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Kapitel 7. Diskussion

Oxidativer Streß und seine Auswirkungen in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen waren und sind ein wichtiges Forschungsgebiet der biologischen Wissenschaften. Die Liste der Veröffentlichungen, in denen die verschiedenen Aspekte der Streßforschung an Pflanzen dargestellt werden, ist lang und umfaßt Analysen der molekularen Ursachen für abiotisch verursachten oxidativen Streß, die Mechanismen der Schadwirkung sowie Regulation und Umfang der antioxidativen Streßabwehr (s. Zitate in den Abschnitten - , - , - und - ). Hinzu kommt die Vielzahl von Untersuchungen zu biotisch hervorgerufenen Streß- und Abwehrreaktionen, die als Folge von Pathogen-Pflanze-Interaktionen beobachtet werden
(s. Referenzen im Kapitel - ).

Durch abiotische Ursachen hervorgerufen und durch exogene Faktoren beeinflußt wird oxidativer Streß z.B. durch die Kombination von ungünstigen Umweltbedingungen, wie Kälte ( Prasad et al. 1994), Trockenheit ( Loggini et al. 1999), Salzbelastung von Böden ( Dionisio-Sese und Tobita 1998), intensive Lichteinstrahlung ( Karpinski et al. 1997), erhöhte UV-Dosis ( Langebartels et al. 2000) oder Luft- bzw. andere Schadstoffe ( Willekens et al. 1994, Langebartels et al. 2000) erzeugt. Solche Faktoren fördern das Entstehen von ROS im Metabolismus der pflanzlichen Zelle, weil Elektronen- und/oder Energietransportketten gestört werden. ROS und Radikale anderer Herkunft, die nun in erhöhter Konzentration vorliegen, schädigen wichtige zelluläre Komponenten (Lipide, Proteine, DNA), wenn sie nicht hinreichend schnell durch das antioxidative Schutzsystem entgiftet werden.

Zusätzlich bergen endogene Faktoren ein Risiko für die Bildung von ROS und anderen Radikalen in sich. Dazu zählen vor allem die Pigmente, die Lichtenergie absorbieren und weiterleiten können. Porphyrine stellen die wichtigste Klasse von Pigmenten in Pflanzen dar und spielen vor allem in Form von Chlorophyll, Häm und Phytochromobilin eine essentielle Rolle für die Konservierung und Umwandlung von (Licht)energie, die Perzeption von Lichtsignalen sowie den Schutz vor Xenobiotika und ROS. Dabei besitzen Porphyrine aber auch ein phototoxisches Potential, welches im normalen Metabolismus durch die strikte Kontrolle der Porphyrinbiosynthese und die stete Bindung der Porphyrinintermediate an Proteine gering gehalten wird. Freie Porphyrine sind in sehr viel stärkerem Umfang durch Photosensibilisierungsreaktionen zur massiven Erzeugung von Radikalen befähigt (s. - ).

Pathogeninfektionen sind ein Beispiel für biotische Stressoren, welche im Zuge der HR ebenfalls die massive Bildung von ROS, vor allem von H₂O₂, auslösen können. Die durch den „oxidative burst“ hervorgerufenen antioxidativen Reaktionen der Pflanze sind ein integraler Bestandteil der Pathogenabwehr, bei der durch programmierten Zelltod lokal Gewebe geopfert

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7.1 Photosensibilisierung durch Deregulation der Tetrapyrrolbiosynthese - photodynamisch erzeugter oxidativer Streß in Pflanze und Mensch

Im Mittelpunkt der in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen stand ein Modellsystem zur endogenen Erzeugung von oxidativem Streß. Genutzt wurden transgene Tabakpflanzen, in denen es wegen der Expression von Antisense-RNA für je ein Enzym der Porphyrinbiosynthese (CPO, UROD) im Vergleich zu WT-Pflanzen zum Absinken des entsprechenden Proteingehaltes und der zugehörigen Enzymaktivität kam ( - , Kruse et al. 1995b, Mock und Grimm 1997). Die aus der Deregulation des Stoffwechselweges resultierende Akkumulation der Substrate und deren (per)oxidierten und photosensibilisierenden Derivaten führt sehr wahrscheinlich zur verstärkten Bildung von ROS und anderen Radikalen, die sich aus methodischen Gründen bisher einer genaueren qualitativen und quantitativen Bestimmung entzogen.

Das phototoxische Potential von isoliertem Chlorophyll auf Zellen wurde schon 1908 durch Hausmann beschrieben. Seitdem gab es vor allem bei der Analyse von Mechanismen der Photosensibilisierung an tierischen Modellsystemen große Fortschritte. Die photochemischen und -physikalischen Charakteristika von verschiedenen Tetrapyrrolen wurden in neueren Reviews durch Spikes und Bommer (1991) sowie Ochsner (1997) zusammengefaßt. Wie bereits in der Einleitung in Abschnitt - erklärt wurde, sind Porphyrine und deren Mg-haltige Derivate potente Photosensibilisatoren. Wird hingegen Fe²⁺ durch Protoporphyrin chelatiert, geht diese Eigenschaft verloren.

Die cytotoxischen Folgen der Photosensibilisierung werden normalerweise durch die strenge Kontrolle der Porphyrinbiosynthese vermieden. Wird diese Kontrolle umgangen, kommt es wie in den hier untersuchten UROD- und CPO-AS-Pflanzen zur Akkumulation von phototoxischen Intermediaten. Die Aktivität der Protoporphyrinogen-Oxidase (PPO) kann durch Diphenylether-Derivate, wie z.B. Acifluorfen oder Oxyfluorfen, gehemmt werden, woraus die Anhäufung von Protoporphyrinogen und nachfolgend dessen unspezifische Oxidation zum photosensibilisierenden Protoporphyrin resultiert ( Böger und Wakabayashi 1995, Knörzer et al. 1996). Diphenylether-Derivate zählen daher zu den photodynamisch wirksamen Herbiziden und werden in der Landwirtschaft zur Unkrautbekämpfung eingesetzt. Auch in Tabakpflanzen, die in ihrer PPO-Aktivität durch die Expression eines entsprechenden Antisense-Konstruktes für die

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Photosensibilisierung wird auch nach der Inkubation von Blattgewebe mit der frühen Zwischenverbindung ALA beobachtet ( Härtel et al. 1996). Hier kommt es zur Anhäufung von größeren Mengen an photosensibilisierendem Protochlorophyllid in der Dunkelphase, weil die feedback-Regulation der geschwindigkeitsbestimmenden ALA-Synthese umgangen wird. Protochlorophyllid als spätes Intermediat mit photodynamischen Potential kann nun akkumulieren, da dessen enzymatische Reduktion durch die POR ebenfalls in einer lichtabhängigen Reaktion erfolgt, alle anderen Reaktionsschritte zwischen ALAD und POR hingegen nicht licht-reguliert sind (s. Biosyntheseweg in Abb. 3 und Abschnitt - .).

