2 MATERIAL UND METHODEN

Für alle Versuche wurden männliche Wistar-Ratten der Versuchstieranstalt Harlan-Winkelmann (Borchen, Deutschland) verwendet. Die Unterbringung erfolgte in Makrolonkäfigen mit den Maßen 40 cm x 60 cm x 25 cm. Bis zum Zeitpunkt der Operation (OP) lebten maximal fünf Tiere in den Tierhaltungskäfigen. Ein Lichtprogramm gab einen circadianen 12-Stunden-Rhythmus mit Lichtphase von 6 bis 18 Uhr vor. Die Tiere wurden mit ad libitum Wasser versorgt, das Futter wurde in Form von Standardpellets Altromin 1326 (Altromin, Deutschland) verabreicht. Für die Versuche am nahrungskarenten Tier wurde dies 16 h ohne Futter gehalten.

Die Raumtemperatur war konstant auf 22 ± 1°C eingestellt.

Vor der Operation wogen die Tiere zwischen 250 ± 30 g. Die Adaptationsphase in der neuen Tierhaltung betrug mindestens 14 Tage. Nach der Operation wurde eine Erholungsphase von 7 Tagen eingehalten.

Postoperativ wurden die Ratten einzeln in zylindrische Käfige mit einem Durchmesser von 37 cm und einer Höhe von 40 cm gesetzt. Sie erhielten Wasser und Futter ad libitum. Nach Wiedererlangen ihrer präoperativen Körpermasse (KM) waren die Tiere versuchsbereit. Während der Mikrodialyseversuche am wachen Tier befanden sich die Ratten ebenfalls in den oben angegebenen Käfigen.

Im folgenden werden die Ratten, die während der Versuche ad libitum Futter erhielten in Anlehnung an den in der englischsprachigen Literatur gebräuchlichen Begriff „freely feeding“ als „frei fressende“ Tiere bezeichnet. Hingegen werden diejenigen Ratten, denen Futter zeitweise vor oder während der Versuche entzogen wurde als „nahrungskarent“ (im Englischen „food deprived“) bezeichnet.

Tabelle 2: Herstellernachweis der verwendeten Substanzen

Die Substanzen wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Kontrolltiere wurden unter gleichen Versuchsbedingungen mit reiner Kochsalzlösung behandelt.

Alle Dosisberechnungen beziehen sich auf die Körpermasse der Tiere (mg/kg oder µg/kg).

In Versuchsreihe A (Versuchsanordnung siehe Tabelle 5) wurde intraperitoneal (i.p.) appliziert. 8-OH-DPAT wurde in zwei Dosen gegeben: 100 µg/kg KM und
300 µg/kg KM. Das Applikationsvolumen betrug 1 ml/kg KM.

In Versuchsreihe B wurde über das Sondensystem lokal appliziert. Die Substanzen wurden in artifizieller cerebrospinaler Flüssigkeit (aCSF) gelöst und lagen in 2 x 10 M Konzentration vor. Das Molekulargewicht von 8-OH-DPAT [Seite 28↓]beträgt 328,29 g/mol, das Molekulargewicht von WAY 100635 beträgt 538,65 g/mol Über das Mikrospritzensystem wurde über die Dauer von 20 min appliziert.

Alle Versuche wurden in der Hellphase durchgeführt. Um eine wirksame Dosierung für die Mikrodialyseversuche festlegen zu können, wurden folgende Experimente durchgeführt:

Die wie oben beschrieben gehaltenen Tiere erhielten über einen Zeitraum von 2 h Futter ad libitum. Nach der ersten und nach der zweiten Stunde wurde jeweils der Futterverbrauch mittels Abwägen der Pellets in Gramm gemessen. Zwanzig Minuten vor Futtergabe wurde 8-OH-DPAT i.p. appliziert. Hierbei wurden zwei Versuchsreihen mit den Substanzdosierungen 100 µg/kg KM und 300 µg/kg KM durchgeführt. Die Kontrollgruppe erhielt statt der Substanzgabe das gleiche Applikationsvolumen NaCl.

Zur Untersuchung einer möglichen Abhängigkeit der unterschiedlichen Substanzeffekte beim frei fressenden und nahrungskarenten Tier von der lokomotorischen Aktivität wurden folgende Versuche durchgeführt:

Die Tiere wurden unter den o.g. Standardbedingungen gehalten. Eine Hälfte der Gruppe war 16 h nahrungskarent, die andere Hälfte hatte freien Futterzugang bis zum Beginn des Versuchs. Beide Gruppen wurden mit 300 µg/kg 8-OH-DPAT behandelt. Die Tierkäfige wurden auf ein Animex (LKB, Schweden) platziert. Die Aktivitätsmessung erfolgte durch ein Zählsystem, das die Unterbrechungen auf dem vertikalen elektromagnetischen Feld, das von dem Animex aufgebaut wird, als Impulse aufnimmt. Im Intervall von 20 min wurden die individuellen Lokomotionswerte über eine Zeit von 1h vor Applikation bis 2 h nach Applikation abgelesen.

