinere Auswahl von Genen (19) auch das Expressionsverhalten nach Einwirken von anderen Stressoren (z.B. Trockenheit, Hitze, Kälte, Methylviologen, s. - ) auf Tabak untersucht, und in den meisten Fällen konnte ebenfalls eine Transkriptakkumulation festgestellt werden (s. Abb. 25 ).

Die zahlenmäßigen Angaben zum Erfolg der Subtraktion mittels SSH sind in Tab. 9 noch einmal zusammenfaßt.

Tab. 9 Statistische Daten zur SSH. Weitere Informationen im Text.

	Ansatz I	Ansatz II
Transformation von E. coli durch	Hitzeschock	Elektroporation
Menge des zur Ligation in den pCRII-Vektor eingesetzten PCR-Produkts (ca.)	30 ng	90 ng
Anzahl der weißen E.coli-Kolonien (Blau/Weiß-Screening)	812	1181
Weiße Kolonien insgesamt	1993
Anzahl der tatsächlich differentiell exprimierten Klone; Identifizierung durch Reverse Northern Blots (Ansatz I) bzw. Koloniehybridisierung (Ansatz II) mit FS- und RS-cDNA-Sonden	81	153
Anzahl differentiell exprimierter Klone lt. erster Überprüfung insgesamt	234 (= 11,7 % von 1993)
Anzahl von zwei im Ansatz I vorkommenden, sehr redundanten cDNAs (GRP, SAR8.2)	19 (GRP) 15 (SAR8.2)

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Anzahl dieser beiden, durch Hybridisierung mit entsprechenden Sonden im Ansatz II ermittelten Klone		15 (GRP) 25 (SAR8.2)
Anzahl weiterer, durch vorhergehende Hybridisierung nicht identifizierter cDNA-Vertreter dieser beiden Gene		8 (GRP) 4 (SAR8.2)
Gesamtanzahl der cDNA-Klone von GRP und SAR8.2 in beiden Ansätzen	42 (GRP; = 17,9 % von 234) 44 (SAR8.2; = 18,8 % von 234)
Weitere redundante cDNA-Klone	11 (PR-P/Q; = 4,7 % von 234) 9 (ribosomale Proteine; = 3,8 %von 234) 8 (HMG-CoA-Reduktase; = 3,4 %aus 234) 4 (HSP70/80; = 1,7 % von 234)
Anteil unikaler bzw. kaum redundanter cDNA-Klone, ca.	50 %
Sequenzierung in Auftrag gegeben für insgesamt 194 Klone, davon:	81 Klone	113 (153-40 GRP bzw. SAR)
Auswertbare Sequenzen	174
Erneutes Überprüfen der differentiellen Expression im Reversen Northern Blot von 141 (anhand der vorliegenden Sequenzinformation) ausgewählten Klonen, davon	35 maschinell gespottet	106 von Hand gespottet
Bestätigung der differentiellen Expression für	16 aus 35 (45,7 %)	70 aus 106 (66,0 %)
Bestätigungsquote insgesamt	86 aus 141 = 61,0 %.
Details der quantitativen Auswertung der differentiellen Expression der cDNA-Klone aus Ansatz II (jeweils Doppelspots): Stark differentiell exprimiert (FS/RS > 1,5) Schwach differentiell (1,1 < FS/RS < 1,5) Uneindeutig (FS/RS beider Spots differiert stark) Unter den differentiell Exprimierten: Fehlende Sequenzinformation bzw. keine oder mangelhafte Homologie mit bekannten Genen			44 aus 70 26 aus 70 10 aus 106 11 aus 70
Überprüfen der differentiellen Expression im Northern Blot (Einbeziehen mehrerer Zeitpunkte während des Lichtshifts) für	36 cDNA-Klone
Bestätigungsquote	25 aus 36 (69,4 %)
Differentielle Expression auch unter anderen Umweltstreß-einflüssen (s. - ) im Northern Blot untersucht für	19 cDNA-Klone

6.2.2.2 Liste der differentiell exprimierten Gene

Nach wiederholter Expressionsanalyse im Reversen bzw. für ausgewählte Klone zusätzlich im konventionellen Northern Blot wurde in Tab. 10 eine Liste von 72 individuellen Genen

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In Tab. 10 sind cDNA-Klone aufgelistet, die auch in der zweiten Kontrollhybridisierung von normalisierten Spot-Blots mit den FS- und RS-Sonden ein differentielles Hybridisierungssignal aufwiesen (Reverser Northern Blot, s. - ). Es wurden außerdem einige cDNA-Klone in die Tabelle aufgenommen, die homolog mit sehr interessanten Genprodukten sind, aber nicht wiederholt als differentiell exprimiert bestätigt werden konnten. Weiterhin sind cDNA-Klone aufgeführt, für die die Sequenz nicht oder nur sehr fehlerhaft ermittelt werden konnte bzw. für die die Sequenzanalyse keine signifikanten Homologien zu bekannten Genen aufzeigte, für welche aber im Reversen Northern Blot wiederholt eine differentielle Expression gezeigt werden konnte.

Durch photodynamisch hervorgerufenen oxidativen Streß und frühe Zelltodprozesse werden Gene unterschiedlichster Klassen und Familien induziert. Neben den zahlreich vertretenen Genen für den Primär- und Sekundärstoffwechsel fallen besonders Gene für Chaperone, Hitzeschockproteine (HSPs) und andere Proteine mit proteinstruktur-stabilisierenden oder
-wiederherstellenden Eigenschaften auf. Die Präsenz dieser Gene in der subtrahierten cDNA-Bank spricht für Verschiebungen im Redoxstatus der Zellen als Konsequenz von oxidativem Streß.

Durch den subtraktiven Ansatz konnten die Ergebnisse vorheriger Experimente bestätigt werden, in denen gezeigt wurde, daß in porphyrischen Pflanzen Pathogenabwehr-Reaktionen ablaufen, die u.a. zur Akkumulation von PR-Proteinen führen ( Mock et al. 1999). Die subtrahierte cDNA-Bank umfaßt eine ganze Reihe von Genen für unterschiedliche PR-Proteine und PR-Protein-Ähnliche. Ebenfalls in Richtung einer Pathogenabwehr oder Verwundungsreaktion läßt sich das Vorkommen von Genen in der Bank interpretieren, die für Proteine mit zellwandmodifizierender Funktion kodieren.

Die Präsenz z.B. der cDNA für die Aminocyclopropancarboxylat-Oxidase (ACO) in der Bank weist auf allgemeine Streß- und Seneszenzprozesse hin, die in den porphyrischen Pflanzen ablaufen. Andere apoptose-assoziierte Gene deuten an, daß bereits zu einem frühen Zeitpunkt Zelltod initiiert wird.

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Tab. 10 Liste der Klone in der subtrahierten cDNA-Bank. Angegeben ist jeweils die Anzahl aller cDNAs einer Klasse (inkl. redundanter Klone) und die Anzahl unikaler Genprodukte. Besonders redundante cDNAs (wie GRP, SAR8.2) sind in Tab. 9 bereits erwähnt worden. Bis auf 7 cDNA-Klone, für die entweder keine Sequenzinformation vorlag bzw. beim Sequenzvergleich keinerlei Homologien zu bereits beschriebenen Genen erkannt werden konnte, ist für jede cDNA der Homologiepartner mit dem wahrscheinlichsten BLAST-Ergebnis aufgelistet. Die in der Literatur bereits beschriebene Bedeutung oder Funktion einer Vielzahl der Genprodukte unter Streßbedingungen ist stichpunktartig angegeben. Die Länge der cDNA-Inserts ist in den meisten Fällen aus der Sequenz abgeleitet; nur bei langen Inserts bzw. stark fehlerhaften u./o. das Insert nicht komplett abdeckenden Sequenzen ist die Insertgröße nach Restriktionsabbau der Plasmide mit EcoRI und Agarosegel-Elektrophorese abgeschätzt worden. Die Induktion im Lichtshift bzw. durch andere Stressoren wurde wiederholt durch Reverse Northern Blots bzw. durch konventionelle Northern Blots überprüft (s. - ). Das Ergebnis dieser Überprüfung ist jeweils in Form von Abkürzungen angegeben: n.d.: nicht ermittelt; nein: kein differentielles Hybridisierungssignal für beide Spots (cDNA-Klone wurden als Duplikate gespottet, s. - , - ); (\|[check ]\|): schwach differentiell exprimiert (1,1< FS/RS < 1,5; s. - ); \|[check ]\|: differentiell (FS/RS > 1,5, s. - ); 0: kein eindeutiges Ergebnis (normalisiertes Signalverhältnis FS/RS beider Spots war umgekehrt zueinander, s. - ); andere Stressoren (s. - ): HL: Starklicht; MV: Methylviologen; AC: Acifluorfen; H2O2; SA: Salicylat; TR: Trockenstreß; K: Kältestreß

Klone insg./ indivi-duelle Klone (=Gene)	lt. BLAST-Datenbank-Recherche homolog mit:	aus der Literatur bekannte - physiologische Bedeutung - Expression unter Streß	Länge der cDNA-Inserts [bp]	Induktion ausgewählter Klone im Licht-shift bestätigt durch		Induk-tion auch durch andere Stres-soren im Northern Blot?
Anzahl Klone/ Gen				Reversen Northern Blot?	Nor-thern Blot?
Enzyme des Primärstoffwechsels: 18/13
3	Triosephosphat-Isomerase	- Glycolyse; auf Proteinebene induziert z.B. durch Trockenstreß in Mais ( Riccardi et al. 1998)	281 307 ca. 1000	\|[check ]\|	nein	HL, MV, AC
1	Enolase	- Glycolyse, (2-PGA PEP); durch Anaerobiose, Trocken-, Kälte und Salzstreß sowie nach ABA-Behandlung induziert ( Riccardi et al. 1998, Lal et al. 1998, Forsthoefel et al. 1995)	365	nein	n.d.	n.d.
2	Pyruvat-Dehydrogenase	- Letzter Schritt der Glycolyse ( Acetyl-CoA); mitochondrial lokalisiert; durch Streß (vor allem Ischemie/ Reperfusions-Streß) in tierischen Systemen beeinflußt ( Janero et al. 1994)	217 ca. 800	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
2	<1>	- Eingangsenzym der Fettsäure-synthese ( Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol tierischer bzw. in den Chloroplasten pflanzlicher Zellen)	198	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.

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1	Transketolase	- u.a. plastidär lokalisierter oxidativer Pentosephosphat-Weg ( Bereitstellung von NADPH); komplementiert Hefe-SOD1-Mutanten; andererseits sind transketolase-defiziente Hefe-Mutanten O2-sensitiv ( Slekar et al. 1996, Juhnke et al. 1996)	595	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
<2>	lösliche saure -Fructosidase (Invertase)	- Bereitstellung von Hexosen; in Mais wird eine vakuoläre lösliche saure Invertase in Folge von Trockenstreß induziert ( Invertase ist Streß-QTL und Schlüsselenzym der Sink-Source-Regulation, Roitsch 1999, Pelleschi et al. 1999)	630	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
2	plastidäre Fructose-1,6-Bisphosphatase (FBPase)	- Glucose/Stärkesynthese im Chloroplasten; aktivierbar durch das Thioredoxin-System, d.h. selbst sensitiv gegenüber oxidativem Streß ( Loggini et al. 1999)	177 403	nein (\|[check ]\|)	n.d.	n.d.
<3>	Formiat-Dehydrogenase	- Formiat-Gärung in Bakterien und Algen; prominentes mitochondriales Protein in nicht-grünem, selten in grünem Gewebe; induzierbar in Blättern durch Hypoxie, Formiat- und Ethanolapplikation, in Wurzeln durch Fe-Defizienz ( Hourton-Cabassa et al. 1998, Suzuki et al. 1998)	381	(\|[check ]\|)	(\|[check ]\|)	MV, AC, SA
2	P- und H-Proteine des Glycin-Decarboxylase-Multienzym-komplexes	- P-Protein katalysiert die eigentliche Decarboxylierung von Glycin und überträgt das Produkt (Methylamin) auf die H-Untereinheit des Komplexes; mitochondrial lokalisierter Abschnitt des C2-Zyklus (Photorespiration); lichtinduzierte, blattspezifische Transkriptakkumu-lation ( Douce und Neuburger 1999)	227 (P) 206 (H)	(\|[check ]\|) 0	n.d.	n.d.
<4>	Thymidin-diphospho-glucose-4,6-Dehydratase	- TDP-Glucose-4,6-Dehydratase (GDH, EC 4.2.1.46); Enzym des Desoxyzuckermetabolismus ( Linton et al. 1995); verleiht Hefezellen erhöhte Toleranz gegenüber SH-Oxidants Diamid ( Kushnir et al. 1995)	568	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
<5>	PAPS-Reduktase-ähnliches Protein	- Reduktion von Sulfat zu Sulfit unter Verbrauch von 2 mol Thioredoxin; induziert durch Cd2+ (wie auch -EC-Synthase) Deckung des erhöhten Bedarfs an Cys und Phytochelatinen unter Streßbedingungen ( Heiss et al. 1999)	314	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
<6>	unbekanntes Protein aus A. thaliana GeneBank Acc.# AC004484	- AC004484 ist homolog mit Na+/Glu-Transportern/ Symportern	408	(\|[check ]\|)	n.d.	n.d.

