2  Material und Methoden

Es handelte sich bei den Versuchstieren um weibliche, geschlechtsreife Schweine (Alter zwischen 15 und 17 Monaten) der Züchtung MICROPIG YUCATAN (Charles River Laboratorien, Paris, Frankreich). Das Durchschnittsgewicht der Schweine lag bei 28,5 Kg (22,0 Kg bis 35,0 Kg).

Die Haltung der Tiere erfolgte in Sechsergruppen. Hierzu wurden sie in Ställen á 16 m² mit Stroheinstreu untergebracht. Die Raumtemperatur betrug 18 bis 20°C, die Luftfeuchte lag bei 75%. Die Belichtung erfolgte mit natürlichem Tageslicht. Gefüttert wurden die Schweine zweimal täglich mit granuliertem Trockenfutter á 300g. An Trinkwasser stand Leitungswasser über eine Tränke ad libitum zur Verfügung.

Die linke Tibia wurde nach Osteotomie der Fibula und Tibia intraoperativ mit einem Halbringfixateur stabilisiert. Der Fixateur wurde in den biomechanischen Forschungswerkstätten des Virchow-Klinikums in Anlehnung an den ursprünglichen Ringfixateur nach Ilizarov gefertigt. Er bestand aus zwei Halbringen, die über drei Drehschrauben miteinander verbunden waren. Die Konstruktion wurde über vier Schanzschrauben mit einem Durchmesser von 4,5 mm am Knochen befestigt.

	Abbildung 8: Fixateur Externe

Nach Tötung der Tiere und vorsichtiger Präparation der knöchernen Strukturen der Tibiae wurden die Knochenenden in BERACRYLâ (Fa. Troller AG, Fuhlenbach, Schweiz), einem selbsthärtenden Acrylat - Kunststoff eingegossen.

Der Einguß erfolgte in polierten Metallformen (innere Maße: Länge 7cm * Breite 7cm* Höhe 6cm). Um die Oberfläche besonders glatt zu halten, wurden diese Formen zuvor mit weißer Vaseline DAB 10® (Fa. Lichtenstein Pharmaceutica, Koblenz, Deutschland) eingestrichen.

Die biomechanischen Messungen wurden an der Zwick - Universalprüfmaschine â (Fa. Zwick GmbH, Ulm, Deutschland) Typ 1455 vorgenommen.

Die Röntgenaufnahmen wurden mit einem Röntgengerät Mobilette Plus ® (Fa. Siemens AG, Erlangen, Deutschland) aufgenommen. Als Röntgenkassetten wurden Kassetten der Firma Duplex® (Fa. Sterling Diagnostic Imaging, England) mit Verstärkerfolie verwendet. Als Röntgenfilm wurde der Cronex 4 Medical X-Ray Film 4® (Fa. DuPont medizinische Produkte, Bad Homburg, Deutschland) im Format 24 x 30 cm verwendet.

Die Filme wurden in dem Entwickler Protec C45 (Compact) 1577® (Fa. DuPont medizinische Produkte, Bad Homburg, Deutschland) mit den dazugehörigen Flüssigkeiten der Firma Cronex entwickelt.

Die konventionell entwickelten Röntgenfilme wurden auf der “Work Station“ des Pace-Systems DiagnostiX 2048® mittels einer ccd-Kamera digital eingelesen. Dort standen sie für die weitergehende Untersuchung zur Verfügung.

Als Kassetten wurden die Röntgenkassetten Digiscan 2H/2Câ (Fa. Siemens AG, Erlangen, Deutschland) im Format 24 x 30 cm verwendet. Die Filme wurden nach Belichtung in der radiologischen Abteilung auf der “Work Station“SIENET VA02D2 Magic Viewâ (Fa. Siemens AG, Erlangen, Deutschland) digital eingelesen und anschließend weiterbearbeitet.

In den biomechanischen Forschungswerkstätten wurde eine Aluminiumtreppe mit zehn Stufen gefertigt. Der Abstand der einzelnen Stufen zueinander betrug 2 mm, so daß die Stufen eine Dicke von 2 mm bis 20 mm hatten (links im Bild auf Abb. 8 und Abb. 9).

Das Aluminiumgemisch bestand aus der Zusammensetzung AlCuMgPb mit der Werkstoffnummer 3.1645 nach DIN 1725 Blatt 1. Die Dichte des Werkstoffes betrug 2,85 Kg/dm³.

