5  Diskussion

Der nicht-depletierende anti-CD4mAk (RIB5/2) induziert im allogenen Nierentransplantationsmodell der Ratte eine permanente Transplantattoleranz. In dieser Arbeit wurde zum einen die Wirkung der anti-CD4mAk-Behandlung auf die Proliferation und Expression Zellzyklus-assoziierter Proteine alloreaktiver T-Zellen untersucht und zum anderen die Regulierung des Effektorzytokins IFNγ analysiert.

Diese Arbeit konnte zeigen, dass die Expression des Kochaperons p23 in verschiedenen T‑Zellaktivierungsmodellen proliferationsabhängig hochreguliert wird und ebenso wie die Proliferation unter anti-CD4mAk reduziert wird. Für diese p23 Expressionsregulation in allogen-aktivierten T-Zellen wurde die verantwortliche Signalkaskade ermittelt. Auch die Synthese von zwei für den Abstoßungsprozess gefährlichen Effektorzytokinen (IL-2 und IFNγ) wird verhindert, wobei interessanterweise die IFNγ mRNA Expression nicht inhibiert wird. Es konnte ein Kandidat dieser IFNγ Translationskontrolle erforscht werden.

Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der molekularen Analyse der anti-CD4mAk Wirkung im Detail diskutiert.

Unsere Expressionsanalysen während der allogenen T-Zellaktivierung im Rattenmodell ergaben, dass das Chaperon p23 kinetisch betrachtet einen Höhepunkt seiner Transkriptionregulation erreicht, wenn sich die Zellen in ihrer Proliferationsphase befinden. Bekanntermaßen ist p23 ein Kochaperon des Hitzeschockproteins Hsp90, für das wiederum schon 1988 nachgewiesen wurde, dass es nach Mitogen- bzw- Lymphokin-Stimulation in humanen T-Zellen hochreguliert wird (159). In älteren Patienten (75 Jahre) mit verringerter IL-2- und IL-2 Rezeptor- Produktion wurde eine reduzierte T-Zellproliferation beobachtet. Diese Prozesse gingen mit einer reduzierter Hsp90-Induktion einher (160). Auch andere Gruppen konnten zeigen, dass das Expressionslevel an Chaperonen/Hsp´s in proliferierenden Zellen verglichen mit ruhenden Zellen hochreguliert wird (161-163). Hansen et al. wiesen nach, dass die Hsp90 Synthese wirklich auf einer verstärkten Transkription beruht und nicht [Seite 82↓]nur der Effekt einer gesteigerten Translation präformierter mRNA ist (164). Korrelationen zwischen Hsp-Expressionen und Proliferation speziell im Rattenmodell wurden schon von anderen Arbeitsgruppen aufgedeckt (163, 165).

Hsp90 ist für die Stabilisierung und Translokation neu synthetisierter Proteine verantwortlich und hilft bei der Eliminierung denaturierter Proteine durch Degradierung (166, 167). Hsp´s spielen aber auch eine Rolle während der Zellzyklusregulation und in Signalkaskaden über Kinasestabilisierungen. Vorstellbar ist, dass nach T-Zellaktivierung die vermehrten Kinaseaktivierungen (auch Zellzyklus-Komponenten) ein höheres Potential an stabilisierenden Chaperonen/Hsp´s benötigen. Die Erkenntnisse, dass p23 für die Stabilisierung der Hsp90/Substrat-Komplexe und die langsame Dissoziation der Substrate (z.B. Kinasen) von Hsp90 erforderlich ist (168), könnten eine gute Erklärung für die Notwendigkeit der p23 Regulation sein. Schon in Bezug auf die nötige Dauer des TCR-APC-Kontaktes für eine vollständige T-Zelltransduktion (169) wird die Dringlichkeit der Signallänge durch stabile Ligandeninteraktionen deutlich. Über den regulativen Einfluss von p23 auf die T-Zellaktivierung ist im Gegensatz zu Hsp90 nichts bekannt. Vielleicht wirkt die p23 mRNA Hochregulation in unserem Modell der T-Zellantwort (MLC) auch regulativ auf die Hsp90 Funktion als Kinasestabilisator ein und moduliert somit Signalkaskaden der T-Zellaktivierung.