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Enzyme des Sekundärstoffwechsels: 11/4
1	Porphobilinogen-Deaminase (hem C)	- Tetrapyrrolbiosynthese; induziert durch Hypoxie-Streß in Knochen-marks- und roten Blutzellen der Ratte ( Heiss et al. 1986); Aktivität (nicht aber Protein) reduziert in UROD-AS-Pflanzen ( Mock und Grimm 1997)	363	\|[check ]\|	nein	nein
6+2 (Fusion mit cDNA für Gly-reiches Protein)	Hydroxymethyl-glutaryl (HMG)-CoA-Reduktase	- Eingangsenzym der Isoprenoid-biosynthese im Cytosol (HMG-CoA Mevalonat); induzierbar durch Pathogeninfektion, Verwundung, Arachidonsäure und Hg2+ ( Genschik et al. 1992, Choi et al. 1992)	175 - 621	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
<7>	<8>	- katalysiert Transfer von Sulfat des PAPS auf 3’-OH des Flavonols; Flavonoidstoffwechsel wird (wie auch PAL und CHS) durch Elicitoren induziert ( Logemann et al. 2000)	ca. 750	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
1	Geranyl-geranyl-pyrophosphat-Synthase	- Isoprenoidstoffwechsel; plastidäre und cytosolische Isoformen induziert durch Verwundungsstreß und Elicitorapplikation ( Hugueney et al. 1996)	504	(\|[check ]\|)	nein	nein
Proteine mit strukturerhaltender oder wiederherstellender Funktion (Chaperone, HSPs, SH-aktive Proteine): 14/10
1	Proteindisulphid-Isomerase (EC 5.3.4.1)	- zählt zu den Chaperonen (und hier zu den „Foldasen“); lokalisiert im ER; öffnet und verknüpft S-S-Bindungen; essentiell für Hefewachstum; hat DHAR-Aktivität in Tieren ( Boston et al. 1996, Wells und Xu 1994)	256	(\|[check ]\|)	\|[check ]\|	n.d.
<9>	Chaperonin-60	- groES/L-ähnliches Chaperonin; involviert in Assemblierung der Rubisco-UE im Plastiden; „Rubisco-Untereinheit-bind. Protein“ ( Hemmingsen et al. 1988)	ca. 550	\|[check ]\|	nein, gene-rell licht-indu-ziert	(AC, H2O2, SA)
<10>	Chaperonin 10	- Cofaktor von Chaperonin 60; praktisch konstitutiv exprimiert; zusätzliche Induktion durch Hitzeschock ( Viitanen et al. 1995)	ca. 650	nein	n.d.	n.d.

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<11>	Streß-responsives Cyclophilin	- Peptidyl-prolyl-cis-trans-Isomerase (EC 5.2.1.8); involviert in Proteinfaltung und Proteininter-aktionen; bindet z.B. das humane thiol-spezifische Antioxidants-Protein Aop1, bindet auch Cyclosporin A; dadurch wird das Öffnen von Poren in der Mitochon-drienmembran beeinflußt ( Gasser et al. 1990, Jaschke et al. 1998, Connern und Halestrap 1994); mitochondrialer Energiestoff-wechsel spielt eine wichtige Rolle beim PCD tierischer Zellen ( Green und Kroemer 1998)	545	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
<12>	Thioredoxin	- universell verbreitetes redoxaktives Protein (Proteindisulfid-Oxido-reduktase); DHAR-Aktivität; aktiviert/deaktiviert eine Reihe von lichtregulierten Enzymen im Plastiden; induziert durch Trockenstreß ( Rey et al. 1998)	<13>	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
1	<14>	- kleine, hitzestabile Proteine mit GSH-abh. Disulfid-Oxidoreduktase-Aktivität; lösen die S-S-Brücken gemischter Disulfide auf ( Wells et al. 1993); Hefe-Deletionsmutanten sind sensitiv gegenüber O2- bzw. H2O2 ( Luikenhuis et al. 1998); Induktion durch oxidativen Streß in E.coli ist oxyR-abh. aber gleich-zeitig wird oxyR durch Grx deaktiviert ( Autoregulation, Zheng et al. 1998); Reporte über Vorkommen und Funktion in Pflanzen, z.B. Rícinus liegen vor ( Szederkenyi et al. 1997)	544	\|[check ]\|	nein, starke diur-nale + circa-diane (?) Rhyth-mik	K
<15>	Calnexin	- ER-lokalisiertes Chaperon ( Boston et al. 1996), das vor allem die Faltung von unter Streßbedingungen synthetisierten und zu exportie-renden Proteinen unterstützt; in tierischen Zellen mit dem Immunoglobulin-bindenden Protein (BiP, gehört zur HSP70-Familie) assoziiert; zählt, da Proteine über ihre Zuckerreste erkannt werden, wie auch Calreticulin zu den Lectinen; essentiell für Überleben von S. pombe ( Jannatipour und Rokeach 1995)	314	(\|[check ]\|)	\|[check ]\|	nein
1+2*	HSP70	- gehören als molekulare Chaperone zur HSP70-Familie; auch in Chloroplasten u. Mitochondrien lokalisiert; hitze- und starklicht-induziert, z.B. Schutz des PSII-Reaktionszentrums während Photoinhibition ( Schroda et al. 1999)* Fusion mit cDNA für SAM-Synthetase bzw. Steaoryl-Coa-Desaturase	Ca. 1000 436 277	<16>	\|[check ]\| + gene-rell licht-indu-ziert	K, TR, MV, AC, (SA)

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1	HSP80	- gehören zur HSP90-Familie; ubiquitär auch unter normalen Bedingungen exprimiert ( Yabe et al. 1994)	229	(\|[check ]\|)	\|[check ]\| + gene-rell licht-indu-ziert	n.d.
1	14-3-3-ähnliches Protein 9	- 14-3-3´s binden phosphorylierte Proteine; Funktion als Adaptor, Chaperon, Aktivator und Repressor beschrieben ( Chung et al. 1999); u.a. 10 Isoformen aus A. thaliana bekannt; pathogen-responsiv ( Aktivierung der Plasmamembran-H+-ATPase); neuerdings auch im Zusammenhang mit der Kontrolle von Transkriptionsfaktoren diskutiert; Report über Vorkommen und mögliche Funktion in Chloroplasten ( Sehnke et al. 2000)	327	(\|[check ]\|), -	\|[check ]\| + gene-rell licht-indu-ziert	nein
Andere redoxaktive Proteine: 3/2
1+1 (Fusion mit cDNA für Gly-reiches Protein)	Ubichinon-abh. NADH-Dehydrogenase	- Enzym des mitochondrialen Atmungskomplexes I; im Plastiden in zyklischen Elektronentransport und Plastidenatmung im Dunklen involviert; wird durch kleine HSPs vor oxidativen Schäden (z.B. bei Hitzestreß) geschützt ( Downs und Heckathorn 1998); im Tiermodell durch Anoxie induziert ( Cai und Storey 1996)	<17>	\|[check ]\|	\|[check ]\|	HL, MV, AC, SA
1	Phytocyanin	- kleine, bläuliche Kupfer-Proteine; vermutlich in Redoxreaktionen während primärer Pathogenabwehr und/oder Ligninsynthese involviert ( Nersissian et al. 1998)	354	(\|[check ]\|)	\|[check ]\|	AC, H2O2, SA
Proteine mit zellwandmodifizierender Funktion: 44/3
1	Pro-reiches Protein	- vermutlich (wie auch Hydroxy-Pro- und Gly-reiche Proteine) ZW-Bestandteil; allgemein streßrespon-sibel (z.B. Trockenstreß); vermutlich in ZW-Modifikation bei Verwun-dung involviert ( Yu et al. 1996, Yasuda et al. 1997, Neale et al. 2000)	137	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
42*	<18>	- wahrscheinlich ZW-assoziiert; TMV-, ABA, Ethylen-, trocken- und verwundungsstreß-induzierbar (sowohl lokal als auch systemisch); ähnlich Pro-reicher Proteine und Extensine an ZW-Modifikation be-teiligt ( Van Kan et al. 1988, Showalter et al. 1992, Brady et al. 1993, Neale et al. 2000) <19>	<20>	\|[check ]\|	\|[check ]\|	AC

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1	Extensin-ähnliches Protein	- ZW-Proteine; regulieren vermutlich über eigenen intra- und intermolekularen Quervernetzungs-zustand mechanische Eigenschaften der ZW; Isoformen sind entwick-lungsabhängig reguliert und werden durch hypoosmotischen Streß, Verwundung und Elicitor-behandlung induziert ( Showalter et al. 1992, Cazale et al. 1998)	163	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
PR-Proteine, PR-Protein-Ähnliche und Resistenzgene: 62/10
1	PR-1(a, b oder c)	- Extrazelluläres, saures PR-Protein mit unbekannter Funktion; häufigstes PR-Protein in Tabak; PR-1a, b und c sind zu über 90% identisch miteinander; ozon-, pathogen- und elicitorinduzierbar ( Ward et al. 1991, Ryals et al. 1996)	245	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
8	PR-P	- Extrazelluläre, saure Chitinase; 90% identisch mit PR-Q; auch als PR-3 bekannt; induzierbar durch Pathogene, Elicitor- und Ethylen-behandlung ( Ryals et al. 1996)	238 - 818	(\|[check ]\|) \|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
3	PR-Q	- s. PR-P	369 408 ca. 900	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
1	Thaumatin-ähnliches Protein (PR-R)	- Thaumatin: süß schmeckendes Protein aus der Frucht des westafrikanischen monocotylen Regenwald-Strauches Thaumato-coccus daniellii Benth; Amylase/ Proteinase-Inhibitor; ähnlich dem PR-S (PR-5), induzierbar durch TMV-Infektion; antifungale Wirkung ( Ryals et al. 1996)	494	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.
43*(*davon 24 durch Kolo-niehybri-disierung identi-fiziert)	„Salicylic Acid Responsive“ (SAR) 8.2	- unbekannte Funktion; zählt praktisch zu den PR-Proteinen, da SA-, INA- und TMV-induzierbar; Isoformen SAR 8.2a-l beschrieben ( Alexander et al. 1992); auch in Pyrophosphatase-Überexpressions-pflanzen ( Akkumulation von löslichen Zuckern) differentiell exprimiert ( Badur et al. 1994)	<21>	\|[check ]\|	\|[check ]\|	SA, HL, MV, AC, H2O2
1	Photoassimilat-responsives Protein (PAR)-1b	- durch akkumulierende lösliche Zucker (z.B. infolge von Pyrophos-phatase-Überexpression) induziertes PR-Protein-ähnliches Protein ( Herbers et al. 1995); induzierbar durch SA und in Kartoffel durch PV-Y (lokal und systemisch) - auch andere Isoformen sind nach Lichtshift im Spot-Blot verstärkt	ca. 600	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.