Seit längerem ist eine Reihe von Mutanten bekannt, in denen es zur Deregulation der Porphyrinbiosynthese kommt. Durch die Mutation in vier unterschiedlichen Genen der Gerste (tigrina-b, -d, -n und -o) wird die Synthese von ALA dereguliert, so daß bereits in etiolierten Keimlingen Protochlorophyllid vorliegt, dessen Menge normalerweise durch den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der ALA-Synthese bestimmt wird. Der Überschuß an ungebundenem Protochlorophyllid führt bei der Belichtung der Pflanzen zu photodynamischen Schäden, da aus Kapazitätsgründen der sofortige enzymatische Umsatz durch die POR nicht möglich ist. Die resultierenden gebleichten und oft nekrotischen Streifen, die den Mutanten ihren Namen geben, sind, wie auch die Effekte, die bei der Inkubation von Blättern mit ALA auftreten (s.o.), auf die phototoxische Wirkung des Protochlorophyllids zurückzuführen ( Nielsen 1974).

Bei den ebenfalls bei Gerste beschriebenen Gendefekten xantha-I und viridis-k handelt es sich

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Bereits in der Einleitung erwähnt wurde die Les22-Mutante bei Mais, die einen genetischen Defekt im UROD-Gen hat. Daraus resultiert ein Anstau von Uroporphyrin(ogen), der zu lokal begrenztem Zelltod und deshalb zum „Disease Lesion Mimic“-Phänotyp führt ( Hu et al. 1998).

Porphyrien sind vererbbare Erkrankungen, die durch Defekte in einem der acht Gene der Hämbiosynthese im Menschen (und Tier) verursacht werden ( Elder 1993). Porphyrien können auch chemisch ausgelöst werden ( Ockner und Schmid 1961). Die Leber und erythropoetische Zellen haben den höchsten Bedarf an Häm und sind deshalb vorrangig bei der Ausprägung von Porphyria-Erkrankungen betroffen. In Porphyria-Patienten kann die Konzentration von Protoporphyrin in den Erythrozyten im millimolaren Bereich liegen, und akkumulierende Pigmente mit den charakteristischen Fluoreszenzeigenschaften der Porphyrine können sich z.B. in der Leber in Form von kristallinen Strukturen ablagern (s. Referenzen in Mock et al. 2000). Die meisten Porphyrien beim Menschen sind von Lichtempfindlichkeitssymptomen der Haut begleitet, da die Porphyrine im ganzen Körper verteilt werden. Endothelzellen können auf diese Weise photosensibilisiert werden. Während in Pflanzen praktisch alle überirdischen Teile dem Licht ausgesetzt sind und damit die Entwicklung von photodynamischen Schäden bis hin zum Absterben des gesamten Organismus begünstigt wird, bleiben die Symptome beim Menschen vorrangig auf die Haut beschränkt.

Wird die photosensibilisierende Wirkung von Porphyrinen hingegen in der photodynamischen Therapie (PDT) ausgenutzt, werden die von Tumoren betroffenen und deshalb zu behandelnden Organe nach der direkten Verabreichung oder durch Inhibitoren verursachten Akkumulation der Porphyrine z.B. endoskopisch mit Licht versorgt, wodurch ROS und andere Radikale im Gewebe entstehen. Neoplastisches Gewebe, das metabolisch sehr aktiv ist und deshalb große Mengen der Porphyrine anhäuft, wird auf diese Weise zerstört (s. Referenzen in Mock et al. 2000).

Der relative Anteil des Typ I bzw. Typ II-Mechanismus der Photosensibilisierung (s. Gl. 6-12) an der toxischen Wirkung hängt stark von der lokalen Sauerstoffkonzentration, d.h. von der Mikroumgebung der Porphyrine ab. Während die Photoinaktivierung von Enzymen der Hämbiosynthese in Erythrozyten-Hämolysat durch Uroporphyrin vorrangig über einen Typ I-, d.h. radikalischen Mechanismus verlief ( Alfonso et al. 1996), zeigten Studien an Erythrozyten-Hüllen („ghosts“), daß die porphyrin-induzierte Lipidperoxidation durch einen Typ II-Mechanismus, d.h. unter Einbeziehung von Singulett-Sauerstoff erfolgte ( Bachowski et al.

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7.2 Porphyrin-akkumulierende Tabakpflanzen als Modellsystem der Photosensibilisierung

Auch die Ausbildung von Blattläsionen an UROD- und CPO-AS-Pflanzen war entscheidend von den Faktoren Licht und Sauerstoff abhängig. So kommt es erst bei Überschreitung eines bestimmten Grenzwertes der eingestrahlten Lichtmenge zur Entwicklung von Nekrosen (Lichtshift-Experiment, s. - ). Diese können aber nur entstehen, wenn Sauerstoff verfügbar ist, was daraufhin deutet, daß ROS und deren Folgeprodukte in hohem Ausmaß für die photodynamisch ausgelösten Schäden verantwortlich sind (s. - ). Zusätzlich werden die photochemischen Reaktionen durch erhöhte Temperaturen (z.B. 32°C anstatt 25°C) beschleunigt, wobei es in Verbindung mit vergrößerten Lichtdosen praktisch zum völligen Absterben der Blätter und damit rasch zum Tod der Pflanze kommt (s. - ).