Der inhibitorische Einfluss des von uns verwendeten anti-CD4mAk´s RIB5/2 sowohl auf die Proliferation als auch auf die p23 Transkription allo-aktivierter T-Zellen lässt auf eine Korrelation zwischen Proliferation und Expression des Kochaperons p23 schließen.

Um den Zusammenhang zwischen p23 Expressionsregulation, Proliferation und die Auswirkung des anti-CD4mAk´s darauf weiter zu untersuchen, haben wir in einer Primär-MLC allogen-stimulierte T-Zellblasten einer weiteren allogenen Stimulation in einer Sekundär-MLC ausgesetzt.

1.) Restimulierte unbehandelte T-Zellen reagieren mit einer erneuten p23 Hochregulation, die im Vergleich zur Primär-MLC beschleunigt abläuft (Peak bei 24 Stunden statt Tag 3). Gefolgt wird diese auch von einer beschleunigten Proliferation (Tag 1-2 statt Tag 3-4). In der Primär-MLC differenzieren die naiven T-Zellen nach Aktivierung und IL-2-induzierter klonaler Expansion zu bewaffneten T-Effektorzellen/ Gedächtniszellen, die bei dem späteren Zusammentreffen mit ihrem spezifischen Antigen (Sekundär-MLC) beschleunigt reagieren [Seite 83↓]konnten. Auch die Th1- (IL-2, IFNγ) und Th2-Zytokine (IL-10) wurden ebenfalls schneller hochreguliert (Daten nicht gezeigt).

2.) Die anti-CD4mAk-Behandlung konnte allerdings allo-vorstimulierte T-Zellen in der Sekundär-MLC nicht mehr inhibieren, was sich interessanterweise in einem kaum gehemmten p23 Expressionsanstieg widerspiegelt. Auch IL-2 und IFNγ sind normal hochreguliert. Im Gegensatz zu naiven T-Zellen scheinen bei den Gedächtnis CD4⁺-T-Zellen einige unmittelbare TCR-vermittelte Signalgebungen auszufallen, wie z.B. die Phosphorylierung der Tyrosin-Kinase Zap-70 über die CD4-assoziierte Src-Tyrosin-Kinase Lck (170). Beeinträchtigungen des CD4-Moleküls durch anti-CD4mAk´s würden somit kaum noch Auswirkungen auf das TCR-Signal ausüben und eine T-Zellaktivierung nicht behindern.

3.) Dagegen sind die in der Primär-MLC anti-CD4mAk-vorbehandelten Blasten stabil anerg, also nicht durch einen erneuten allogenen Stimulus in der Sekundär-MLC wieder aktivierbar. Mit diesem Befund geht die geringe p23 (als auch IL-2, IFNγ und IL-10) Expression konform.

Aufgrund der bisherigen Daten stellte sich die Frage, ob die p23 Regulation nicht nur mit der Proliferation korreliert, sondern womöglich von ihr abhängig ist. Dafür wurden verschiedene Proliferationshemmer in der allogenen MLC eingesetzt und die p23 Expressionskinetik untersucht. Es zeigte sich, dass p23 durch alle Zellzyklus-Inhibitoren in seiner Hochregulation unterdrückt wird, was für eine Proliferations-abhängige Regulation der p23 Transkription spricht. Allerdings ist damit nicht ersichtlich, in welcher Zellzyklus-Phase p23 hochreguliert wird, da alle Inhibitoren den gleichen blockierenden Effekt ausüben. Möglicherweise wird die p23 Transkription erst während der späten Phase des Zellzyklus (G2/M oder M) initiiert. Dies konnte allerdings mangels spezifischer Proliferationshemmer nicht näher untersucht werden. Andererseits bleibt offen, ob die T-Zellen erst eine Runde der Zellteilung durchgeführt haben müssen, ehe die Expression ermöglicht wird, so wie es z.B. für einige Zytokine beschrieben ist (171). Der Zellzyklus kann hierbei die Expression verschiedenster Zytokine kontrollieren, die zeitunabhängig erst nach ein paar ZZ-Runden gestartet wird (172). Da es aber eine Grundexpression an p23 gibt und die Hochregulation in der MLC zum Tag 5 hin wieder fällt, ist es eher anzunehmen, dass die p23 mRNA Expression nach jedem Zyklus neu hochreguliert wird. Hinzu kommt ein kritischer Punkt in Bezug auf die Methode, da die T-Zellen in einem Gemischten Lymphozytenansatz unterschiedlich schnell aktiviert werden und damit auch ungleichmäßig in den Zellzyklus eintreten. Eine vorherige Synchronisation der T-Zellen hätte [Seite 84↓]eventuell ein eindeutigeres Ergebnis liefern können. Für einige Hsp´s wurde eine Zellzyklus-abhängige Expression schon nachgewiesen, wie z.B. für Hsp90, dessen mRNA während der G1/S-Phase angereichert wird (173).

