4 DISKUSSION

Die Mikrodialyse ist eine Sammel- und Applikationstechnik, die es ermöglicht, die Konzentration von Substanzen im Extrazellularraum zu bestimmen. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete intracerebrale Mikrodialyse ist eine geeignete Methode, um neurochemische Prozesse im Gehirn in Zusammenhang mit Verhaltensereignissen und/oder pharmakologischer Behandlung zu erfassen. Andererseits können Substanzen auch lokal über die Mikrodialysesonde appliziert werden.

Die Wiederfindung einer Substanz aus dem Extrazellularraum hängt von der Diffusion bzw. dem Konzentrationsgradienten an der Sondenmembran ab. Um diesen aufrecht zu erhalten, ist eine kontinuierliche Perfusion der Sonde notwendig. Ist die Fließgeschwindigkeit hoch, so steigt die absolute Substanzmenge, die in einer definierten Zeitspanne im Dialysat gewonnen werden kann. Der absolute Wiederfindungswert ist Schwankungen ausgesetzt, die durch Freisetzung aus dem Gewebe verursacht werden (Ungerstedt, 1991).

Eine entgegengesetzte Abhängigkeit besteht bei der relativen Wiederfindungsrate. Sie beschreibt die Konzentration einer bestimmten Substanz in der Probenflüssigkeit im Verhältnis zur Konzentration des Stoffes, welcher sich im die Dialysemembran umgebenden Gesamtmedium befindet.

Bei hohem Fluss steigt der Verdünnungseffekt im perfundierten Medium, die relative Wiederfindungsrate sinkt. Je minimaler der Fluss desto höher die relative Wiederfindungsrate. Das heißt, bei einem Fluss von Null wird die Konzentration in der Sonde identisch mit der Konzentration des Stoffes im umgebenden Medium. Dann wird auch die aus dem Dialysesystem gewonnene Substanzmenge gleich Null. Damit ist der absolute Wiederfindungswert gleich Null, die relative Wiederfindungsrate hingegen 100 %.

Neben der Perfusionsgeschwindigkeit ist der Wiederfindungswert abhängig von der Anfangskonzentration des Stoffes im perfundierten Medium, der Membranpassierbarkeit der Substanz, das heißt der Porengröße, und schließlich von der Gewebetemperatur.

Um einerseits einen möglichst hohen Wiederfindungswert und andererseits möglichst große Probenvolumina in geringer Zeit zu erhalten, muss eine optimale Fließgeschwindigkeit gefunden werden (Amberg und Lindefors, 1989).

Die Fließgeschwindigkeit wurde in den vorliegenden Versuchen mit 1 µl/min so langsam wie möglich gewählt, um Gewebeschäden und Auswascheffekte extrem gering zu halten. Andererseits gewährleistete diese Geschwindigkeit das Sammeln von ausreichenden Probenvolumina zur kontinuierlichen 20-minütigen 5-HT-Bestimmung.

Ein technischer Kompromiss musste ebenfalls in Bezug auf Wiederfindungswert und die Länge der Sonde gefunden werden. Dieser Zusammenhang war in Mikrodialyseversuchen von mehreren Autoren (Amberg und Lindefors 1989; Benveniste, 1989) beschrieben worden. Die technische Sondenentwicklung hatte zum Ziel, die Sondenlänge einerseits zu minimieren, um den Gewebeschaden gering zu halten, und andererseits die Länge zu maximieren, um eine höhere Wiederfindungsrate zu erlangen.

Es wurden Sonden mit 2 mm und 3 mm Länge geprüft. Sie wurden jeweils nach einmaligem und zweimaligem Gebrauch in Mikrodialyseversuchen untersucht.

Mit 22,2 % wiesen die 3 mm Sonden beim erstmaligem Gebrauch über eine Dauer von 20 h die höchste Wiederfindungsrate für 5-HT auf. Nicht signifikant geringer war die Rate mit 16,7 % nach dem zweiten Gebrauch (40 h) der gleichen Sonden. Nicht signifikant niedrigere Werte für die Wiederfindung wurden bei den 2 mm Sonden mit 15,7 % beim ersten und 13,8 % beim zweiten Gebrauch ermittelt.

Der Gebrauch der Sonden über einen Zeitraum von mehr als 20 h ist also nach unseren Versuchen mit gründlicher Sondenspülung (s. Tab. 3) ohne messbare Verluste in der Qualität möglich und ökonomisch sinnvoll. Ein längerer Gebrauch und dessen qualitative Auswirkungen auf die Wiederfindung müssten in weiteren Testreihen untersucht werden.

In den Mikrodialyseversuchen am wachen Tier entschieden wir uns für den Einsatz der 3 mm Sonden. Da die Versuche in der Regel mindestens 20 h dauerten, musste durch die längere Verweildauer und Durchspülung der Sonde mit einem Abfall der extrazellulären Konzentrationen von 5-HT im Dialysat gerechnet werden.

Am ersten postoperativen Tag verloren die Tiere bis zu 6 % ihrer Ausgangskörpermasse. An den darauf folgenden 5 Tagen nahmen die Tiere allesamt stetig an KM zu und erreichten spätestens am 6. postoperativen Tag ihre Ausgangskörpermasse. Dies stimmt mit postoperativen Erholungszeiten in früheren Versuchen anderer Autoren überein (Hutson et al., 1986). Die Tiere wurden mit Erreichen ihrer Ausgangskörpermasse in die Dialyseversuche genommen.