Durch die Kombination von molekularbiologischen, biochemisch-analytischen und physiologischen Methoden sollten die Auswirkungen von photodynamisch ausgelöstem oxidativen Streß in UROD- und CPO-AS-Pflanzen untersucht werden. Es wurden dabei sowohl Pflanzen analysiert, die bereits den charakteristisch nekrotischen Phänotyp ausgebildet hatten als auch Pflanzen, in denen durch die Verlängerung der Lichtperiode die Ausprägung von Blattläsionen erst induziert wurde.

Dieser als Lichtshift-Experiment bezeichnete Versuch bietet als induzierbares Modellsystem Vor- und Nachteile: Oxidativer Streß kann in den bis dahin dem WT phänotypisch gleichen UROD- bzw. CPO-AS-Pflanzen durch einfache Erhöhung der Lichtdosis ausgelöst werden. Es kommt zur raschen Ausbildung von Nekrosen, die bei anschließender Verringerung der Lichtintensität oder Verkürzung der Lichtperiode gestoppt wird, d.h. die Photosensibilisierung des Blattgewebes kann in gewissem Umfang ein- und ausgeschaltet werden ( - ). Dabei

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Somit scheint die Auslösung von massivem, photodynamisch verursachtem oxidativen Streß unter veränderlichen Lichtbedingungen ein Schwellenwerteffekt zu sein. Bis zu einem bestimmten Niveau der Akkumulation von Uro- bzw. Coproporphyrin(ogen) sind die Chloroplasten in der Lage, Photosensibilisierungsreaktionen zu verhindern. Bei der Überschreitung der Konzentrationsschwelle kommt es hingegen sehr schnell zu den phototoxischen Wirkungen der Porphyrine.

7.3 Identifizierung und Charakterisierung von Genen, deren Expression frühzeitig als Reaktion auf die Photosensibilisierung induziert wird

Ein wesentliches Ziel der Arbeit bestand darin, Gene zu identifizieren, die zu einem frühen Zeitpunkt der Photosensibilisierung exprimiert werden, so daß ihre Transkripte akkumulieren. Zu diesem Zweck wurde mittels der Subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH; Clontech PCR-Select Kit) eine subtrahierte cDNA-Bank angelegt und diese auf tatsächliche differentielle Expression der Gene überprüft (s. - , - ). Die Bestätigungsrate von 11,7 % (s. - ) liegt im Rahmen dessen, was im Handbuch zum Kit beschrieben wird. In der Literatur finden sich bisher nur zwei Berichte über den erfolgreichen Einsatz dieser Methode bei der Isolation von differentiell exprimierten Genen aus Pflanzen ( Kim et al. 1999a, b ). Allerdings wurden bei

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Die in den photosensibilisierten Pflanzen frühzeitige Transkriptakkumulation von Genen unterschiedlichster Funktion weisen auf die breit angelegte Aktivierung verschiedenster Stoffwechselwege hin. Dabei dienen die wahrscheinlich wegen erhöhter mRNA-Synthese akkumulierenden Transkripte sowohl dem Ausgleich von Verlusten an redox-sensitiven Proteinen, als auch der de novo Aktivierung von zusätzlichen Schutzkomponenten. Die besonders häufig vorhandenen Vertreter von Chaperonen, PR-Proteinen sowie ZW-modifizierenden oder zelltod-assoziierten Proteinen deuten an, daß in den Pflanzen nach der Verlängerung der Lichtphase einerseits den photodynamisch verursachten Schäden unmittelbar begegnet werden muß, andererseits aber auch Pathogenabwehr-Reaktionen kreuzinduziert werden. Für letzteres spricht auch das Vorhandensein von Resistenzgen-Homologen in der subtrahierten cDNA-Bank (s. - ).

Die Präsenz von Genen, die Homologien mit Transkriptionsfaktoren aufweisen, belegt die Fähigkeit der SSH, sehr seltene Gene zu identifizieren. Gleichwohl können jene Transkriptionsfaktoren, die für die schnelle Aktivierung der Expression der in der Bank befindlichen Gene verantwortlich sind, mit dem gewählten methodischen Ansatz vermutlich nicht nachgewiesen werden, da sie zu Beginn der Photosensibilisierung bereits als inaktive Proteine vorliegen, welche sehr rasch aktiviert werden können. Die in die cDNA-Bank aufgenommenen Transkriptionsfaktoren stellen somit wahrscheinlich erst das Folgeglied einer Transkriptionsaktivierungs-Kaskade dar, in der in einem ersten Schritt von Anfang an vorhandene Transkriptionsfaktoren aktiviert werden. Durch deren Wirkung wird dann die Transkription von Zielgenen induziert, welche entweder eine direkte Funktion in Schutzsystemen haben (Chaperone, PR-Proteine) oder wiederum als Transkriptionsaktivatoren

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Ausgewählte Gene der differentiellen cDNA-Bank waren auch durch andere Stressoren induzierbar (s. - ), was darauf hinweist, daß die Genprodukte eine allgemeine Funktion bei oxidativem Streß haben. Für eine Vielzahl der Klone wurde die Streßinduzierbarkeit in der Literatur bereits beschrieben (s. Zitate in Tab. 10 ).

Der anfänglich verfolgte Ansatz der Komplementation von Hefezellen mit pflanzlicher cDNA zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Oxidationsmitteln (s. - , - ) ist generell nur bedingt dazu in der Lage, auch Komponenten zu identifizieren, die in frühen Stadien von oxidativem Streß von essentieller Bedeutung sind. Da keine normalisierte cDNA-Bank transformiert wurde, in der auch seltene Gene, wie z.B. Transkriptionsfaktoren ausreichend vertreten wären, ist es eher wahrscheinlich, daß Strukturkomponenten, wie z.B. die ZW-modifizierende Pectinacetyl-Transferase, isoliert werden (s. - ). Auch in den veröffentlichten Berichten gelang mit dieser Technik unter unterschiedlichen Streßbedingungen, welchen die Hefezellen ausgesetzt waren, ausschließlich die Identifizierung von Enzymen, die das Überleben der Transformanten ermöglichten. So verliehen eine

"NADPH-Oxidoreduktase ( Babiychuk et al. 1995), ein DnaJ-homologes Chaperon, die "

" (s. auch cDNA-Klon in Tab. 10 ) sowie eine "

"aus " A. thaliana" "

"wachsenden Hefezellen eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Thiol-Oxidationsmittel Diamid. Ein bisher unbekannter "

Konnten interessante Gene identifiziert werden, die vielleicht sogar regulatorische Bedeutung haben, bietet es sich an, ihre Funktion in transgenen Pflanzen zu untersuchen. Dafür stehen sowohl der Antisense- als auch Überexpressionsansatz zur Verfügung. Während bei letzterem untersucht wird, was die Auswirkungen des nun vermehrt vorkommenden und meistens unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors stehenden Zielproteins in der Pflanze sind, werden bei der Antisense-Strategie die Folgen einer abgestuften Defizienz analysiert. Hierbei wird die Untersuchung von Folgen des graduellen Mangels auch an absolut essentiellen Proteinen möglich und das Überleben der Transformanten gesichert, während der komplette Ausfall des Genprodukts in Mutanten oft letal ist.