Für die Mikrodialyseversuche am wachen Tier musste eine Führungskanüle (CMA, Schweden) für die Mikrodialysesonde implantiert werden. Dazu wurde das Tier mit Pentobarbital in einer Dosis von 45 mg/kg KM (i.p.) narkotisiert. Das Tier wurde in ein stereotaktisches Gerät eingespannt, danach wurde mit einem Skalpell die Haut im Längsschnitt bis zum Periost aufgeschnitten und der Knochen [Seite 29↓]freipräpariert. Die Führungskanüle wurde in das dafür gebohrte intracraniale Loch eingeführt. Drei weitere Bohrungen dienten dem Einsetzen von Schrauben, die zusammen mit der eingeführten Kanüle den abschließend aufgebauten Sockel aus Kunststoff (Technovit, Kulzer, Deutschland) zur Fixierung bildeten. Am Ende wurde der Schnitt mit chirurgischem Nahtmaterial verschlossen. Bis zum Ende der Narkose blieb die Ratte auf einer Wärmeplatte und kam dann in die Tierhaltung zurück.

Die Koordinaten für die Lokalisation der Führungskanüle in den Kerngebieten des lateralen Hypothalamus betrugen nach Paxinos und Watson (1986) 2,5 mm posterior des Bregmas, 1,6 mm lateral der Sagittalnaht und 5,5 mm intracranial. Die Sonde reichte 3 mm über die Führungskanüle hinaus, womit eine intracraniale Gesamttiefe von 8,5 mm erreicht wurde (Abb. 4).

	Abbildung 4: Lokalisation der Mikrodialysesonde im lateralen Hypothalamus

Mit einer Dosis von 400 mg/kg KM Chloralhydrat wurde die Ratte durch i.p. Injektion in Narkose versetzt. Wie unter 2.5.1.1 beschrieben, erfolgte die Präparation bis zum Knochen. Das Loch für die Sonde wurde mit einem Elektrobohrer entsprechend der Koordinaten gewählt. Da in der Versuchsanordnung für narkotisierte Tiere die Führungskanüle nicht notwendig [Seite 30↓]war, errechnete sich die Sondentiefe mit 8,5 mm von der Gehirnoberfläche aus, die posterioren und lateralen Werte konnten beibehalten werden. Die Sonde wurde direkt in die gebohrte Öffnung eingeführt und das Tier auf dem stereotaktischen OP-Tisch bis Versuchende in Narkose belassen.

Die an den verwendeten Sonden fixierten Dialysemembrane (CMA 10, CMA, Schweden) waren 3 mm (Versuchsreihe A: wache Ratte) und 2 mm (Versuchsreihe B: narkotisierte Ratte) lang und wiesen einen Durchmesser von 0,5 mm auf (Abb. 5). Die Moleküldurchlässigkeit („cut-off“) belief sich auf maximal 20 000 Dalton.

Die relative Wiederfindungsrate (%) wurde in Vorversuchen bestimmt (Werte siehe unter 3.1.1).

Aufbau einer Mikrodialysesonde

	Abbildung 5: Schematische Darstellung einer Mikrodialysesonde

Die Sonde wurde an ein Schlauchsystem aus Teflon angeschlossen.

Mittels einer CMA Mikroinjektionspumpe wurde das gesamte System mit im Ultraschallbad entgaster aCSF kontinuierlich mit einer Flussrate von 1 µl/min durchspült.

Die Zusammensetzung der aCSF bestand aus 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 27 mM NaHCO, 0,5 mM NaHPOHO, 2,4 mM NaHPO2 HO, 0,5 mM NaSO, 1 mM MgCl 6 HO und 1 mM CaCl 2 HO. Der pH wurde mit HPO 30 % auf 7,4 eingestellt.

Bei einer konstanten Flussrate von 1 ml/min konnte im Intervall von 20 min ein Dialysatvolumen von 20 ml entnommen werden. Als Oxidationsschutz wurden in das Eppendorfgefäß, in dem das Dialysat aufgefangen wurde, vor jedem neuen Probenintervall 5 ml Perchlorsäure 10 % zugegeben.