Coudereau wies 1995 für Mäuse nach, dass die durch die OP bedingten isolierten Haltebedingungen über eine Dauer von 7 Tagen keine Veränderung in der Wirkung des 5-HT-Rezeptoragonisten 8-OH-DPAT auf die Futteraufnahme zeigten.

Obgleich die intracerebrale Implantation der Mikrodialysesonde in Versuchen anderer Autoren einige postoperativ veränderte Parameter, wie verminderte Geschwindigkeit des Blutflusses, erhöhte Glukose-Verstoffwechselung und Änderungen in der Transmitterausschüttung zeigte, waren diese Veränderungen höchstens bis 24 h nach OP beobachtet worden. Nach 24 h stellten sich wieder die präoperativen Werte ein (Benveniste, 1989). Die Zeit bis zum Erreichen einer kontinuierlichen Grundlinie hängt von den analysierten Stoffen und ihren metabolischen Eigenschaften, aber auch von den operativen Methoden und Dialysetechniken ab (Ungerstedt, 1991).

In Versuchsreihe A mit peripherer Gabe von 8-OH-DPAT wurde die Sonde am Vortag in die Führungskanüle eingesetzt. In Versuchsreihe B mit zentraler Gabe unter Narkose der Tiere konnte die Sonde in stereotaktischer Operation direkt am Versuchstag ohne Führungskanüle ins Gehirn eingesetzt werden.

Nach einem Intervall von 60 min wurde mit der Sammlung von Proben zur 5-HT-Bestimmung begonnen. In der Regel wurden nach 120 min stabile Werte gemessen, und es erfolgte die Bestimmung der Basislinie.

Erstmals von Dourish et al. (1985) veröffentlicht, bestätigte sich in späteren Versuchsreihen, dass die Gabe des 5-HT-Agonisten 8-OH-DPAT die Futteraufnahme bei Ratten steigert (Dourish, 1992). Dieser Effekt ist durch [Seite 54↓]somatodendritische Autorezeptoren vermittelt (Dourish et al., 1985; Hutson et al., 1986).

Das Ausmaß des stimulierenden Effekts auf die Futteraufnahme zeigte in unseren Versuchen allerdings eine Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen. In unseren Pilotversuchen stieg, wie oben erwähnt, nach intraperitonealer (i.p.) Gabe von 300 µg/kg 8-OH-DPAT die Futteraufnahme bei den Tieren mit freiem Futterzugang signifikant an. Mit NaCl-Lösung behandelte Tiere nahmen hingegen nur geringe Mengen an Futter (< 1g/2 h) auf.

Diese Hyperphagie nach Gabe von 8-OH-DPAT am frei fressenden Tier wurde nicht nur nach systemischer, sondern auch nach lokaler Gabe in die serotonergen Ursprungsgebiete, den Raphe-Kernen, beobachtet (Bendotti und Samanin, 1986; Hutson et al., 1988). Die lokale Gabe von 8-OH-DPAT in die Raphe führte zu keiner Veränderung der 5-HT-Freisetzung im Applikationsgebiet selbst (Adell et al., 1993), jedoch zu einem Abfall von 5-HT in den Projektionsgebieten. In Mikrodialyse-Versuchen an der narkotisierten Ratte untersuchten Kreiss und Lucki (1994) den Effekt von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung in Striatum und Hippocampus. Nach systemischer Gabe des 5-HT-Rezeptoragonisten fiel die 5-HT-Ausschüttung erwartungsgemäß ab. Nach lokaler Gabe von 8-OH-DPAT in die jeweiligen Projektionsgebiete zeigte sich kein Substanzeffekt. Lokale Gabe in die dorsale Raphe hingegen führte allein im Striatum zum 5-HT-Abfall, lokale Gabe in die mediane Raphe nur im Hippocampus. Damit ist die regionale Abhängigkeit des Effektes von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung beschrieben.

In unseren Versuchen an nahrungskarenten Tieren konnte jedoch kein hyperphager Effekt von 8-OH-DPAT beobachtet werden. Unter gleicher Dosisgabe (300 µg/kg i.p.) zeigten diese Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe sogar eine signifikant geringere Futteraufnahme.

Die NaCl-behandelten oder mit einer Dosis von nur 100 µg/kg 8-OH-DPAT behandelten nahrungskarenten Tiere nahmen deutlich mehr Futter im Vergleich zu den frei fressenden Kontrolltieren auf.

Bendotti und Samanin (1987) stellten die Hypothese auf, dass sich das hypophage Verhalten nach Gabe von 8-OH-DPAT an nahrungskarenten Tieren durch die postsynaptische Wirkung des Agonisten erkläre. Dies führe zu einer [Seite 55↓]Interferenz zwischen Futteraufnahme und dem postsynaptisch ausgelösten 5-HT-Syndrom.

Dieses Syndrom („forepaw trading“, „head-weaving“, „hind limb abduction“,„straub tail“ und „flat body posture“) wurde unter 1.3.6 bereits beschrieben (Grahame, 1971; Jacobs, 1976; Curzon, 1999). Dourish et al. (1985) zeigten ebenfalls bei hungrigen Tieren hypermotorisches Verhalten nach Gabe von 8-OH-DPAT.

Im Gegensatz zu o.g. Autoren wurde jedoch auch eine Abnahme der Lokomotion nach 8-OH-DPAT am nahrungskarenten Tier beschrieben, wobei methodische Unterschiede, wie z.B. Applikationsart und Dosierung, bei der Interpretation der Ergebnisse zu berücksichtigen sind.

