A new safeguard eliminates T cell receptor gene-modified auto-reactive T cells after adoptive therapy

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fachbereich Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von


Diplom - Biologin   Elisa   Kieback
geboren am 01.12.1980 in Dresden

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies



Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
2. Prof. Dr. Thomas Blankenstein
3. Prof. Dr. Hinrich Abken

Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2008

To my parents

Summary

The adoptive transfer of T cell receptor (TCR) gene-modified T lymphocytes into patients is associated with potential risk factors. First, auto-immunity may occur if a tumor-associated antigen is targeted on normal tissue, if TCR chain mispairing leads to the formation of an auto-reactive receptor or if an otherwise anergic endogenous receptor specific for an auto-antigen becomes activated. Second, retroviral integration could lead to malignant transformation of the T cell. Therefore, it is essential to have the possibility to deplete the transferred T cells in vivo in case of severe side effects. The available safety modalities such as suicide gene/prodrug systems or cell surface proteins that are targeted by specific antibodies comprise disadvantages rendering them less feasible for the application in adoptive therapy with TCR gene-modified T cells.

In this thesis, a new safeguard has been developed which is based on a TCR-intrinsic depletion mechanism and can eliminate auto-reactive TCR-redirected T cells. By introducing a 10 amino acid-long sequence of the human c-myc protein (myc-tag) into the murine OT-I and P14 TCRs or the human gp100 TCR it was possible to deplete TCR-expressing T cells in vitro and in vivo with a myc-specific antibody. Depending on the antibody isotype, either complement lysis or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity could be induced. The T cells maintained equal function compared to cells expressing the wild-type receptor as shown by MHC-tetramer binding and cytokine secretion. 

Importantly, the in vivo depletion of adoptively transferred T cells could prevent disease in an auto-immune mouse model. Here, splenocytes transduced with a myc-tagged OT-I TCR were injected into RIP-mOVA mice which express the OT-I-specific antigen ovalbumin in the β-islet cells of the pancreas. Destruction of these cells by the adoptively transferred T cells led to severe diabetes in untreated mice. Animals which received a myc-specific antibody after T cell transfer remained healthy and showed no increase in blood glucose levels.

The developed safeguard allows termination of adoptive therapy in case of severe side-effects. The strategy is superior to previous ones as it relies on a TCR-intrinsic mechanism which does not require introduction of an additional gene. Safety is not hampered by loss or low expression of the transgene and immunogenicity in humans is unlikely.

Zusammenfassung

Der adoptive Transfer von T-Zellrezeptor- (TZR-) modifizierten T Zellen ist mit potentiellen Risiken verbunden. Erstens können Autoimmunreaktionen auftreten, wenn Tumor-assoziierte Antigene auf normalem Gewebe erkannt werden, Fehlpaarung der TZR-Ketten zur Bildung eines autoreaktiven Rezeptors führen oder ein sonst anerger endogener Rezeptor aktiviert wird, der ein Autoantigen erkennt. Zweitens besteht das Risiko der malignen Transformation der Zelle durch Insertionsmutagenese des Retrovirusvektors. Daher ist es notwendig, die transferierten T Zellen im Falle schwerer Nebenwirkungen eliminieren zu können. Verfügbare Sicherheitsmechanismen wie Suizidgene oder Oberflächenmoleküle, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden, sind für adoptive Therapie mit TZR-modifizierten T Zellen aufgrund vieler Nachteile ungeeignet.

In dieser Arbeit wurde ein neuer Sicherheitsansatz entwickelt, der auf einem TZR-intrinsischen Depletionsmechanismus beruht und autoreaktive, TZR-veränderte T Zellen eliminieren kann. Durch Einfügen einer 10 Aminosäure-langen Sequenz des humanen c-myc Proteins (myc-tag) in murine (OT-I, P14) und humane (gp100) TZRs konnten TZR-exprimierende T Zellen in vitro und in vivo mittels eines myc-spezifischen Antikörpers depletiert werden. Abhängig vom Isotyp des Antikörpers konnte Komplement-abhängige Lyse oder Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität gezeigt werden. Die T Zellen behielten vergleichbare Funktionalität hinsichtlich Antigenerkennung und Zytokinsekretion wie Zellen, die den Wild-Typ Rezeptor exprimierten.

Die i n vivo Depletion adoptiv transferierter T Zellen verhinderte lethalen Diabetes in einem Mausversuch. Im verwendeten Modell wurden Splenozyten, die mit einem myc-getagten OT-I TZR transduziert wurden, in RIP-mOVA Mäuse injiziert, die in den Inselzellen des Pankreas das OT-I-spezifische Antigen Ovalbumin exprimieren. Zerstörung der Inselzellen durch die transferierten T-Zellen induzierte lethalen Diabetes in unbehandelten Mäusen. Tiere, denen ein myc-spezifischer Antikörper verabreicht wurde, zeigten keine Symptome. Dieser neuartige Sicherheitsmechanismus erlaubt es, adoptive T Zelltherapie abzubrechen, falls schwere Nebenwirkungen auftreten. Im Gegensatz zu früheren Strategien beruht diese auf einem TZR-intrinsischen Mechanismus, bei dem kein zusätzliches Gen eingebaut werden muss. Die Sicherheit des Ansatzes wird durch Verlust oder Herunterregulierung des Transgens nicht beeinflusst und Immunogenität im Menschen ist unwahrscheinlich.

Keywords: T cell receptor, gene therapy, safety, myc-tag

Eigene Schlagworte: T Zellrezeptor, Gentherapie, Sicherheit, myc-tag

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23.08.2010