	Abbildung 9: schematische Darstellung des Aluminiumkeils

Der linke Hinterlauf wurde am Tag 1 osteotomiert und anschließend mit einem Fixateur externe stabilisiert. Nach einer Latenzperiode von 5 Tagen wurde am 6. Tag p.o. begonnen, den Lauf am Frakturspalt um 2 mm pro Tag auf insgesamt 2 cm in 10 Tagen zu distrahieren. Die Distraktion wurde in eine morgendliche und eine abendliche Phase unterteilt, um eine kontinuierliche Streckung zu gewährleisten. Während der sich anschließenden Konsolidierungsphase wurden die Messungen an den Versuchstagen 16, 17, 18, 19, 21, 23 und 25 vorgenommen.

	Abbildung 10: Zeitverlauf der Versuchsphase

Die Tiere wurden über die gesamte Versuchszeit antibiotisch mit Tardomyocel® (Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) einem Breitspektrumantibiotikum aus der Gruppe der b-Lactamantibiotika, abgedeckt. Das Medikament wurde alle 3 Tage in der Dosierung von 3 ml intramuskulär appliziert. Zusätzlich wurde den Tieren täglich die Temperatur rektal mittels eines handelsüblichen Thermometers gemessen. Bei Infektionen der Pinaustrittsstellen sowie erhöhter Körpertemperatur über 39,5°C wurde zusätzlich zur intramuskulären Antibiose das Reserveantibiotikum Ciprobay® (Fa. Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), einem Gyrasehemmer, intravenös verwendet.

Die Pinaustrittsstellen der Tiere wurden ab dem 5. p.o. Tag täglich gepflegt. Hierzu wurde zuerst die Schutzvorrichtung des Fixateurs gelöst. Der Fixateur wurde mechanisch mit einem Wasserstrahl und sterilen Pinzetten gereinigt. Anschließend wurde der Halt der Schrauben überprüft und die Schutzvorrichtung wieder [Seite 25↓]befestigt.

Die Ports wurden zur Gewährleistung der Durchgängigkeit mit 10 ml einer NaCl/ Heparin-Lösung geblockt. Die Lösung bestand aus 9 ml NaCl 0,9% Lösung und 1 ml Heparin á 100 internationalen Einheiten.

Am 26. Versuchstag wurden die Tiere mit der Applikation von 40 ml Trapanal® (Fa. Byk Gulden, Konstanz, Deutschland) iv. und anschließend von 40 ml KCl in einer Konzentration von 14% eingeschläfert. Nach Entnahme des Fixateurs erfolgte die Präparation der gesamten Weichteile und der Tibia des linken Hinterlaufes. Die Tibia wurde bis zur Weiteruntersuchung in einer mit NaCl getränkten Kompresse gelagert, um ein Austrocknen zu verhindern. Nach den biomechanischen Messungen standen die Präparate den weiteren histologischen Untersuchungen zur Verfügung.

Die Versuchstiere wurden 2 Stunden vor der Operation mit 3 ml Stresnil ® (Fa. Boehringer AG, Mannheim, Deutschland) im., einem Barbiturat, und 3 ml Atropin ® (Fa. Braun, Deutschland) im., einem Anticholinergikum, sediert. Als Narkoseeinleitung wurde den Tieren 6-8 ml Trapanal ® iv. über das Portsystem verabreicht. Anschließend wurden sie mit einer Tubusgröße zwischen 6 und 7,5 mm (innerer Durchmesser) intubiert. Gegebenenfalls wurde mit Trapanal ® nachsediert.

Nach erfolgreicher Intubation wurde den Tieren 1 Ampulle Pancuronium ® (Fa. Boehringer AG, Mannheim, Deutschland) iv. als Muskelrelaxans appliziert.

Im Narkoseeinleitungsraum wurden sie nun mit 3-4 ml/ min O₂ beatmtet. Das Atemzugvolumen lag bei 400 ml, der Beatmungsdruck bei 20 cm Wassersäule.

Während der Operation wurde die Narkosetiefe mit Trapanal ® 3-4 ml/h und Fentanyl ® (Fa. Byk Gulden, Konstanz, Deutschland), einem Morphinderivat, 3-4 ml/h gewährleistet. Sobald die Herzfrequenz über 150 Schläge/min stieg, wurde ein Fentanylbolus von 2 ml verabreicht. Ebenso wurden 2 ml Pancuronium ® bei Bedarf appliziert. Als Narkosegerät diente der Doppelturm Servo Ventilator 900D ® [Seite 26↓](Fa. Dräger, Deutschland). Intraoperativ wurde das Beatmungsgerät Dräger AV-1 ® (Fa. Dräger, Deutschland) verwendet.