Die Untersuchung von UROD- und CPO-AS-Pflanzen erwies sich als äußerst ergebnisreich, weswegen für die zwei aus der cDNA-Bank ausgewählten Gene GRP und HAP5 zuerst auch der Antisense-Ansatz gewählt wurde. Das GRP-Gen war vor allem deshalb für eine genauere

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Mit der Manipulation des Expressionsniveaus der Untereinheit 5 des Transkriptionsfaktors HAP/NF-Y war die Hoffnung verbunden, ein wesentliches Stellglied in der zweiten Reihe von aktivierenden Faktoren zu beeinflussen und damit einer funktionellen Untersuchung zugänglich zu machen. Aus Pflanzen liegen bisher nur wenige Erkenntnisse zu streßregulierten Transkriptionsfaktoren vor. Bereits erwähnt wurden die HSF, welche die Expression von HSP unter den Bedingungen des Hitzeschocks regulieren (s. - ). Aus den sehr viel genauer charakterisierten mikrobiellen und tierischen Modellsystemen ist aber bekannt, daß Transkriptionsfaktoren direkt oder indirekt durch den zellulären Redoxzustand aktiviert bzw. deaktiviert werden können ( Jamieson und Storz 1997, Gabbita et al. 2000).

In E. coli wird die Expression von mindestens 9 Genen, unter ihnen gorA, welches die GR codiert, durch den Transkriptionsfaktor OxyR kontrolliert. OxyR, der auch als Repressor, z.B. bei seiner eigenen Transkription wirken kann und der sich somit autoreguliert, ist nur in seiner oxidierten Form ein Transkriptionsaktivator. Direkte Oxidation ist der wahrscheinlichste Mechanismus, durch den die Zellen H₂O₂ quantifizieren und letztendlich das oxyR-Regulon induziert wird. Ein weiteres Beispiel für redox-responsible Kontrolle der prokaryotischen Transkriptionskontrolle ist das ebenfalls in E. coli am besten untersuchte SoxR/SoxS-System, welches die Hauptkomponente der Adaptation an erhöhte Mengen von Superoxid darstellt. Die direkt an der Entgiftung von ^•O₂^- beteiligte Mn-SOD sowie die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, welche für die Erhöhung der Reduktionskapazität in Form von zusätzlich bereitgestelltem NADPH in der Zelle verantwortlich ist, zählen zu den Genprodukten des soxRS-Regulons. Die Kontrolle der Transkription ist ein zweistufiger Mechanismus: Zuerst wird das Eisen-Schwefel-Protein SoxR entweder durch ^•O₂^--vermittelte Oxidation des Fe-S-Zentrums oder aber Akquirierung von zusätzlichem Fe aktiviert, welches aus ^•O₂^--geschädigten, Fe-haltigen Proteinen freigesetzt wird. Durch die Aktivierung wahrscheinlich in seiner

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Zwei sehr gut untersuchte Beispiele für eukaryotische, redox- und deshalb ROS-responsible Transkriptionsfaktoren sind NF-_B und AP-1. Der nukleäre Faktor (NF)-_B ist ein oligomeres Protein, das eine Vielzahl von Genen aktiviert, die in die frühe Phase von zellulären Abwehrreaktionen in tierischen Zellen involviert sind. Das NF-_B-Dimer liegt im Cytoplasma an den Inhibitor I_B gebunden in inaktivem Zustand vor. Bei der Stimulierung, die vielfältige Ursachen haben kann (u.a. Behandlung mit IL-1, TNF, UV), wird der Inhibitor phosphoryliert, und der Komplex aus NF-_B und I_B löst sich auf. Daraufhin kann NF-_B in den Kern wandern, wo es die Transkription von verschiedenen Genen induziert. Dieses Transkriptionssystem kann direkt durch H₂O₂ aktiviert und durch Reduktionsmittel (wie z.B.
N-Acetyl-L-Cystein) deaktiviert werden. Für die redoxabhängige (De)phosphorylierung von I_B ist eine komplexe Kaskade von Protein-Kinasen und -phosphatasen verantwortlich
(s. Review von Gabbita et al. 2000 und die darin vorhandenen Zitate).

Auch die Aktivität des aus Homo- bzw. Heterodimeren von Jun- und Fos-Proteinen zusammengesetzten Transkriptionsfaktors AP-1 ist strikt redox-reguliert. Unter der Kontrolle von AP-1 stehen Gene, die für Zellproliferation und Apoptose verantwortlich sind. Mehrere unabhängige Wege der Regulation von AP-1 sind bekannt. Die c-Jun-Untereinheit (in
S. cerevisiae auch als YAP1 bekannt) wird durch die c-Jun-spezifische NH₂-terminale Kinase (JNK) an mehreren Resten phosphoryliert und damit AP-1 aktiviert. JNK gehört zur großen Gruppe der MAP-Kinasen und unterliegt wiederum selbst einer redoxabhängigen Kontrolle der Aktivität. Endprodukte der Lipidperoxidation, wie z.B. 4-Hydroxy-2-nonenal können das auslösende Moment für diese Art der Aktivierung sein ( Uchida et al. 1999). Ein unabhängiger Mechanismus, der die AP-1-Aktivität beeinflußt, besteht in der reversiblen Oxidation eines konservierten Cys-Restes in der DNA-Bindedomäne von Fos und Jun. Schließlich wurde auch die Existenz eines ubiquitären, nukleären Redoxfaktors bekannt (Ref-1), der den Redoxzustand von Fos und Jun zusätzlich beeinflußt. Ref-1 ist in der Lage, die Bindung von AP-1 an DNA thioredoxin-abhängig zu induzieren. Zu diesem Zweck wird Thioredoxin, das sich normalerweise im Cytoplasma befindet, nach bestimmten Stimuli in den Kern transportiert, wo es mit Cys-Resten von AP-1 interagiert und diese dabei reduziert. Somit gibt es in tierischen Zellen mit dem Cytosol und Kern mindestens zwei Kontrollstellen, an welchen der Aktivierungszustand von AP-1 reguliert werden kann (s. Review von Gabbita et al. 2000 und die darin vorhandenen Zitate).

