4  Ergebnisse

Mit Hilfe der Gemischten Lymphozytenkultur (MLC) kann man in vitro die direkte Antigenerkennung eines Transplantats durch allo-spezifische T-Zellen des Empfängers simulieren (siehe auch 6.2.4). Sie ermöglicht damit die Analyse der Auswirkung einer anti-CD4-Antikörper Behandlung auf die Aktivierung allo-spezifischer T-Zellen. Die Aktivierung von T-Zellen äußert sich unter anderem in deren Proliferation. Die proliferative Antwort wurde zwischen Tag 3 und Tag 4 der 5-Tage-MLC über den Einbau des radioaktiven Nukleotids ³H-Thymidin in die neusynthetisierte DNA sich teilender Empfänger-Zellen gemessen (Abb.5). Die Stimulator-Zellen waren durch die Bestrahlung vor der Kultur nicht mehr fähig zu proliferieren. Für die Analyse wurden folgende Kulturansätze miteinander verglichen:

1. allogene MLC (Stimulator- und „Responder“-Zellen von verschiedenen Rattenstämmen, DA nach Lewis)
2. allogene MLC + anti-CD4-Antikörper (RIB5/2, 1µg/ml), (aCD4mAk)
3. syngene MLC (Stimulator- und „Responder“-Zellen vom gleichen Rattenstamm, Lewis nach Lewis)

Die syngene MLC diente als Negativ-Kontrolle, da bei fehlender Fremd-Antigenerkennung im Falle genetisch identischer Individuen keine T-Zellaktivierung und damit -proliferation erfolgen sollte.

	Abb.5: Anti-CD4mAk hemmte dieT-Zellproliferation in der Gemischten Lymphozytenkultur.
	Die allogene, allogene anti-CD4mAk-behandelte und syngene T-Zellantwort wurde zwischen Tag 3 und 4 über den Einbau von radioaktivem 3H-Thymidin gemessen. Die geernteten Zellen wurden mittels Proliferationsassay analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse mit Standardabweichung von jeweils 5 untersuchten Kulturansätzen.

Im Gegensatz zu unbehandelten allogen stimulierten T-Zellen lässt sich die T-Zellproliferationsantwort unter Gabe des anti-CD4mAk´s verringern. Unter anti-CD4-Behandlung nur noch ca. 10% der Proliferation, vergleichbar mit der syngenen Kontrolle, detektierbar. Der anti-CD4mAk ist also in der Lage, eine allogen-induzierte TCR-vermittelte Proliferation von T-Zellen nahezu komplett zu verhindern.

Es ist bekannt, dass das Chaperon Hsp90 in proliferierenden Säugerzellen hochreguliert wird und eine Zellzyklus-abhängige Expression aufweist. Außerdem assoziiert Hsp90 transient mit Schlüsselproteinen des Zellzyklus und der Mitogen-aktivierten Signalkaskade (siehe 4.8). p23 als Kochaperon von Hsp90 wurde mittels PCR-Select als ein differentiell exprimiertes Gen in anti-CD4mAk-behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen einer MLC am Tag 5 identifiziert (siehe 4.7). Da wenig über dessen Bedeutung oder sogar Regulation während der T-Zellaktivierung bekannt ist, sollte die Expressionskinetik von p23 in allo-aktivierten T-Zellen untersucht werden. Dafür wurde eine MLC mit den Kulturansätzen 1-3 (siehe 7.1.1) für 5 Tage angesetzt und die RNA täglich mit Hilfe der Real Time TaqMan-PCR quantifiziert (Abb.6). Die p23-Werte wurden auf CD3 bezogen, weil dieses Molekül mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR) aller T-Zellen assoziiert ist und so als „house-keeping gene“ zur Normung [Seite 48↓]der T-Zellanzahl genutzt werden konnte. Das „house-keeping gene“ dient als interner Bezugswert für die Effizienz der cDNA-Synthese, damit Proben verschiedener zellulärer Ansätze vergleichbar sind.

	Abb.6: Einfluss der anti-CD4mAk-Behandlung auf das p23 Expressionsmuster allo-aktivierter T-Zellen
	Unbehandelte allo-aktivierte (), anti-CD4mAk-behandelte allo-aktivierte () und syngene T-Zellen () wurden von Tag 0 bis 5 der MLC geerntet. Die RNA wurde isoliert und die p23 mRNA Expression mittels Real Time PCR analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse fünf unabhängiger Experimente als Mittelwert mit Standardabweichung.

Wie aus Abbildung 6 deutlich wird, führt eine Alloaktivierung von T-Zellen zur Hochregulation der p23 mRNA Expression zwischen Tag 2 und 3. Im Vergleich zur syngenen Kontrolle und unstimulierten Responder-Zellen war ein 6-10facher Expressionsanstieg zu beobachten. Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Vergleich zu einem nicht T-Zell-spezifischen house-keeping Gen (β-Aktin) erzielt (Daten nicht dargestellt). Die anti-CD4-Behandlung allogen-stimulierter Zellen führte zu einer Reduzierung dieser Hochregulation auf das Niveau der syngenen Kontroll-MLC. Es ist zu erkennen, dass in der p23 Expressionskinetik zum Tag 5 hin eine Veränderung erfolgt. Im Gegensatz zur allogenen MLC, in der die p23 Expression wieder rapide abfällt, ist ein leichter Anstieg der Expression von p23 in der syngenen und anti-CD4-behandelten MLC zu beobachten. Damit lässt sich erklären, warum p23 ursprünglich am Tag 5 als ein selektiv exprimiertes DNA-Fragment in anti-CD4-behandelten Kulturen und nicht in der unbehandelten allogenen Kultur identifiziert wurde. Es zeigt auch, wie wichtig Kinetikuntersuchungen sind, um funktionell differentielle Genexpressionsmuster richtig zu interpretieren.

In Bezug auf diese Daten wollten wir zusätzlich untersuchen, ob die p23 Expression von restimulierten Memory-T-Zellen ebenfalls hochreguliert wird. Zuerst wurde eine allogene MLC und eine anti-CD4mAk-behandelte allogene MLC für 5 Tage durchgeführt. Am Tag 5 erfolgte die Aufreinigung der allo-spezifisch aktivierten T-Zell-Blasten (Lewis) über einen Ficoll-Gradienten und ein anschließendes „Hungern“ (Starven) über Nacht im CO₂-Inkubator. Dafür wurden die Blasten in einer 24-well-Platte mit 2x10⁶ Zellen/well aufgeteilt und in 1% FCS-haltigem Medium inkubiert. Die gestarvten T-Zellen lagen 24 Stunden später in einem deaktivierten Zustand vor, der sich mikroskopisch über deren reduzierte Zellgröße feststellen ließ. Die allogene Restimulation wurde mit den aufgereinigten T-Zellen (5x10⁴/well), bestrahlten DA-Thymozyten (2,5x10⁵/well) und bestrahlten Lewis-Thymozyten (1,5x10⁵/well) angesetzt. In Abbildung 3 ist die Auswertung von 3 unterschiedlichen Ansätzen dargestellt:

1. allogene Blasten / allogen restimuliert
2. allogene Blasten / allogen restimuliert + anti-CD4mAk (1µg/ml)
3. aCD4-behandelte Blasten / allogen restimuliert

Allogen-voraktivierte T-Zell-Blasten regulierten nach wiederholter Stimulation durch allogene Antigene die p23 mRNA Expression wieder um ein 5-6faches hoch, allerdings diesmal schon nach 24 Stunden (Abb.7a). Im Gegensatz zur Primärstimulation hatte der anti-CD4mAk kaum noch einen inhibitorischen Einfluss auf die p23 mRNA Expression restimulierter allogener Blasten. Interessanterweise blieben anti-CD4mAk-behandelte Blasten auch nach allo-spezifischer Reaktivierung anerg. Ähnliche Daten hinsichtlich der Aktivierung restimulierter T-Zellen waren im Proliferationsassay (Abb.7b) erkennbar, was einen Zusammenhang zwischen T-Zell-Vermehrung und p23mRNA-Regulation vermuten ließ.