In unseren Versuchen zeigten sowohl die frei fressenden als auch die nahrungskarenten Tiere in den ersten 20 min nach Substanzgabe einen signifikanten Anstieg der Lokomotionswerte. Dies legt einen gleichartigen Wirkmechanismus des 5-HT-Rezeptoragonisten bezogen auf Lokomotion am satten und hungrigen Tier nahe.

Kritik an der Hypothese, dass die postsynaptisch ausgelösten Lokomotionsveränderungen mit der Futteraufnahme interferieren, wurde von Ebenezer (1992) geübt. Er fand einen antiorexigenen Effekt von 8-OH-DPAT auch bei Dosen unter 100 µg/kg, die keine Stereotypien hervorriefen. Damit lag nahe, dass der hypophage Effekt durch andere Rezeptormechanismen ausgelöst sein musste als das 5-HT-Syndrom.

In den vorliegenden peripheren Versuchen wurde 8-OH-DPAT stets intraperitoneal appliziert. Da die Mikrodialysesonde mit Haltesockel am Kopf des Versuchstieres angebracht war, tangierte die intraperitoneale Applikation daher das Operationsgebiet im Gegensatz zur subcutanen Applikation nicht. Die Dosis von
8-OH-DPAT (i.p.) musste mit 300 µg/kg KM relativ hoch gewählt werden. Die ebenfalls gebräuchliche subkutane Applikation zeigt eine geringfügig höhere Anreicherung der Substanz im ZNS (Perry und Fuller, 1989) und eine etwas stärkere Wirksamkeit als die intraperitoneale Applikation (Fuller und Snoddy, 1987). Dies mag eine Erklärung dafür sein, dass das 5-HT-Syndrom trotz der hohen Dosierung des Agonisten in unseren Mikrodialyse- und Lokomotionsversuchen im Vergleich zu anderen Autoren (Dourish et al., 1985; [Seite 56↓]Hutson et al., 1988) nicht oder nur schwach ausgeprägt war.

Unsere Versuche legen daher den Schluss nahe, dass sich die unterschiedliche Wirkung des 5-HT-Agonisten auf die hypothalamische 5-HT-Freisetzung bei frei fressenden und nahrungskarenten Ratten nicht in der Lokomotion widerspiegelt.

8-OH-DPAT vermindert die Freisetzung von extrazellulärem 5-HT im Hypothalamus durch seine Wirkung an somatodendritischen Autorezeptoren in den Raphe-Kernen. Dies konnte in früheren Experimenten gezeigt werden (Schwartz et al., 1990a; Lorrain et al., 1998). In unserem zweiten Mikrodialyseversuch konnten wir jedoch nachweisen, dass 8-OH-DPAT keine Wirkung auf die 5-HT-Freisetzung beim hungrigen Tier hat.

In zahlreichen Studien wurde versucht, den Mechanismus zu erklären, der für die unterschiedliche Wirkung von 8-OH-DPAT in Abhängigkeit vom Fütterungszustand ursächlich ist (in De Vry und Schreiber, 2000). Dabei kristallisierten sich zwei Erklärungshypothesen heraus, die die fehlende Wirkung von 8-OH-DPAT bei nahrungskarenten Ratten zu erklären versuchen:

1. Unterschiede im 5-HT-Metabolismus beim satten und beim hungrigen Tier
2. Unterschiede in Zahl und Funktion der 5-HT-Rezeptoren beim satten und beim hungrigen Tier

Zum ersten Punkt: Die Synthese von 5-HT ist abhängig von der Menge und Verfügbarkeit an Tryptophan. Nach Nahrungskarenz wurden erhöhte Werte von Tryptophan im ZNS gemessen (Schweiger et al., 1989). In weiteren Vergleichen zwischen frei fressenden und nahrungskarenten Ratten wurden erhöhte Werte von
5-HIAA und 5-HT im Cortex, Striatum, Cerebellum und Mittelhirn der hungrigen Tiere gemessen (Knott und Curzon, 1974). Im Hypothalamus wurden gegensätzliche Ergebnisse gefunden (Knott und Curzon, 1974; Kantak et al., 1978). Die einzelnen Kerngebiete wiesen unterschiedliche Veränderungen im 5-HT- bzw. 5-HIAA-Gehalt nach Futterrestriktion auf. Loullis et al. (1979) bestätigten einen Anstieg von 5-HIAA im LHA nach 48 h Futterdeprivation. Der 5-HT-Gehalt blieb nach diesen Studien hingegen unverändert, was beides auf eine Steigerung des serotonergen Metabolismus hinweist. Im VMH wurden keine serotonergen Veränderungen beim nahrungskarenten Tier gefunden. Dies steht im Einklang mit den klassischen Läsionsversuchen (Anand und Brobeck, 1951), die den jeweiligen [Seite 57↓]hypothalamischen Kerngebiete erstmals spezifische Funktionen in der Nahrungsregulation zugeordnet hatten.

Fuenmayor und Garcia (1984) vermuteten, dass der erhöhte 5-HT-Metabolismus im Hypothalamus von einer gesteigerten neuronalen Transmitterausschüttung begleitet wird. Ergänzende Ansätze kamen von Schwartz et al. (1990b), die feststellten, dass peripheres Tryptophan beim nahrungskarenten Tier den hypothalamischen 5-HT-Spiegel leichter anheben konnte als bei Tieren, die ad libitum Futter erhielten.