Den Versuchstieren wurde 10 Tage vor der Osteotomie das Portsystem GPV-AC® (Fa. Access Technologies, Skokie, USA) implantiert, um die Applikation von Medikamenten und Antibiotika zu vereinfachen.

Der Katheter wurde in der linken V. jugularis externa plaziert und anschließend mit Suturpak-Handseide ® (Fa. Ethicon, Johnson-Johnson Intl) fixiert. Die Porttasche wurde im subcutanen Fettgewebe 10 cm kaudal des Unterkiefers angelegt. Das Portsystem wurde mit Vicryl ® 2,0 Subcutannaht in der Subcutis fixiert.

Nach Beendigung der Implantation wurde die Funktionsfähigkeit des Portsystems getestet. Anschließend wurde das Portsystem mit einem Heparinbolus von 3 ml (100 I.E./ ml) geblockt, um eine intraluminale Gerinnung zu verhindern.

Im ersten Schritt erfolgte die Osteotomie der Fibula. Dazu wurde über dem distalen Teil der Fibula von lateral ein Hautschnitt gesetzt und stumpf die Fibula präperiert. Diese wurde mit dem Raspartorium partiell deperiostiert, um anschließend ein circa 1 cm langes Knochenstück freizulegen und dieses mit einer oszillierenden Säge zu resezieren. Danach erfolgte der schichtweise Wundverschluß.

Im zweiten Schritt erfolgte die Implantation des Fixateur externe. Nach Stichinzision wurde die erste Schanzschraube 1 cm über dem distalen Anteil der Tibia plaziert. Daran wurde der zusammengesetzte Fixateur achsengerecht angebracht und diente als Führungsschiene für die weiteren Schanzschrauben.

Die nächste Schanzschraube mit Lokalisation am lateralen proximalen Tibiaende wurde entsprechend der Vorrichtung des Fixateurs parallel zur ersten plaziert, wobei der Bohrer durch die Tuberositas tibiae knapp unterhalb der ersten Schanzschraube und senkrecht zu dieser gesetzt wurde; die dritte Schraube in gleicher Weise proximal medial. Als letzte Schraube wurde die distale mediale Schanzschraube angebracht, die möglichst senkrecht zur ersten und etwas proximal zu derselben stehen sollte. Hier war besonders auf die Schonung der Streckersehnen zu achten.

Abschließend erfolgt die Kortikotomie der Tibia mit der oszillierenden Säge. Die [Seite 27↓]vollständige Durchtrennung wurde durch eine Drehbewegung des Fixateurs und anschließend mittels Bildwandler kontrolliert. Daraufhin folgte der schichtweise Wundverschluß.

Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn mit Trapanal ® iv. 8-10 ml sediert. Nun konnten die Tiere in einer speziellen Hängematte mit freihängenden Hinterläufen in den Versuchsraum getragen werden.

Der Fixateur wurde rechtsbündig in der Mitte der Kassette so plaziert, daß das Fadenkreuz des Lichtes in der Frakturzone lag. Markierungen auf der Röntgenkassette dienten als Orientierungshilfen.

Die Belichtung erfolgte mit der Einstellung von 66 kV und 2,5 mAs. Um den Abstand zwischen Röntgengerät und Röntgenkassette bei 100 cm konstant zu halten, wurde eine spezielle Vorrichtung gebaut.

Zu beginnder Messung wurde ein konventionelles Röntgenbild zur Kontrolle der richtigen Positionierung belichtet und vor Ort entwickelt. Zum Ende des Meßversuches wurden die weiteren Röntgenaufnahmen vorgenommen. Insgesamt wurden jeweils zwei konventionelle Röntgenaufnahmen und eine digitale Aufnahme erstellt.

Die digitalen Röntgenbilder wurden an der Befundungskonsole auf dem SIENET VA02D2 Magic View â (Fa. Siemens Health Services GmbH, Erlangen, Deutschland) eingelesen und ausgewertet. Als Modus wurde der Schulter a.p. ST-Modus gewählt, da dieser die beste Beurteilbarkeit ermöglichte. Die Bilder wurden auf den Archive Servers SIENET Archive Server VA02B â (Fa. Siemens Health Services GmbH, Erlangen, Deutschland) transferiert und dort auf einer WORM LM 510 654 Megabyte ® (Fa. Maxell, England) abgespeichert.