Der Versuch, einen generellen Eindruck über die p23-Regulation zu gewinnen, zeigte in allen Modellen der unterschiedlichen T-Zellstimulationen eine Hochregulation der p23 Expression. Das entsprach unseren Erwartungen, da auch in diesen Modellen eine Proliferation beobachtet wurde. Die T-Zellaktivierung nach ConA-Stimulation, die zu einer Vernetzung der CD2-Moleküle auf den T-Zellen führt, erfolgt beschleunigt durch den direkten Zell-Zell-Kontakt und dem unspezifischen Mitogenkontakt. Unspezifisch deshalb, weil die T-Zellaktivierung in diesem Modell zwar APC-abhängig, aber TCR/Ag-unabhängig abläuft. Das Plateau der p23 Hochregulierung (7fach) erreicht das der allogenen T-Zellstimulation, wieder konform gehend mit der parallel ablaufenden Proliferation der Zellen.

Bei der aCD3/aCD28mAk-Stimulation erfolgt die Aktivierung und Proliferation sowohl APC- als auch Ag-unabhängig. Deshalb ist in diesem Modell eine etwas beschleunigte T-Zellantwort und p23 Expression zu beobachten. Außerdem ist ein Kontakt wahrscheinlicher zwischen den Zellen und dem Stimulus, da jede T-Zelle und nicht nur allogen-spezifische T-Zellen reagieren. Entscheidend ist dabei auch die Stimuluskonzentration. Fraglich bleibt die anhaltende Hochregulierung von p23 bis zum Tag 5 der Stimulation, da sonst regelmäßig ein Höchstwert mit anschließendem Abfall beobachtet wurde. Andererseits war aber auch ein Anstieg der IFNγ mRNA Expression bis zum Tag 5 hin zu verzeichnen, der ebenfalls in der Regel nach dem Expressionsmaximum wieder abfiel.

Interessanterweise erreicht die T-Zellaktivierung und p23 Expression in humanen PBMC´s im Gegensatz zu Ratten-T-Zellen (72 h) ihr Maximum schon nach 40 Stunden. Die Ursache könnte der ständige Pathogenkontakt des Menschen nach Infektionen und Vakzinierungen sein, die zur Bildung von Gedächtniszellen führen, die wiederum dementsprechend schneller auf Ag-Kontakt reagieren und proliferieren würden. Generell demonstrieren diese Daten, dass die Hochregulation von p23 ein allgemeines Prinzip bei der T-Zellaktivierung über Speziesgrenzen hinweg darstellt.