	Abb.7: p23 mRNA-Expression und Proliferation restimulierter T-Zellen
	Aus einer primären 5 Tage-MLC wurden allo-aktivierte T-Zellblasten und anti-CD4mAk-behandelte T-Zellblasten aufgereinigt und über Nacht gestarvt. Die allo-Blasten (5x104/well) wurden mit bestrahlten DA-Thymozyten (2,5x105/well) und bestrahlten Lewis-Thymozyten (1,5x105/well) allo-restimuliert () und anti-CD4mAk-behandelt (). Anti-CD4mAk-behandelte T-Zellblasten (5x104/well) wurden mit bestrahlten DA-Thymozyten (2,5x105/well) und bestrahlten Lewis-Thymozyten (1,5x105/well) allo-restimuliert (). a) TaqMan-PCR-Analyse der p23 mRNA b) Proliferationsanalyse mittels 3H-Thymidin-Einbau zwischen Tag 1 und 2 für 16 Stunden. Dargestellt sind die repräsentativen Ergebnisse von jeweils einer aus drei untersuchten Kulturen.

Aufgrund der vermuteten Korrelation zwischen der p23mRNA-Expressionskinetik und der Proliferation allospezifischer T-Zellen sollte untersucht werden, ob p23 proliferationsabhängig transkribiert wird und welche Phase des Zellzyklus (ZZ) für die p23-Regulation eine Rolle spielen könnte. Dafür wurden folgende ZZ-Inhibitoren separat der allogenen MLC am Tag 0 zugesetzt und die p23 mRNA Expression täglich für 5 Tage mittels Real Time-PCR quantifiziert. Die eingesetzten Inhibitoren blockten den Zellzyklus in unterschiedlichen Phasen (siehe Abb.8a):

1. Mycophenolate Mofetyl (MMF) inhibiert in der G1-Phase (de novo GTP-Synthese)
2. L-Mimosine (L-M) inhibiert in der G1/S-Phase (DNA-Replikation)
3. Aphidicoline (Aph) inhibiert die S-Phase (DNA-Polymerase α-Aktivität)
4. Nocodazole (Noco) inhibiert die G2/M-Phase (Microtubuli-Bildung)

	Abb.8: Einfluss von Zellzyklus-Inhibitoren auf die T-Zellaktivierung
	a) schematische Abbildung der Wirkungsweise der ZZ-Inhibitoren. b) Allo-aktivierte T-Zellen wurden am Tag 0 einer 5 Tage-MLC mit ZZ-Inhibitoren behandelt und täglich geerntet. Aus der isolierten RNA wurde die Regulation der p23 mRNA Expression mittels TaqMan PCR ermittelt. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Alle ZZ-Inhibitoren übten vergleichbar mit dem anti-CD4mAk wie erwartet einen inhibitorischen Effekt auf die Proliferation allo-aktivierter T-Zellen aus (Daten nicht dargestellt). Wie in Abbildung 8b erkennbar ist, hemmten diese aber auch die p23 mRNA-Hochregulation. Diese Ergebnisse deuten auf eine Proliferations-abhängige Transkription von p23 in T-Zellen hin, die aber nicht spezifisch innerhalb einer der ZZ-Phasen erfolgt. Es könnte daher sein, dass die p23 Expression mindestens eine Proliferationsrunde benötigt, da z.B. erst bei DNA-Replikation eine Demythelierung und damit aktive Transkribierung erfolgen könnte.

Die bisherigen Untersuchungen wurden ausschließlich an allogen-stimulierten Ratten T-Zellen durchgeführt. Um einen generellen Eindruck über die Regulation der p23 Transkription zu erhalten, wurde dessen Expression auch unter anderen Stimulationsbedingungen analysiert. Dafür wurden folgende Ansätze ausgewählt:

a) andere T-Zellstimulationen

• Lewis-Lymphknotenzellen + anti-CD3mAk/anti-CD28mAk (je 10µg/ml)
• Lewis- Lymphknotenzellen + ConA (1µg/ml)

b) andere Spezies

• Humane PBMC´s (peripheral blood mononuclear cells) + OKT3 (anti-CD3mAk) / anti-CD28mAk (je 1µg/ml)

Lewis Lymphknotenzellen wurden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern für 5 Tage kultiviert. Die Antikörper wurden vorher für 1 Stunde auf der Flachbodenplatte gebunden und diese anschließend einmal mit kaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden wie üblich mit einer Konzentration von 3x10⁵ pro well ausgesät und täglich für die p23 mRNA-Quantifizierung geerntet und aufgearbeitet. In diesem Fall liefern statt der Stimulator-Zellen (DA) die Antikörper die notwendigen T-Zell-Aktivierungssignale 1 (anti-CD3mAk) und 2 (anti-CD28mAk), wobei die Aktivierung und Proliferation antigenunabhängig von allen T-Zellen erfolgt. Wie aus Abbildung 9 ersichtlich, führte die Stimulation der Lewis-T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern zu einem früheren Anstieg der p23 mRNA Expression, schon nach 1 Tag, der außerdem noch länger anhielt als bei einer allogenen Stimulation der T-Zellen.

	Abb.9: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in aCD3/aCD28-stimulierten Lewis-T-Zellen
	Während einer 5 Tage-MLC wurden aCD3/aCD28 (je 10µg/ml) -stimulierte () T-Zellen (3x105 pro 96er well) mit einer allogenen () und syngenen () MLC verglichen. Tag 0 entspricht der Expression in unstimulierten T-Zellen. Nach Zellernte und RNA-Isolation wurde die p23 Transkription mittels RT-PCR analysiert. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Für die ConA-Stimulation wurde die 3fache Zellkonzentration an Lewis-Lymphozyten eingesetzt, um den notwendigen Zell-Zell-Kontakt zu gewährleisten. Die Zugabe des Mitogens erfolgte löslich am Tag 0. Auch ConA induziert eine antigenunabhängige Aktivierung aller Lymphozyten über eine Vernetzung von Oberflächenmolekülen, zu denen unter anderem das Lektin CD2 auf T-Zellen gehört, wirkt aber nach ungefähr 48 Stunden toxisch auf die Zellen. Diese starke Stimulation induzierte schon am Tag 1 eine 7fache p23 mRNA Hochregulation, die am Tag 3 wieder abfiel (siehe Abb.10).

	Abb.10: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in ConA-stimulierten Lewis-T-Zellen
	1,5x105 Lewis-Lymphozyten wurden pro 96er well mit ConA (1µg/ml) inkubiert und von Tag 0 bis 3 geerntet. Die RNA wurde isoliert und die p23 Transkription mittels RT-PCR analysiert. Tag 0 entspricht der Expression in unstimulierten T-Zellen. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Die humanen PBMC´s, die vorher über einen Ficoll-Gradienten aufgereinigt wurden, um die Erythrozyten und Granulozyten abzutrennen, wurden ebenso über CD3/CD28 mit den entsprechenden Antikörpern stimuliert. Die Abbildung 11 macht deutlich, dass auch die Stimulation humaner T-Zellen eine verstärkte Transkription von p23 nach ca. 40 Stunden bewirkt. Im Vergleich zu unstimulierten Zellen (Tag 0) war ungefähr ein 8facher Unterschied nachweisbar.

	Abb.11: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in humanen aCD3/aCD28-stimulierten T-Zellen
	2x105 humane Lymphozyten wurden pro 96er well mit aCD3/aCD28-Antikörpern (je 1µg/ml) inkubiert und nach 0, 24, 40, 48, 72 und 120 Stunden mittels RT-PCR analysiert. Tag 0 entspricht der Expression in unstimulierten T-Zellen. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

IL-2 wirkt als T-Zell-Wachstumsfaktor und wird als erstes Zytokin von aktivierten T-Zellen gebildet, das wiederum autokrin deren Proliferation stimuliert. Bekannt ist, dass rekombinantes IL-2 die Induktion einer anti-CD4-induzierten Toleranz im Nierentransplantationsmodell der Ratte verhindern kann, wenn auch mit einer extrem hohen Dosis von 200.000 U. In der anti-CD4-behandelten allogenen MLC mit nur noch 10% der T-Zell-Antwort könnte ein mögliches Fehlen der IL-2 Produktion die Ursache für die Proliferationshemmung sein. Tatsächlich ergaben mRNA- und Proteinexpressionsanalysen von IL-2 eine gehemmte Produktion von IL-2 unter anti-CD4mAk-Behandlung (siehe Abb.12).