Die Trennung von 5-HT aus dem Injektionsgemisch erfolgte durch Umkehrphasen-Chromatographie (High Performance Liquid Chromatography = HPLC) an einer
200 mm langen Messsäule. Diese besteht prinzipiell aus einem Rohr, das an beiden Enden mit porösen Filtern abgedichtet ist. Das Säulenbett enthält einen dichten Verband poröser Teilchen, an deren Porenwänden ein Grenzfilm gebildet wird. An diesem werden die im Fließmittel befindlichen zu analysierenden Substanzen unterschiedlich lange, charakteristisch für die jeweilige Substanz, adsorbiert und dann wieder in das Fließmittel abgegeben. Der adsorbtive Grenzfilm entspricht der stationären Phase. Das bewegte Fließmittel entspricht der mobilen Phase.

Die im Injektionsgemisch befindlichen Substanzen werden demnach je nach Verzögerung an der stationären Phase eluiert und treten mit unterschiedlicher Verweildauer in getrenntem Zustand aus der Säule aus, an welcher sie detektiert werden.

Als mobile Phase wurde eine Lösung aus dreifach destilliertem, entionisiertem Wasser, dem 0,1 mM NaHPO, 0,7 mM EDTA und 0,23 mM OSA zugesetzt wurden, verwendet. Die Lösung wurde mit konzentrierter Phosphorsäure auf einen pH von 5,22 eingestellt und gefiltert. Anschließend wurde 4 % Isopropanol zugefügt. Nachfolgend wurde die mobile Phase mit einer Heliumspülung und durch Ultraschall entgast.

Das Dialysat wurde in die HPLC durch ein Injektionsventil in die 20 ml Sammelschleife (Rheodyne, USA) eingegeben. Durch eine Pumpe mit Pulsationsdämpfer (Gynkotek, Deutschland) wurde der Fluss der mobilen Phase auf 250 ml/min konstant gehalten.

Nach der chromatographischen Trennung wurde 5-HT bei einem Gleichspannungspotential von + 0,650 V an einer Glaskarbonelektrode gegenüber einer Ag/AgCl-Referenzelektrode (Antec VT03 elektrochemische Zelle) mit Hilfe eines elektrochemischen Detektors (EC-30, Gynkotek, Deutschland) oxidiert. Der Oxidationsstrom wurde mit einem Chromatographie-Datensystem aufgezeichnet und ausgewertet.

Die Nachweisgrenze für 5-HT lag im Bereich 1x10 M.

Aus Proben, die einer Standardlösung in künstlichem Liquor entstammten konnte die spezifische Retentionszeit für 5-HT auf dem Chromatogramm bestimmt werden (Abb. 6). Dies diente der Identifikation von 5-HT im aufgegebenen Dialysat.

Serotonin im lateralen Hypothalamus

	Abbildung 6: Chromatogramm eines Dialysats aus dem lateralen Hypothalamus der Ratte mit Angabe der Retentionszeit für 5-HT.

Am Vortag des Experimentes um 16 Uhr wurden die Sonden gespült:

Tabelle 3: Schematische Darstellung der Sondenspülung

Die Dauer des Sondengebrauchs belief sich bei einmaligem Gebrauch auf 20 Stunden, bei zweimaligem Gebrauch auf 40 h.

Die Flüssigkeiten wurden stets im UV-Bad entgast, um Luftblasen im Schlauch- und Sondensystem zu vermeiden.

Die Qualitätsprüfung der Sonde erfolgte durch Bestimmung der Wiederfindungsrate in aCSF. Unter einer den Versuchsbedingungen entsprechenden Flussrate von 1 µl/min wurde die relative Wiederfindungsrate [%] aus einer 10 M 5-HT-Standardlösung bestimmt.

Versuchsaufbau Mikrodialyse

	Abbildung 7: Schematische Versuchsanordnung der Mikrodialyse im LHA der Ratte. Das dialysierte Probenvolumen wurde mit Hilfe eines Injektionsventils alle 20 min in das HPLC-System eingegeben und 5-HT elektrochemisch detektiert.

Die Mikrodialyseversuche wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

A Versuche mit peripherer Substanzgabe (waches, frei bewegliches Tier)

Tabelle 4: Versuchsreihe A mit Applikationsschema bei peripherer Substanzgabe

B

Tabelle 5: Versuchsreihe B mit Applikationsschema bei zentraler Substanzgabe

Dem wachen Tier wurde 16 h vor Versuchsbeginn die gespülte Sonde ohne Narkose in den LHA eingesetzt. Bei einer Flussrate von 1 µl/min wurden nach etwa 30 min im Abstand von 20 min Dialysate gesammelt und im Chromatogramm der Peak für 5-HT anhand der spezifischen Retentionszeit bestimmt.