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87

1	Proteinase-Inhibitor II	- Expressionsmuster ähnelt oft dem von PR-Proteinen; (systemisch) induzierbar durch TMV, Verwundung (Jasmonsäure), ABA, UV, Ethephon (Ethylen) ( Balandin et al. 1995); PI werden auch als Modulatoren des PCD diskutiert ( Solomon et al. 1999)	202	\|[check ]\|	\|[check ]\| + gene-rell licht-indu-ziert	n.d.
1	Ubiquitin-Extensions-Protein	- Vorläufer des durch Proteolyse gebildeten Ubiquitins; durch Hitzeschock in Tabak ( Park et al. 1997) und Chlamydomonas reprimiert; nach Salzbehandlung in Aspergillus induziert ( Redkar et al. 1996); wird in A. thaliana allerdings auch zu den HSPs gezählt und früh-zeitig durch Trockenstreß, in Trypanosoma hingegen durch UV induziert; Überexpression von Polyubiquitin erhöht die Resistenz gegenüber H2O2 in Hefe ( Cheng et al. 1994)	306	(\|[check ]\|) \|[check ]\|	\|[check ]\| + gene-rell licht-indu-ziert	K, TR, MV, (AC)
1	RPP8	-Pathogen-Resistenz- (R)-Gen der NBS-LRR-Klasse („nucleotide-binding site and leucine-rich repeat“); Existenz dieses Locus verleiht in A. thaliana Resistenz gegen Peronospora parasitica (Mehltau) ( McDowell et al. 1998, Speulman et al. 1998)	319	(\|[check ]\|)	n.d.	n.d.
1	Resistenz-Gen-Kandidat aus Lactuca sativaGeneBank Acc.# AF017751	- höchste Homologie des Salat-Resistenz-Gens zu Genen der „nucleotide-binding site and leucine-rich repeat“-Superfamilie; I2C aus Tomate verleiht z.B. Resistenz gegenüber Fusarium oxysporum ( Ori et al. 1997)	208 (3’-Bereich)	nein	n.d.	n.d.
Andere Proteine, die im Zusammenhang mit Apoptose, Seneszenz oder Verwundungsstreß beschrieben wurden: 2/2
1* *Fusion mit Ami-nosäure-Perme-ase	„Defender against Cell Death“ (DAD1)	- homolog zur Ost2p-Untereinheit des ER-lokalisierten Oligosaccharyl-Transferase-Komplexes (OST); letal (Apoptose) in DAD1-defizienten Hefen und Hamster-Zellinien wegen des Ausbleibens von N-Glycosylie-rung ( Gallois et al. 1997, Tanaka et al. 1997, Sanjay und Kreibich 1998)	ca. 1000 (DAD1: 358)	nein	\|[check ]\|	HL, AC
<22>	Aminocyclopro-pancarboxylat-Oxidase (ACO1)	- „Ethylen-bildendes Enzym“; katalysiert den 2. (letzten) Schritt der Ethylenbiosynthese aus SAM; reife-(seneszenz)-spezifische Expression von Isoformen neben der Induktion durch (a)biotische Streßfaktoren, wie z.B. Verwundung, SA, Ethylen, Jasmonat, CuSO4 ( Kim et al. 1998)	303	\|[check ]\|	\|[check ]\|	n.d.

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88

Proteine mit vermuteter Funktion in der Signaltransduktion/ Transkriptionsfaktoren: 15/13
1	Transkriptions-faktor Hap5 (NFY-C)	- homolog mit C-Untereinheit des humanen „Nukleären Faktors (NF)-Y“ (NFY-C, auch CBF od. CP1); bindet an die CAATT-Box vieler (auch streß-spezifischer) Promoto-ren; reguliert z.B. Aktivität des humanen SOS-Gens MDR1 u. des Frosch-hsp70; Hefe-Homologes (Hap5) ist Teil eines Komplexes aus Hap2, 3 und 5; im Genom von A. thaliana multiple Formen von jeder Hap-Untereinheit codiert ( Edward et al. 1998); sowohl Zusammen-lagerung des heterotrimeren Transkriptionsfaktors als auch DNA-Bindung sind redox-kontrolliert ( Nakshatri et al. 1996)	699 Voll-längen-klon:1320	\|[check ]\|	nein	nein
<23>	Homeobox-Protein Cux1 (Maus)	- homolog mit hCut/CDP (Mensch; CDP = CCAAT displacement protein), Cut (D. melanogaster) und Clox (Kaninchen); Antisense in transgenen Nieren-Zellinien verursacht Apoptose ( Quaggin et al. 1997)	320	\|[check ]\|	<24>	n.d.
1	Befruchtungs-unabhängiges Endosperm-protein FIE (A. thaliana), GeneBank Acc.# AF129516.1	- gehört zu den WD-Repeat-Proteinen bzw. den Proteinen der Polycomb-Gruppe; zu letzteren zählen z.B. „Extra sex combs“ ESC (D. melanogaster, Van Lohuizen et al. 1998) und „Embryonic ectoderm development“ EED (Maus); repri-mieren zum gegebenen Zeitpunkt nicht benötige Homeobox-Gene; WD-Repeat-Protein WAIT-1 (Mensch) interagiert mit Integrinen ( Rietzler et al. 1998)	474	(\|[check ]\|)	n.d.	n.d.
<25>	putative Ser/Thr-Protein-Kinase aus Thermonospora curvata	- Thermonospora -Protein enthält ebenfalls WD-Repeats; Funktion und Bedeutung ansonsten unklar ( Janda et al. 1996)	109	0	n.d.	n.d.
<26>	26S Proteasom-Regulations-Untereinheiten 8 und 6A	- regulatorische Untereinheit p45 des 26S Proteasoms mit ATPase-Aktivität; homolog zum Transkrip-tionsfaktor Sug1p aus Hefe (Trip1 aus Mensch); auch homolog zum humanen HIV-TAT-bindenden TBP1; proteolytische Aktivität des 26S Proteasoms ist notwendig für das Fortschreiten des Zellzyklus in Hefe ( Aliyama et al. 1995, Kitashiba und Toriyama 1997)	ca. 750 (UE 8) ca. 1300 (UE 6A)	(\|[check ]\|) nein	nein n.d.	nein n.d.

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89

<27>	ADP-Ribosylierungs-faktor	- kleines GTP-bindendes Protein; strukturelle Ähnlichkeiten zu ras-Faktoren ( Regad et al. 1993, Sewell und Kahn 1998); Deletion beider bekannter Hefe-Isoformen ist letal; Deletion von ARF1 steigert Kältesensitivität; induzierbar durch Ischemie (Hypoxie) in tierischen Zellen ( Katayama et al. 1998)	ca. 600 ca. 950 (Fusion mit cab-6b)	\|[check ]\| (\|[check ]\|)	n.d.	n.d.
1	Cys2/His2-Zink-Finger Protein aus Petunia ZPT2-9; hoch-homolog mit putativen Proteinen aus A. thaliana	- gehört zur EPF-Familie von ca. 10 verschiedenen. Cys2/His2 Zink-Finger Proteinen mit 2, 3 oder 4 Zinkfingern; binden AGT-Kern-motive der DNA in abstands-spezifischer Weise ( Kubo et al. 1998)	170	0	n.d.	n.d.
<28>	unbekanntes Protein aus A. thaliana GeneBank Acc.# CAA22994	- CAA22994 hat starke Homologie zu humanen Krebsmarkerproteinen und zu Nbr1 aus Maus, welches eine B-Box besitzt und sich in der Nähe von BRCA1 befindet, dessen Funktion aber noch ungeklärt ist ( Chambers und Solomon 1996).	409	0	n.d.	n.d.
1	unbekanntes Protein aus A. thaliana GeneBank Acc.# AAC00624	- AAC00624 hat schwache Homologien u.a. sowohl mit dem Transkriptionsfaktor E2F-4 (Maus, Mensch; Regulation der Zellpro-liferation, Sardet et al. 1995) als auch mit einem 23kD-Protein des wasser-spaltenden Komplexes des PSII	406	\|[check ]\|	nein	nein
1	unbekanntes Protein aus A. thaliana GeneBank Acc.# AF007269	- AF007269 hat Homologien mit weiteren putativen Proteinen aus A. thaliana aber auch mit einem Myb-verwandtem Transkriptionsfaktor (CCA-1)	198	nein	n.d.	n.d.
1	Protein-Phosphatase 2C (PP2C)	- Genfamilie (mit z.B. 10 Mitglie-dern in M. crystallinum); in ABA-induzierte Signalprozesse involviert; unterschiedliche Reaktion auf Kälte und Trockenheit (je nach Isoform ); negativer Regulator des MAPK-Weges in Hefe, Tier und Pflanze ( Meskiene et al. 1998, Sheen 1998, Neale et al. 2000, Gabbita et al. 2000)	ca. 1100	nein	nein	n.d.
<29>	Protein B2	- in Karotten-Zellen während der Embryogenese exprimiert; Homo-loges aus Erbse (GDA-1) induzier-bar durch verkürzte Photoperiode und GA ( Li et al. 1998)	493	\|[check ]\|	n.d.	n.d.
Proteine mit Funktion bei der post-transkriptionellen Modifikation oder Translation: 10/8

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90

2

Ribosomales Protein L17

- gehört, wie auch L18 u. L28 zur cytosolischen 60S ribosomalen Untereinheit; besonders die Initiations- und Elongationsfaktoren der ribosomalen Komplexe werden durch Streß (UV, Hitze) sowohl transkriptional als auch post-translational modifiziert (variieren-der Phosphorylierungszustand) ( Mizoguchi et al. 1996, Brosche und Strid 1999, Lee et al. 1999)

<30>

\|[check ]\| (\|[check ]\|)

n.d.

n.d.

<31>

Ribosomales Protein L18

s. L17

252 554

(\|[check ]\|), nein \|[check ]\|

n.d.

n.d.

1

Ribosomales Protein L28

s. L17

475

\|[check ]\|

n.d.

n.d.

1

Ribosomales Protein L37

s. L17

155

nein

n.d.

n.d.

1

Ribosomales Protein L1B

s. L17

280

nein

n.d.

n.d.

1

Ribosomales Protein L15

gehört zur plastidären ( kerncodier-ten) 50S ribosomalen Untereinheit

ca. 500

\|[check ]\|

n.d.

n.d.

1

Ribosomales Protein L27

s. L15

548

nein

n.d.

n.d.

1

Spliceosom-assoziiertes Protein 145 (SAP145)

- Bestandteil des snRNA-Protein-Komplexes, der die Verzweigungs-punkt-Sequenz im Intron bindet ( Gozani et al. 1996)

674

\|[check ]\|

n.d.

n.d.

cDNA-Sequenzen ohne Homologe in den Datenbanken bzw. Klone mit nicht auswertbarer Sequenz: 7

Klon Nr. 663 1062 1303 1318 1497 1505 1822

289 ? ca. 1100 ca. 550 159 227 ?

(\|[check ]\|) (\|[check ]\|) (\|[check ]\|) \|[check ]\| (\|[check ]\|) 0 (\|[check ]\|)

nein n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

n.d.

Eine sehr interessante Klasse von Genen wurde unter dem Begriff „Komponenten von Signaltransduktions-Kaskaden“ zusammengefaßt, zu denen auch eine Anzahl von putativen Transkriptionsfaktoren gehört. Der relativ große Anteil dieser eher seltenen Transkripte in der cDNA-Bank weist erstens darauf hin, daß die SSH-Methode tatsächlich auch Expressionsunterschiede von schwach exprimierten Genen sichtbar machen kann, und daß zweitens der Zeitpunkt der Probennahme und Konstruktion der cDNA-Bank innerhalb des Zeitrahmens des Lichtshift-Experiments gut gewählt wurde. Offensichtlich ermöglicht die cDNA-Bank durch ihre Zusammensetzung eine Momentaufnahme in einer transkriptionell sehr aktiven Phase, in der sowohl zentrale als auch terminale Komponenten von Signalkaskaden gebildet werden.

91

Nur 7 aus 72 (bzw. 186) cDNAs verbleiben ohne vorliegende Sequenz- bzw. Homologieinformation. Dies ist ein erfreulich geringer Anteil und spricht einerseits erneut für die SSH-Methode, da hier (im Gegensatz z.B. zur DD-RT-PCR) zentrale und relativ große Abschnitte der cDNAs verfügbar gemacht werden. Andererseits ist dies auch Zeugnis für die inzwischen sehr umfangreichen und ständig aktualisierten Sequenzdatenbanken.

Bemerkenswert ist das Fehlen von Genen in der cDNA-Bank, die für klassische Schutzenzyme wie SOD, APX oder CAT kodieren. Die Induktion solcher Gene war nach den Ergebnissen der Northern Blot-Analyse an vollständig nekrotischen Pflanzen erwartet worden (s. Abb. 11 , Mock et al. 1998). Sehr wahrscheinlich wird die Expression dieser Gene aber erst zu einem späteren Zeitpunkt verstärkt, während die Veränderung der Lichtbedingungen bereits am Anfang des Experiments erhöhte Aktivitäten der Schutzenzyme hervorruft (s. - ).

6.2.2.3 Northern Blot-Analyse ausgewählter, im Lichtshift-Experiment induzierter Gene

Nachdem die meisten cDNAs aus der subtrahierten Bank im Reversen Northern Blot als differentiell exprimiert bestätigt werden konnten (s. - ), sollte durch konventionelle Northern Blot-Analyse a) dieses Ergebnis zusätzlich überprüft und b) die Expression ausgewählter Gene über den gesamten zeitlichen Verlauf des Lichtshift-Experiments untersucht werden. Die Auswertung von 25 aus insgesamt 36 Northern Blots, bei denen cDNA-Fragmente aus der subtrahierten Bank als Sonde Verwendung fanden, erbrachte die Bestätigung der Ergebnisse der Reversen Northern Blots, d.h. sie zeigte, daß das entsprechende Transkript sich tatsächlich in den CPO-AS-Pflanzen im Vergleich zum WT anreicherte. Beginn, Dauer und Grad der sichtbaren Akkumulation von Transkript waren für die untersuchten Gene unterschiedlich ( Abb. 23 ).