	Abb.12: Einfluss des anti-CD4mAk´s auf die IL-2 Transkription und IL-2 Sekretion allo-reaktiver T-Zellen
	Verglichen wurde eine allo-aktivierte () MLC mit einer anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten () und einer syngenen () MLC. Die T-Zellen wurden täglich von Tag 0 bis 5 geerntet und nach der RNA-Isolation für die IL-2 mRNA-Analyse mittels RT-PCR verwendet. Aus dem Überstand der T-Zellkultur wurde die Menge des IL-2 Proteins mittels ELISA bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von fünf unabhängigen Experimenten.

In unbehandelten allogenen Kulturen sieht man eine Hochregulation der IL-2 mRNA am Tag 2 der MLC. Um 1 Tag verzögert ist dann die Protein-Produktion detektierbar. Unter Zugabe des anti-CD4mAk´s zum allogenen Kulturansatz wurde die IL-2 Synthese komplett geblockt, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene, da das Level an IL-2 mRNA und [Seite 56↓]Zytokinsynthese ähnlich war dem der syngenen Kontrolle.

Deswegen sollte untersucht werden, ob sich durch Zugabe von rekombinantem IL-2 zu anti-CD4-behandelten Zellkulturen die Proliferation und damit die p23 mRNA-Expression wieder revertieren läßt. Außerdem stellte sich auch die umgekehrte Frage, ob die Blockade der α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) in der allogenen MLC einen inhibitorischen Effekt auf die p23 Hochregulation ausübt. Diese Kette des IL-2 Rezeptors wird von T-Zellen erst nach deren Aktivierung exprimiert und ist für die Formierung des hochaffinen IL-2 Rezeptors essentiell. Dafür wurden folgende MLC-Kulturen angesetzt und die Zellen wieder von Tag 1-5 geerntet und deren p23 Transkription mittels Real Time RT-PCR analysiert:

1. allogene MLC
2. allogene MLC + anti-CD4mAk (1µg/ml) + rek.IL-2 (100U/ml)
3. allogene MLC + anti-CD25mAk (10µg/ml)

In Abbildung 13 wird deutlich, dass die reduzierte p23 mRNA-Expression in anti-CD4mAk-Kulturen nach IL-2 Zusatz wieder auf das Niveau der unbehandelten allogenen Kulturen angehoben werden konnte. Wegen der Bedeutung von IL-2 für die p23-Regulation vermuteten wir, dass die spezifische Blockade der α-Kette des IL-2 Rezeptors durch den anti-CD25-Antikörper bei allo-aktivierten T-Zellen die Hochregulation der p23 mRNA-Expression verhindern würde. Interessanterweise hatte der neutralisierende anti-CD25mAk jedoch keinen inhibitorischen Einfluss auf die Hochregulation der p23 Expression in allo-aktivierten T-Zellen.

	Abb.13: Bedeutung von IL-2 für die p23 Expression allo-aktivierter T-Zellen
	Allo-aktivierte T-Zellen wurden mit einem IL-2 Rezeptor-hemmenden anti-CD25mAk (10ng/ml) () versetzt und anti‑CD4mAk-behandelte T-Zellen mit rekombinantem IL-2 (100U/ml) () inkubiert. Für den Vergleich mit allogen stimulierten T-Zellen () wurden die Zellen täglich von Tag 0 bis 5 geerntet und die RNA isoliert. Die Analyse der p23 mRNA Regulation erfolgte mittels TaqMan PCR. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Zusätzlich wurden diese T-Zellen mittels ³H-Thymidin-Einbau zwischen Tag 3 und 4 auf ihr Proliferationsverhalten untersucht (Abb.14). Mit einer Zugabe von 100U/ml rekombinantes IL-2 zu anti-CD4-behandelten allogenen T-Zellen konnte deren Proliferationsvermögen wieder vollständig wiederhergestellt werden (Daten nicht dargestellt). Überraschenderweise sieht man, dass die Proliferation in anti-CD25-behandelten Kulturen nicht gehemmt ist und sich wie bei unbehandelten allogenen Kulturen verhält (Abb.14). Diese Ergebnisse zeigen, dass der anti-CD25mAk weder die p23 Expression noch die Proliferation allo-aktivierter T-Zellen hemmen kann. Innerhalb der Signaltransduktion des IL-2 Rezeptors spielt die Kinase mTOR eine essentielle Rolle für die Initiierung des Zellzyklus, was eindrucksvoll durch den Effekt des mTOR Inhibitors Rapamycin demonstriert werden kann. Deshalb sollte untersucht werden, inwieweit eine Inhibierung der Kinase durch Zugabe des Inhibitors Rapamycin die Proliferation allo-aktivierter T-Zellen beeinflusst. Aus Abb.14 geht hervor, dass eine Behandlung allo-aktivierter T-Zellen mit Rapamycin deren Proliferation zu ca. 80% inhibiert.

	Abb.14: Vergleich der Proliferation in einer syngenen, unbehandelten allogenen, anti-CD25-behandelten allogenen und Rapamycin-behandelten allogenen MLC
	Gemessen wurde die T-Zellantwort durch den 3H-Thymidin-Einbau zwischen Tag 3 und 4 der MLC für 16 Stunden. Die geernteten Zellen wurden mittels Proliferationsassay analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse als Mittelwert von jeweils 5 untersuchten Kulturansätzen mit Standardabweichung.

Für die unterschiedlichen Wirkungen von anti-CD25 und Rapamycin auf die Proliferation alloaktivierter T-Zellen könnten verschiedene Ursachen eine Rolle spielen. Zum Beispiel teilt das Zytokin IL-15 mit IL-2 viele gemeinsame Aktivitäten und ist ebenso ein T-Zell-Wachstumsfaktor. Damit könnte IL-15 auch die notwendigen Signale zur Proliferation liefern. Beide benutzen die gleiche β- und γ-Kette des Rezeptors, die α-Kette ist jedoch für jedes Zytokin spezifisch (Abb.15). Die Wirkung von endogen produziertem IL-15 in der MLC würde daher nicht durch den anti-CD25-Antikörper blockiert werden. Die mTOR Kinase ist jedoch Zytokin-unspezifisch an den Zytokinrezeptor-Signalwegen beider Zytokine beteiligt.

	Abb.15: Vereinfachte Darstellung der Gemeinsamkeiten des IL-2 und IL-15 Rezeptors

Versuche mit einem blockierenden Antikörper gegen die α-Kette des IL-15 Rezeptors (rekombinantes Maus-IL-15Rα/Fc-Fusionsprotein) in der allogenen MLC zeigten jedoch auch keine inhibitorischen Auswirkungen auf die Proliferation bzw. die p23 Expression (Daten nicht dargestellt). Fraglich ist hier, ob der Antikörper im Rattenmodell überhaupt wirksam ist und entsprechende Rattenantikörper stehen leider zur Zeit noch nicht zur Verfügung.

Aufgrund der stimulierenden Wirkung von IL-2 auf die T-Zell-Proliferation und dessen Bedeutung für die Hochregulation der p23 Expression, sollten die TCR-induzierten und IL-2 Rezeptor-induzierten Signaltransduktionswege und deren Bedeutung für die p23 Expression näher analysiert werden. Mittels spezifischer Inhibitoren gegen Kinasen, die hierbei eine Rolle spielen, konnten gezielt einzelne Wege der Signaltransduktion geblockt werden (siehe Abb.16).

	Abb.16: Schematische Übersicht der TCR- und IL-2R-induzierten Signaltransduktionswege während der T-Zellaktivierung.
	In der Darstellung sind die im folgenden Experiment verwendeten Kinase-Inhibitoren rot markiert. Diese hemmen gezielt spezifische Signalkaskaden, welche die Transkription, Translation und/oder Proliferation induzieren.