In späteren Versuchen wurde das Futter-Restriktionsmodell von Haleem und Haider (1996) spezifiziert. Den Ratten, die Futter ad libitum erhielten wurde eine Gruppe von Ratten gegenübergestellt, die über 5 Tage an eine bestimmte Fresszeit (4 h) gewöhnt wurde. Nach 5 Tagen wurde der Hälfte dieser Gruppe für 2 h Futter angeboten, die andere Hälfte wurde ohne Futteraufnahme getötet. In den Gehaltsbestimmungen wurde ein signifikanter Abfall an 5-HT bei beiden vorher nahrungskarenten Gruppen gefunden. Der Metabolit 5-HIAA war in diesen beiden Gruppen erhöht. Dieses Ergebnis zeigt die offensichtlichen Veränderungen in Synthese und Metabolismus von 5-HT bei Ratten, die einem Nahrungsregime unterliegen. Durch Gehaltsbestimmungen von Tryptophan wurde in derselben Studie bei denjenigen Ratten, die im nahrungskarenten Zustand getötet wurden ein Anstieg der nicht gebundenen Form und ein Abfall des Gesamtgehaltes im Plasma gemessen. Der Zustand einer eingeschränkten Nahrungsaufnahme über einen längeren Zeitraum bewirkt auf biochemischer Ebene eine veränderte Aktivität des Enzyms Tryptophanhydroxylase und damit auch eine Veränderung der 5-HT-Verfügbarkeit.

Der Syntheseanstieg von 5-HTP nach Nahrungskarenz wurde in Zusammenhang mit der Tryptophan-Bindungskapazität an Albumin gesehen (Knott und Curzon, 1974).

Eine Verbindung der erstgenannten Hypothese zum unterschiedlichen 5-HT-Metabolismus beim satten und beim hungrigen Tier wurde von nachfolgenden Autoren untersucht. Dabei zeigte sich weder beim frei fressenden, noch beim nahrungskarenten Tier eine Korrelation des 5-HT-Anstiegs mit den Effekten des
5-HT-Rezeptoragonisten. Der Einfluss von 8-OH-DPAT auf die 5-HTP-Synthese war weder beim satten noch beim hungrigen Tier nachzuweisen. In einer [Seite 58↓]Ausgangshypothese von Chaouloff et al. (1997) wurde vermutet, der Anstieg der neuronalen Aktivität serotonerger Zellen beim nahrungskarenten Tier bewirke eine Desensibilisierung der somatodendritischen 5-HT-Rezeptoren. Die Effekte der Nahrungskarenz auf den 5-HT-Metabolismus sind damit wahrscheinlich unabhängig von 5-HT-Autorezeptoren. Vielmehr ist ein kompensativer Mechanismus denkbar, der beim nahrungskarenten Tier letztlich zu einem unveränderten extrazellulären 5-HT-Spiegel nach Stimulation am Autorezeptor führt. Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse unserer Mikrodialysestudien bestätigt. Außerdem sind Interaktionen mit anderen serotonergen Rezeptoren oder die Involvierung weiterer Transmissionssysteme möglich.

Die zweite Hypothese fokussiert auf die Rezeptorebene.

Weniger klar als die bereits dargestellte Rolle der somatodendritischen ist die der postsynaptischen 5-HT-Rezeptoren für die Regulation der Futteraufnahme. Mit der Entdeckung von Glukose-sensitiven Neuronen (GSN) im LHA wurden weitere Erklärungsansätze gefunden (Anand 1961; Anand und Pillai, 1967). Diese Rezeptoren zeigten eine reduzierte elektrische Aktivität nach peripherer Infusion von Glukose und eine Aktivitätssteigerung nach Insulin-induzierter Hypoglykämie. Dem gegenüber reagierten Neurone im VMH, die als glukose-rezeptiv (GRN) bezeichnet werden, entgegengesetzt (Anand 1961; Anand und Pillai, 1967). Ursprungsgebiete der GSN-Projektionsfasern im LHA wurden im Hypothalamus selbst, im Tractus nucleus solitarius und in den dorsalen Raphe-Kernen vermutet (Bernardis und Bellinger, 1996; Orsini et al., 1992). Eine Interaktion von Fettsäuren und Peptiden mit GSN wurde nachgewiesen (Oomura, 1974).

Grunstein et al. (1986) untersuchten die Involvierung hypothalamischer Kerngebiete in den zentralen Steuerungsprozess des Blutglukosespiegels mittels weiterer Pharmaka. In seiner Studie verglich er die Aktivität von noradrenergen mit serotonergen Neuronen im Hypothalamus nach akuter und chronischer Therapie mit Tolbutamid, einem in der Inneren Medizin seit Jahrzehnten bekannten oralen Antidiabetikum aus der Gruppe der Sulfonylharnstoffe. Hierbei zeigte sich 10 min nach Gabe von Tolbutamid ein signifikanter Anstieg an NA, im weiteren Verlauf jedoch ein stetiger Anstieg von 5-HT und 5-HIAA. Eine vordem angenommene direkte Involvierung noradrenerger Systeme konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden, jedoch ist eine Verbindung von 5-HT mit der extrapankreatischen [Seite 59↓]hypoglykämischen Wirkung von Tolbutamid sehr wahrscheinlich. Ein Anstieg der serotonergen Aktivität bei induzierter Hypoglykämie ließ sich weder nach
2-deoxyglukose noch nach chronischer Insulintherapie nachweisen (Grunstein et al., 1986). Dies widerspricht den oben dargestellten Ergebnissen von Anand (1961) und Anand und Pillai, (1967).

Versuche mit peripherer Gabe von 8-OH-DPAT zeigten einen Anstieg des Blutglukosespiegels, welcher nachweislich sowohl an postsynaptische 5-HT-Rezeptoren als auch an adrenerge Systeme gekoppelt war. In Vergleichen zwischen hungrigen und satten Ratten zeigte sich bei den hungrigen Tieren eine abgeschwächte, aber länger anhaltende Hyperglykämie nach 8-OH-DPAT.