Die konventionellen Röntgenbilder wurden vor Ort belichtet und zu einem späteren Zeitpunkt am Pace-Rechner DiagnostiX 2048® eingescannt und ausgewertet.

	Abbildung 11: Darstellung der Röntgenuntersuchung

Das Knochengewicht wurde als Aluminiumäquivalent EAT bestimmt. Hierfür wurden die Mittelwerte der Helligkeitsverteilung des Knochenregenerates zur besseren Vergleichbarkeit in die Schichtdicke eines vordefinierten Aluminiumkeils umgerechnet.

Auf den Befundungskonsolen der DFR und der DLR wurde hierfür zunächst der Mittelwert der Helligkeitsverteilung der gesamten Distraktionszone bestimmt. Die proximale, distale sowie laterale und mediale Begrenzung der Distraktionszone wurden visuell bestimmt und dieser Bereich als Viereck eingezeichnet. Der Computer berechnete anschließend den Mittelwert der Helligkeitsverteilung.

Der Aluminiumkeil bestand aus zehn Stufen á 2 mm Dicke mit ansteigender Schichtdicke und diente als Vergleich für die Helligkeitsverteilung des Röntgenbildes (siehe Abb. 2.2). Für jede Stufe des Phantoms wurde der Mittelwert der Helligkeitsverteilung in einem Volumen von 0,1 cm³ bestimmt. Die Helligkeitswerte wurden zu den jeweiligen Schichtdicken in Bezug gesetzt und für jedes Röntgenbild eine spezielle Eichkurve erstellt. Der Kurvenverlauf der Eichkurve wurde nun annäherungsweise mittels einer Regressionsanalyse beschrieben und schließlich das Knochengewicht in Aluminiumäquivalent EAT bestimmt, wobei 1 mm EAT einem Gewicht von 142,5 mg des Aluminiumgemisches entsprach. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm SPSS® (Fa. SPSS, München, Deutschland).

Für die destruktive torsionale Messung mußten die Hinterläufe in Beracryl® eingegossen werden. Die Knochen wurden dazu bis zur Weiterverarbeitung in einer mit NaCl-getränkten Kompresse gelagert. Die obere und untere Eingußgrenze wurde auf 1cm nach proximal vom superioren und auf 1cm nach distal vom inferioren Osteotomierand festgelegt. Die Abstandsgröße ergab sich aus der Anordnung der Löcher, die die Schanzschrauben hinterließen.

Der Einguß erfolgte in Metallformen, welche später bei der torsionalen Messung als Halterung der Knochen dienten. Zur Erleichterung der späteren Knochenentnahme wurden die Metallformen mit Vaseline®- Salbe eingerieben. Die Ausrichtung der Knochen war standardisiert. Die Halterung der Knochen erfolgte durch Stative und Klemmschrauben bzw. beim Einguß des zweiten Endes durch die biomechanische Prüfmaschine.

Zwischen allen Arbeitschritten wurden die Knochen zur Vermeidung der Austrocknung der Präparate mit feuchten Kompressen benetzt und im Kühlschrank bei +4°C gelagert.

In der Zwick-Prüfmaschine wurde der Drehwinkel des Knochens über einen internen Winkelaufnehmer und das Drehmoment für die Drehung über den internen Kraftaufnehmer der Maschine gemessen. Der gesamte Versuchsablauf sowie die Berechnungen zur Steifigkeit wurden über einen mit der Zwick-Prüfmaschine verbundenen Computer gesteuert und dokumentiert. Sämtliche Messungen erfolgten bei Raumtemperatur 20°C +/- 1°C.

Die Knochen wurden senkrecht in der Zwick-Maschine eingespannt. Die Halterung erfolgt in zwei parallel ausgerichteten Metallformen. Während der Messung wurde der Knochen mit einer Vorkraft von 20 N (axiale Dauerlast) und 0,5 Nm Vormoment (torsionale Vorlast) belastet. Der Torsionstest wurde mit einer Prüfgeschwindigkeit von 10°/min durchgeführt. Die Beendigung des Testes erfolgte maschinell. Als Kriterium für den Abbruch diente eine Stagnation des Momentwertes bei gleichzeitigem Anstieg des Winkels. Eine weitergehende plastische Verformung oder ein Bruch des Knochens sollte wegen nachfolgender Untersuchungen der Präparate vermieden werden.