Dafür wurden die Inhibitoren am Tag 0 zu allogenen MLC-Ansätzen gegeben und deren p23 Expression täglich für 5 Tage auf mRNA-Ebene mittels Real Time RT-PCR analysiert (Abb.17). In der folgenden Tabelle sind die eingesetzten Hemmstoffe, die spezifische Kinasen der oben aufgeführten Signalwege blocken, zusammenfassend dargestellt:

Tabelle 1: spezifische Kinase-Inhibitoren, die auf TCR- und/ oder IL-2-induzierte Signalkaskaden hemmend einwirken

	Abb.17: Einfluss verschiedener Kinase-Inhibitoren auf die p23 Transkription während der allogenen MLC
	Allo-aktivierte T-Zellen wurden am Tag 0 einer 5 Tage-MLC mit den Inhibitoren der Kinasen unterschiedlicher Signalkaskaden behandelt und täglich geerntet. Aus der isolierten RNA wurde die Regulation der p23 mRNA Expression mittels TaqMan PCR ermittelt. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Unter Zugabe der spezifischen Inhibitoren für die Kinasen MEK, PKC und mTOR zum allogenen Kulturansatz wurde nicht nur die Proliferation der aktivierten T-Zellen gehemmt, sondern auch die Hochregulation der p23 Transkription komplett verhindert (Abb.17). Da die Kinase MEK TCR- und IL-2-induziert jeweils die Transkription und Translation beeinflusst, wurde der MEK-Inhibitor zusätzlich erst am Tag 2 dazugegeben, um ausschließlich den Effekt auf die IL-2-induzierte Translation analysieren zu können. Eine spätere Zugabe des MEK Inhibitors PD184352 am Tag 2 der MLC führte jedoch weder zur Hemmung der Proliferation der T-Zellen noch zu deren Hochregulation der p23 Transkription (Daten nicht dargestellt). Eine Inkubation der T-Zellen mit dem p38 MAPK Inhibitor SB203580 konnte die Hochregulation der p23 Expression nicht verhindern, wenngleich die T-Zellen mit einer verzögerten Kinetik reagierten.

Die mit den Kinase-Inhibitoren erzielten Ergebnisse deuten auf einen Einfluss PKC-, mTOR- und MEK-abhängiger Signaltransduktionswege auf die p23 Transkription und Proliferation während der T-Zellaktivierung hin. Deshalb wollten wir als nächstes Korrelationen zwischen den bisherigen Daten der p23 Expression und dem Aktivierungsstatus verschiedener Kinasen während der T-Zell-Aktivierung aufdecken. Die Aktivierung von Kinasen erfolgt durch andere, in der Signaltransduktionskette höher geschaltete Kinasen und ist daher oft mit einer [Seite 62↓]Veränderung ihres Phosphorylierungsmusters verbunden. Da p23 mRNA zwischen Tag 2 und 3 nach allo-spezifischer Aktivierung von T-Zellen am stärksten exprimiert wird, wurden die Kinaseaktivitäten verschiedener Kulturansätze am Tag 2 und 3 miteinander verglichen. Kinasen der Mitogen-aktivierten Signaltransduktionswege und des durch TOR kontrollierten Signalweges wurden hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht. Ihre Aktivität wurde in folgenden Kulturansätzen miteinander verglichen:

Am Tag 2 und 3 wurden die einzelnen Zellkulturen gesammelt und die Pellets in eiskaltem Protein-Lysispuffer aufgenommen. Das Hauptproblem der MLC-Proben ist die variable Zellmenge an aktivierten T-Zellen in den verschiedenen Zellkulturansätzen. Deshalb erfolgte vorher eine Gesamtproteinbestimmung, um die Proben mengenmäßig aufeinander abzustimmen und eine gleichmäßige Beladung der Western-Blots zu gewährleisten. Außerdem dienten der zusätzlichen Kontrolle der Einsatz von Antikörpern, die gegen das unphosphorylierte, nicht aktive Protein gerichtet sind. Für eine möglichst hohe Anreicherung aktivierter T-Zellen wurden pro Probe mit ca. 3x10⁶ Lewis-Zellen nur 20 µl Lysepuffer verwendet. Mittels mehrerer Membranen konnten die verschiedensten Kinasen hinsichtlich ihres Phosporylierungszustandes untersucht werden.

Beim Vergleich der Kulturansätze ließen sich kaum Unterschiede am Tag 2 hinsichtlich der p38 MAPK Aktivierung feststellen (Abb.18). Auffällig war nur deren verminderte Aktivierung in syngenen Kulturansätzen. Das gleiche Ergebnis wurde für die ERK1/2- Kaskade beobachtet. Am Tag 3 mit der stärksten p23 Hochregulation waren p38 und ERK1/2 etwas mehr phosphoryliert in unbehandelten allo-aktivierten T-Zellen als in anti-CD4-behandelten Zellen, wobei aber die schwachen Abweichungen von leichten Beladungsunterschieden auf den Gelen stammen könnten. Außerdem erbrachte ein Vergleich zwischen anti-CD4-behandelten und syngenen Kulturen keine korrelierenden Ergebnisse mit der p23- Hochregulation. D.h. man erwartete eigentlich in beiden Ansätzen ähnliche Kinaseaktivitäten, da die p23 mRNA Expressionsdaten auch keine Differenzen aufweisen. [Seite 63↓]Der anti-CD25mAk Ansatz verhielt sich wie der allogene und entsprach damit den bisherigen p23 Expressionsdaten.

	Abb.18: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand von Kinasen der Mitogen-aktivierten Signaltransduktionswege (p38 und ERK) mit der p23 Expression
	Proben unterschiedlicher MLC-Kulturansätze (allogen, allogen + anti-CD4mAk, syngen, allogen + anti-CD25mAk) wurden jeweils am Tag 2 und 3 in Lysepuffer aufgenommen und ihre Konzentration an Gesamtprotein mittels Bradford-Methode bestimmt. Nach der SDS-PAGE (30µg Protein/Bahn) wurden die Proben geblottet und die Phosphorylierungszustände der Kinasen p38 und ERK mittels spezifischer Phospho-Antikörper analysiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von zwei kompletten Westernblot-Analysen.

In Übereinstimmung mit der p23 Regulation detektierten wir interessanterweise Phosphorylierungen von Kinasen, die im IL-2-induzierten Akt/TOR-Signaling involviert sind. Eine Schlüsselkinase hierbei ist die p70S6 Kinase, die die Translation von mRNA´s des Translationsapparates kontrolliert und 2 Isoformen aufweist (70 und 85 kDa). Sie wiederum aktiviert über die Phosphorylierung ihr ribosomales Substrat 40S6. Aus Abbildung 19 ist zu erkennen, dass bei Zugabe von anti-CD4mAk´s zum allogenen Kulturansatz die Phosphorylierung der Kinase p70S6 und des ribosomalen Proteins 40S6 verhindert wurde. [Seite 64↓]Die anti-CD25-Behandlung allogener Zellen dagegen ergab ähnliche Proteinaktivierungsmuster wie die unbehandelten allo-aktivierten Zellen.

	Abb.19: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand von Kinasen und Substraten des mTOR-kontrollierten Signalweges (S6K und 40S6) mit der p23 Expression
	Proben unterschiedlicher MLC-Kulturansätze (allogen, allogen + anti-CD4mAk, syngen, allogen + anti-CD25mAk) wurden jeweils am Tag 2 und 3 in Lysepuffer aufgenommen und ihre Konzentration an Gesamtprotein mittels Bradford-Methode bestimmt. Nach der SDS-PAGE (30µg Protein/Bahn) wurden die Proben geblottet und die Phosphorylierungszustände der Kinase p70S6 (S6K) und des Substrates 40S6 mittels spezifischer Phospho-Antikörper analysiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von zwei kompletten Westernblot-Analysen.

