3  Material und Methoden

Folgende Methoden wurden nach Standardprotokollen [Sambrook et al.] oder Herstellerprotokollen (von kommerziell erhältlichen Kits) durchgeführt:

• Agarosegelelektrophorese
• Mini-Präparation von Plasmid-DNA (Jetstar, Genomed)
• Maxi-Präparation von Plasmid-DNA (Qiagen Maxi Plasmid Kit, Qiagen)
• Präparation und CaCl₂-Transformation¹ von kompetenten Bakterien
• DNA-Extraktion aus Agarosegelen (Jetstar, Genomed)
• Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
• Ligation von DNA-Fragmenten

Da die quantitative Aussagekraft der PCR-Methode wesentlich durch die Qualität und Quantität der umzuschreibenden RNA abhängt, wurde für die Präparierung der RNA der Kit „Absolutely RNA Miniprep Kit” (Stratgene) verwendet. Er beinhaltet den sorgfältigen Probenaufschluss über einen Prefilter und einen DNAse-Verdau von 15 Minuten bei 37°C, um eine hohe Reinheit der RNA zu gewährleisten.

Die Verwendung eines RNA-Chips und des dazugehörigen Kits „RNA 6000 Nano Assay Reagents & Supplies“ (Stratagene) ermöglichte die präzise und schnelle Quantifizierung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent).

Eventuelle Kontaminationen mit genomischer DNA während der RNA-Präparation wurden durch einen zusätzlichen DNAse-Verdau vor der cDNA-Synthese beseitigt. Trotzdem wurden als Qualitätskontrolle von jeder Probe sogenannte „–RT“ (Reverse Transkriptase) - Proben mitgeführt.

Zur Auffaltung der Sekundärstrukturen (intramolekulare H₂-Brückenbindungen) wurde 1 µg RNA mit 1 µl der Oligo-dT-Primer 10 min bei 70°C erhitzt und danach sofort wieder auf Eis gegeben. Hinzugegeben wurde folgender Mix pro Probe:

Jetzt erfolgte der zusätzliche DNase-Verdau für 30 min bei 37°C mit anschließender 5 minütiger DNase-Inaktivierung bei 75°C. Nach 2 minütiger Eis-Inkubation wurde zu den cDNA-Proben jeweils 0,5 µl RT und RI gegeben. Bei den –RT-Proben wurde die Reverse Transkriptase durch 0,5 µl ddH₂O ersetzt. Nun folgte die eigentliche cDNA-Synthese bei 42°C für 60 min, die zum Schluss für 5 min bei 94°C gestoppt wurde.

Die PCR ist eine Methode, um ein bestimmtes DNA-Segment in vitro exponentiell zu amplifizieren.. Mittels zweier Oligonukleotide („Primer“), die an bekannte Sequenzbereiche des „sense“- und „antisense“- Stranges des DNA-Segmentes binden, findet eine Vervielfältigungsreaktion statt, die von einer hitzestabilen DNA-abhängigen Polymerase (z.B. Taq-Polymerase) katalysiert wird. Die DNA wird bei Temperaturen von 94°C in einzelsträngige Moleküle denaturiert, gefolgt von der Anlagerung der Oligonukleotidprimer an die spezifische Region der Matrize bei einer dafür kalkulierten Annaelingtemperatur (gewöhnlich zwischen 40-60°C) und einer anschließenden DNA-Synthese bei 72°C durch die hitzestabile Taq-Polymerase (Elongation). Der 25 µl Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:

Nach einer initialen Denaturierungsphase von 5 min bei 94°C folgten 30 bis 35 Zyklen, die jeweils die 3 Inkubationen für die Denaturierung (20 s), die Anlagerung (30 s) und die Verlängerung der Matrize (30 s) beinhalteten. Für eine vollständige Elongation schloss sich eine abschließende Inkubation für 5 min bei 72°C an.