Wie bereits erwähnt, hemmt der anti-CD4 Antikörper RIB5/2 sowohl die Proliferation als auch die Hochregulation der p23 Transkription. Außerdem konnte ein Zusammenhang zwischen der Proliferation der Zellen und einer erhöhten p23 Expression aufgedeckt werden. [Seite 85↓]Da IL-2 bekanntermaßen der Hauptwachstumsfaktor für aktivierte T-Zellen darstellt und dessen Bedeutung in der Toleranzverhinderung bzw. Toleranzbrechung (105) schon nachgewiesen wurde, wurde die Bedeutung von IL-2 auch in unserem in vitro-Modell MLC untersucht. Es wird deutlich, dass unter anti-CD4mAk-Behandlung sowohl die IL-2 Trankription als auch Translation gehemmt ist und letztendlich die inhibierte Proliferation durch exogene IL-2 Gabe konzentrationsabhängig wieder revertierbar ist. Die naheliegende Vermutung, dass sich die anti-CD4mAk-gehemmte p23 Expression ebenfalls durch IL-2 Gabe rekonstituieren lässt, ließ sich mit unseren p23 mRNA Analysen bestätigen. Der p23-inhibierende Effekt des anti-CD4mAk´s wirkt vermutlich indirekt über eine Hemmung der TCR-induzierten IL-2 Produktion. Untersucht wurde die Annahme durch die Verwendung von Substanzen in der allogenen MLC, die mit der IL-2 Wirkung interferieren, aber die TCR-Stimulation unbeeinflusst lassen sollten. Das ist zum einen ein anti-CD25mAk, der den hochaffinen IL-2 Rezeptor blockiert und zum anderen Rapamycin, welches über die Inhibierung von mTOR den IL-2 Signalweg beeinflusst. Rapamycin hemmte wie erwartet die Proliferation der allo-aktivierten T-Zellen und die Hochregulation von p23, was eine Abhängigkeit vom IL-2 Weg demonstriert. Überraschenderweise war allerdings die Blockade von CD25 wirkungslos sowohl für die p23 Expression als auch für die Proliferation. Die Vermutung, dass der anti-CD25mAk funktionell nicht aktiv ist, konnte durch die inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers auf die IFNγ Translation widerlegt werden (siehe Abb.23). Möglicherweise können andere Zytokine, deren Signaltransduktion auch über die gleiche gamma-Kette erfolgt wie IL-2 (IL-4, IL-7, IL-9 oder IL-15), die Funktion von IL-2 ersetzen, werden aber in ihrer Wirkung auch von Rapamycin gehemmt. Von diesen Zytokinen ist IL-7 allerdings unwahrscheinlich, da es von Knochenmarkstromazellen produziert wird (174, 175), die jedoch nicht in unserem Stimulationsansatz vorhanden sind. Auch IL-9 wurde zwar ursprünglich als muriner T-Zellwachstumsfaktor beschrieben (176), wird aber im Vergleich zu IL-2 von aktivierten T-Zellen erst verzögert produziert. IL-4 wird wie IL-2 unter anderem von aktivierten CD4⁺-T-Zellen produziert (177) und kann ebenfalls als T-Zellwachstumsfaktor fungieren, der die Proliferation humaner und Maus-T-Zellen induziert. Beschränkt ist diese dabei auf bestimmte T-Zellpopulationen, wie z.B. Th2-Zellen, die aber kein IFNγ produzieren, welches in unserem MLC-Modell eine große Rolle spielt. Wahrscheinlicher erscheint eine stimulatorische Wirkung durch IL-15. Die Rolle von IL-15 wurde erst später identifiziert (178, 179), da seine Proteinproduktion relativ schwierig zu detektieren ist (180). Interessanterweise enthält der IL-15 Rezeptor nicht nur die γ-Kette, [Seite 86↓]sondern auch die IL-2β-Kette (181, 182). IL-15 und IL-2 spielen in der Homeostasis der adaptiven Immunantwort ganz unterschiedliche Rollen. IL-2 induziert dabei eher den Aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD), der für die periphere Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen erforderlich ist, während IL-15 inhibitorisch in diesen Prozess eingreift und zusätzlich im Gegensatz zu IL-2 das Überleben von Gedächtniszellen unterstützt (183). Andererseits teilen IL-2 und IL-15 eine Vielzahl biologischer Aktivitäten. So ist IL-15 ebenso ein starker Wachstumsfaktor für T-Zellen (184). Damit rückte IL-15 näher in unser Interesse, aber Untersuchungen mit einem blockierenden spezifischen Antikörper gegen die α-Kette des IL-15 Rezeptors (anti-IL15Rα) zeigten auch in Kombination mit anti-CD25mAk keine inhibitorische Wirkung auf die Proliferation der allo-aktivierten T-Zellen. Wie schon im Ergebnisteil erwähnt, ist dabei unklar, ob der Maus-Antikörper gegen die IL-15Rα—Kette überhaupt einen Effekt auf Ratten-Zellen ausüben kann. Spezifische Anti-Ratten-Antikörper stehen aber zur Zeit leider noch nicht zur Verfügung.