In der Tabelle 2 wurden die p23 Expressions- und Proliferationsdaten mit den Kinaseaktivierungen zusammenfassend dargestellt. Wie man sieht, besteht nur zwischen der p23 Aktivierung und dem Akt/TOR-Signalweg eine genaue Übereinstimmung, was zu der Annahme führt, dass dieser mTOR Kinase-Weg verantwortlich für die Hochregulierung der Expression des Kochaperons p23 sein könnte. Dies steht in Übereinstimmung mit den p23 Expressionsdaten von Kinaseinhibitor-behandelten MLC Ansätzen. Eine Behandlung allo-stimulierter T-Zellen mit dem mTOR Kinase-Inhibitor Rapamycin verhinderte den p23 Expressionsanstieg.

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Tabelle 2: Vergleich der p23 Expressions- und Proliferationsdaten mit den Kinaseaktivierungsdaten. Die grau markierten Spalten zeigen eine Übereinstimmung zwischen der p23-Expression, der Proliferation und dem Akt/TOR-Signalweg (p70S6K).

Bisher konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von p23 proliferationsabhängig ist und über den mTOR-abhängigen Signalweg hochreguliert wird. Aber damit konnten keine reversen Schlussfolgerungen gezogen werden. Da Hsp90/p23-Komplexe eine große Rolle in der Stabilisierung von Kinasen spielt, stellte sich die Frage, ob die Proliferation allogen-aktivierter T-Zellen auch abhängig von der p23-Expression ist oder für welche anderen Funktionen die Hochregulation von p23 notwendig ist. Dafür war der Einsatz transgener Zellen, die antisense- bzw. sense-p23 mRNA exprimieren, in der Gemischten Lymphozytenkultur geplant.

Für die Konstruktion eines p23-pLXSN Expressionsplasmides wurde das p23-Fragment (ca. 1800bp) vorher in den p123T-Vektor zwischenkloniert. Anschließend erfolgte die Klonierung des p23 ORF in die multiple cloning site des retroviralen pLXSN Plasmides (siehe Abb.20). Mit enzymatischen Restriktionsanalysen ließ sich die Orientierung des p23 Fragmentes testen. Zusätzlich wurde die Orientierung und die Sequenzidentität des p23 ORF´s über Sequenzierungsanalysen der DNA geprüft.

	Abb.20: Retroviraler Expressionsvektor p23-pLXSN
	Amp: Ampicillin-Resistenzgen; LTR: „long terminal repeat“, Integrationsstelle des retroviralen Plasmides in die Zielzelle mit intrinsischer Promoteraktivität; MCS: „multiple cloning site“; IRES: „internal ribosome entry site; GFP: „green fluorescent protein“; SV40: Polyadenylierungssignal, Promoter des neo-Gens; neo: Neomycin-Resistenzgen

Eine effektive retrovirale Transduktion kann nur in sich teilenden Zielzellen stattfinden (155). Dafür stehen zwei Methoden zur Verfügung. Zum einen kann simultan eine MLC für die alloantigen-spezifische T-Zellaktivierung und eine Transduktion mittels stabiler Klone der Verpackungszellinie durchgeführt werden. Zum anderen kann ohne Ko-Kultivierung der Virusüberstand polyklonaler Verpackungszellen direkt zu den proliferierenden T-Zellen gegeben werden. Die Arbeit mit stabilen Klonen erfordert mehr Aufwand als die üblichere transiente Transfektion und Transduktion mittels viralen Überstandes. Die AG Dr. Ritter in unserem Institut konnte jedoch zeigen, dass sich Ratten-T-Zellen mit retroviralen Überstand nur schlecht transduzieren ließen. Aufgrund dieser Erfahrungen, bevorzugten wir zuerst die aufwendigere Methode der Generierung von stabilen Virus-produzierenden Klonen, die sich für die Ratten-T-Zelltransduktion bewährt hatten.

Die pLXSN-IRES-GFP-p23 Plasmide (Sense und Antisense) wurden mittels Kalzium-Phosphat-Präzipitation in die Verpackungszellinie GP+E transfiziert. Da das Plasmid auch ein Neomycin-Resistenzgen (neo^r) trug, erlaubte es eine positive Selektion transfizierter Zellen. Unter Selektionsdruck mit dem synthetischen Neomyzin-Äquivalent G-418 konnte nach 48 Stunden eine Plasmid-tragende und Virus-produzierende polyklonale Verpackungszellinie hochgezogen und expandiert werden. Da das Fluoreszenz-Protein GFP als Marker positiver Zellen dient, konnte die Transfektion mit Fluoreszenz-Mikroskopie kontrolliert werden. Für die Generierung eines stabilen p23⁺ Klones (Sense und Antisense) wurde die Methode der „limited dilution“ unter ständiger Anwendung von G-418 angewandt. Die entstandenen monoklonalen p23⁺/GFP⁺- Verpackungszellinien wurden mit einer FACS-Analyse (GFP) und auf Proteinebene (p23) überprüft. Als Kontrolle dienten GP+E Zellen ohne transfiziertes Plasmid, die somit kein GFP und p23 nur unverändert exprimierten und deshalb weder ein [Seite 67↓]Fluoreszenz-Signal auslösen noch die p23 Expression beeinflussen konnten. Verglichen mit der Kontrolle detektierten wir nur eine Verdopplung der Intensitätsverstärkung des mittleren Fluoreszenz-Signals [FL1=GFP] bei den p23 Sense⁺ Klonen (z.B. Klon C) und maximal eine Verdreifachung bei den p23 Antisense⁺ Klonen (z.B. Klon B) im Gegensatz zu dem negativen p23 Antisense⁺ Klon A (Abb.21a). Durch die IRES-Kopplung ist die Expression des Fluoreszenzproteins (GFP) proportional zur Expression der antisense-bzw. sense-p23 mRNA. Ein Teil der Zellen wurde in Protein-Lysispuffer aufgenommen und für eine anschließende Kontrolle der p23 Proteinexpression mittels Western-Blot eingesetzt (Abb.21b).

	Abb.21: Analyse der p23 Expression in monoklonalen p23+/GFP+-Verpackungszellinien (GP+E).
	Für a) wurden nichttransfizierte GP+E-Zellen (1) und p23 Sense+ bzw. Antisense+ Klone (3-5) geerntet und in FACS-Puffer aufgenommen (1x106Zellen/200µl). Die FACS-Analyse stellt die Intensität des mittleren Fluoreszenz-Signals (GFP) im Histogramm der einzelnen stabilen Klone dar. b) Zellen nichttransfizierter GP+E-Zellen (1) und p23 Sense+ bzw. Antisense+ Klone (2-7) wurden geerntet, in Lysepuffer aufgenommen, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend geblottet. Dargestellt ist die p23 Proteinmenge bezogen auf das Kontrollprotein β‑Aktin.

Es wird deutlich, dass p23 schon in der Kontrolle, den nicht-transfizierten GP+E Zellen, sehr stark exprimiert wird. Trotzdem müsste die Antisense-p23 mRNA eine Verminderung der p23 Proteinexpression in den Zellen erzielen. Entsprechend der FACS-Daten konnte auch auf dem Westernblot detektiert werden, dass der p23 Antisense⁺ Klon B im Gegensatz zur Kontrolle [Seite 68↓]und zum p23 Antisense⁺ Klon A, der nur schwach exprimiert (siehe GFP Expression), zwar keine vollständige Inhibierung, aber eine deutliche Reduzierung in der p23 Expression aufweist. Die p23 Sense⁺ Klone dagegen zeigten im Vergleich zu den untransfizierten GP+E Zellen kaum sichtbare Unterschiede in der p23-Expression.

Für eine erfolgreiche retrovirale Transduktion jedoch war eine Verpackungszellinie notwendig, die kontinuierlich viel Virus produziert, der durch seine Integration ins Wirtsgenom eine starke p23 Antisense- bzw. Sense-mRNA Expression bewirkt. Deshalb wurde hinsichtlich unserer Ergebnisse vorerst auf eine Virustiterbestimmung und die Transduktion von T-Lymphozyten verzichtet. Dennoch wurden die stabilen p23 Sense⁺ bzw. Antisense⁺ Klone in Flüssigstickstoff weggefroren, um diese im Rahmen anschließender Projekte noch funktionell in der MLC zu untersuchen.