Tab. 10 und unter den gleichen Oberbegriffen geordnet. Zu den Abkürzungen: 14-3-3: 14-3-3-ähnliches Protein; NADH-DH: NADH-Dehydrogenase; GRP: Gly-reiches Protein; PR: Pathogenesis-related (Protein); SAR: Salicylic Acid Responsive (Protein); PAR: Photoassimilate-responsive (Protein). Alle Blots wurden nach Entfernen der cDNA-Sonden mit einer Sonde für die 18S rRNA hybridisiert, um zu kontrollieren, ob gleiche Mengen an RNA aufgetragen wurden.

93

92

Während sich die Transkripte der ATP-Citrat-Lyase als Vertreter der Enzyme des Primär- und Sekundärmetabolismus am Anfang nicht, 12, 24 und 96 h nach Beginn des Lichtshift-Experiments aber stark in den CPO-AS-Pflanzen anhäufen (andere Zeitpunkte wurden bei diesem Beispiel nicht untersucht), beobachtet man bei der HMG-CoA-Reduktase von Anfang an eine unterschiedliche Expression zwischen WT- und CPO-AS-Pflanzen ( Abb. 23 ). Dies spricht dafür, daß die HMG-CoA-Reduktase als Eingangsenzym in den streß-responsiven Isoprenoidstoffwechsel bereits im prä-nekrotischen Zustand der CPO-AS-Pflanzen bei niedriger Lichtdosis aktiviert ist, wohingegen der vermutlich steigende Bedarf und folglich die Bereitstellung von Acetyl-CoA durch die ATP-Citrat-Lyase erst mit Veränderung der Lichtbedingungen Bedeutung erlangt.

Im Hinblick auf die Kinetik der Transkriptakkumulation zeigt sich auch bei den Chaperonen, HSP und thiol-aktiven Proteinen ein uneinheitliches Bild ( Abb. 23 ). Während die RNA der Protein-Disulfid-Isomerase erst durch den im Verlauf des Lichtshift-Experiments wachsenden tetrapyrrol-bedingten oxidativen Streß in den CPO-AS-Pflanzen nachweisbar wird, zeigen die anderen ausgewählten Vertreter dieser Proteingruppe sowohl in WT- als auch in CPO-AS-Pflanzen zu fast allen Zeitpunkten eine sichtbare Transkriptakkumulation. Einige Gene dieser Gruppe sind offenbar licht-induzierbar und reagieren daher vor allem am Tag 1 auf die veränderten Lichtbedingungen mit einer Transkriptanhäufung (Cyclophilin, Thioredoxin, HSP70, HSP80). Ab einem bestimmten Zeitpunkt (Cyclophilin: 40h; Thioredoxin: ab 12h; HSP70: 4, 12, 64h; HSP80: 4, 16, 40, 72h) akkumuliert - auch im Northern Blot sichtbar - mehr Transkript in den CPO-AS-Pflanzen. Da alle diese cDNAs Bestandteil der zum Zeitpunkt „12h“ angelegten, subtrahierten Bank sind und durch Reverse Northern Blots mit komplexen cDNA-Sonden, die diesen Zeitpunkt repräsentieren, als differentiell exprimiert bestätigt werden konnten, sollte für die untersuchten Gene auch zu diesem Zeitpunkt bereits ein (wenn auch nur graduell quantitativer) Unterschied in der Menge der Transkripte zwischen WT- und CPO-AS-Pflanzen bestehen.

94

Die differentielle Expression der zwei analysierten Gene für ZW-modifizierende Proteine (Pro- bzw. Gly-reiches Protein (GRP), Abb. 23 ) läßt sich erst am 2. bzw. 3. Tag des Lichtshift-Experiments im Northern Blot nachweisen. Dies läßt eine Assoziation mit dem Auftreten der Blattläsionen vermuten, die sich im gleichen Zeitraum entwickeln.

Während die mRNA für die PR-Proteine 1, Q und R sowie das Photoassimilat-responsive Protein (PAR) 1 bereits während der ersten verlängerten Lichtphase verstärkt in den CPO-AS-Pflanzen sichtbar wird ( Abb. 23 ), läßt sich dies für das Salicylsäure-responsive Protein (SAR8.2) erst zu einem Zeitpunkt feststellen, an dem die Ausbildung von Nekrosen praktisch ihren Höhepunkt erreicht (48h). Da alle diese Gene SA-induzierbar sind, ist die Reaktionskinetik auf erhöhte SA-Gehalte (s. auch Abb. 43 ) offensichtlich unterschiedlich. Die zeitlichen Expressionsmuster von PR-1 und PR-R sind allerdings sehr ähnlich zueinander.

Die Northern Blots, mit denen die differentielle Expression von putativen Faktoren der Signaltransduktion, wie z.B. Transkriptionsfaktoren, untersucht wurde, lieferten bei ihrer Wiederholung für mehrere Lichtshift-Experimente keine reproduzierbaren Ergebnisse, was vor allem auf die (trotz vermuteter Induktion) wahrscheinlich niedrige Transkripthäufigkeit zurückzuführen ist. Die für die Reversen Northern Blots verwendeten FS- bzw. RS-Sonden, mit denen die differentielle Expression dieser Gene gezeigt wurde, eliminieren das Problem der geringen Abundanz von Transkripten in der Gesamt-mRNA (s. - , - ).

6.2.2.4 Northern Blot-Analyse der Expression von Genen des antioxidativen Schutzsystems im Lichtshift-Experiment

Zusätzlich wurde auch die Kinetik der Expression von ausgewählten klassischen antioxidativen Schutzenzymen im Northern Blot untersucht, die nicht Bestandteil der subtrahierten cDNA-

95

Abb. 24 Northern Blot-Analyse von Genen der antioxidativen Schutzenzyme Fe-SOD, plastidären bzw. cytosolischen Cu/Zn-SOD, mitochondrialen Mn-SOD, cytosolischen APX, einer Peroxidase mit breiter Substratspezifität (keine APX) und zweier Catalase-Isofomen während des Lichtshift-Experiments. Die vier dargestellten Zeitpunkte entsprechen dem Beginn des Lichtshift-Experiments (0h), dem Zeitpunkt der Probennahme für die Konstruktion der subtrahierten cDNA-Bank (12h) und dem Beginn der Lichtphase am 2. bzw. 5. Tag des Lichtshift-Experiments
(24 bzw. 96h), an dem die sichtbare Bildung von Nekrosen an den Blättern der CPO-AS-Pflanzen (Linie 1/41) gerade beginnt bzw. abgeschlossen ist. Die methodischen Einzelheiten entsprechen den Angaben aus Abb. 23 . Die Sonden wurden freundlicherweise von D. Inzé (Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt.

Während sich die mRNA der plastidären Cu/Zn-SOD, der mitochondrialen Mn-SOD, der APX und der Peroxidase während des Lichtshift-Experiments sowohl in WT- als auch in CPO-AS-Pflanzen transient anreicherte, konnte für die cytosolische Cu/Zn-SOD praktisch keine Veränderung im Transkript-Niveau beobachtet werden. Die mRNA-Menge für die CAT1 nimmt hingegen über den untersuchten Zeitraum in beiden Pflanzenpopulationen konstant zu. Dieses Verhalten scheint die allgemeine Reaktionen auf die veränderten Lichtbedingungen zu repräsentieren. Eine zu bestimmten Zeitpunkten für WT- und CPO-AS-Pflanzen unterschiedliche Expression konnte allerdings für die plastidäre Fe-SOD und die CAT2 nachgewiesen werden. Dabei könnte das sehr frühe (0h) bzw. späte (96h) Auftreten der differentiellen Expression der CAT2 das Fehlen dieses Gens in der zum Zeitpunkt „12h“

96

6.2.2.5 Northern Blot-Analyse ausgewählter Gene aus der subtrahierten cDNA-Bank unter dem Einfluß anderer Stressoren

Ausgewählte Vertreter der durch tetrapyrrol-bedingten oxidativen Streß induzierten Gene sollten auf ihr Expressionsverhalten unter dem Einfluß anderer Streßfaktoren hin untersucht werden. Dazu wurden Blattscheiben von WT-Pflanzen z.B. dem Einfluß von Herbiziden, Kälte oder hoher Lichtintensität ausgesetzt (s. - ). Northern Blots von RNA aus diesen Versuchen wurden mit aus der subtrahierten cDNA-Bank stammenden markierten Sonden hybridisiert, um Aussagen über die unter Streß allgemeingültige Bedeutung einzelner Gene zu treffen.

Für alle 10 ausgewählten Gene läßt sich aus dem Northern Blot die induzierbare Expression unter dem Einfluß unterschiedlicher Stressoren ableiten. Die Pufferkontrolle zeigt, daß wahrscheinlich als Folge der Verwundung für die meisten untersuchten Gene nach mehreren Stunden Inkubation ebenfalls das entsprechende Transkript akkumuliert ( Abb. 25 ).

Tab. 10 ). Blattscheiben von 8 Wochen alten WT-Pflanzen wurden zu Beginn (Experiment I) bzw. zum Ende der Lichtphase (Experiment II) im Gewächshaus ausgestochen und für die angegebenen Zeiten auf
10 mM K-Phosphat-Puffer (pH 7,0) mit folgenden Zusätzen inkubiert: 1 bzw. 10 µM Methylviologen (MV); 1 bzw. 10 µM Acifluorfen (AC); 1 mM H₂O₂; 10 bzw. 100 µM Salicylsäure (SA). Die Starklichtbehandlung erfolgte bei 1500 µE m^-2 s^-1, die Kältebehandlung bei 6°C, und beim Trockenstreßversuch wurden die Blattscheiben ohne Puffer inkubiert. Im Streßexperiment I wurden die Blattscheiben nach 24h Dunkel- (24D) sowie nach weiteren 5h Lichtinkubation (+5L; 200 µE m^-2 s^-1) eingefroren. Im Streßexperiment II schloß sich einer Inkubation von 12h im Dunkeln (12D) entweder ein um 6h verlängertes Verweilen im Dunkeln (+6D) oder im Licht an (+6L; 200 µE m^-2 s^-1), bevor die Blattscheiben ebenfalls in flüssigem N₂ eingefroren wurden. Zusätzlich wurden zum Zeitpunkt 0h, d.h. beim Ausstechen der Blattscheiben, Proben als Kontrolle gewonnen. Je 10 µg der aus den Blattscheiben gewonnenen Gesamt-RNA wurden pro Spur auf formamid/formaldehydhaltige Agarose-Gele aufgetragen und diese elektrophoretisch getrennt. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Beladung der Gelspuren wurde die RNA in den Gelen mit Ethidiumbromid angefärbt. Das Blotten, Hybridisieren und Waschen entsprach den Angaben aus Abb. 23 . Zu weiteren experimentellen Details s. Abschnitt - .

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Kältebehandlung hat nur bei den Genen für Grx, HSP70 und das Ubiquitin-Extensions-Protein eine induzierende Wirkung. Allen drei Proteinen wird eine Funktion unter extremen Temperaturbedingungen zugeschrieben (s. auch Tab. 10 ).

Die Starklichtbehandlung führt vor allem beim Phytocyanin zur Akkumulation des Transkripts. Da diese aber schon (wie auch beim GRP, SAR und Hap) bei der Dunkel(vor)inkubationsphase sichtbar ist, scheint hier eine Überlagerung von Verwundungs- und HL-Effekt vorzuliegen. Die Expression von Phytocyanin ist als pathogen- und daher wahrscheinlich auch verwundungs-induzierbar beschrieben worden (s. auch Tab. 10 ).

Trockenstreß führt unter den Bedingungen des Experiments I nur beim Transkriptionsfaktor Hap5 zur verstärkten Expression, während im Experiment II nur das Ubiquitin-Extensions-Protein mit Transkriptakkumulation reagierte. Beide Gene sind allgemein als streß-responsiv

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Das Herbizid Methylviologen, daß vor allem im Licht zur vermehrten Bildung von Superoxid am PS I und bereits im Dunkeln in den Mitochondrien führt, zeigt vor allem bei der Expression von SAR, HAP, Formiat-Dehydrogenase und Grx sowie bei einer Konzentration von 10 µM auch beim Ubiquitin-Extensions-Protein Wirkung. Dabei werden die jeweils größten Transkriptmengen am Ende der Dunkelinkubation beobachtet. Dies bedeutet, daß bereits vor Eintritt der lichtabhängigen ^•O₂^-- Produktion die Gene von Schutz- und Abwehrenzymen aktiviert werden.