Hinzu kommt, dass die blockierende Wirkung des anti-CD25mAk diskutiert werden muss, da bekanntermaßen die IL2Rβ- und IL2Rγ-Kette verantwortlich sind für die Signaltransduktion-Funktion des Rezeptors (185, 186). Die alpha-Kette des IL-2 bzw. IL-15 Rezeptors ist hauptsächlich für die Steigerung der Bindungsaffinität des Rezeptors verantwortlich und kann in Abwesenheit der anderen beiden Ketten keine Signale auslösen (187-190). Kürzlich wurde jedoch in einer murinen Zellinie gezeigt, dass auch die IL-15Rα-Kette eine Signaltransduktion induzieren kann (191). Es bleibt die Frage offen, welche Signalwege und welche Unterschiede zwischen den Signalkaskaden der IL-2Rα- und IL‑15Rα-Kette bestehen.

Weshalb die blockierenden Antikörper keinen inhibitorischen Effekt auf die Proliferation ausüben, könnte weitere Ursachen haben. Für die T-Zell-Proliferation reicht vielleicht auch schon der Rezeptor aus beta-Kette und gamma-Kette aus. Dieser kann trotz geringerer Affinität IL-2 in sehr hohen Konzentrationen binden und ruhende T-Zellen aktivieren. Da die IL-2 Expression durch den anti-CD25mAk nicht beeinflusst wird, ließe sich damit die ungestörte Proliferation und p23 Hochregulation erklären.

Außerdem wurde beschrieben, dass eine T-Zell-Proliferation auch IL-2-unabhängig allein durch den Stimulus des T-Zell-Rezeptors und kostimulatorischer Moleküle (CD28) induziert werden kann (21, 192, 193). Allerdings reicht dieses Signal nur für ein paar Zellzyklen. Inwiefern dieser Mechanismus in unserem Modell entscheidend ist, müsste weiteren Untersuchungen unterzogen werden.

Die Erforschung der Signalwege, die zu einer Induktion der p23 Transkription führen könnten, wurde mit dem Einsatz spezifischer Kinase-Inhibitoren in der allogenen MLC erweitert. Die Zugabe der Inhibitoren am Tag 0 der MLC sollte zu einer allgemeinen Hemmung der p23 Transkription führen, da alle Signalwege (TCR-, CD28- und IL-2R-induziert) von Anfang an geblockt waren (Abb.32).

	Abb.32: Inhibitorische Einflüsse der Kinase-Hemmstoffe auf die T-Zellaktivierung

Da der p38-Inhibitor keinen Einfluss auf die Regulation der p23 Expression hatte, kann die MAPK/p38-Kaskade als Weg der p23 Kontrolle ausgeschlossen werden. Ansonsten bewirkten alle anderen Kinase-Inhibitoren eine Hemmung der p23 Hochregulation. Offenbar sind die Signalwege entscheidend für unsere beobachtete p23 Hochregulation, welche die IL‑2 Transkription induzieren oder zum Zellzyklus führen. Dazu gehört der PKC-Weg (Kalzium-abhängige NFκB-Aktivierung), die MAPK/ERK-Kaskade und die mTOR-abhängige PI3/PKB-Kaskade. Interessant wäre zu untersuchen, ob unter PKC-Hemmung eine Zugabe von exogenem IL-2 die p23 Inhibierung wieder revertieren kann, da die PKC-Kinase als einzige nicht in der IL-2 Signaltransduktionskaskade involviert ist und nur durch das TCR-Signal aktiviert wird. Alternativ könnte die Zugabe des PKC-Inhibitors erst am Tag 2 stattfinden, wenn das TCR-Signal schon erfolgt ist. Diese Experimente würden zukünftig noch für eine weitere Aufklärung sorgen.

Mit den bisherigen Daten der Signalweg-Inhibitoren und der IL-2 Rekonstitution der anti-CD4mAk-induzierten p23 Expressionshemmung könnte man schlussfolgern, dass die Kontrolle der p23 Regulation über die IL-2 Wirkung erfolgt.

Um den Einfluss der untersuchten Signalkaskaden auf die Regulation von p23 weiter zu belegen, versuchten wir, die Kinaseaktivitäten der relevanten Kinasen zu analysieren.