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In Erweiterung der Untersuchung von AS-Pflanzen für GRP und Hap5 wird es auch interessant sein, die Folgen von Überexpression dieser Proteine auf Pflanzen zu studieren und außerdem durch die Herstellung von rekombinanten Proteinen in Bakterien die Herstellung von spezifischen Antikörpern zu ermöglichen. Die Erstellung und funktionelle Überprüfung von entsprechenden Konstrukten ist ein Nahziel der weiteren Arbeit. Aus der wissenschaftlichen Literatur sind Beispiele bekannt, bei denen durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren die Streßtoleranz von Pflanzen deutlich erhöht werden konnte. Der Faktor DREB1A bindet an das „Dehydrierungs-responsible Element“ (DRE) vieler in das System der Trockentoleranz involvierten Gene und aktiviert deren Transkription. Durch die Überexpression von DREB1A unter der Kontrolle des ebenfalls streß-induzierbaren rd29A-Promotors in A. thaliana und die dadurch nur unter Streßbedingungen verstärkte Expression der Zielgene sind die transgenen Pflanzen toleranter gegenüber Trockenheit, erhöhter Salinität und Kälte ( Kasuga et al. 1999). Die unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors stehende und damit konstitutive Expression eines wurzelspezifischen Transkriptionsfaktors Alfin1 in Lupine (M. sativa), der u.a. die Aktivität des salz-induzierbaren MsPRP2-Gens reguliert, hatte ebenfalls eine positive Wirkung auf die Salztoleranz dieser Kulturpflanzenart und verbesserte außerdem noch das Wurzelwachstum unter streßarmen Umweltbedingungen ( Winicov und Bastola 1999, Winicov 2000).

Im Zusammenhang mit den Ausführungen zur Redoxkontrolle von Transkriptionsfaktoren, die Thioredoxin und redox-regulierte Protein-Kinasen bzw. -Phosphatasen einbezieht, soll an dieser Stelle noch einmal die Tatsache erwähnt werden, daß durch Photosensibilisierung in den CPO-AS-Pflanzen auch die Expression von Thioredoxin, einer Protein-Kinase und einer Protein-

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7.4 Chronologische Betrachtung der Folgen von Photosensibilisierung in porphyrin-akkumulierenden Tabakpflanzen

Die biochemisch-physiologischen Analysen hatten das Ziel, generelle Auswirkungen der Photosensibilisierung zu untersuchen und vor allem Aussagen über den Aktivierungszustand des antioxidativen und Pathogenabwehr-Systems zu ermöglichen. An dieser Stelle sollen die bisher getrennt dargestellten Ergebnisse zusammengefaßt werden, die aus den Untersuchungen an Pflanzen stammen, die einen bereits vollständig ausgeprägten nekrotischen Phänotyp aufweisen (s. - ) oder die diesen Phänotyp im Lichtshift-Experiment gerade entwickeln (s. - ).

Nach Verlängerung der Lichtperiode, noch vor dem Auftreten erster sichtbarer Nekrosen kommt es zu Symptomen, die normalerweise vor allem als Folge von Pathogeninfektionen beobachtet werden. Die differentielle cDNA-Bank enthält z.B. eine Reihe von Genen für PR-Proteine, Resistenzfaktoren und andere zelltod-assoziierte Proteine (s. - ), die bereits 12-16h nach Beginn des Lichtshift-Experiments auch im Northern Blot als differentiell exprimiert erkennbar sind (s. - ). Auch die PR-Proteinmenge steigt rasch an, wie z.B. im Western Blot für PR-1 und Sesquiterpen-Cyclase bereits nach 12h gezeigt wurde (s. - ). Phenolische Verbindungen, die in Zusammenhang mit Pathogenese-Prozessen stehen (s. - ), akkumulieren ebenfalls sehr schnell, nachdem die Pflanze durch veränderte Lichtbedingungen photosensibilisiert wird. So ist die Anhäufung von Scopolin und SA bereits nach 12-16h nachweisbar (s. - ). Diese Indizien deuten an, daß bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt durch Photosensibilisierung eine Kreuzinduktion der Pathogenabwehr erfolgt. Eine solche gemeinsame Reaktion des Systems von antioxidativer und Pathogenabwehr wird auch bei der Behandlung von Pflanzen mit Ozon beobachtet ( Langebartels et al. 2000).

In diesem frühen Stadium von photodynamisch verursachtem Streß im Modellsystem des Lichtshift-Experiments reagieren die klassischen antioxidativen Schutzenzyme auf Transkriptebene noch nicht bzw. weniger ausgeprägt (s. - ). Alternativ kann auch spekuliert werden, daß die im Kurztag jeweils vorübergehend auftretende Akkumulation von Porphyrin(ogen)en bereits im Vorfeld des Lichtshift-Experiments zu einer ebenfalls nur transienten Aktivierung der Genexpression geführt hat. Diese könnte ausreichen, um dem unter Kurztagbedingungen nur unterschwellig existenten, oxidativen Streß zu begegnen.

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Die korrespondierenden Enzymaktivitäten hingegen zeigen bereits an den ersten Tagen des Lichtshift-Experiments Unterschiede zwischen WT- und CPO-AS-Pflanzen. So steigt die Aktivität verschiedener Isoformen der SOD in den porphyrischen Pflanzen schon innerhalb der ersten 24h nach Veränderung der Lichtbedingungen an (s. - ), und auch die APX reagiert bereits am ersten Tag des Experiments auf die einsetzende Photosensibilisierung (s. - ).