Diese quantitative PCR-Methode ermöglicht die Visualisierung der Amplifikation der Proben in Echtzeit. Unter Verwendung eines Farbstoffes, SYBR® Green, erhält man „Real Time“ PCR-Informationen, die pro Zyklus gemessen und über eine exponentielle Kurve verfolgt werden können. Aus dieser exponentiellen Probenanalyse wird bei der Real Time-PCR der sogenannte C_T-Wert („Theshold Cycle“) ermittelt, der die Zyklenzahl angibt, bei der zum ersten Mal ein statistisch signifikantes Reportersignal über dem Grundrauschen detektiert wird. SYBR® Green interkaliert während der Amplifikation in die Doppelstrang-DNA und lässt somit die Signalintensität proportional zur Produktmenge ansteigen. Das Problem hierbei sind unspezifische Signale, die von Primerdimeren stammen, die aber über eine Anzeige von Dissoziationskurven spezifischer Schmelztemperaturen detektiert werden können. Die Detektion des Fluoreszenzanstieges erfolgt für jeden Zyklus im geschlossenen Reaktionsgefäß mit Hilfe des ABI PRISM^TM 5700 Sequence Detectors.

Neben dem Einsatz des SYBR® Green–Farbstoffes, gibt es die Möglichkeit, eine spezielle fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonde zu verwenden, die zur Erhöhung der Spezifität beiträgt. Diese ist am 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) markiert und trägt am 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat), der zusätzlich mit einem Phosphatrest blockiert ist. Bei Anregung der intakten Sonde bei einer spezifische Wellenlänge (488 nm) wird deren Fluoreszenz durch die räumliche Nähe vom Reporter-Farbstoff zum Quencher-Farbstoff durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Während der PCR hybridisieren Sonde und Primer gleichermaßen an den Matrizenstrang. In der Extensionsphase kommt es zur Hydrolyse der Sonde durch die 5´- 3´- Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase, wobei die räumliche Nähe und somit auch der FET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen und die Emission des Reporters als Signal gemessen werden kann. Freie, nicht-gebundene Sonde wird nicht hydrolysiert. Die Fluoreszenz des Reporters steigt entsprechend der Akkumulation des PCR-Produktes mit jedem PCR-Zyklus an. Die Detektion des Fluoreszenzanstieges erfolgt für jeden Zyklus im geschlossenen Reaktionsgefäß mit Hilfe des ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detectors.

Die Etablierung eines TaqMan-Primerpaares erfolgte nach den Regeln der SOP (erstellt am Institut für Medizinische Immunologie, Charité Berlin, Fr. Vogt). Dazu gehören das Heraussuchen der Primer und Sonden mit der entsprechenden Software „Primer Express“, die Testung des Primerpaares und die Primertitration mit anschließender Effizienzbestimmung.

Zur Durchführung der PCR wurden folgende Bedingungen gewählt:

Zykler:

Der TM-Mastermix enthält die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTP´s mit dUTP, MgCl₂ (5mM Endkonzentration), ROX (passiver Referenzfarbstoff) und eine Uracil-N-Glycosylase. Der SYBR-Green- Mastermix enthält zusätzlich den Farbstoff SYBR-Green, dafür nicht die Glycosylase, die aber separat dazupipettiert werden kann (AmpErase).

Durch die Verwendung von dUTP´s statt dTTP´s werden eventuelle Kontaminationen mit bereits amplifizierten PCR-Produkten verhindert. Die Zugabe von dem Enzym Uracil-N-Glycosylase bewirkt während der 2-minütigen Inkubation bei 50°C die Hydrolyse Uracil-haltiger PCR-Produkte. Die anschließende 10-minütige Inkubation dient der Inaktivierung des Enzyms, der Denaturierung der verdauten DNA-Proben und der gleichzeitigen Aktivierung der Polymerase.

Die relative Quantifizierung der Expressionshöhe erfolgt unter Nutzung des ermittelten C_T-Wertes. Generell gilt, umso höher die Startkopienzahl der Probe, desto geringer der C_T-Wert. Arbeitet z.B. ein System mit 100 % Effizienz, nimmt der C_T-Wert mit jeder Verdopplung der Startkopienzahl um genau einen Zyklus ab. Außerdem benötigt man für die quantitative Aussage zur Expression der zu untersuchenden Gene die gleichzeitige Amplifikation eines konstitutiv exprimierten Gens („house-keeping“-Gen z.B. CD3 bei T-Zellen). Ein dimensionsloses Ergebniss ermittelt man, wenn beide Primerpaare mit annähernd gleicher Effizienz arbeiten, über folgende Formel:

Ergebnis = (1 + Effizienz) – ( C T Genx - C T CD3)

Suspensionszellen wurden geerntet, indem sie nach dem Resuspendieren zentrifugiert (1200 rpm, 5 min, 4°C) und anschließend kurz mit kaltem PBS gewaschen wurden. Der Überstand wurde so sauber wie möglich abgezogen und das Pellet schnellmöglichst in dem vorgekühlten Protein-Lysispuffer durch wiederholtes Scheren mit einer Kanüle (0,60 x 25 mm) resuspendiert. Dabei ist streng darauf zu achten, dass alle Arbeitsschritte bei 0°C - 4°C ablaufen. Die Lysate wurden zentrifugiert (13000 rpm, 5 min, 4°C), der Überstand überführt und in flüssigen Stickstoff sofort weggefroren. Bis zur Proteinanalyse mittels Western-Blot wurden die Proben bei –70°C gelagert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Bradford-Methode mit dem kommerziell erhältlichen Kit von PIERCE (“Coomassie Protein Assay Reagent”).

Die Proben wurden für jeden Versuch mit einer Gesamtmenge an Protein von 30-50µg/20µl eingestellt, anschließend in einem Verhältnis von 1:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95°C denaturiert. Die Auftrennung der Proteine erfolgte nach der Vorschrift „Minigel und Minigel-Twin“ (Biometra, Göttingen) auf 15%-igen SDS-Gelen, die anschließend mit Hilfe des semi-trockenen Fastblot-System (Biometra) auf Nitrocellulosemembranen geblottet wurden. Der Transfer (48 cm² Gel) erfolgte für 1 Stunde bei 250 mA. Um den erfolgreichen Transfer einschätzen zu können, wurden die geblotteten Proteine auf der Membran durch eine kurze Färbung in Ponceaulösung sichtbar gemacht. Je nach verwendeten Antikörper wurden die Membranen entweder über Nacht bei 4°C oder für 1 Stunde bei RT (Antikörper von Cell Signaling) in 5% Milchpuder / TBST (Blockmilch) inkubiert, um nichtspezifische Bindungen abzudecken. Die Antikörper wurden wie folgt inkubiert:

Die Detektion des gebundenen POD-markierten Sekundärantikörpers erfolgte mit dem ECL-Kit (Amersham). Reagenz A und B wurden dafür in einem Verhälnis 1:1 gemischt und die Membran für 1 Minute darin inkubiert. Anschließend konnte der Substratumsatz autoradiographisch nach entsprechenden Zeitpunkten sichtbargemacht werden.

Zur Konzentrationsbestimmung von Zytokinen in Zellkulturüberständen wurden kommerzielle ELISA-Kits eingesetzt. Es wurde bei allen Proteinbestimmungen gemäß den Herstellervorgaben verfahren. Die Messung wurde für folgende Zytokine durchgeführt: Ratten IFN-γ und Ratten IL-2. Die Auswertung fand am ELISA-Reader Anthos 2001 statt.

Die MLC ist ein in vitro-Modell der T-Zell-Antwort, die im Laufe einer allogenen Transplantat-Abstoßungsreaktion ausgelöst wird. Hierfür wurden Lymphozyten der zwei verschiedenen Rattenstämme Lewis, als Empfänger, und DA, als Stimulator isoliert und gemeinsam kultiviert. Da Lewis und DA komplett in ihren MHC I- und MHC II- Molekülen differieren, ist dieses Rattenmodell besonders gut für die Analyse einer starken T-Zell-Antwort geeignet. Für die Gewährleistung der einseitigen Reaktion wurden die DA-Lymphozyten vorher bestrahlt (30Gray).

Die Tötung der Tiere erfolgte durch ein Carbogen-Kohlendioxid-Gasgemisch mit einem Narkose- und Tötungsgerät. Im Anschluss wurden die Körper mit einer 70%-igen Ethanolspülung grob desinfiziert und sofort thorakal zur kardialen Blutabnahme geöffnet. Nach Entnahme des Thymus wurden mesenterial und subkutan die Lymphknoten sauber aus Bindegewebe und Fett herausgelöst und in steriles DMEM-Medium überführt. Die Aufarbeitung wurde möglichst sofort durchgeführt.