In Bezug auf den Aktivierungszustand der p38 Kinase- und der ERK1/2 Kinase liessen sich am Tag 2 in den verschiedenen Kulturansätzen kaum Unterschiede feststellen. Am Tag 3 mit der stärksten p23 Hochregulation waren p38 und ERK1/2 etwas mehr phosphoryliert in unbehandelten und anti-CD25mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen als in anti-CD4-behandelten Zellen. Schwache Unterschiede rühren aber von leichten Beladungsunterschieden her. Außerdem könnte man erwarten, dass bei der syngenen MLC ein ähnliches Kinaseaktivierungsmuster wie in der anti-CD4mAk-behandelten MLC zu beobachten sein sollte, da die p23 Regulation und Proliferation in beiden Fällen unterdrückt ist. Das ist aber nicht der Fall. Die syngene MLC, die weder eine aktivierte p38 Kinase oder ERK1/2 Kinase aufweist, verhält sich damit anders als die anti-CD4mAk-behandelte allogene MLC. Allerdings könnte bei der syngenen MLC jedoch das fehlende TCR-Signal die Ursache sein. Wie schon diskutiert, verursacht der anti-CD4mAk anscheinend keine vollständige Blockade der T-Zell-Oberflächenmoleküle, sondern wirkt eher modifizierend auf die Signalgebung ein. So kann eine partielle Aktivierung von Kinasen (z.B. ERK) nach TCR-MHC-Wechselwirkung durchaus noch erfolgen. Im syngenen Ansatz der MLC treffen Zellen des selben Rattenstammes aufeinander, die bei fehlendem Fremd-Ag Kontakt dementsprechend auch keine T-Zellaktivierung starten und keine ERK-Aktivität aufweisen müssen. Die untersuchten Phosphorylierungszustände der MAPK p38 und ERK lassen darauf schließen, dass deren induzierte Signalwege offenbar nicht im Zusammenhang mit der Hochregulierung von p23 stehen.

Interessanterweise gibt es aber eine gute Übereinstimmung der p23 Expression mit dem Aktivierungsmuster des IL-2-induzierten Signalweges, der die Kinasen PI3, PDK, PKB, mTOR und p70S6 einschließt. Diese Daten entsprechen der Beobachtung, dass die p23 Hochregulation von der mTOR-Aktivität abhängig ist, was durch die p23-hemmende Rapamycin-Behandlung schon erwartet wurde. Diese Signalkaskade führt letztendlich auch zur Proliferation, die das Zellwachstum (Zellgröße) und die Zellteilung beinhaltet. Zellwachstum ist durch eine erhöhte Produktion von Proteinen des Translationsapparates gekennzeichnet, der notwendig ist, um mit dem steigenden Bedarf an Proteinsynthese fertig [Seite 89↓]zu werden (194). Erst wenn die Zelle eine bestimmte Mindestgröße erreicht hat, kann sie in den Zellzyklus treten und ihre zellulären Resourcen an die Tochterzelle weitergeben, um deren Überleben zu sichern. Die Synthese vieler Translations-assoziierter Proteine (5´‑TOPmRNA´s) wird wachstumsabhängig auf der Translationsebene durch den oben genannten IL-2-induzierten p70S6 Kinase-Signalweg reguliert (195). 5´-TOPmRNA´s kodieren Gene für Proteine, die entweder für den Zellzyklusverlauf notwendig sind oder ein Teil des Translationsapparates sind. Rapamycin inhibiert die Translation dieser Proteine, die für den Übergang der Zellzyklusphase G1 in die S-Phase erforderlich sind und führt somit zu einem Arrest in der G1-Phase (196). Man könnte vermuten, dass p23 Zellzyklus-abhängig in seiner Expression kontrolliert wird, um eventuell die schon nachgewiesenen Assoziationen von Hsp´s mit verschiedenen Komponenten des Zellzyklus-Kontrollsystems zu stabilisieren. Zu diesen Komponenten gehören Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (CDK´s) und Cyclin-abhängige Kinasen-Inhibitoren (CKI´s) (150, 197, 198). Unter normalen Wachstumsbedingungen wurde schon im Hefemodell das p23 Homolog Wos2 als ein Regulator von Schlüsselproteinen des Zellzyklus identifiziert (199).