Diese Methode ist eigentlich die Standardmethode, da ein höherer Probendurchsatz ermöglicht wird. Aufgrund unserer geringen Expression in den selektionierten stabilen Klonen, wiederholten wir den Versuch der Transfektion und Transduktion in Zusammenarbeit mit dem DRFZ Berlin (AG Radbruch). Das dort verwendete System arbeitete mit der Verpackungszellinie Phoenix für die transiente Transduktion von Maus-Milzlymphozyten. Wegen der starken Homologie zwischen Maus- und Rattensequenz gab es keine Bedenken, unsere p23-Rattensequenz im Mausmodell (Balb/c) anzuwenden.

Da die AG Radbruch erfolgreich mit der Methode der Virusüberstandgabe arbeitete, verwendeten wir diese auch für unseren Wiederholungsversuch.

Die Transfektion der Verpackungszellinie Phoenix mit den pLXSN-IRES-GFP-p23 Plasmiden (Sense und Antisense) erfolgte zum einen mittels Kalzium-Phosphat Präzipitation und zum anderen mittels Lipofektamin. Nach 2 Tagen konnte der Virusüberstand weggefroren werden. Eine FACS-Analyse der Fluoreszenz-Intensität von GFP der p23⁺/GFP⁺-Transfektanten ergab als Transfektionskontrolle folgende Werte (Tabelle 3):

Tabelle 3: Transfektionskontrolle polyklonaler p23+/GFP+-Verpackungszellinien (Phoenix). 2 Tage nach Transfektion der Phoenix mit p23 Sense bzw. p23 Antisense Plasmiden erfolgte eine FACS-Analyse der GFP-Fluoreszenzintensität

Die Überstände der polyklonalen Phoenix-Zellen mit der höchsten Transfektionsrate 1.a) und 1.b) wurden für die anschließende retrovirale Transduktion von Milz-T-Zellen der Maus verwendet. Dafür wurden die Milz-Lymphozyten vorher isoliert und nach der Erythozytenbeseitigung für 24 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert, um eine vollständige, aber antigen-unabhängige T-Zellaktivierung zu erreichen. Für die Transduktion wurde der Virusüberstand auf die Mauszellen gegeben und für 48 Stunden kultiviert. Nach den ersten 24 Stunden erfolgte eine FACS-Analyse der GFP-positiven Zellen im ersten Fluoreszenzkanal des Durchflußzytometers. Ein Teil der Suspensionszellen wurde entnommen und mit Propidiumjodid gefärbt, um bei der Messung tote Zellen auszuschließen (Autofluoreszenz). Propidiumjodid ist ein Farbstoff, der sich in tote Zellen einlagert und somit eine Differenzierung zwischen den toten und den Plasmid-tragenden lebenden Lymphozyten erlaubt. In Abbildung 22 ist die Effizienz der T-Zell Transduktion nach 24 Stunden dargestellt:

	Abb.22: Effizienz der T-Zelltransduktion
	Nach anti-CD3/anti-CD28 Antikörperstimulation (je 3µg/ml) von Mauslymphozyten (3x106Zellen/well) erfolgte die Transduktion mit Virusüberstand polyklonaler p23+/GFP+-Phoenix-Zellinien für insgesamt 48 Stunden. Rot dargestellt sind die prozentualen Transduktionsraten nach 24 Stunden von jeweils p23 Sense+-und Antisense+-T-Zellen.

Der Durchschnittswert der Transduktionseffizienz in der AG Radbruch liegt bei ca. 10% bis maximal 20%. Trotz der relativ schlechten Transduktionsrate von 1,81% - 2,36%, entschieden wir uns dafür, die p23⁺/GFP⁺-Zellen mittels eines FACS-Sorts zu isolieren und zu restimulieren. Es sollte untersucht werden, ob die T-Zellen, in denen p23 inhibiert (p23 Antisense-mRNA) bzw. überexprimiert (p23 Sense-mRNA) wurde, nach allogener Aktivierung ein verändertes Proliferationsverhalten aufweisen. Das Sorten der p23⁺/GFP⁺-Zellen ergab leider nur eine geringe Zellmenge von 8x10⁴ der p23 Sense⁺-T-Zellen und 1x10⁵ der p23 Antisense⁺-T-Zellen, was jedoch bei der geringen Transduktionsrate nicht anders zu erwarten war.

Die gesorteten Zellen wurden gewaschen und für 24 Stunden ruhen gelassen, damit die erneute Stimulation nicht vorzeitig die Apoptose der Zellen induziert. Erst danach wurden die Zellen mit anti-CD3- und anti-CD28- Antikörpern restimuliert. Die selektionierten Lymphozyten ließen sich nicht restimulieren, auch nicht nach Zugabe von 1U Maus-IL2. Ein Wiederholungsversuch ergab ein ähnliches Ergebnis. Die T-Zellen reagierten nicht mehr auf den Stimulus, weil sie schon apoptotisch waren und nicht weil der p23 Einfluss diesen Effekt hervorrief.

Bei einer Aktivierung von naiven T-Zellen treten diese in den Zellzyklus, um sich vermehren (klonale Expansion) und zu Effektorzellen differenzieren zu können. Dabei setzt eine neue RNA- und Proteinsynthese ein. Das Zytokin Interleukin-2 (IL-2), von aktivierten T-Zellen selbst gebildet, steuert die Proliferation und Differenzierung. Außerdem verstärkt es die Produktion anderer Zytokine, wie z. B. Interferon-γ (IFNγ). IL-2 und IFNγ, als wichtige Marker allogener Abstoßungsprozesse nach Transplantation, spielen eine entscheidende Rolle während der T-Zellaktivierung. Neben den analysierten IL-2 Daten sollte deshalb noch die Expression von IFNγ in der MLC sowohl auf mRNA-Ebene (TaqMan) als auch auf Proteinebene (ELISA) täglich für 5 Tage analysiert (Abb.23) werden.

	Abb.23: Einfluss des anti-CD4mAk´s auf die IFNγ Transkription und Sekretion allo-aktivierter T-Zellen
	Unbehandelte allo-aktivierte (), anti-CD4mAk-behandelte allo-aktivierte () und syngene T-Zellen (Ж) wurden von Tag 0 bis 5 einer MLC geerntet. Die RNA wurde isoliert und die IFNγ mRNA Expression mittels TaqMan PCR bestimmt (links). Der Kulturüberstand wurde für die Analyse der IFNγ Proteinsekretion mittels ELISA verwendet (rechts). Dargestellt sind die Ergebnisse fünf unabhängiger Experimente als Mittelwert mit Standardabweichung.

In unbehandelten allogenen Kulturen sieht man eine Hochregulation der IFNγ mRNA Expression am Tag 2 der MLC, gefolgt von der Protein-Translation am Tag 3. Im Gegensatz zu der vollständig geblockten IL-2 Synthese unter Zugabe des anti-CD4mAk´s zum allogenen [Seite 72↓]Kulturansatz (siehe Pkt. 7.1.5. und Abb.12) konnte keine Inhibierung der IFNγ-Transkription festgestellt werden. Anti-CD4-behandelte T-Zellen zeigten zwar eine verzögerte Kinetik der IFNγ mRNA-Expression, erreichten aber ebenso die Maximalwerte wie die unbehandelten allogenen Kulturen. Trotz ähnlicher IFNγ mRNA-Expression war nur eine geringe IFNγ Proteinmenge detektierbar. Entweder ist die IFNγ Translation inhibiert oder die Sekretion des Proteins verhindert. Deshalb wurde in anti-CD4mAk-behandelten allo-reaktiven T-Zellen untersucht, ob die IFNγ Produktion durch eine verhinderte Proteinsekretion verursacht wurde. Dafür wurde die intrazelluläre IFNγ Färbung am Tag 4 der MLC durchgeführt. In Abb.24 ist dargestellt, dass ungefähr 70% der CD4⁺-Zellen in unbehandelten allogenen Kulturen IFNγ exprimieren, während nur 30% der anti-CD4mAk-behandelten Zellen IFNγ-positiv sind. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse von CD8⁺-T-Zellen erhalten. Infolgedessen kann man sagen, dass die reduzierte IFNγ Produktion nur teilweise auf einen Sekretionsblock zurückzuführen ist, sondern mehr auf einen Translationsblock beruht. Hierbei können aber mögliche posttranskriptionelle Kontrollprozesse (splicing, mRNA Export) nicht ausgeschlossen werden.