Beim Vergleich der Proteinmengen für cytosolische APX und CAT1 im Western Blot sind allerdings in den ersten Tagen der Photosensibilisierung keine Unterschiede zwischen WT- und CPO-AS-Pflanzen sichtbar (s. - ).

Es gibt bereits in den ersten Stunden des Lichtshift-Experiments Unterschiede in den Gehalten bzw. Redoxverhältnissen der niedermolekularen Antioxidantien Ascorbat, Glutathion und Tocopherol, die latent vorhandenen, oxidativen Streß vermuten lassen (s. - ). Auch bei der durch die Inhibition der PPO durch Oxyfluorfen verursachten Photosensibilisierung einer Sojabohnen-Zellkultur kommt es rasch zu Veränderungen im Redoxverhältnis und Gesamtgehalt der Antioxidantien ( Knörzer et al. 1996). Die meisten Autoren berichten von Veränderungen in diesen Parametern unter verschiedenen Streßbedingungen (s. Zitate in - ).

Als weiterer Indikator für den bereits sehr früh einsetzenden oxidativen Streß weisen die ansteigenden Mengen von TBA-RS bzw. Ethan auf verstärkte Lipidperoxidation und daraus resultierende Membranschäden hin (s. - ). Der Gefahr von Mißfaltung und anderen oxidativen Schäden an Proteinen wird in den CPO-AS-Pflanzen auch durch die Induktion von Genen begegnet, die für Chaperone kodieren. Die Akkumulation von Transkripten z.B. für Enzyme des Primär- und Sekundärstoffwechsels aber auch für ribosomale Proteine zeigt, daß durch die einsetzende Photosensibilisierung umfassende Veränderungen im zellulären Metabolismus ausgelöst werden (s. - , - ).

Die Konzentration von H₂O₂ steigt als Reaktion auf die veränderten Lichtbedingungen innerhalb der ersten 24h des Lichtshift-Experiment sowohl in WT- als auch in CPO-AS-Pflanzen an und schwingt danach - wie auch die Mehrzahl der anderen biochemischen Parameter - im weiteren Verlauf des Experiments im Tagesgang (s. - ). Dabei kann aber vermutet werden, daß besonders in den Zellen und Blattabschnitten, die kurz vor dem Absterben stehen, die

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Jedenfalls könnte die schnelle Aktivierung von Pathogenabwehr-Reaktionen (Induktion und Akkumulation von PR-Proteinen, SA und Scopolin) durch die massenhafte Erzeugung von ROS, insbesondere von H₂O₂ ausgelöst werden. Dabei bleibt die Anhäufung von Scopolin und SA ( Mock et al. 1999) sowie von PR-Proteinen (H.-P. Mock, unveröffentlicht) auf die nekrotischen Bereiche im Blatt beschränkt. Eine systemische Ausbreitung, wie sie bei der SAR beobachtet wird (s. - ), findet hingegen nicht statt.

Schreitet die Nekrotisierung im Verlauf des Lichtshift-Experiments voran, bzw. wurden die porphyrischen Pflanzen von Anfang an unter nekrose-induzierenden Bedingungen kultiviert, beobachtet man neben der erhöhten Aktivität der meisten von den untersuchten Enzyme der antioxidativen Streßabwehr (s. - ) auch eine deutliche Induktion der Genexpression auf Transkript- und Proteinebene (s. - ). Auf diese Weise soll offensichtlich der permanent erhöhte Bedarf an Entgiftungskapazität gedeckt werden. Wegen der gesteigerten APX-Aktivität (s. - ) ist auch der Bedarf an Ascorbat erhöht, wobei Gesamtgehalt und Redoxverhältnis aber trotz der Aktivierung des regenerativen Systems (MDAR, GR) nicht aufrechterhalten werden (s. - ). Die Menge an verfügbarem reduzierten Ascorbat sinkt so in den porphyrischen Pflanzen auf ca. 50 % des WT-Niveaus ab. Schuld daran könnte auch die verringerte Aktivität der DHAR tragen (s. - ), die im bereits erwähnten Photosensibilisierungsmodell von Knörzer et al. (1996) nach der Behandlung einer Sojabohnen-Zellkultur mit einer hohen Konzentration des PPO-Inhibitors Oxyfluorfen ebenfalls eine niedrigere Aktivität aufwies. Diese Autoren berichten von einem deutlichen Unterschied im Verhalten des antioxidativen Schutzsystems in Abhängigkeit von der eingesetzten Inhibitorkonzentration. Während 100 nM Oxyfluorfen eine allgemeine Stimulation der Schutzkapazität, und damit z.B. einen Anstieg der meßbaren Ascorbat- und Glutathionmenge sowie verschiedener Enzymaktivitäten zur Folge hatten, führte die Behandlung der Zellen mit 500 nM des PPO-Inhibitors zur Überbeanspruchung des Systems und deshalb trotz der weiter gesteigerten Enzymaktivitäten zu deutlich verminderten Redoxverhältnissen der Antioxidantien.

Während in den UROD-AS-Pflanzen beim Tocopherol dramatische Einbrüche zu verzeichnen