Da p23 in unserem T-Zellaktivierungsmodell proliferationsabhängig hochreguliert wird, stellt sich die umgekehrte Frage, ob die Proliferation allogen-aktivierter T-Zellen auch p23 Expression-abhängig ist oder ob es womöglich auch für andere Prozesse der T-Zellaktivierung notwendig ist. 1998 wurde Hsp90 als ein wichtiger Faktor in der CD28-vermittelten T-Zellaktivierung identifiziert. Als Beweis diente das antiproliferative Antibiotika Geldanamycin, das neben der Proliferation die IL-2 Sekretion und die IL-2 Rezeptor Expression inhibiert (142). Geldanamycin ist für die Dissoziation des Hsp90´s von ihren Klienten verantwortlich. Dazu gehören Kinasen, die in der T-Zellaktivierung involviert sind, verantwortlich. Es reduziert die Menge und Phosphorylierung von z.B. Lck, Raf-1 und Mek, verhindert die Aktivierung der ERK Kinase und unterbricht die TCR-vermittelte Aktivierung des nukleären Faktor´s aktivierter T-Zellen (NF-AT) (143, 144). Das alles führt zu einer beeinträchtigten T-Zellantwort, da keine adäquate Reaktion mehr auf den TCR-Stimulus stattfinden kann. Interessanterweise wurde zwar eine indirekte Assoziation von p23 über Hsp90 mit anderen Kinasen beschrieben (133, 134, 200), aber bisher gibt es keine Daten in diesem Zusammenhang mit Lck, Raf-1 und Mek (Abb.33).

	Abb.33: Hsp90-Kinasen-Komplexe während der T-Zellaktivierung
	Grau dargestellt sind die Hitzeschockproteine Hsp90, die nach Stabilisierung durch das Kochaperon p23 (blau markiert) einen Komplex mit Kinasen der T-Zellaktivierung eingehen und diese somit in eine funktionelle Konformation bringen. Rot wird die Inhibierung der Hsp90﷓Kinase-Komplexe durch den Hemmstoff Geldanamycin demonstriert.

Darum wollten wir untersuchen, inwieweit sich eine Inhibierung der p23 Expression auf die Aktivierung von T-Zellen auswirkt. Dafür war der Einsatz von p23-Antisense-Oligonukleotiden geplant. Die Versuche mit kommerziell bestellten Antisense-Oligonukleotiden in der allogenen MLC verliefen jedoch erfolglos, was in der unbeeinflussten Regulation der p23 Proteinmenge in einer Proteinanalyse (Westernblot) sichtbar wurde. Die Methode an sich ist in unserem Institut für das Protein Bag-1 etabliert gewesen und hat bisher gut funktioniert (107). Allerdings ist unklar, ob das Problem womöglich im Design der entworfenen p23- Oligonukleotide lag oder aber in der Halbwertszeit von p23.

Da die Oligonukleotide nur eine Länge von 14-25 Basen aufweisen (Optimum), wurde als nächstes versucht, mit der Überexpression einer Antisense-mRNA gerichtet gegen den kompletten ORF die p23-Expression zu verhindern. Mit Hilfe transgener Zellen sollte die Antisense- bzw. Sense-p23 mRNA stabil exprimiert und in der Gemischten Lymphozytenkultur eingesetzt werden, um herauszufinden, ob die Expressionsregulation von p23 funktionelle Konsequenzen für die T-Zellaktivierung hat. Die retrovirale Transduktion des p23 ORF´s sollte zu einer stabilen Expression der Antisense/Sense-p23mRNA führen, damit diese mit anhaltendem Effekt auf neuproduziertes p23 auch längere Halbwertszeiten des p23 Proteins überbrücken könnte. Unter dem Einfluss inhibierter p23 Expression würden wir eine Hemmung der T-Zellaktivierbarkeit erwarten, die indirekt durch die verhinderte [Seite 91↓]Proliferation hervorgerufen würde. Andererseits vermuteten wir, dass die Überexpression von p23 zu einer stärkeren Aktivierbarkeit der T-Zelle bzw. zu einer unkontrollierten Proliferation von T-Zellen führen könnte. In Bezug auf Hsp90 existieren z.B. Berichte über dessen Antisense-Inhibierung, die zu einer Reduzierung der Zellteilungsrate der humanen Tumorzellinie U937 führt bzw. über dessen Überexpression, unter der die Zellen verstärkt in die S-Phase des Zellzyklus übergetreten sind (201). Auch in einem anderen Zusammenhang mit Tumorzellen wurde eine verstärkte Expression von sowohl Hsp90 als auch p23 nachgewiesen (125).