Die folgende Verarbeitung der lymphatischen Gewebe fand unter sterilen Bedingungen statt. Zur Gewinnung der Einzelzellsuspension wurden die Organe erst durch ein 100 µm Nylonsieb gedrückt, in T-Zell-Medium (TCM) aufgenommen und anschließend durch ein 40 µm Nylonsieb gespült. Die Zellzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer mittels Vitalfärbung mit Trypan-Blau bestimmt. Je nach Tieralter und Präparation ergaben die Lymphknoten 1-2x10⁸ lebende Zellen. Währenddessen wurde das kardial gewonnene Blut zur Serumgewinnung bei 4500 rpm, 4°C für 10 min zentrifugiert und der so entstandene Serumüberstand abgenommen und bis zur Anwendung bei 4°C gelagert.

Die für die MLC dienenden Stimulator-Zellen (DA) wurden vor der Kultivierung mit 30 Gray bestrahlt. Von den Stimulator-Zellen wurden 3x10⁵ mit 3x10⁵ „Responder“-Zellen pro well einer 96 well Flachbodenplatte in 200 µl TCM/ well bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Je nach Fragestellung wurden zu den Reaktionsansätzen noch Antikörper, Inhibitoren oder Zytokine in entsprechender Verdünnung hinzugegeben. Die Auswertung erfolgte in einer 5 Tage-Kinetik, indem pro Tag und Ansatz die Zellen geerntet und die Überstände, sowie die Zellpellets nach einmaligen Waschen mit PBS für weitere Analysen bei –70°C weggefroren wurden.

Die Zellsuspensionen der MLC wurden geerntet und mit PBS (2% FKS, 0,02% Azid) gewaschen. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 15 min bei 4°C mit 4µg/ml FITC-markierten anti-Ratten-α,β-TCR Antikörper und/ oder PerCp-markierten anti-Ratten-CD8 Antikörper. Die Proben wurden danach mit einer Lysislösung von Becton Dickenson für 15 min bei RT fixiert und mittels 0,2% Saponin/ PBS permeabilisiert. Nach einem erneuten [Seite 42↓]Waschschritt mit PBS wurden die Zellen mit 4µg/ml PE-markierten anti-Ratten-IFNγ Antikörper gefärbt und die IFNγ Expression in T-Zellen mittels 3-Farben-Durchflußzytometrie am FACScort (BD) bestimmt.

Zur Bestimmung des Proliferationspotentials der Zellen wurden am Tag 3 einer MLC 18,5 kBq ³H-Thymidin / well dazupipettiert und die Zellen für weitere 16 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden entweder sofort geerntet oder bei –70°C gelagert. Zur Detektion des Thymidineinbaus wurde das System von INOTECH verwendet.

Zur Inhibierung der p23 Proteinexpression in den allogenen Kulturen wurden von der Firma Biognostik aufgrund der ermittelten Ratten-cDNA-Sequenz zwei verschiedene „Antisense“-Oligonukleotide mit den dazugehörigen „Nonsense“-Oligonukleotiden (Basensequenz der „Antisense“-Oligonukleotide zufällig angeordnet) synthetisiert. 4x10⁶ „Responder“-Zellen wurden dabei vor der MLC mit 10 µM Oligonukleotiden für 30-45 min bei 37°C in PBS mit oder ohne Lipofektaminzusatz (10 µg/ml) schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit TCM gewaschen und gemeinsam mit Stimulator-Zellen ausplattiert. Als Kontrolle diente der gleiche allogene Ansatz ohne Oligonukleotidbehandlung. Die Proteinanalyse der p23-Expression und die Proliferationskontrolle mittels ³H-Thymidin Essay erfolgte am Tag 4 der Kultur.