Für fast alle analysierten Gene wird eine starke Expression in Anwesenheit des Herbizids Acifluorfen beobachtet. Dieser Inhibitor der PPO vom Diphenylether-Typ der 2. Generation
(s. - , - ) bewirkt die Akkumulation und Autoxidation von Protoporphyrinogen, dessen oxidierte Form ebenfalls ein potenter Photosensibilisator ist ( Böger und Wakabayashi 1995, Wakabayashi und Böger 1999). Deshalb ist der Einsatz dieses Hemmstoffes direkt mit den Auswirkungen des Lichtshift-Experiments vergleichbar. Es ist interessant, daß auch hier die stärkste Akkumulation der Transkripte bereits während der Dunkelinkubation erfolgt, d.h. bevor der eigentliche photodynamische Schaden entsteht.

Wasserstoffperoxid induziert vor allem die Expression der Gene SAR8.2, Hap5, Grx und Phytocyanin. Da H₂O₂ eine bedeutende Rolle bei der Signaltransduktion von Infektionsereignissen zugeschrieben wird (s. - ) überrascht der Einfluß auf die Transkriptmengen dieser pathogen- bzw. verwundungs-responsiven Gene nicht. Grx-defiziente Hefe-Mutanten sind z.B. hypersensitiv gegenüber H₂O₂ (s. Tab. 10 ). Die durch H₂O₂ ausgelösten zellulären Redoxverschiebungen wirken direkt auf die DNA-Bindeeigenschaften des Transkriptionsfaktors HAP5 (s. Tab. 10 ), so daß vermutet werden könnte, daß auch die Transkriptmenge in Abhängigkeit von H₂O₂ reguliert wird.

Erwartungsgemäß wird die Expression des bereits als „Salicylsäure-responsiv“ beschriebenen Proteins 8.2 durch Salicylsäure positiv beeinflußt. Aber auch DAD1, Hap5 und die Gene für Formiat-Dehydrogenase, Glutaredoxin und Phytocyanin reagieren auf die Applikation dieser als Signaltransmitter bei der Ausprägung der systemisch erworbenen Resistenz (SAR) bedeutenden Substanz (s. - ). Diese SA-abhänigige Induktion der getesteten Gene aus der subtrahierten cDNA-Bank läßt sich sehr gut mit dem meßbaren Anstieg von Salicylsäure während des Lichtshift-Experiments vereinbaren (s. - ).

Insgesamt zeigen diese Versuche, daß viele der in der photosensibiliserungs-spezifischen, subtrahierten cDNA-Bank zusammengefaßten Gene auch auf andere Streßfaktoren mit der

99

6.3 Untersuchungen zum Gly-reichen Protein (GRP) und Charakterisierung von GRP-AS-Pflanzen

Die cDNAs für dieses Protein waren einerseits sehr zahlreich in der subtrahierten Bank vertreten (s. - ), und andererseits war nur wenig zur Funktion dieses als virus-induzierbar beschriebenen Proteins bekannt ( Van Kan et al. 1988, Showalter et al. 1992, Brady et al. 1993) Zusätzlich zu den in Abschnitt - beschriebenen Analysen zur Streßinduzierbarkeit wurde auch die Transkriptakkumulation in den unterschiedlichen Pflanzenorganen und zu verschiedenen Tageszeiten untersucht. Dazu wurde die vorliegende cDNA als Sonde in Northern Blot-Analysen an WT-Pflanzen eingesetzt ( Abb. 26 - Abb. 28 ).

Abb. 26 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in unterschiedlichen Organen von WT-Tabakpflanzen. Je 10 µg Gesamt-RNA aus den in der Mitte der Lichtperiode geernteten Organen von acht (Blätter 1-4, 5-8, Mittelrippe, Wurzel) bzw. zwölf Wochen alten Tabakpflanzen (alle übrigen Organe), die unter Gewächshausbedingungen angezogen worden waren, wurden elektrophoretisch in formamid/formaldehyd-haltigen Agarosegelen aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nylonmembranen wurde mit einem 297 bp langen und radioaktiv markierten cDNA-Fragment von GRP unter hoch-stringenten Bedingungen hybridisiert und die Filter anschließend gewaschen. Die autoradiografische Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Phosphorimagers. Als Kontrolle für die gleichmäßige Beladung des Gels mit RNA diente die Färbung mit Ethidiumbromid (s. auch - ).

GRP-Transkripte konnten in allen untersuchten Organen nachgewiesen werden ( Abb. 26 ). Nur in den Stamina, Griffeln und Narben sowie den Fruchtknoten war die detektierbare Transkriptmenge sehr gering. Offenbar hybridisierte die verwendete Sonde mit mehreren (2-3) Isoformen von GRP, da Banden mit unterschiedlichem Molekulargewicht erkennbar waren. Dabei war die Bande, die dem niedrigsten Molekulargewicht entsprach, diejenige mit dem stärksten Hybridisierungssignal, weswegen es sich bei den anderen Banden auch um Splicing-Zwischenprodukte handeln könnte.

100

Abb. 27 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in unterschiedlich alten Blättern von WT-Tabakpflanzen. Die Position der Blätter beim Zählen von der Spitze zur Basis ist angegeben. Die Proben wurden in der Mitte der Lichtperiode von Pflanzen geerntet, die seit acht Wochen unter Gewächshausbedingungen gewachsen waren. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .

Die Untersuchung zur Akkumulation von GRP-Transkript im Licht/Dunkelrhythmus ergab Hinweise, daß sich die Menge von GRP-mRNA zum Ende der Dunkelperiode verringert und innerhalb der ersten Hälfte der Lichtperiode wieder auf das Normalniveau ansteigt ( Abb. 28 ). Für eine detaillierte Aussage zum diurnalen Rhythmus sind aber weitere Analysen nötig, die eine größere Anzahl von Zeitpunkten umfassen.

Abb. 28 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) zu unterschiedlichen Tageszeiten im fünftjüngsten Blatt von WT-Tabakpflanzen. Die Pflanzen wurden für acht Wochen in einer Klimakammer unter kontrollierten Bedingungen angezogen (13.00-01.00 Uhr (12h): 400 µE m^-2 s^-1, durchgehend 25°C, 70% rel. Luftfeuchte). Die Proben wurden zu Beginn (0h), in der Mitte (6h) und zum Ende der Lichtperiode (12h) sowie in der Mitte der Dunkelperiode (18h) gewonnen. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .

Um Hinweise auf die Funktion des GRP zu erhalten, wurden transgene Pflanzen erzeugt, die das cDNA-Fragment für GRP in Antisense-Orientierung enthalten (s. - , - ). Die Primärtransformanten und F₁-Nachkommen ausgewählter transgener Individuen unterschieden sich phänotypisch nicht von den WT-Pflanzen (Daten nicht gezeigt). Die PCR-Analyse der genomischen DNA von Primärtransformanten unter Einsatz des 35S-Promoter- und des 288AS-Primers zeigte, daß 98 der untersuchten 110 Primärtransformanten tatsächlich transgen waren,

101

Abb. 29 Northern Blot-Analyse der Expression des Gly-reichen Proteins (GRP) in den Blättern 3, 5 und 7 (gezählt von der Spitze in Richtung Basis) von 3 WT-Pflanzen und 13 ausgewählten Primärtransformanten, die mit einem GRP-AS-Konstrukt transformiert sind (s. - , - ). Von den Pflanzen, die für 6 Wochen unter Gewächshausbedingungen angezogen worden waren, wurden in der Mitte der Lichtperiode Blattproben genommen und Gesamt-RNA präpariert. Weitere technische Details in der Legende zur Abb. 26 .

Für die vier ausgewählten GRP-AS-Pflanzen 21, 27, 35 und 52 wurde in einer Southern Blot-Analyse versucht, die Anzahl der Transgen-Kopien zu ermitteln. Das Ergebnis der Hybridisierung von mit Xba I bzw. Hind III fragmentierter genomischer DNA zeigte, daß in den WT-Pflanzen zwischen 4 und 8 Genkopien und/oder Isoformen existieren ( Abb. 30 ).

Abb. 30 Southern Blot-Analyse der DNA von zwei WT-Pflanzen und von vier GRP-AS-Primärtransformanten. Je 10 µg genomische DNA wurden mit den Restriktionsendonukleasen Hind III, Sph I bzw. Xba I vollständig fragmentiert und die Fragmente anschließend in Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Transfer und Fixierung der DNA auf Nylonmembranen wurden diese unter stringenten Bedingungen mit einer radioaktiv markierten GRP-Sonde hybridisiert und gewaschen. Weitere Angaben in - .

102

Zusammengefaßt ergab die Analyse der Expression von GRP in Tabakpflanzen folgende Ergebnisse:

GRP wird in allen untersuchten Organen exprimiert, wobei die Expression in den reproduktiven Organen (Stempel, Stamina) sehr niedrig ist. Die größeren Transkriptmengen sind vor allem in jüngeren Blättern nachweisbar, in denen es zum Ende der Dunkelperiode hin zu einem Absinken des GRP-mRNA-Gehaltes kommt. Transgene Pflanzen, in deren Genom GRP-AS-Konstrukte integriert sind, weisen unter normalen Umweltbedingungen keinerlei Unterschiede zu WT-Pflanzen auf. Mit der eingesetzten cDNA-Sonde konnte nur in einem Fall eine im Vergleich zu WT-Pflanzen verringerte Transkriptmenge festgestellt werden. Weitere Analysen unter Bedingungen, bei denen die Pflanzen gezielt Stressoren ausgesetzt werden, könnten Hinweise auf die Funktion der GRP-Isoformen geben. In Experimenten mit Blattscheiben wurde bereits gezeigt, daß die Expression von GRP unter dem Einfluß von Umweltstreß ansteigt (s. - ).

6.4 Alternativer Ansatz zur Isolation von pflanzlichen Genen, die Streßtoleranz bzw. -resistenz vermitteln

In einem Nebenprojekt der Arbeit wurde versucht, Gene aus A. thaliana zu identifizieren, die durch ihre Expression in S. cerevisiae Toleranz bzw. Resistenz gegenüber chemisch induziertem oxidativen Streß verleihen (s. - ). Dies setzte voraus, daß die pflanzliche cDNA auch in den Hefezellen in aktiver Form exprimiert wird. Der WT-Stamm YPH250 von S. cerevisiae wurde dazu mit einer im Hefe-Expressionsvektor pFL61 klonierten cDNA-Bank aus A. thaliana ( Minet et al.1992) transformiert. Bei der anschließenden Suche nach Transformanten mit gesteigerter Toleranz gegenüber chemisch erzeugtem oxidativen Streß kamen mehrere Oxidationsmittel zur Anwendung, u.a. das Vitamin K-Derivat Menadion, das zur vermehrten Bildung von Superoxid beiträgt. Die Selektion von Transformanten-Kolonien, die sich tolerant gegenüber ansonsten letalen Dosen von Menadion im Medium zeigten, waren ein erster Schritt hin zur Isolation einer Transformante, deren Plasmid auch nach Isolation und Re-Transformation in andere YPH250-Zellen diese neue Eigenschaft vermittelte ( Abb. 31 ). In semiquantitativen Tests konnte gezeigt werden, daß die Transformante in hoher Zelldichte im

103

Abb. 31 Ergebnis der Komplementationsversuche von Hefezellen mit einer cDNA-Bank aus A. thaliana. Das Wachstum des mit dem leeren Plasmid pFL61 transformierten Stamms YPH250 (jeweils obere Reihe) und des transformierten Stamms #3, bei dem das Plasmid die cDNA für eine Pectinacetyl-Esterase beinhaltet (jeweils untere Reihe) wurde auf unterschiedlichen Medien getestet: A) Minimalmedium (YNB + Glc - Uracil) und B) gleiches Minimalmedium mit 120 µM Menadion. Dieses Vitamin K-Derivat führt zur verstärkten Produktion von Superoxid. Die Flüssigkulturen beider Stämme in der frühen stationären Phase wurden nach photometrischer Bestimmung bei 600 nm durch die Zugabe von Medium auf gleiche Zelldichte eingestellt und anschließend mit sterilem Wasser schrittweise 1:10 verdünnt. Je 20 µl der Verdünnungen, die ca. 1 x 10⁶, 1 x 10⁵ ... 10 Zellen enthielten, wurden auf festes Minimalmedium getropft und die Petrischalen anschließend für 84 h bei 30°C inkubiert. Nur die Transformante #3 ist in der Lage, auch in Anwesenheit von erhöhten Menadionkonzentrationen zu wachsen.

Dieses Projekt wurde wegen des wachsenden Arbeitsaufwandes und steigenden Erfolgs der parallel unternommenen Konstruktion und Analyse einer subtrahierten cDNA-Bank mittels SSH aufgegeben. Mit dem Hefe-Komplementationsansatz wäre auch die Konzentration auf frühe Zeitpunkte von Streß schwieriger zu bewerkstelligen gewesen.