Jhanwar et al. (1994) bezog die Insulin-Glukose-Interaktion in den Sättigungsprozess mit ein. Eine Kopplung der hyperphagen Wirksamkeit von 8-OH-DPAT über präsynaptische Rezeptoren mit postsynaptisch regulierten Insulin- und Glukosespiegeln wurde vermutet. Nach peripherer Gabe von Tolbutamid zeigte sich eine erhöhte Dichte der 5-HT-Rezeptoren im VMH, nicht jedoch im LHA. Demnach ändern sich die postsynaptischen Rezeptoren in Abhängigkeit von Glukose. Das heißt, beim hungrigen Tier mit niedrigem Glukosespiegel könnte die postsynaptische Rezeptordichte im Vergleich zum satten Tier mit hohem postprandialem Glukosespiegel verändert sein. Unterschiede in der Wirksamkeit von 8-OH-DPAT auf Futteraufnahme und 5-HT-Freisetzung ließen sich somit durch die beschriebenen Wechselwirkungen zwischen somatodendritischen und postsynaptischen 5-HT-Rezeptoren erklären.

Zusammengefasst lassen diese Studien vermuten, dass der ausbleibende Effekt des Agonisten 8-OH-DPAT beim hungrigen Tier wiederum nicht nur von Autorezeptoren, sondern von komplexen serotonergen Mechanismen, einschließlich postsynaptischer Rezeptoren abhängt. Orosco et al. (2000) lieferten in aktuellen Mikrodialysestudien Ergebnisse über die Aktivierung der hypothalamischen Insulinausschüttung nach lokaler Gabe eines 5-HT-Wiederaufnahmehemmers in den VMH. Umgekehrt bewirkt die lokale Insulingabe einen Anstieg der 5-HT-Freisetzung.

Da Nahrungsaufnahme den extrazellulären 5-HT-Spiegel im LHA erhöht, konnte dies auch in den Versuchen erwartet werden, in welchen den Ratten nach Substanzgabe Futter angeboten wurde. Die gewonnenen Mikrodialysedaten im [Seite 60↓]Experiment am satten Tier zeigen die Überschneidung von einerseits inhibitorischer Wirkung auf die 5-HT-Freisetzung durch den Agonisten und andererseits stimulierender Wirkung durch Futteraufnahme. Im entsprechenden Versuch am nahrungskarenten Tier erwarteten wir nach Futteraufnahme einen 5-HT-Anstieg. Das anders ausfallende Bild in diesem Versuch kann mehrere Ursachen haben: zum einen scheint die Aktivität des serotonergen Systems beim hungrigen Tier verändert zu sein, wie anhand des vorigen Versuchs am nahrungskarenten Tier diskutiert. Zum anderen hatte sich in den Versuchen zur Futteraufnahme ohne Mikrodialyse gezeigt, dass 8-OH-DPAT im Vergleich zu unbehandelten hungrigen Tieren Hypophagie auslöst. Auch unter Mikrodialysebedingungen war die Substanz-induzierte Verringerung der Futteraufnahme bei hungrigen Tieren zu messen. In diesen vorausgegangenen Versuchen belief sich der durch Futteraufnahme induzierte 5-HT-Anstieg auf knapp 164 % bezogen auf die Grundlinie (Voigt et al., 1998). In diesen Versuchen fraßen die Ratten mehr als in unseren vorliegenden Versuchen nach Gabe von 8-OH-DPAT. Damit ist wahrscheinlich, dass die verringerte Futteraufnahme beim hungrigen Tier nach 8-OH-DPAT nicht ausreichte, um einen signifikanten Anstieg der 5-HT-Freisetzung auszulösen (Voigt et al., 2000).

Es ist bekannt, dass eine zentrale Gabe von 8-OH-DPAT in die Raphe den gleichen Effekt wie nach systemischer Gabe hat, d.h. über Stimulierung somatodendritischer Autorezeptoren zu einer Steigerung der Futteraufnahme führt (Dourish et al., 1985; Fletcher und Davis, 1990). Nicht bekannt war, wie eine intrahypothalamische Gabe des Agonisten auf ein Gebiet, in dem postsynaptische Rezeptoren erwartet werden, wirken würde.

Ziel der zweiten Versuchsreihe war es daher, durch lokale Substanzgabe diese Rezeptoren im LHA zu stimulieren und damit die Wirkmechanismen am 5-HT-Rezeptor genauer zu erklären.

Die intrahypothalamische Applikation von 8-OH-DPAT über das Mikrodialysesystem löste in unseren Versuchen beim wachen Tier eine starke Ausprägung des 5-HT-Syndroms aus. Die pharmakologische Wirksamkeit war über diesen Applikationsweg damit gesichert. Zunächst sollte jedoch geklärt werden, inwieweit die Wirkung von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung über den 5-HT-Rezeptor vermittelt ist. Daher wurde mit agonistisch und antagonistisch [Seite 61↓]wirkenden Substanzen gearbeitet. Da die Futteraufnahme in diesen Versuchen nicht untersucht werden sollte und die massive Verhaltensänderung der Ratte nach zentraler Substanzgabe vergleichbare Versuchsbedingungen wie in Versuchsreihe A der peripheren Gabe nicht gewährleistet hätten, wurden die folgenden Versuche alle am narkotisierten Tier durchgeführt.