	Abb.24: Intrazelluläre IFNg Expression in unbehandelten allo-aktivierten und anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten CD4+-T-Zellen
	Die Zellen einer 5 Tage-MLC wurden am Tag 4 geerntet und für die FACS-Analyse vorbereitet. Die integrierten Zahlen repräsentieren den prozentualen Anteil der IFNγ-produzierenden CD4+-T-Zellen. Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Da IL-2 eine verstärkende Wirkung auf die Zytokinproduktion aktivierter T-Zellen ausübt und in seiner Expression in anti-CD4-behandelten MLC-Kulturen verhindert ist, wurde versucht, die fehlende IFNγ Produktion durch den Zusatz von rekombinantem IL-2 wiederherzustellen. Es wurde eine Konzentration von 1U/ml verwendet, die sich nicht stimulierend auf die Proliferation auswirkte (Daten nicht gezeigt). Die Zugabe erfolgte erst am Tag 2 der MLC, da ab diesem Zeitpunkt die IFNγ Transkription schon nachweisbar war. Wie in Abbildung 25 erkennbar ist, übte rekombinantes IL-2 in anti-CD4-behandelten Kulturen keinen zusätzlichen Stimulus auf die IFNγ mRNA Expression aus, bewirkte aber die Wiederherstellung der IFNγ Zytokinproduktion.

	Abb.25: Einfluss von rekombinantem IL-2 (1U/ml) auf die gehemmte IFNγ Proteinproduktion in anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen
	Unbehandelte allo-aktivierte T-Zellen () wurden mit anti-CD4mAk versetzt () und anti-CD4mAk-behandelte T-Zellen zeitgleich mit rekombinanten IL-2 (1U/ml) inkubiert (). Die Ernte der Zellen erfolgte von Tag 0 bis 5 der MLC. Die isolierte RNA wurde für die Analyse der IFN γ mRNA Expression mittels TaqMan PCR verwendet (links) und aus dem Kulturüberstand wurde die Menge der IFN γ Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt (rechts). Dargestellt sind die Ergebnisse fünf unabhängiger Experimente als Mittelwert mit Standardabweichung.

Mit der Verwendung des neutralisierenden anti-CD25 Antikörper´s wurde die Bedeutung von IL-2 für die Translationskontrolle von IFNγ noch deutlicher. Wie in Abbildung 14 dargestellt, verhinderte der anti-CD25mAk zwar nicht die Proliferation allo-aktivierter T-Zellen, aber [Seite 74↓]inhibierte ähnlich wie der anti-CD4mAk die IFNγ Translation, ohne dabei die Transkription zu beeinflussen (Abb.26).

	Abb.26: IFNg Expression anti-CD25mAk-behandelter allo-aktivierter T-Zellen (10µg/ml)
	Verglichen wurden unbehandelte allo-aktivierte T-Zellen (■) mit anti-CD25mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen () in einer MLC. Die Ernte der Zellen erfolgte täglich von Tag 0 bis 6. Die isolierte RNA wurde für die Analyse der IFN γ mRNA Expression mittels TaqMan PCR verwendet (links) und aus dem Kulturüberstand wurde die Menge der IFN γ Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt (rechts). Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

IL-15 als T-Zell Wachstumsfaktor weist etliche Gemeinsamkeiten mit IL-2 auf, wie z.B. die Nutzung der β- und γ-Kette des Rezeptors. Deshalb untersuchten wir, ob auch IL-15 für die IFNγ Translationskontrolle in allo-aktivierten T-Zellen bedeutend ist. Überraschenderweise hatte die Zugabe eines rekombinanten IL-15 Rezeptor-Antagonisten (mrIL-15Ra/Fc Chimäre) zu sonst unbehandelten allogenen Kulturen keine inhibitorische Wirkung auf die IFNγ Proteinproduktion. Auch die Zugabe von exogenem murinen IL-15 (mrIL-15) zu anti-CD4mAk-behandelten Kulturen vermochte nicht, wie IL-2, die IFNγ Proteinhemmung aufzuheben (Abb.27).

	Abb.27: Bedeutung von IL-15 für die IFNγ Expression
	Während einer 5 Tage-MLC wurden allo-aktivierte () und anti-CD4mAk-behandelte allo-aktivierte T-Zellen () verglichen. Dabei wurde zusätzlich die Auswirkung der IL-15 Rezeptorinhibierung (1µg/ml mrIL-15R) allogener T‑Zellen ( ) und die IL-15 Gabe (1U/ml) zu anti-CD4mAk-behandelten T-Zellen ( ) untersucht. Tag 0 entspricht der Expression in unstimulierten T-Zellen. Nach Zellernte und RNA-Isolation wurde die IFNγ Transkription mittels TaqMan PCR analysiert (links) und aus dem Kulturüberstand wurde die Menge der IFNγ Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt (rechts). Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Wie schon erwähnt, induziert IL-2 mehrere Signalwege, die unter anderem die Transkription (z.B. IFNγ) und Translation verschiedener Proteine regulieren und den Zellzyklus und die Proliferation beeinflussen. Auch die MAP Kinase p38 und ERK1/2 spielen eine wichtige Rolle in der mRNA Translations-Regulation. Deshalb sollte ihr Einfluss auf die Translationskontrolle von IFNγ in allo-aktivierten T-Zellen untersucht werden. Dafür wurden einer MLC am Tag 2 der spezifische MEK Kinase-Inhibitor PD184352 und p38 Kinase-Inhibitor SB203580 separat dazugegeben, um deren Aktivität zu blocken. Damit wurde gezielt nur in die Regulation der Translation eingegriffen, da bis Tag 2 die IFNγ Transkription schon nachweisbar war. In Abbildung 28 wird sichtbar, dass die Inhibierung der p38 und ERK1/2 Kinase am Tag 2 der MLC keine Auswirkung mehr auf die IFNγ Transkription hatte, aber ähnlich wie der anti-CD4mAk die IFNγ Translation verhinderte. Die Zugabe der Inhibitoren am Tag 0 der MLC verhinderte auch die IFNγ Transkription, was darauf hindeutet, dass die p38 und ERK1/2 Kinase sowohl in der frühen (Transkription), als auch in [Seite 76↓]der späten Phase (Translation) der IFNγ Expression aktiviert werden. Wie schon in Abb.18 dargestellt wurde, zeigten anti-CD4mAk-behandelte T-Zellen keine Verringerung der p38 und ERK Kinaseaktivität im Vergleich zu unbehandelten allo-reaktiven T-Zellen. Auch wenn die Inhibierung der beiden MAPKs p38 und ERK die IFNγ Proteinexpression verhinderte, beruht der IFNγ Translationsblock in anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen wahrscheinlich doch nicht auf deren reduzierter Kinaseaktivität.

	Abb.28: Auswirkungen spezifischer Inhibitoren der p38- und MEK-Kinase (jeweils 10µM) auf die IFNγ Expression allo-aktivierter T-Zellen
	Allo-aktivierte T-Zellen ( ) wurden entweder mit dem MEK-Inhibitor PD84352 () oder dem p38-Inhibitor SB203580 () versetzt. Nach der Zellernte erfolgte dieAnalyse der IFNγ Transkription mittels TaqMan-PCR aus der isolierten RNA (links) und die IFNγ Sekretion wurde mittels ELISA aus dem Kulturüberstand bestimmt (rechts). Dargestellt sind die Ergebnisse von einem der drei repräsentativen Experimente.