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Die lokal begrenzte Aktivierung des Pathogenabwehr-Systems im Bereich der Blattläsionen bleibt bestehen, wie anhand der weiterhin erhöhten Mengen von PR-Proteinen, SA und Scopolin abgelesen werden kann (s. - ). Sie ist ausreichend, um die Ausbreitung einer TMV-Infektion stark zu behindern ( Mock et al. 1999). Dies eröffnet interessante biotechnologische Anwendungsmöglichkeiten. Würde die Expression von Antisense-Konstrukten für Gene der Tetrapyrrolbiosynthese und die damit einhergehende Photosensibilisierung unter die Kontrolle eines strikt pathogen-responsiblen Promotors gestellt, könnte das antioxidative und Pathogenabwehr-System der Pflanzen wegen der verstärkten Bildung von ROS nach beginnender Infektion und daraus resultierender Induktion der Antisense-Expression sehr viel stärker und schneller aktiviert werden, als dies durch die Infektion allein möglich ist. Unter Umständen könnten auch nicht-resistente Arten auf diese Weise gegen die negativen Auswirkungen von Pathogenbefall „geimpft“ werden. Diese Art von „Immunisierung“ wurde in einem anderen Modellsystem bereits gezeigt. Hier wurde durch die Expression einer pilzlichen Glucose-Oxidase in Kartoffelpflanzen die interne H₂O₂-Konzentration gesteigert und wegen der dadurch verstärkt aktivierten Pathogenabwehr auch eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektionen mit Erwinia und Phytophthora erreicht ( Wu et al. 1995). Auf einen ähnlichen Effekt stützt sich die Erklärung der Tatsache, daß A. thalina-Pflanzen, die eine bakterielle Cholin-Oxidase exprimieren, resistenter gegen Starklichtstreß sind ( Alia et al. 1999). Studien an CAT- und APX-AS-Pflanzen weisen darauf hin, daß die Suppression von ROS-detoxifizierenden Enzymen während der Hypersensitivitätsreaktion eine wichtige Rolle bei der Beschleunigung und Verstärkung von programmiertem Zelltod und damit der Verhinderung einer weiteren Ausbreitung des Pathogens in der Pflanze spielt. Solche Pflanzen mit permanent verringerter Entgiftungskapazität sind hyperresponsibel gegenüber Pathogeninfektionen ( Mittler et al. 1999).

Eine moderate photodynamische Schädigung des Gewebes der CPO- bzw. UROD-AS-Pflanzen hat nur geringe Auswirkungen auf die durch Gaswechselmessungen bestimmte Nettoassimilationsrate, wenn diese auf den Chlorophyllgehalt des Blattes, d.h. auf den funktionsfähigen Anteil des Blattgewebes bezogen wird (s. - ). Wird hingegen die gesamte Blattfläche als Berechnungsgrundlage gewählt, sind die porphyrischen Pflanzen im Vergleich zu WT-Pflanzen weitaus weniger in der Lage, Kohlenstoff zu assimilieren. Bei sehr stark

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In komprimierter Darstellung läßt sich die zeitliche Reihenfolge der Ereignisse so zusammenfassen ( Abb. 45 ):

In den UROD- und CPO-AS-Pflanzen kommt es auch unter Kurztag- bzw. Schwachlichtbedingungen zur transienten Akkumulation von Uro- bzw. Coproporphyrinogen in den Chloroplasten. Wird die Lichtdosis erhöht und ein bestimmter Grenzwert der Photosensibilisierung überschritten, setzen zellschädigende Prozesse ein, die vor allem von der Lichtmenge, Temperatur und von Sauerstoff abhängig sind und das antioxidative Abwehrsystem überfordern. Im Zuge der Peroxidationsreaktionen, bei denen sehr schnell Membranlipide angegriffen werden, entstehen lokal ROS, u.a. H₂O₂, in großer Menge. Das antioxidative Schutzsystem, welches in den Chloroplasten eine hohe Kapazität hat, wird als Reaktion auf den beginnenden oxidativen Streß aktiviert. Sehr früh kommt es zu einem Anstieg der Enzymaktivitäten der SOD und APX. Erste Auswirkungen sind auch bei den niedermolekularen Antioxidantien Ascorbat, Glutathion und Tocopherol zu beobachten. Etwas später, aber noch innerhalb des ersten Tages des Lichtshift-Experiments, scheinen die akkumulierten Porphyrin(ogen)e in einigen Zellen die bereits irreversibel geschädigten Chloroplasten zu verlassen, wodurch die gesamte Zelle von photooxidativem Streß betroffen wird. Dies ist z.B. anhand der Aktivierung von nicht-plastidären Isoformen der SOD erkennbar. Die unspezifische Oxidation der aus den Plastiden freigesetzten Porphyrinogene wird durch die Wirkung von membran-assoziierten Peroxidasen beschleunigt. Auf der Ebene der Transkription werden Gene unterschiedlichster Klassen aktiviert, wozu auch eine Reihe von vermutlichen Komponenten von Signaltransduktionskaskaden gehören. Bereits innerhalb der ersten 24h nach Veränderung der Lichtbedingungen kommt es zu lokalen Zelltodereignissen. Wahrscheinlich spielt in diesem Zusammenhang, wie auch nach Pathogeninfektionen oder Ozonbegasung die verstärkte Bildung von H₂O₂ eine entscheidende Rolle, was wiederum im umliegenden Gewebe HR-ähnliche Reaktionen auslöst. Dazu zählen die sehr zeitig auftretende Synthese und Anhäufung von SA, Scopolin und PR-Proteinen. Der Anteil an bereits totem oder sehr stark geschädigtem Gewebe ist noch gering, und erst in der zweiten verlängerten Lichtphase werden erste Läsionen sichtbar. Die Aktivität von antioxidativen Schutzenzymen steigt als Reaktion auf anhaltenden oxidativen Streß weiter an, die Gehalte bzw. Redoxzustände von Ascorbat, Glutathion und Tocopherol unterscheiden sich aber bisher nur wenig von den Verhältnissen in

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Abb. 45 Fließschema der durch Photosensibilisierung ausgelösten Prozesse in transgenen Tabakpflanzen, die Antisense-RNA für UROD bzw. CPO exprimieren. Die Abfolge von schwarzen und weißen Balken auf der linken Seite stellt nicht-maßstäblich die Länge der Dunkel- bzw. Lichtphasen dar, unter denen die Pflanzen angezogen wurden. Der rote Querstrich symbolisiert den Beginn der ersten verlängerten Lichtphase im Lichtshift-Experiment. Mit dem dicker werdenden violetten Pfeil wird die zunehmende Photosensibilisierung und mit dem darin eingesetzten grauen Balken das verstärkte Auftreten von nekrotischem Blattgewebe dargestellt. Orange Färbung in den Balken auf der rechten Seite der Abb. symbolisiert die zuerst nur transiente, später aber permanente Akkumulation von Uro- bzw. Coproporphyrin(ogen) in den UROD- bzw. CPO-AS Pflanzen. Die über bzw. unter dem roten Trennstrich aufgezählten Symptome treten unter den entsprechenden experimentellen Bedingungen teilweise auch zeitgleich ein, weswegen aus der grafischen Reihenfolge nicht automatisch auf die zeitliche Abfolge der Ereignisse geschlossen werden kann. Weitere Erläuterungen im Text.