104

6.5 Ergebnisse der begleitenden biochemischen Analyse während des Lichtshift-Experiments

Neben der Analyse der Kinetik der Transkriptakkumulation für die durch subtraktive Hybridisierung identifizierten Gene, standen biochemische Untersuchungen vor allem hinsichtlich der antioxidativen Schutzsysteme im Mittelpunkt der Arbeiten mit dem Lichtshift-System. Aber auch andere Parameter wie die Gehalte von Chlorophyll, Carotinoiden und phenolischer Verbindungen wurden in quantitativen Tests bestimmt.

6.5.1 Veränderungen von Chlorophyll- und Carotinoidgehalt

Sowohl UROD- als auch CPO-AS-Pflanzen mit ausgeprägtem nekrotischen Phänotyp unterscheiden sich hinsichtlich ihres Chlorophyllgehaltes in den Blättern nur unwesentlich von WT-Pflanzen (s. - , Kruse et al. 1995b, Mock und Grimm 1997). Die Resultate der Untersuchung von Blattproben, die während des Lichtshift-Experiments gewonnen wurden, bestätigten dieses Ergebnis ( Abb. 32 ). Hier wurden in den transgenen Pflanzen teilweise größere Chlorophyllmengen bestimmt, als in den WT-Pflanzen. Der allgemeine Eindruck, daß die Blätter durch die verlängerten Lichtphasen dunkelgrün wurden, während sie vorher unter dem Einfluß der Kurztagbedingungen eher hellgrün waren, läßt sich offenbar mit der Zunahme der Blattdicke erklären, da nur der Gesamt-Chlorophyllgehalt pro Blattfläche innerhalb der ersten drei Tage von ca. 130 auf 160-200 mg m^-2 anstieg, der auf Frischgewicht bezogene Wert hingegen keine klare Tendenz aufwies. Vielmehr beobachtet man hier Schwankungen in den Werten, die vor allem auf die relative Inhomogenität des Probenmaterials hinweisen, die auch durch den Modus der Probennahme nicht ausgeschlossen werden konnte (s. auch - , - ). Nach drei Tagen schien die Anpassung der Blattmorphologie an die veränderten Lichtbedingungen abgeschlossen zu sein, da der auf Blattfläche berechnete Chlorophyllgehalt eine Art Plateau erreichte.

Das Chlorophyll a/b-Verhältnis blieb im Verlauf des Lichtshift-Experiments relativ unverändert, lag aber in den CPO-AS-Pflanzen vor allem ab dem 2. Tag höher als in den WT-Pflanzen.

105

Abb. 32 Chlorophyllgehalt und Verhältnis von Chlorophyll a/b in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 während des Lichtshift-Experiments. Chlorophyll- und Carotinoidgehalte (s. Abb. 33 ) wurden in methanolischen Extrakten photometrisch bestimmt und nach Formeln von Lichtenthaler und Wellburn (1983) berechnet (s. auch - ). Links sind die Gehalte in Bezug zum Frischgewicht, rechts auf der Basis von Blattfläche angegeben. Die Zeitachse beginnt am Anfang der ersten von 6 auf 16h verlängerten Lichtphase am Tag 1 des Lichtshift-Experiments und endet am Beginn der Lichtperiode am 5. Tag des Versuchs (96h). Am oberen Rand der Abb. wird durch schwarze die Dunkel- und durch weiße Rechtecke die Lichtphase symbolisiert. Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ergebnisse von sechs Blattextrakten aus mehreren Lichtshift-Versuchen sind gezeigt.

Die unterschiedlichen, in Pflanzen vorkommenden Carotinoide übernehmen sowohl Lichtsammel- als auch protektive Funktionen in den Photosystemen. Hier konnte ebenfalls im Verlauf des Lichtshift-Experiments eine Anpassung an die erhöhten Lichtdosen beobachtet werden ( Abb. 33 ). Der auf Blattfläche bezogene Carotinoidgehalt zeigte diurnale

106

Das Verhältnis von Carotinoiden zu Chlorophyll zeigte am Ende der Lichtphase des
2. Lichtshift-Tages ein Maximum, was ebenfalls eine allgemeine Reaktion auf veränderte Lichtbedingungen zu sein scheint, da der Wert für die WT-Pflanzen höher lag als der für CPO-AS-Pflanzen.

Abb. 33 Carotinoidgehalt und Verhältnis von Carotinoiden zu Gesamt-Chorophyll in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Verlauf des Lichtshift-Experiments. Weitere Details sind in der Legende zur Abb. 32 beschrieben.

6.5.2 Aktivität ausgewählter antioxidativer Schutzenzyme und Gehalt an niedermolekularen Antioxidantien während des Lichtshift-Experiments

6.5.2.1 Analyse der Aktivität verschiedener Isoformen der SOD mittels nicht-denaturierender PAGE

Analog zur Bestimmung der Aktivität unterschiedlicher Isoenzyme der SOD an bereits nekrotischen Pflanzen (s. - ), wurden auch Blattproben aus den Lichtshift-Experimenten durch native PAGE und Aktivitätsfärbung der SOD-Banden im Gel analysiert (s. - ).

Die Gesamtaktivität aller SOD-Isoformen war ab dem Ende der Lichtphase am ersten Tag des

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Über den gesamten Zeitraum des Lichtshift-Experiments hinweg trat ausschließlich in den CPO-AS-Pflanzen zusätzliche SOD-Aktivität in Form einer schwachen Bande auf, die im Gel kurz oberhalb der plastidären Fe-SOD sichtbar wurde. Die Kinetik dieser Aktivität folgte der der plastidären Fe-SOD, machte aber nur 30-50% dieser Isoform-Aktivität aus.

Zusammenfassend betrachtet, wurde in den CPO-AS-Pflanzen im Vergleich zum WT eine erhöhte Isoenzym-Aktivität der SOD ab dem Ende der ersten verlängerten Lichtphase sichtbar, die ihr Maximum ca. 48h nach Beginn des Lichtshift-Experiments aufwies und damit zeitlich mit der Ausbildung von Blattläsionen zusammenfiel. Die Aktivierung der SOD betraf zu verschiedenen Zeitpunkten die Isoformen aller Zellorganellen, so daß auf einen die ganze Zelle betreffenden Bedarf an Entgiftungspotential für Superoxid geschlossen werden kann. Die teilweise gegensätzlich im Tagesgang schwingenden Aktivitäten der verschiedenen SOD-Isoformen ergaben für die aus der Summe der Einzelaktivitäten berechnete Gesamt-SOD-Aktivität ein arhythmisches Bild. Die größten Unterschiede in der Gesamtaktivität bestanden zwischen 48 und 64h nach Beginn des Experiments und markieren damit den Zeitraum rascher Nekrotisierung von Blattgewebe der CPO-AS-Pflanzen.

108

Abb. 34 Enzymaktivität einzelner Isoformen der SOD in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Aliquots von Proteinextrakten mit je 40 µg Protein aus Blattproben von drei Lichtshift-Experimenten wurden gelelektrophoretisch unter nicht-denaturierenden Bedingungen aufgetrennt und die Enzymaktivität in den SOD-Banden durch Färbung sichtbar gemacht. Die Gele wurden anschließend densitometrisch ausgewertet (s. - ), und Mittelwerte sowie Standardabweichungen der anhand eines aufgetragenen Mn-SOD-Standards in Units/Aktivitätsbande berechneten Enzymaktivitäten sind angegeben. Die Abb. zeigt Daten für die Summe aller Isoenzym-Aktivitäten, die cytosolische bzw. plastidäre Cu/Zn-SOD, die mitochondriale Mn-SOD, die plastidäre Fe-SOD und eine zusätzliche Aktivitätsbande, die nur in den CPO-AS-Pflanzen auftrat. Die Angaben zum zeitlichen Rahmen des Experiments entsprechen den Details aus Abb. 32 .

109

6.5.2.2 Aktivität ausgewählter Enzyme des Ascorbat-Glutathion-Zyklus: APX und GR

Die während des Lichtshift-Experiments auftretende Aktivierung von Isoenzymen der SOD in den CPO-AS-Pflanzen (s. - ) könnte auch eine Erhöhung der Aktivität der im Ascorbat-Glutathion-Zyklus nachgeschalteten Enzyme nach sich ziehen, damit das vermehrt als Produkt der SOD-Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid entgiftet werden kann (s. - ). Tatsächlich wurde der bereits am Ende der ersten Lichtperiode sichtbare Aktivitätsanstieg der SOD
(s. Abb. 34 ) durch eine erhöhte Aktivität der APX begleitet. Dieser Anstieg setzte sich im Verlauf des Experiments in den CPO-AS-Pflanzen fort, wobei die APX-Aktivität am Ende des 4. Versuchstages fast 300 % des zum Beginn des Experiments gemessenen Wertes und damit auch das Dreifache des WT-Wertes betrug ( Abb. 35 ).

Abb. 35 Aktivität der löslichen Isoformen von Ascorbat-Peroxidase (APX) und Glutathion-Reduktase (GR) in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Die Details zum zeitlichen Rahmen der Experimente sind in der Legende zur Abb. 32 beschrieben. Der letzte, hier dargestellte Zeitpunkt (88h) entspricht dem Ende der vierten verlängerten Lichtperiode. Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet.

Nur transient, und bei weitem im Umfang nicht so ausgeprägt, waren die Veränderungen der gemessenen GR-Aktivität ( Abb. 35 ). Hier beobachtete man nur vom Ende der ersten bis zum Ende der zweiten Lichtperiode einen Anstieg der Aktivität um ca. 50 % in den CPO-AS-Pflanzen, in denen in diesem Zeitbereich erste Nekrosen sichtbar wurden. Beginnend mit dem Wert bei 88h traten allerdings auch zum Ende des Lichtshift-Experiments hin wieder erhöhte

110

6.5.2.3 Einfluß des Lichtshift-Experiments auf die Proteinmenge von APX und Catalase

Neben der Aktivität wurde für ausgewählte Enzyme auch die Proteinmenge während des Lichtshift-Experiments untersucht. Trotz der Steigerung der Gesamtaktivität aller löslichen APX-Isoformen in den CPO-AS-Pflanzen während des Lichtshift-Experiments ( Abb. 35 ), konnten für die cytosolische APX praktisch keine Unterschiede in der Menge zwischen WT- und CPO-AS-Pflanzen oder im zeitlichen Verlauf festgestellt werden ( Abb. 36 ).

Abb. 36 Repräsentatives Ergebnis der Western Blot-Analyse von Proteinextrakten aus Blättern von WT- (W) und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 (T) im Lichtshift-Experiment. Gleiche Mengen an Protein (10 µg) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Der zum Nachweis der APX verwendete monoklonale Antikörper, der gegen cytosolische (cyt.) APX aus Spinat erzeugt wurde, war freundlicherweise durch H. Saji (Onagawa, Japan) zur Verfügung gestellt worden. Das Serum gegen Catalase (CAT) aus Tabak stammt aus dem Labor von D. Klessig (Piscataway, USA). Zusätzlich zu den Daten für die 16h der ersten verlängerten Lichtperiode (0-16h) sind die Zeitpunkte 24, 48, 72, 96 und 168h nach Beginn des Lichtshift-Experiments gezeigt, die dem Beginn der Lichtperiode am Tag 2, 3, 4, 5 und 8 entsprechen. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)

Im Gegensatz dazu wurde für die Catalase eine deutliche Zunahme der Proteinmenge innerhalb

111

6.5.2.4 Niedermolekulare Antioxidantien im Lichtshift-Experiment: Ascorbat, Glutathion und Tocopherol

Wegen der unter Schwachlicht- im Vergleich zu Gewächshausbedingungen geringeren Biosynthesekapazität beobachtete man in den Pflanzen zu Beginn des Experiments sehr niedrige Werte für reduziertes und Gesamt-Ascorbat ( Abb. 37 , vgl. auch Abb. 14 ).

Abb. 37 Reduziertes und Gesamtascorbat in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 in den ersten 88h des Lichtshift-Experiments. Mittelwerte und Standardabweichungen der Werte aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Für Details zu den Probennahmezeitpunkten
s. Abb. 32 .

112

Die Kinetik der Glutathiongehalte wies ein ähnliches Profil auf ( Abb. 38 ). Auch hier konnte ein Anstieg sowohl für reduziertes als auch für Gesamt-Glutathion in WT- und CPO-AS-Pflanzen im Verlauf der ersten verlängerten Lichtperiode beobachtet werden (0-16h). Diese Steigerung im Gehalt von GSH war beim Bezug der Werte auf die Blattfläche deutlicher als bei der Berechnung auf der Basis von Frischgewicht. Wie bereits für den Ascorbatgehalt festgestellt wurde, kehrten auch die Mengen von reduziertem und oxidiertem Glutathion am Tag 2 des Lichtshift-Experiments auf das jeweilige Ausgangsniveau zurück. Während sich das Redoxverhältnis am ersten Tag des Versuchs noch einschwang, wies es an den folgenden Tagen eine deutliche Anpassung an den Tag/Nacht-Rhythmus auf. Dabei wurden die stärker reduzierten Werte stets am Ende und die stärker oxidierten Werte immer am Anfang der Dunkelperiode gemessen. Ab dem Beginn der Lichtperiode am 3. Versuchstag (48h) wurde ein um 4-5 % stärker oxidiertes Redoxverhältnis in den CPO-AS-Pflanzen als in den WT-Pflanzen offenbar.