Ein anderer IL-2-induzierter Signaltransduktionsweg während der T-Zellaktivierung wird von der mTOR Kinase (Target of Rapamycin) kontrolliert. Diese reguliert mehrere Prozesse, so auch die Proliferation und die Translationinitiation über die Deaktivierung des Translationsrepressors 4E-BP. Ob die mTOR-abhängige Deaktivierung von 4E-BP für die Aufhebung der IFNγ Translationshemmung durch IL-2 verantwortlich ist, sollte durch den Einsatz des mTOR-spezifischen Inhibitors Rapamycin getestet werden. Wir benutzten wieder eine Konzentration von 50 ng/ml, die eine vergleichbare Hemmung der T-Zellaktivierung (Proliferation) wie der anti-CD4mAk erreichte. Trotz des antiproliferativen Effekts, verhinderte Rapamycin weder die Transkription noch die Translation von IFNγ (Abb.29). Auch wenn eine leicht verzögerte Kinetik zu beobachten ist, erreichten die IFNγ Werte auf mRNA- und Proteinebene die Maximalwerte der unbehandelten allogenen Kultur.

	Abb.29: Einfluss von Rapamycin (50ng/ml) auf die IFNγ Regulation allo-aktivierter T-Zellen
	In einer MLC wurden allo-aktivierte T-Zellen ( ) mit dem mTOR-spezifischen Inhibitor Rapamycin (ο) inkubiert. Die Zellen wurden täglich von Tag 0 bis 6 geerntet und die RNA isoliert. Die Analyse der IFNγ Transkription erfolgte mittels TaqMan PCR (links) und die Menge der IFNγ Proteinsekretion wurde mittels ELISA aus dem Kulturüberstand bestimmt (rechts). Dargestellt ist eins von drei repräsentativen Ergebnissen.

Es scheint, dass IL-2 zwar die IFNγ Translationshemmung kontrolliert, diese Hemmung aber über einen mTOR-unabhängigen Signalweg vermittelt wird.

Zwischen dem IL-2 Rezeptor und mTOR ist die PI3 Kinase zwischengeschaltet, die für die IL-2-induzierte Genexpression eine entscheidende Rolle spielt. Inwiefern PI3K in der IFNγ Translationhemmung involviert ist, wollten wir mit der Blockierung der Kinase untersuchen. Der PI3K Inhibitor Ly294002 wurde am Tag 2 zu allo-aktivierten T-Zellen gegeben. Abbildung 30 zeigt, dass die Inhibierung der PI3 Kinase während der allogenen T-Zell-Aktivierung die Translation von IFNγ blocken konnte, die Transkription aber unbeeinflusst ließ.

	Abb.30: Effekte des PI3 Kinase-Inhibitors Ly294002 (10µM) auf die IFNγ Translation während der Alloaktivierung von T-Zellen
	Unbehandelte allo-aktivierte (), anti-CD4mAk-behandelte allo-aktivierte () und Ly-behandelte allo-aktivierte T-Zellen () wurden von Tag 3 bis 5 der MLC geerntet. Tag 0 entspricht der Expression in unstimulierten T-Zellen. Aus der isolierten RNA wurde die IFNγ Transkription mittels TaqMan PCR bestimmt (links) und aus dem Kulturüberstand die IFNγ Proteinsekretion mittels ELISA (rechts).Dargestellt sind die Ergebnisse von einem der drei repräsentativen Experimente.

Aktivitätsnachweise verschiedener Kinasen, die die Proteinsynthese kontrollieren, sollten weitere Beweise der Bedeutung des IL-2-induzierten Signalweges für die IFNγ Translation in allo-aktivierten T-Zellen liefern. Die oben genannte PI3 Kinase reguliert die Akt (PKB) Kinase, die wiederum über mTOR für die Aktivierung der p70S6 Kinase verantwortlich ist. Die Bedeutung der Akt-abhängigen Aktivierung der p70S6 Kinase mit ihrer Kontrollfunktion der Translation ribosomaler Protein-mRNA´s (z.B. Elongationsfaktoren) sollte mit in die Untersuchungen einbezogen werden. Ihre Aufgabe besteht neben der Regulation der Proteinsynthese über die Phosphorylierung ihres Zielproteins 40S6, in der Translation von 5´‑TOPmRNA´s und in der Kontrolle des Zellwachstums (156) über die Regulation von E2F Transkriptionsfaktoren in T-Zellen (157, 158), die für den kontrollierten Durchlauf des Zellzyklus mitverantwortlich sind. Die Translationseffizienz während der T-Zellstimulation wird hauptsächlich durch die Stärke der Translationsinitiation bestimmt. Der Initiationsfaktor eIF2α als Schlüsselprotein der Translationsinitiierung vermittelt die Bindung der Initiator-tRNA an die Ribosomen und wird durch Dephosphorylierung aktiviert.

Die Aktivität der p70S6 Kinase und des Initiationsfaktors eIF2α wurde in unbehandelten und anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen am Tag 3 einer MLC analysiert. Auch der Phosphorylierungszustand nach Zugabe von rekombinantem IL-2 oder IL-15 zu anti‑CD4mAk-behandelten Kulturen wurde untersucht. Mit Hilfe der SDS-PAGE und anschließenden Western-Blots konnten die Phosphorylierungen von p70S6, 40S6 und eIF2α mit Phospho-spezifischen Antikörpern detektiert werden (Abb.31). Auch hier wurde die Kontroll-Inkubation mit einem Antikörper gegen β-Aktin durchgeführt, um zu zeigen, dass eine gleichmäßige Beladung mit den Zellysaten vorliegt.

	Abb.31: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand IL-2-induzierter mTOR-kontrollierte Kinasen und Substrate mit der IFNγ Expression
	Proben unterschiedlicher MLC-Kulturansätze (allogen, allogen + anti-CD4mAk, allogen + anti-CD4mAk + IL-2, allogen + anti-CD4mAk + IL-15, syngen) wurden jeweils am Tag 3 in Lysepuffer aufgenommen und ihre Konzentration an Gesamtprotein mittels Bradford-Methode bestimmt. Nach der SDS-PAGE (30µg Protein/Bahn) wurden die Proben geblottet und die Phosphorylierungszustände der Kinase p70S6 (S6K), des Substrates 40S6 und des Initiationsfaktors eIF2α mittels spezifischer Phospho-Antikörper analysiert. Die Bandenintensität wurde am Imager vermessen und prozentual im Vergleich zu b-Aktin demonstriert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von zwei kompletten Westernblot-Analysen. LW=unbehandelte allo-aktivierte T-Zellen.

In Abbildung 31 ist dargestellt, dass die Behandlung allogen-aktivierter T-Zellen mit dem anti-CD4mAk zu einer reduzierten Phosphorylierung der p70S6 Kinase, vor allem der 70 kDA Isoform, und deren Substrat 40S6 führt, wie auch schon in Abb.19 gezeigt wurde. Unter Gabe von IL-2 und IL-15 konnte die p70S6-Phosphorylierung wieder revertiert werden. Da IL-15 aber für die IFNγ Translation während der allogenen T-Zellaktivierung keine Rolle spielte (Abb.27) scheint die verringerte Aktivierung der p70S6 Kinase in anti-CD4mAk-behandelten Kulturen nicht verantwortlich für den IFNγ Translationsblock zu sein. Auch die Daten der Rapamycin-Hemmung sprechen dagegen, da Rapamycin als Inhibitor von mTOR, worüber die p70S6 Kinase aktiviert wird, keinen Einfluss auf die IFNγ Translation (Abb.29) hatte. Ausserdem zeigte die p70S6 Kinase unter dem anti-CD25mAk, der auch zum IFNγ Translationsblock führte (Abb.26), ein ähnliches Proteinaktivierungsmuster wie unbehandelte allo-aktivierte Zellen (Abb.19).

Dagegen kann man in allogenen Kulturen eine verringerte Phosphorylierung von eIF2α beobachten, was für einen aktiven Zustand des Initiationsfaktors spricht. Die Zugabe des anti-CD4 Antikörpers zu allo-aktivierten T-Zellen verhinderte jedoch diese Dephosphorylierung. Die Zugabe von rekombinantem IL-2 zu anti-CD4-behandelten allogenen Kulturen führte zu einer Dephosphorylierung und damit Aktivierung des Translationsinitiations-Faktors, rekombinantes IL-15 hatte jedoch keinen Einfluss auf dessen Phosphorylierung.