Die intraperitoneale Gabe von 8-OH-DPAT am narkotisierten Tier entsprach dem Effekt am wachen Tier und zeigte einen in früheren Versuchen anderer Autoren beschriebenen signifikanten Abfall in der 5-HT-Freisetzung im LHA innerhalb der ersten 20 min nach Substanzgabe (Lorrain et al., 1998; Schwartz et al., 1990a). Die Versuche an der narkotisierten Ratte konnten damit als Entsprechung zu den Versuchen an der frei beweglichen Ratte gelten.

Lokal über das Mikrodialysesystem in den LHA appliziert, erhöhte der Agonist die
5-HT-Freisetzung im LHA signifikant. Eine nur unspezifische Stimulation durch die lokale Applikationsart wurde durch die Kontrollgruppe ausgeschlossen, die eine intrahypothalamische Infusion über 20 min mit aCSF zugesetztem NaCl erhielten. Hier zeigten sich keine signifikanten Veränderungen in der 5-HT-Freisetzung.

In Fressversuchen an der frei fressenden Ratte hatte sich in früheren Versuchen nach intraventrikulärer Substanzgabe die gleiche hyperphage Wirkung wie nach systemischer Gabe gezeigt (Hutson et al., 1986). Allerdings waren nicht nur der LHA, sondern sämtliche Gehirnstrukturen Angriffsorte der Substanz. Angenommen wurde die Wirkung von 8-OH-DPAT an Autorezeptoren im Mittelhirn, die zu einem Abfall der 5-HT-Freisetzung führten.

Sowohl die durch 8-OH-DPAT induzierte Futteraufnahme (Fletcher et al., 1995) als auch der induzierte 5-HT-Abfall lassen sich durch systemische Gabe von
WAY 100635 antagonisieren (Casanovas et al., 1997).

Am Anfang unserer Versuche mit WAY 100635 wurde zunächst die Eigenwirkung des 5-HT-Rezeptorantagonisten ausgeschlossen. Nach Applikation über das Sondensystem zeigte sich keinerlei signifikante Veränderung in der 5-HT-Freisetzung im LHA. Dies bestätigt die spezifische Blockierung des Rezeptors ohne antagonistische Eigeneffekte, daher als stiller Antagonist („silent antagonist“) charakterisiert (Fletcher et al., 1996; Fletcher und Coscina, 1993; Routledge et al., 1993; Vickers et al., 1996). In Versuchen zur Futteraufnahme nach peripherer [Seite 62↓]Gabe des älteren 5-HT-Rezeptorantagonisten WAY 100135 waren ebenfalls keine Veränderungen in der Feuerungsrate serotonerger Neuronen und der 5-HT-Freisetzung in der Raphe festgestellt worden. Die Applikation des Antagonisten alleine beeinflusste die Futteraufnahme nicht (Hartley und Fletcher, 1994).

WAY 100635 ist eine Substanz, die selektiv und ohne intrinsische Aktivität sowohl prä- als auch postsynaptisch am 5-HT-Rezeptor angreift (Routledge et al., 1993). Die Ergebnisse wurden durch kinetische und Radioligandenstudien bestätigt. Dies ist vor allem relevant für -Experimente zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung des 5-HT-Rezeptors.

Die Wirkung der zentralen Gabe von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung konnte in unseren Versuchen durch Vorbehandlung mit dem Antagonisten
WAY 100635 nicht geblockt werden.

Andererseits konnte in früheren Studien nachgewiesen werden, dass der Antagonist die verminderte 5-HT-Freisetzung nach peripherer Gabe von 8-OH-DPAT hemmte (Hartley und Fletcher, 1994). Des weiteren traten die von 8-OH-DPAT induzierte Hyperphagie, Hypothermie, das 5-HT-Syndrom und andere Verhaltensparameter durch Vorbehandlung mit dem Antagonisten nicht auf. Dies bestätigte, dass der Angriff von WAY 100635 am 5-HT-Autorezeptor erfolgte. Die Kriterien eines selektiv wirksamen Antagonisten sind damit erfüllt (Fletcher et al., 1996). Die serotonerge Feuerungsrate in der dorsalen Raphe wurde durch
WAY 100635 erhöht, was die Vermutung nahe legt, dass die dort lokalisierten 5-HT-Neuronen in ihrer Aktivität einer 5-HT-Rezeptor-vermittelten Hemmung ausgesetzt sind (Routledge et al., 1993).

Durch Messungen in unterschiedlichen Hirngebieten konnte festgestellt werden, dass WAY 100635 den Effekt von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung im frontalen Cortex antagonisieren, nicht jedoch in den zentralen Kerne der Amygdala, den Raphe-Kernen, Hippocampus und Striatum. Dies bestätigt die Komplexität der Regulation der 5-HT-Rezeptoraktivität in verschiedenen Gehirnregionen (Casanovas et al., 1997).Der in unseren Versuchen beobachtete Anstieg in der 5-HT-Freisetzung nach lokaler Sondenapplikation in den LHA, der auch durch den Antagonisten nicht blockierbar war, kann damit nicht 5-HT-Rezeptor-vermittelt sein. Dies wird gestützt durch Versuche von Assie und Koeck (1996), die an der narkotisierten Ratte nach lokaler Gabe von 8-OH-DPAT über [Seite 63↓]die Mikrodialysesonde einen Anstieg der 5-HT-Freisetzung im Hippocampus gemessen hatten. Dies steht im Gegensatz zu Ergebnissen von Kreiss und Lucki (1994), die in den Projektionsgebieten nur regional abhängige Effekte nach lokaler Gabe von 8-OH-DPAT in serotonerge Ursprungsgebiete gefunden hatten. Assie und Koeck (1996) konnten in ihren Versuchen den Effekt von 8-OH-DPAT nicht antagonisieren.