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Abb. 38 Reduziertes (GSH) und oxidiertes Glutathion (GSSG) sowie das daraus resultierende Redoxverhältnis in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Die Werte sind in Bezug auf Frischgewicht (links) bzw. Blattfläche (rechts) dargestellt. Mittelwerte und Standardabweichungen der Werte aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Für Details zu den Zeitpunkten der Probennahme s. Abb. 32 . Im Gegensatz zu den in Abb. 14 als Resultat eines photometrischen Tests präsentierten Daten sind die hier gezeigten Werte Ergebnisse von HPLC-Analysen, in denen GSH und GSSG gleichzeitig gemessen werden konnten.

Als besonders in der hydrophoben Umgebung von Membranen essentielles Antioxidants wurde die Kinetik des Tocopherolgehalts im Lichtshift-Experiment untersucht ( Abb. 39 ). Hierbei wurde durch die HPLC-Analyse zwischen - und +-Tocopherol unterschieden. Sowohl in WT- als auch in CPO-AS-Pflanzen kam es innerhalb der ersten verlängerten Lichtphase des Experiments zu einem drastischen Anstieg im -Tocopherolgehalt. Dabei waren bereits zu Beginn der Lichtperiode in den CPO-AS- im Vergleich zu WT- Pflanzen auf das Dreifache erhöhte Spiegel vorhanden, die nach 16h Belichtung schließlich ein ähnliches Niveau erreichten. Bereits mit Beginn bzw. dem Ende der zweiten Lichtperiode (24 bzw. 40h) wurden in WT bzw. CPO-AS-Pflanzen wieder niedrige -Tocopherolgehalte erreicht, die sich auf dem Niveau der Anfangswerte für die WT-Pflanzen bewegten. Die Werte, die 48, 64 und 96h nach

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Abb. 39 - und +-Tocopherol in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Die Abbildung zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 Extrakten aus Proben eines Lichtshift-Experiments. Tocopherol wurde durch HPLC bestimmt. Für Details zu den Zeitpunkten der Probennahme s. Abb. 32 .

Für +-Tocopherol konnte wiederum eine ausgeprägte diurnale Rhythmik beobachtet werden, die durch die Zunahme des Gehaltes im Verlauf der Lichtphase und jeweils leicht absinkendes Konzentrationsniveau in den Dunkelphasen gekennzeichnet war. Dabei stieg die Konzentration in den Blättern mit zunehmender Dauer des Lichtshift-Experiments an und erreichte am
3. Versuchstag ein Plateau. In den Blättern der untersuchten WT-Pflanzen ließen sich zu den meisten Zeitpunkten höhere Gehalte an +-Tocopherol nachweisen als in den CPO-AS-Pflanzen. Außer während der ersten verlängerten Lichtperiode, in der -Tocopherol in WT- und CPO-AS-Pflanzen bis zu fünffach höhere Werte als für +-Tocopherol aufwies, waren die

115

6.5.2.5 Indikatoren für Lipidperoxidation und Membranschädigung im Lichtshift-Experiment: Nachweis von Ethan und TBA-RS

Mit der Bestimmung von Ethan und der thiobarbitursäurereaktiven Substanzen (TBA-RS) wurden zwei unabhängige Marker für Membranschädigung infolge von Lipidperoxidation ermittelt (s. - , - ). In Form von Ethan wird dabei ein direktes Endprodukt und mit dem Malondialdehyd als Hauptbestandteil der TBA-RS ein Zwischenprodukt des Lipidabbaus nachgewiesen. Bereits in den Untersuchungen an porphyrischen Pflanzen mit vollständig ausgeprägtem nekrotischen Phänotyp hatte sich herausgestellt, daß die Akkumulation von photosensibilisierenden Tetrapyrrolen erhöhte Spiegel an TBA-RS verursacht, d.h. daß das Auftreten von Blattläsionen von einer verstärkten Lipidperoxidation begleitet wird (s. - , Mock et al. 1998). Diese Ergebnisse konnten mit der Analyse der Anreicherungskinetik von Lipidperoxidationsprodukten in zwei unterschiedlichen Lichtshift-Experiment bestätigt werden ( Abb. 40 ). In einem gemeinsamen Versuch von H.-P. Mock und C. Triantaphylidès (CEA Cadarache, Frankreich) mit CPO-AS-Pflanzen wurde gezeigt, daß die Menge an nachweisbarem Ethan sofort ansteigt, wenn den Pflanzen eine größere Lichtmenge verabreicht wird. Im Verlauf dieses Experiments, in dem nicht die Länge der Lichtperiode vergrößert sondern die Lichtintensität erhöht wurde, stieg die Ethanbildung auf das Fünffache des WT-Wertes.

Auch im wie üblich durchgeführten Lichtshift-Experiment konnte man bereits 8h nach Beginn der Lichtperiode am ersten Tag einen im Vergleich zum WT deutlich erhöhten Wert für die Menge an TBA-RS nachweisen ( Abb. 40 ). Bis zu 4h nach Beginn der Lichtphase war hingegen noch kein Unterschied zu WT-Pflanzen festzustellen, was dafür spricht, daß eine verstärkte Lipidperoxidation tatsächlich erst durch die Verlängerung der Lichtperiode ausgelöst wird. Die in den CPO-AS-Pflanzen gemessene Menge an TBA-RS nimmt bis zum Ende der Lichtperiode am 2. Tag (40h) stetig zu, um danach, wie auch für die WT-Pflanzen beobachtet, in eine Art diurnalen Rhythmus zu fallen. Die Werte bleiben dabei in den CPO-AS- immer höher als in den WT-Pflanzen und entsprachen den Konzentrationen, die von porphyrischen Pflanzen mit vollständig nekrotischem Phänotyp bekannt waren (s. Abb. 15 ).

116

Abb. 40 Bildung von Ethan (links) und TBA-RS (rechts) als Indikatoren der verstärkten Lipidperoxidation infolge der Veränderung der Lichtbedingungen in porphyrischen Pflanzen der Linie CPO-AS 1/41 und Vergleich mit Daten für WT-Pflanzen. In einem modifizierten Lichtshift-Experiment wurde die den Pflanzen verabreichte Lichtdosis durch Erhöhen der Intensität von
70 auf 650 µE m^-2 s^-1 vergrößert und das gebildetet Ethan gaschromatografisch quantifiziert. Der Versuch wurde dreimal wiederholt und Mittelwerte aus den Daten berechnet. Die Standardabweichungen waren < 10%. Die Details zu den Lichtshift-Experimenten, bei denen Probenmaterial für die Bestimmung der TBA-RS gewonnen wurde, sind in der Legende zur
Abb. 32 beschrieben. Die dargestellten Werte verkörpern Mittelwert und Standardabweichung für mehrere unabhänigige Lichtshift-Experimente.

In weitergehenden HPLC-Analysen der Lipidperoxidationsprodukte, die unter den Bedingungen des Lichtshift-Experiments in den porphyrischen Pflanzen entstehen, wurden Hinweise darauf erhalten, daß der Großteil dieser Produkte nicht-enzymatischen Ursprungs ist. Da fast ausschließlich racemische Gemische der auch Oxylipine genannten Produkte vorliegen, kann die Beteiligung von Lipoxygenasen (LOX) weitgehend ausgeschlossen werden (I. Feußner,
H.-P. Mock, persönliche Mitteilung).

6.5.3 Kinetik der Akkumulation von pathogenese-assoziierten Substanzen im Lichtshift-Experiment

Wie bereits dargestellt wurde, zeichnen sich tetrapyrrol-akkumulierende Tabakpflanzen durch die Aktivierung von zellulären Programmen aus, die normalerweise bei der Abwehr von Pathogeninfektionen oder Verwundung eingeschaltet werden. Dazu zählt die besonders in den nekrotischen Abschnitten von Blättern nachweisbare Anhäufung von PR-Proteinen, Scopolin und Salicylat (s. - , Mock et al. 1999). Das zeitliche Verhältnis dieser Prozesse zur Ausbildung der Blattläsionen sollte zusätzlich durch Lichtshift-Experimente untersucht werden.

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6.5.3.1 Untersuchungen zur phenolischen Verbindung Scopolin, H₂O₂ und Salicylsäure

Während Chlorogensäure, die die quantitative Hauptkomponente der phenolischen Verbindungen in Tabak darstellt, als Reaktion auf die erhöhte Lichtdosis sowohl in WT- als auch in CPO-AS-Pflanzen gleichermaßen auf das Dreifache anstieg, konnte für das Scopolin nur in den porphyrischen Pflanzen die dramatische Zunahme auf das mehrere Hundertfache konstatiert werden ( Abb. 41 ). Diese Verbindung, die in den WT-Pflanzen nur in Spuren nachweisbar war, hat antimikrobielle Eigenschaften und läßt sich bei dieser massiven Akkumulation durch seine blaue Autofluoreszenz nachweisen ( Mock et al. 1999).

Abb. 41 Gehalt von Scopolin und Chlorogensäure in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 bei Veränderung der Lichtbedingungen. Die Lichtshift-Experimente wurden in modifizierter Form durchgeführt: Nach achtwöchigem Wachstum unter Schwachlichtbedingungen (6h:200 µE m^-2 s^-1) wurden die Pflanzen in Klimakammern mit 12h: 400 µE m^-2 s^-1 überführt und die phenolischen Verbindungen in den methanolischen Blattextrakten durch HPLC analysiert. Der Zeitpunkt 0h entspricht dem Transfer der Pflanzen und damit gleichzeitig dem Beginn der veränderten Lichtbedingungen. Das repräsentative Ergebnis für die Extrakte eines Lichtshift-Experiments ist gezeigt. Mehrere Wiederholungen lieferten eine grundsätzlich gleiche Kinetik der Gehalte beider Substanzen mit allerdings stark schwankenden Absolutwerten, so daß auf die Berechnung von Mittelwerten verzichtet wurde. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)

Wasserstoffperoxid hat mehrere Funktionen im Stoffwechsel der Pflanzen (s. - , - ). So wird es bei Pathogenbefall im infektionsnahen Gewebe aktiv gebildet („oxidative burst“) und ist essentieller Bestandteil der Hypersensitivitätsreaktion (HR). Es entsteht aber auch als Zwischenprodukt bei der Entgiftung von Superoxid, welches z.B. in der Lichtreaktion der Photosynthese gebildet wird, und es ist außerdem Substrat von Peroxidationsreaktionen.

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Abb. 42 Wasserstoffperoxidgehalt in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 während des Lichtshift-Experiments. H₂O₂ wurde durch einen fluorimetrischen Test bestimmt ( - ), und Mittelwert und Standardabweichungen für drei unabhängige Lichtshift-Experimente wurden berechnet. Für die Details zum Lichtshift-Experiment s. Legende zu Abb. 32 .

Salicylsäure (SA) ist eine wichtige Signalsubstanz bei der Etablierung der systemisch erworbenen Resistenz (SAR, s. - ), die als Folge von Pathogeninfektionen an Pflanzen beobachtet wird. Auch in porphyrischen Pflanzen mit nekrotischem Phänotyp wurde ein massiver Anstieg von freier und vor allem von gebundener (konjugierter) SA im Vergleich zu WT-Pflanzen gemessen (s. - , Mock et al. 1999). Diese Ergebnisse wurden durch die Analyse von Blattproben bestätigt, die während des Lichtshift-Experiments gewonnen wurden ( Abb. 43 ).

In der zweiten Hälfte der ersten verlängerten Lichtperiode kam es zu einem kurzzeitigen steilen

119

Abb. 43 Gehalt von freier (links) und gebundener (konjugierter) Salicylsäure (rechts) in WT- und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 im Lichtshift-Experiment. Gezeigt werden repräsentative Einzelmessungen aus drei unabhängigen Versuchen, die zwar die gleiche Tendenz der Meßdaten aber stark differierende Absolutwerte aufwiesen. Deshalb wurde auf die Berechnung von Mittelwert und Standardabweichung aus den HPLC-Daten verzichtet. Zu den Details des zeitlichen Rahmens des Lichtshift-Experiments s. Legende zu Abb. 32 .