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Im weiteren Verlauf des Lichtshift-Experiments und bei Pflanzen, die unter Lichtbedingungen angezogen wurden, welche die Photosensibilisierung permanent fördern, beobachtet man die zunehmende Nekrotisierung von Blattgewebe. Neben der erhöhten Aktivität von Enzymen des antioxidativen Schutzsystems (SOD, APX, MDAR, GR), findet nun auch die vermehrte Bildung von Transkript bzw. Protein der Schutzenzyme statt. Wegen des erhöhten Bedarfs an und der nicht ausreichenden Regeneration von Ascorbat, beobachtet man ein Absinken des verfügbaren reduzierten Anteils. Die Aktivierung von pathogenese-assoziierten Prozessen bleibt bestehen, was sich funktionell durch eine erhöhte Resistenz gegenüber TMV-Infektion zeigt. Der größer werdende Anteil an totem Blattgewebe führt zu Einschränkungen in der Assimilationskapazität, die allerdings nur bei sehr stark nekrotischen Pflanzen auch die grünen Areale der Blätter betreffen. Reduktionsäquivalente aus der Lichtreaktion der Photosynthese werden nun verstärkt für Detoxifizierungsreaktionen aufgewendet und stehen damit nicht mehr zur Fixierung von CO₂ bereit. Es wird im Cytosol sogar zusätzliche Reduktionskapazität durch eine Erhöhung der Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase bereitgestellt (Mock et al., unveröffentlicht), wie es auch in E. coli nach der Behandlung mit superoxid-generierenden Chemikalien beobachtet wird. Diese Erhöhung der Reduktionskapazität in Bakterien steht unter der Kontrolle des redox-regulierten soxR/soxS-Systems ( Jamieson und Storz 1997). Auch in Hefezellen (S. cerevisiae) spielt der Pentosephosphat-Weg eine wichtige Rolle bei der oxidativen Streßabwehr ( Slekar et al. 1996).

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7.5 Die wichtigsten Ergebnisse der Arbeit im Überblick

und damit die Antworten auf die in Abschnitt 0 formulierten Fragen sollen hier noch einmal zusammengefaßt herausgestellt werden:

1. Das antioxidative Schutzsystem der transgenen Pflanzen wird als Reaktion auf den durch akkumulierende Porphyrine ausgelösten oxidativen Streß aktiviert. Seine Kapazität reicht aber in Abhängigkeit von der Stärke des Antisense-Effektes und den die Photosensibilisierung stark beeinflussenden Umweltfaktoren wie Licht oder Temperatur nicht aus, um das Absterben von Zellen zu verhindern, was makroskopisch als Ausprägung eines nekrotischen Phänotyps sichtbar wird. Durch die Verlängerung der Lichtperiode (Lichtshift-Experiment) kann die Ausbildung von Blattläsionen an porphyrischen Pflanzen induziert werden, die bis dahin wegen der niedrigen empfangenen Lichtdosis von WT-Pflanzen nicht zu unterscheiden waren. Mit diesem schaltbaren experimentellen System lag ein biologisches Modell vor, in dem die molekularen Folgen von photodynamisch verursachtem oxidativen Streß in Pflanzen zu beliebigen Zeitpunkten untersucht werden konnten. Die untersuchten Enzyme des antioxidativen Schutzsystems reagieren direkt nach dem Beginn der Photosensibilisierung mit dem Anstieg ihrer Aktivität und zeigen erst später, im weiteren Verlauf der photodynamischen Prozesse, auch Veränderungen in ihrer Transkript- und Proteinakkumulation. Vor allem die Gesamtmengen der niedermolekularen Antioxidantien reagieren anfänglich mit einem Anstieg auf die Photosensibilisierung. In den transgenen Pflanzen mit vollständig ausgeprägtem nekrotischen Phänotyp scheint dann vor allem die verfügbare Menge an reduziertem Ascorbat limitierend zu sein, was sich in einem Absinken sowohl des Redoxverhältnisses als auch der Konzentration des gesamten Ascorbats widerspiegelt.

2. Die negativen Auswirkungen der Photosensibilisierung auf den Metabolismus der Pflanze zeigen sich auch anhand des verringerten Wachstums und der verlangsamten Entwicklung der porphyrin-akkumulierenden Pflanzen. Dabei korreliert die Stärke der Expression des Antisense-Konstruktes mit der Menge an akkumulierten photosensitiven Intermediaten und der Ausprägung eines nekrotischen Phänotyps der Pflanzen. Wird die Blattfläche als Basis zur Berechnung der CO₂-Asssimilationskapazität gewählt, fällt diese im Vergleich zu WT-Pflanzen sowohl unter unterschiedlichen Licht- als auch CO₂-Verhältnissen deutlich ab. Allerdings wird dieser Einbruch fast ausschließlich durch den Anteil an totem Blattgewebe verursacht, während die grünen Areale funktionstüchtig bleiben.

3. Die Folgen der Photosensibilisierung zeigen deutliche Parallelen mit pflanzlichen Pathogenabwehr-Reaktionen, wie sie in Form der raschen aber lokal auf den Bereich des nekrotisierenden Gewebes begrenzten Akkumulation von PR-Proteinen, Salicylsäure und

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4. Unter Ausnutzung des durch Vergrößerung der Lichtdosis induzierbaren Systems der Photosensibilisierung von transgenen Pflanzen war es möglich, eine differentielle cDNA-Bank anzulegen, mit der sehr zeitige Veränderungen auf der Ebene der Transkriptakkumulation erfaßt wurden. Die Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH) erwies sich als sehr effizient, um streß- bzw. zelltodspezifische Gene zu identifizieren. Darunter sind Gene für Effektorproteine, wie Enzyme des Primär- und Sekundärmetabolismus, Chaperone, Hitzeschockproteine, PR-Proteine und andere direkt in die antioxidative und Pathogenabwehr involvierte Genprodukte. Aber auch seltene Transkripte für mögliche Regulatoren der zellulären Streßantwort, wie Transkriptionsfaktoren, Protein-Kinasen und Phosphatasen sowie andere mögliche Signaltransmitter befinden sich in der differentiellen cDNA-Bank.

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