Für die Klonierung von p23 in das retrovirale Expressionsplasmid pLXSN-IRES-GFP erfolgte zunächst eine Zwischenklonierung in den p123T-Vektor. Mit den p23-spezifischen Primern p23-5´-universal und p23-3´-reverse wurde aus cDNA (aCD4-behandelte Ratten-LK-MLC) ein ca. 1800 bp großes p23-Fragment amplifiziert. In diesem Fragment war der komplette ORF enthalten. Aufgrund der Größe des Fragments wurde das Expand High Fidelity PCR-Systems von Boehringer Mannheim eingesetzt, da dieses System eine Polymerase mit „proofreading activity“ enthält. Von dem PCR-Ansatz wurden 20 ng direkt für die Ligation in den p123T genutzt. Nach der Transformation kompetenter DH5α-[Seite 43↓]Bakterien und einer anschliessenden Plasmid-Präparation zeigten Sequenzieranalysen die Richtigkeit der p23-Basefolge. Der pLXSN-IRES-GFP stellte nur eine unicale Schnittstelle (EcoRI) zur Verfügung, die nicht in dem zu klonierendem p23-Fragment vorkam. Deshalb musste diese erst mit Hilfe der Primer p23(Eco)sense und p23(Eco)antisense in die p23-Sequenz mittels PCR eingefügt werden. Damit die Primer mit der Basensequenz für die EcoRI-Schnittstelle trotzdem an die Matrize anlagern konnten, waren vor den 30 Zyklen mit der spezifischen Annealingtemperatur von 61°C 5 Zyklen bei 45°C eingefügt. Nach Aufreinigung der DNA aus dem Agarosegel wurde die Konzentration mit dem RNA / DNA Kalkulator Gene Quant II bestimmt. Anschließend wurden die p23-DNA und der pLXSN-Vektor mit EcoRI geschnitten, extrahiert und ligiert. Um Rezirkulationen und Religierungen der linearisierten Vektor´s zu vermeiden, wurde dieser vor der Ligation einer Phosphatase-Behandlung (CIP, Promega) unterzogen. Der folgenden Transformation schloss sich die Isolation der Plasmid-DNA an, die mit einer Restriktionskontrolle auf das Vorhandensein des p23-Inserts und dessen Orientierung analysiert wurde. Durch anschliessende Sequenzierung mittels spezifischer pLXSN- und IRES-Sequenzierprimer sollten die Ergebnisse bestätigt werden.

3.2.5.2 Transfektion²

a) Kalzium-Phosphat Transfektion:

GP+E 86 Zellen bzw. Phoenix-Zellen wurden in DMEM-Medium in T75-Kulturflaschen bei 37°C, 5% CO₂ im Inkubator kultiviert. Bei Erreichen einer ca. 90%-igen Konfluenz wurden die Zellen je nach Bedarf im Verhältnis 1:3 bis 1:10 aufgeteilt. Einen Tag vor Transfektion wurden 1x10⁶ Zellen je 6 cm-Schale ausplattiert, so dass bis zum folgenden Tag möglichst 60% - 70% Konfluenz erreicht wurde. Zirka 4 Stunden vor der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel. Die Transfektion erfolgte nach dem Standardprotokoll für Kalzium-Phosphat-Präzipitation adhärenter Zellen [ Sambrook et al.] mit 10µg DNA. Die Vorbereitung zur Transduktion verlief für die Zellinien auf zwei verschiedenen Wegen:

1) GP+E-Zellen: Nach maximal 18 Stunden Inkubation wurde das Medium gewechselt unter Zugabe von Gentamycin (G-418, 1mg/ml) zur Selektionierung der positiven Zellen. Von diesem Zeitpunkt an wurde allen Passagen der GP+E-p23 Zellen (Sense bzw. Antisense) G-418 dem Medium zugesetzt. Die positiven GP+E-p23 Zellen wurden so expandiert und in [Seite 44↓]Einfriermedium (FKS, 10% DMSO) zur Lagerung in Flüssigstickstoff weggefroren für die Generierung stabiler GP+E-p23-Klone.

2) Phoenix: Ungefähr 24 Stunden später erfolgte ein Mediumwechsel, wobei ab diesem Zeitpunkt RPMI-Medium verwendet wurde. 48 und 72 Stunden nach der Transfektion wurde der Virusüberstand gesammelt und sofort bei –70°C bis zur Transduktion³ mittels Virusüberstandes zwischengelagert.

b) Lipofektamin-Transfektion:

Die Transfektion mit Lipofektamin erfolgte an Phoenix-Zellen, die 1 Tag vorher mit einer Konzentration von 1x10⁶ pro well in einer 6-well-Platte in 2,5 ml DMEM ausplattiert wurden. Bei einer Zelldichte von 90% wurde das Gemisch aus 5 µg DNA und 15 µl Lipofektamin2000 (GibcoBRL) jeweils in 250 µl FKS-freiem DMEM-Medium kombiniert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser DNA-Lipofektamin-Komplex wurde vorsichtig zu den Phoenix-Zellen pipettiert und im Inkubator kultiviert. Ungefähr 24 Stunden später erfolgte ein Mediumwechsel, wobei ab diesem Zeitpunkt RPMI-Medium verwendet wurde. 48 und 72 Stunden nach der Transfektion wurde der Virusüberstand gesammelt und sofort bei –70°C bis zur Transduktion mittels Virusüberstandes zwischengelagert.

Die polyklonale Verpackungszellinie GP+E-p23Sense bzw. p23Antisense wurde zur Klonierung einer monoklonalen Verpackungszellinie einer Verdünnungsreihe nach folgendem Schemata unter G-418 (1 mg/ml)-Selektion unterzogen:

2 x 96 well Platte mit 3 Zellen / well

2 x 96 well Platte mit 0,3 Zellen / well

In den nächsten 4-6 Wochen der negativen Selektion konnten 2 GP+E-Klone mit p23 Sense und 4 Klone mit p23 Antisense expandiert werden. Zur Bestimmung der Höhe der p23 Expression wurden ca. 1x10⁶ Zellen in entweder 200 µl FACS-Puffer für eine anschließende FACS-Analyse des Reportergen GFP oder in 100 µl Proteinlysispuffer für einen p23- Proteinnachweis aufgenommen.

Zur Durchführung der Transduktion wurde 1 Tag vorher eine Milz-T-Zellkultur (Maus) angesetzt. Dafür wurde die entnommene Milz in PBS durch ein 70 µm Nylon-Sieb gedrückt und die Erytrozyten durch Lyse entfernt. Dazu wurde das Zellpellet in PBS in einem Verhältnis von 1:4 in Ery-Lysispufferresuspendiert und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mittels zweifacher Menge an 0,5 % BSA in PBS gestoppt und anschließend bei 1200 rpm, 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde nach einem Waschschritt mit PBS in RPMI-Medium aufgenommen und mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (jeweils 3µg/ml) versetzt. Die Aussaat erfolgte in einer Konzentration von 3x10⁶ Zellen /well. Am folgenden Tag wurde ¾ des Mediums vorsichtig abgenommen, aber nicht verworfen. Die aufgetauten Virusüberstände wurden zusammen mit Polybren (8 µg/ml) auf die Zellen verteilt und dann für 1 Stunde bei 1800 rpm und 25°C zentrifugiert. Nach der Transduktion konnte der retrovirale Mediumüberstand von den wells gegen das aufbewahrte Medium ausgetauscht werden. Die Zellen wurden 24 Stunden später aufgrund starker Proliferation im Verhältnis 1:2 aufgeteilt und konnten dann für die folgenden 48 Stunden bei 37°C kultiviert werden.

3.2.5.5 Analyse der p23 transgenen⁴ T-Zellen

Die Zellen konnten im Anschluss auf positive GP+E-p23Sense bzw. p23Antisense Zellen gesortet werden. Dafür wurden die Pellets bei 1200 rpm, 10 Minuten, 4°C zentrifugiert, in 750 µl 0,5 % BSA haltigem PBS resuspendiert und durch einen 40 µm Nylon-Filter aufgereinigt. Nach Zugabe von 3 µM Propidiumjodid zu den transduzierten Zellen, um die toten Zellen ausschließen zu können, wurden diese sofort im Anschluss am Durchflußzytometer „FACSort“ gesortet. Auch hier erfolgte die Detektion der positiven Zellen über das Reportergen GFP. Diese positiv gesorteten Zellen wurden für spätere Analysen verwendet.

Fußnoten und Endnoten

¹ Transformation = Einführung nackter DNA in eine Bakterienzelle

² Transfektion = Einbringen fremder DNA in eukaryontische Zellen

³ Transduktion = Übertragung genetischen Materials von Zelle zu Zelle durch Retrovirus

⁴ Transgen = eingeschleustes und stabil in das Genom integriertes Fremdgen