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6.5.3.2 Western Blot-Analyse von pathogenese-assoziierten Proteinen im Lichtshift-Experiment

Die nach Pathogeninfektionen beobachtete systemisch erworbene Resistenz (SAR) umfaßt u.a. die verstärkte Bildung und Akkumulation von pathogenese-assoziierten (PR-) Proteinen
(s. - ). Auch in porphyrischen Pflanzen mit nekrotischem Phänotyp wurde die Anreicherung von PR-Proteinen beobachtet (s. - , Mock et al. 1999). Zusätzlich lieferte der SSH-Ansatz Hinweise auf die Aktivierung der Expression von mehreren PR-Genen zu einem frühen Zeitpunkt des Lichtshift-Experiments, der vor dem Auftreten erster Blattläsionen liegt
(s. - , Tab. 10 , - ).

Auch die Western Blot Analyse von Proteinextrakten der Blattproben von Lichtshift-Experimenten zeigte eine deutliche Erhöhung der Proteinmenge von PR-S und der Sesquiterpen-Cyclase in Blättern von CPO-AS Pflanzen bereits am ersten Tag des Versuchs
8-12h nach Beginn der Belichtung. In WT-Pflanzen hingegen wurde im Verlauf des gesamten Experiments nur ein leichter Anstieg im Gehalt von PR-S sichtbar ( Abb. 44 ). Auch andere PR-Proteine (PR-1, PR-2, PR-Q) zeigten ein ähnliches Muster (H.-P. Mock, persönliche Mitteilung). Die Sesquiterpen-Cyclase katalysiert die Konversion von Farnesyldiphosphat in
5-Epi-aristolochen, welches ein Intermediat bei der Synthese von Sesquiterpen-Phytoalexinen, so z.B. dem Capsidiol, in Tabak ist. Die Kinetik der PR-Protein-Akkumulation entspricht sehr gut den zeitlichen Änderungen in der SA-Konzentration und der Anhäufung von Scopolin
(s. Abb. 41 u. Abb. 43 ) als zwei weiteren Indizien für pathogenese-assoziierte Abwehrreaktionen, die bereits zu prä-nekrotischen Zeitpunkten offenbar werden.

Abb. 44 Repräsentativer Western Blot von den zwei pathogenese-assoziierten Proteinen Sesquiterpen-Cyclase und PR-S in WT- (W) und CPO-AS-Pflanzen der Linie 1/41 (T). Die experiementellen Details entsprechen denen aus Abb. 36 . Der Antikörper gegen die Sesquiterpen-Cyclase wurde freundlicherweise von J. Chappel (Lexington, USA), der gegen PR-S von B. Fritig (Strasbourg, Frankreich) zur Verfügung gestellt. (Daten von H.-P. Mock, unveröffentlicht)

121

6.5.4 Versuche zur Detektion von prä-nekrotischen Veränderungen im Blattgewebe porphyrischer Pflanzen durch noninvasive Techniken

Durch zwei verschiede Ansätze wurde versucht, den genauen Ort von Läsionen an den Blättern der CPO-AS-Pflanzen im Lichtshift-Experiment vorherzusagen. Durch den Einsatz dieser noninvasiven Methoden sollte vor allem ermöglicht werden, bereits vor dem Sichtbarwerden von Nekrosen zwischen Blattgewebe zu unterscheiden, welches nach der Erhöhung der Lichdosis nekrotisch werden würde und welches WT-artig bliebe, um gezielt spezifisches Probenmaterial gewinnen zu können.

6.5.4.1 Analyse von räumlich aufgelösten Chlorophyll-Fluoreszenzparametern an Blättern (Leaf fluorescence imaging)

Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit Dr. Katharina Siebke am Lehrstuhl von Prof. Weis an der Universität Münster wurde versucht, mit Hilfe des dort etablierten Systems an Blättern von CPO- und UROD-AS-Pflanzen die Kinetik von lokal begrenzten Veränderungen der Chlorophyll-Fluoreszenz als Reaktion auf veränderte Lichtbedingungen zu untersuchen ( Siebke und Weis 1995). Aus diesen Daten wurde auf zeitlich und örtlich aufgelöste Veränderungen im photosynthetisch getriebenen Elektronentransport geschlossen, die infolge des Lichtshift-Experiments in den Blättern der porphyrin-akkumulierenden Pflanzen auftraten. Die Ergebnisse waren allerdings nicht immer reproduzier- und interpretierbar. Sichtbare Veränderungen in Parametern des photosynthetisch getriebenen Elektronentransports wurden nur manchmal von der Ausbildung von Läsionen an der gleiche Stelle gefolgt. Andererseits traten später auch Nekrosen an Blattabschnitten auf, die sich zuvor nicht durch Veränderungen von Fluoreszenzdaten angekündigt hatten (Daten nicht gezeigt). Diese Versuche sollen mit der jetzt auch am IPK zur Verfügung stehenden Fluoreszenz-Imaging-Technik noch einmal wiederholt werden.

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6.5.4.2 Infrarot (IR)-Photographie von Blättern (Thermographie)

Ein vorläufiger Versuch, die spätere Ausbildung von Nekrosen an Blättern präsymptomatisch durch ein thermographisches Verfahren sichtbar zu machen, wurde zusammen mit Laury Chaerle in der Gruppe von Dr. D. van der Straeten an der Universität von Gent (Belgien) unternommen. Dabei kam die von Chaerle et al. (1999) beschriebene Technik an CPO-AS-Pflanzen zum Einsatz. In diesem Verfahren wird mit Hilfe einer hochauflösenden IR-Kamera die lokale Erwärmung von Blattgewebe dargestellt. Dieser Anstieg der Temperatur um ca. 0,4 K tritt z.B. nach TMV-Infektion von Tabakblättern mehrere Stunden vor dem Sichtbarwerden von totem Blattgewebe auf und läßt sich durch die verstärkte alternative Atmung und das SA-abhängige Schließen der Stomata mit daraus resultierender erniedrigter Transpirationsrate erklären ( Chaerle et al. 1999). Da auch in den porphyrischen Pflanzen erhöhte SA-Gehalte gemessen wurden (s. - ) und weitere Parallelen zu pathogenese-assoziierten Prozessen bestehen (s. - ), bestand die Hoffnung, mit der IR-Technik die Entstehungsorte von Nekrosen an CPO-AS-Pflanzen während des Lichtshift-Experiments voraussagen zu können. Aber auch hier konnten - ähnlich wie mit der Fluoreszenz-Imaging-Technik (s. - ) - keine reproduzierbaren Daten gewonnen werden, was vor allem auf die sehr schwache Ausprägung des nekrotischen Phänotyps zurückgeführt wurde. Sowohl die Lichtquellen als auch die Lichtintensität in der Pflanzenanzucht- und IR-Versuchskammer (Leuchtstoffröhren mit max. 80 µE m^-2 s^-1 in Gent, Na-Dampflampen mit 200 µE m^-2 s^-1 am IPK) waren sehr verschieden voneinander. Nach dem z.Zt. durchgeführten Austesten von optimalen nekrose-induzierenden Bedingungen für CPO- und UROD-AS-Pflanzen im Genter Labor sollen diese Versuche noch einmal wiederholt werden.

6.5.4.3 Gaswechselmessungen während des Lichtshift-Experiments

An Blättern von WT- und CPO-AS-Pflanzen wurden an den ersten 4 Tagen von Lichtshift-Experimenten zu je zwei Zeitpunkten mittels Gaswechselmessung die Nettoassimilationsraten bestimmt. Hierbei wurde die Photosyntheseleistung sowohl unter ambienten (200 µE m^-2 s^-1; 350 ppm CO₂) als auch unter Bedingungen gemessen, die maximale Raten ermöglichen sollten (2000 µE m^-2 s^-1; 1000 ppm CO₂). Das Auftreten von Nekrosen an den CPO-AS-Pflanzen im Verlauf der Experimente wurde allerdings von keinem signifikanten Unterschied in der Nettoassimilationsrate begleitet (Daten nicht gezeigt). Die Raten am Ende der Lichtperiode lagen sowohl für WT- als auch für CPO-AS-Pflanzen immer etwas niedriger als die Raten zu Beginn der Lichtphasen. Die maximale Rate unter optimalen Bedingungen war ca. 80-100% höher als die meßbare Photosyntheseleistung unter ambienten Bedingungen.

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6.6 Untersuchungen an Kreuzungsprodukten zwischen porphyrischen Pflanzen und transgenen Linien, die antioxidative Schutzenzyme überexprimieren

Nachdem die Bedeutung des antioxidativen Schutzsystems und besonders dessen Limitierung für die Ausprägung des nekrotischen Phänotyps der porphyrischen Pflanzen bekannt war (s. - , - ), wurde versucht, die Kapazität der antioxidativen Abwehr in den porphyrischen Pflanzen durch das Kreuzen mit transgenen Linien zu vergrößern, die sich durch die erhöhte Expression für ausgewählte Schutzenzyme auszeichnen. Pollen der heterozygoten Linien CPO-AS 1/3 und 1/41 sowie UROD-AS 35/2 wurde verwendet, um Blüten von homozygoten Tabakpflanzen zu bestäuben, die entweder Mn-SOD ( Slooten et al. 1995), Fe-SOD ( Van Camp et al. 1996) oder APX (D. Inzé et al., unveröffentlicht) überexprimieren (s. - ).

Je 10 Pflanzen der 3 x 3 = 9 Kreuzungsprodukte sowie je 4 Pflanzen der Parental-Linien wurden anschließend im Hinblick auf ihren Phänotyp, die Akkumulation von Porphyrin(ogen)en und die Aktivität des jeweiligen antioxidativen Schutzenzyms untersucht. Dazu wurden Blätter unterschiedlicher Entwicklungsstadien nach ca. 6 Wochen Anzucht unter Gewächshausbedingungen als Proben gewonnen. Diese bisher nur einmal durchgeführten und daher vorläufigen Analysen wurden zusammen mit Dr. Sandeep Aurora am IPK durchgeführt.

Die Mn-SOD-überexprimierenden Pflanzen wiesen das Doppelte, die Fe-SOD-Überexprimierer sogar das Zehnfache der Aktivität auf, die in den WT-, CPO- oder UROD-AS-Pflanzen für das jeweilige Enzym gemessen wurden (Daten nicht gezeigt). Die APX-Aktivität war in allen untersuchten Pflanzen der Parental-Linien praktisch identisch, zeigte aber in den Pflanzen der APX-Überexpressionslinie die geringste Varianz, was auf den homozygoten Zustand hinweist. Die CPO- und UROD-AS-Linien akkumulierten ca. 300-2000% des in den WT-, Mn- oder Fe-SOD- bzw. APX-überexprimierenden Pflanzen vorhandenen Copro- bzw. Uroporphyrin(ogen)s. Diese Anhäufung der photosensibilisierenden Intermediate führte unter den Gewächshausbedingungen zu Nekrosen an den Blättern der meisten AS-Pflanzen.

Unter den verschiedenen Kreuzungsprodukten wurden Pflanzen identifiziert, die trotz der meßbaren Akkumulation von Uro- bzw. Coproporphyrin(ogen) keine oder nur sehr schwache Nekrosen aufwiesen. Ob die Unterdrückung des nekrotischen Phänotyps reproduzierbar auf die durch Überexpression des entsprechenden antioxidativen Schutzenzyms erhöhte Aktivität von Mn- oder Fe-SOD bzw. APX zurückzuführen ist, konnte aufgrund der nicht ausreichenden Datenmenge nicht bewiesen werden. Ausführlichere Untersuchungen sind nötig, die erstens an einer größeren Anzahl von Individuen der Kreuzungsprodukte durchgeführt und in die, zweitens, auch die Analyse von anderen Parametern der antioxidativen Streßabwehr einbezogen werden muß. Solche erweiterten Analysen werden vermutlich die Identifikation von

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Fußnoten:
<1>	ATP-Citrat-Lyase
<2>	1
<3>	1
<4>	1
<5>	1
<6>	1
<7>	1
<8>	Flavonol-3-Sulfotransferase
<9>	1
<10>	1
<11>	1
<12>	3
<13>	410 461
<14>	Glutaredoxin (Grx) (Thiolransferase)
<15>	1
<16>	(\|[check ]\|) \|[check ]\|
<17>	ca. 950 ca. 800
<18>	(Virus-induzierbares) Gly-reiches Protein
<19>	* davon zwei Fusionen mit cDNA für HMG-CoA-Red. bzw. NADH-DH, 15 durch Koloniehybridisierung identifiziert
<20>	ca. 250 ca. 290 ca. 600 ca. 550 ca. 1000
<21>	ca. 200 - ca. 330
<22>	1
<23>	1
<24>	nein, starke diur-nale + circa-diane? Rhyth-mik
<25>	1
<26>	je 1* *cDNA-Klon für UE 6A Fusion mit cDNA für Rubisco
<27>	2+1* *Fusion mit cDNA für cab-6b
<28>	1
<29>	1
<30>	183 270
<31>	2

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