Am folgenden Morgen um 8 Uhr begann der Versuch mit 20 minütigen Sammelperioden der Dialysate bei einer Flussrate von 1 µl/min. Aus drei konstanten Werten wurde die Basislinie gemittelt. Nach Erreichen der Basislinie wurde die gelöste Substanz appliziert und im Intervall von 20 min mit den Dialysat-[Seite 35↓]Sammlungen fortgefahren. Die Sammlung nach Applikation erfolgte zwei Stunden lang.

Die Versuche am wachen, frei beweglichen Tier wurden zuerst am satten Tier mit Futterentzug nach Substanzapplikation, dann am 16 h nahrungskarenten Tier entsprechend durchgeführt (Tab. 4).

In einer zweiten Versuchsreihe wurde sowohl dem satten, als auch dem hungrigen Tier nach Substanzgabe Futter angeboten und der Verbrauch stündlich gemessen (Tab. 4).

Alle Versuchstiere hatten vor Narkose Futter ad libitum.

Unter kontrollierter Dauernarkose mit Chloralhydrat wurde die 2 mm tiefe, nach angegebenem Schema gespülte Sonde in den Führungskanal eingeführt. Bei einer aCSF-Flußrate von 1 µl/min wurden über einen Zeitraum von 20 min 20 µl Dialysat gesammelt, dem 5 µl Perchlorsäure wie in den vorausgehend beschriebenen Versuchen am wachen Tier zugesetzt wurden. Das Gesamtvolumen von 25 µl wurde mit Hilfe eines Injektionsventils alle 20 min in das HPLC-System eingegeben. Nach Erreichen einer stabilen Basislinie wurde die jeweilige Substanz appliziert.

Hierbei wurde wiederum die periphere oder lokale Applikationsweise benutzt, sowie die unter 2.5.3.1 Punkt B angegebenen Kombinationen und Konzentrationen von 8-OH-DPAT und WAY 100635 eingesetzt. Die intraperitoneale Applikation erfolgte wie unter 2.5.3.2 beschrieben.

Mittels eines dreifachen Mikrospritzensystems unter rechnerischer Berücksichtigung des Totraumvolumens im Schlauchsystem konnten die beiden oben angegebenen Substanzen als Einzel- oder Doppelapplikation verabreicht werden. Zum Applikationszeitpunkt wurde von aCSF auf das in aCSF gelöste entsprechende Pharmakon umgeschaltet. Bei Verwendung beider Substanzen wurde nach Applikation von WAY 100635 auf das dritte System mit in aCSF gelöstem 8-OH-DPAT gewechselt.

Während des gesamten Versuchs wurden weiterhin im Intervall von 20 min Dialyseproben gesammelt und auf die HPLC aufgetragen. Versuchende war 120 min nach Gabe der letzten Substanz. Das Tier wurde in Exitus letalis durch eine Überdosis Chloralhydrat versetzt.

Nach Abschluss der Dialyseversuche wurde dem eingeschläferten Tier die Mikrodialysesonde entnommen und das Gehirn freipräpariert und gefroren. Mit einem Mikrotom wurde das fixierte Präparat in 30 µm dünne Scheiben geschnitten. Anhand des Paxinos/Watson-Atlas wurde von einem unabhängigen Beobachter die Sondenlokalisation festgestellt. Die fehlgetroffenen Operationen wurden ausgeschlossen.

Die Analyse erfolgte mit dem Paired t-Test.

Die Daten sind als Mittelwerte + SEM angegeben. Die Analyse erfolgte mit der einfachen Varianzanalyse (One-Way ANOVA), gefolgt von Dunnett’s Test oder bei nicht erreichter Normalitätsverteilung mit dem Kruskal-Wallis Test, gefolgt von Dunn’s Test.

Bei nicht erreichter Normalverteilung wurden die Gruppenvergleiche mit dem Mann-Whithney -Test durchgeführt.

Da die Konzentrationen von 5-HT im Dialysat zwischen den Versuchstieren variierten, wurden die Werte prozentual angegeben. Hierbei wurde eine Basislinie aus der Sammlung dreier Dialysate vor Applikation (siehe Punkt 2.5.3.2) erstellt und als 100 % gesetzt. Die folgenden Werte wurden stets auf diese 100 % bezogen.

Vergleiche zwischen den Gruppen wurden entweder über die einfache Varianzanalyse und folgendem Dunnett’s Test oder über den Student’s t-Test oder bei fehlender Normalverteilung über den nicht-parametrischen Mann-Whithney -Test berechnet. In Versuchsreihe B wurde neben den oben genannten Tests mit mehrfacher Varianzanalyse (ANOVA on repeated measures) gerechnet. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von P < 0,05 betrachtet.