Unsere Arbeit fokussierte auf die laterale Hypothalamusregion, die traditionell im Modell der „Fresszentren“ (siehe Einleitung) die Region ist, die Nahrungsaufnahme reguliert. Die wesentliche funktionelle Bedeutung dieser Region für die Regulation von Sättigungsprozessen des LHA wurde in unseren Versuchen bekräftigt. Die Rolle anderer hypothalamischer Strukturen wurde von Bernardis und Bellinger (1998) für den dorsomedialen Kern, von Leibowitz und Alexander (1998) für die paraventrikulären, ventromedialen und suprachiasmatischen Kerne beschrieben. Alle Strukturen spielen eine Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Mustern des Nahrungsverhalten. Eine Kopplung zu den Effekten von Insulin und deren Entgleisung bei adipöser und diabetischer Stoffwechsellage konnte für alle Kerne gefunden werden.

Mit der Technik der intracerebralen Mikrodialyse konnte in unseren Versuchen die unterschiedliche Wirkung von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung im LHA in Abhängigkeit von den Fressbedingungen dargestellt werden. Beim frei fressenden Tier besteht eine Interaktion zwischen 5-HT-Freisetzung nach Substanzgabe und gleichzeitiger Futteraufnahme. Dies lässt vermuten, dass ernährungsbedingte Verhaltenszustände die 5-HT-Freisetzung im LHA beeinflussen.

Es kristallisiert sich ein Modell zur Erklärung von Nahrungsverhalten heraus, das die Sequenz von Nahrungsaufnahme, Metabolismus der biochemischen Grundbausteine, Sättigung und Beendigung des Mahls differenzierter als in den traditionellen „Zentrumsmodellen“ betrachtet. 5-HT spielt zusammen mit Peptiden wie Galanin und NPY eine starke Rolle beim Beginn der Nahrungsaufnahme (Leibowitz und Alexander, 1998). Hierbei scheint durch serotonerge Bahnen der Energieverbrauch angestoßen zu werden, welcher Blutglukose und Blutcorticosteroide senkt. Die Stimulation der serotonergen Rezeptorsysteme führt zur direkten oder indirekten Involvierung zentraler (NA, DA, NPY u.a.) und peripherer (Insulin, Leptin u.a.) Substanzen (in Parker, 1999; Simansky, 1996). [Seite 64↓]Proteine, Kohlenhydrate und Fette werden auf unterschiedliche Weise in den Regulationsmechanismus eingebaut und stimulieren ihrerseits bereits die Synthese von Sättigungsfaktoren wie z.B. Leptin.

Beim Menschen ist die Bedeutung von 5-HT als zentraler Sättigungsvermittler bekannt. In der Klinik haben Pharmaka, die auf serotonerge Rezeptoren wirken, bereits Eingang in die Therapie gefunden. Widersprüchliche Ergebnisse in der Therapie von Essstörungen konnten mit dem 5-HT-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin, dem 5-HT-Freisetzer und 5-HT-Wiederaufnahmehemmer -Fenfluramin und Sibutramin, das sowohl die Wiederaufnahme von 5-HT als auch von NA hemmt, erzielt werden (Jimerson et al., 1990; Kaye, 1997, Ferguson, 1999).

Die gewichtsreduzierende Wirkung von Fluoxetin zeigte sich sowohl bei adipösen als auch bulimischen Patienten, allerdings nur in sehr hohen Dosen. Die Wirkung hielt nicht mehr als einige Wochen an, außerdem bedingte die hohe Dosis nicht tolerierbare dopaminerge Nebenwirkungen. Interessant ist jedoch, dass die Frequenz der Essattacken bei bulimischen Patientinnen vermindert wurde (Fluoxetine Bulimia Nervosa Collaborative Group [FBNCG], 1992). Gabe von Fluoxetin bei Patienten mit Anorexia nervosa bewirkte neben der bekannten antidepressiven und anxiolytischen Wirkung eine Gewichtszunahme (Gwirtsman et al., 1990; Kaye und Weltzin, 1991). Insgesamt gibt es jedoch für Fluoxetin noch immer wenige klinisch gesicherte Kontrollstudien.

-Fenfluramin zeigte in der Therapie von Fresssucht die erwünschte hypophage und gewichtsreduzierende Wirksamkeit (Finer, 1992; Halford und Blundell, 2000a). Von besonderer klinischer Bedeutung war, dass der Gewichtsabfall über den bislang längsten medikamentös erreichten Zeitraum von einem Jahr anhielt. Dies wurde in multizentrischen internationalen -Fenfluramin-Studien (INDEX) bestätigt. Der Effekt von -Fenfluramin ist über serotonerge Autorezeptoren vermittelt und involviert über Genexpression Hypothalamus und Cortex (Javed et al., 1998). Wegen des Risikos eines pulmonalen Hochdrucks und anderer kardiovaskulärer Nebenwirkungen wurde die Substanz allerdings vom Markt genommen.

Sibutramin wirkt vergleichbar potent wie -Fenfluramin, die Nebenwirkungsrate fiel jedoch wesentlich geringer aus, seit 1998 ist es in den USA erhältlich (Lean, 1997; Astrup, 1998).

Weitere experimentelle Studien an der Ratte zeigten, dass die durch ionisierte Strahlung induzierte Anorexie mit 8-OH-DPAT aufgehoben wurde und sogar ein Anstieg der Futteraufnahme resultierte (Winsauer et al., 1994). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Therapie der symptomatischen Anorexie, wie sie bei malignen Erkrankungen oder nach Bestrahlung auftritt, ebenfalls durch serotonerg wirkende Pharmaka verbessert werden könnte.

Die Essstörungen dominieren bei Mädchen und Frauen. Geschlechtsunterschiede bezüglich 5-HT-Metabolismus und 5-HT-Rezeptorebene wurden an Tier und Mensch beobachtet. So fand sich z.B. bei weiblichen Ratten im Gegensatz zu männlichen eine Bevorzugung von Kohlenhydraten in der Nahrungszusammensetzung und eine tageszeitliche Bevorzugung der Kohlenhydrataufnahme in der inaktiven Phase (Leibowitz, 1992). Bei Mädchen in der Pubertät wurden ähnliche Ernährungsmuster beobachtet (Drewnownoski et al., 1992). Bekannt ist, dass das serotonerge System bei chronischer Anorexie mit erhöhtem intrazellulärem Stoffwechsel reagiert, ein gegensätzlicher Effekt findet sich bei bulimischen Patientinnen (Kaye, 1997).

Weibliche Ratten weisen interessanterweise nicht nur eine höhere Anzahl von
5-HT- und 5-HT-Rezeptoren im VMH auf, sondern sprechen auch stärker auf serotonerge Wirkstoffe an (Gundlah et al., 1998). Hypothalamische 5-HT-Spiegel waren bei weiblichen Tieren in der östrogenen Zyklusphase signifikant niedriger als in der präöstrogenen Phase und als bei männlichen Tieren; Verbindungen zwischen 5-HT und luteinisierendem Hormon (LH), Follikel-stimulierendem Hormon (FSH), sowie den hypothalamischen Releasing-Hormonen (RH) wurden ebenso beschrieben wie spezifische Wirkungszusammenhänge zwischen Sexualhormonen und dem somatodendritischen 5-HT-Rezeptor. Die Gabe von 8-OH-DPAT induzierte bislang nur bei männlichen Tieren Hyperphagie (in Ebenezer, 1994).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 5-HT eine wichtige Rolle in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht einnimmt. Die sättigenden Effekte von 5-HT werden durch verschiedene Rezeptorsubtypen vermittelt, wobei der 5-HT-Rezeptor eine besondere Bedeutung hat. Wichtige Schaltstellen in der Regulation von Sättigung und Hunger sind die hypothalamischen Kerngebiete. Im lateralen Hypothalamus steigt die 5-HT-Freisetzung bei Nahrungsaufnahme.

Auf der Grundlage der unterschiedlichen Effekte des 5-HT-Rezeptoragonisten
8-OH-DPAT auf die Nahrungsaufnahme bei satten und hungrigen Tieren stellten wir die Hypothese auf, dass die Wirkung von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung im LHA mit den verschiedenen Fressbedingungen interferiert und sich in unterschiedlichen Mustern der 5-HT-Freisetzung abbilden lässt.

Die Ergebnisse unserer Mikrodialysemessungen von extrazellulärem 5-HT im LHA zeigten einen signifikanten Abfall der 5-HT-Freisetzung nach intraperitonealer Gabe von 8-OH-DPAT bei satten Ratten. Diese erhielten Futter ad libitum bis zur Substanzgabe. Wenn satte Ratten jedoch auch nach Substanzgabe Futterangebot hatten, wurde durch 8-OH-DPAT Nahrungsaufnahme induziert und die 5-HT-Freisetzung fiel nicht ab.

Bei hungrigen Ratten zeigte sich nach derselben Dosis von 8-OH-DPAT kein Effekt auf die 5-HT-Freisetzung. Die Freisetzung veränderte sich auch dann nicht signifikant, wenn den zuvor nahrungskarent gehaltenen Tieren nach Substanzgabe Futter angeboten wurde.

Zusätzlich wurde in einem zweiten Versuchsabschnitt 8-OH-DPAT über das Mikrodialysesystem lokal in den LHA appliziert. Dabei zeigte sich im Gegensatz zur systemischen Gabe jedoch ein Anstieg der 5-HT-Freisetzung. In anschließenden Versuchen wurde an der narkotisierten Ratte geprüft, ob dieser Effekt auch über den 5-HT-Rezeptor vermittelt wird. Der 5-HT-Antagonist WAY 100635 konnte den Effekt von 8-OH-DPAT nicht antagonisieren. Damit wurde ausgeschlossen, dass die stimulierende Wirkung einer lokalen Gabe von 8-OH-DPAT auf die 5-HT-Freisetzung über den 5-HT-Rezeptor vermittelt wird.

Die vorliegende Studie zeigt damit erstmals die Wirkung von 8-OH-DPAT auf die
5-HT-Freisetzung im LHA in Abhängigkeit von unterschiedlichen Motivationszuständen in Verbindung mit Nahrungsaufnahme auf.

Sibutramin wird derzeit mit gutem Erfolg in der Adipositastherapie eingesetzt. In seiner Funktion als 5-HT-Wiederaufnahmehemmer wirkt er als Appetitzügler bei den Patienten.

Erkenntnisse weiterer experimenteller Forschungen sind Voraussetzung für das vertiefte pathophysiologische Verständnis der Regulation von Nahrungsaufnahme. Sie können Ansatzpunkte für die Durchführung weiterer klinischer [Seite 67↓]pharmakologischer Studien und somit für eine verbesserte Therapie von Essstörungen sein.