Der von uns verwendete retrovirale Vektor (s.Abb.20) enthält neben dem p23-ORF (Sense/Antisense), unter Kontrolle des retroviralen 5´LTR-Promotors, eine GFP-Reporterkassette, die über eine IRES gekoppelt ist. Da GFP nach seiner Translation nicht sezerniert wird, sondern im Zytosol verbleibt, spiegelt sich angesammeltes GFP in einer stärkeren Emission wider, die man als Fluoreszenzintensität im FACS quantifizieren kann. Auch die einfache Handhabbarkeit des Reportergens ist von Vorteil, da weder chemische noch enzymatische Modifikationen notwendig sind, um das fluoreszierende Protein sichtbar zu machen. Da GFP nicht als Fusionsprotein , sondern über eine IRES bicistronisch gekoppelt ist, sollte die Funktion des p23 Proteins des Sense-Konstruktes unbeeinflusst bleiben. Zusätzlich wird die mRNA des Antisense-Konstruktes stabilisiert und nicht vorzeitig abgebaut, da zelluläre Kontrollmechanismen einen „sinnvollen“ ORF durch die abgelesene Sequenz des GFP´s vorfinden.

In der FACS-Analyse unserer stabilen p23-Antisense⁺/Sense⁺-Klone wurde nur eine Verdopplung bzw. Verdreifachung der Intensitätsverstärkung des mittleren Fluoreszenz-Signals (GFP) detektiert.Schwache GFP-Signale sind allerdings nicht außergewöhnlich, da schon oft berichtet wurde, dass GFP hinter einer IRES geschaltet nur schwach exprimiert und dementsprechend auch nur schwach leuchtend detektiert werden kann. Der Unterschied zwischen dem p23 Antisense⁺-Klon A und B hinsichtlich ihrer GFP- und p23- Expression ließe sich mit einer ungleichen Kopienzahl an integrierten Plasmiden erklären. Im Fall Klon A würde das bedeuten, dass eine sehr geringe Kopienzahl zwar die Resistenz gegenüber dem Selektionsmarker G-418 gewährt, aber nicht für eine ausreichende Transkription der Transgene p23 und GFP sorgt. Offenbar trägt der p23 Antisense⁺-Klon B genügend Plasmide in einer Zelle, um sogar eine Reduzierung der starken basalen p23 Produktion zu bewirken.

In einer Protein-Analyse der p23-Expression in den transgenen Zellen wurde deutlich, dass p23 schon in der Kontrolle, den nicht-transfizierten Zellen der Verpackungszellinie GP+E, [Seite 92↓]sehr stark exprimiert wird. Ein p23 Antisense⁺-Klon zeigte zwar im Gegensatz zur Kontrolle keine vollständige Inhibierung, aber eine deutliche Reduzierung in der p23 Expression. Die p23 Sense⁺-Klone dagegen zeigten im Vergleich zu der untransfizierten Verpackungszellinie kaum sichtbare Unterschiede in der p23-Expression. Dass die nicht-transfizierte Verpackungszellinie p23 schon sehr stark exprimiert ist nicht sonderlich verwunderlich, da Zellinien permanent proliferieren. Auch andere Arbeitsgruppen berichteten von einem sehr hohen endogenen Expressionsniveau von p23, das somit bestimmte in vivo Studien erschwert (123).

Auch wenn die p23 Sense⁺-Klone dieser artifiziellen Zellinie nicht offensichtlich p23 Protein überexprimieren können, ist keine generelle Aussage über die Fähigkeit der stabilen Klone, die p23 Expression doch zu beeinflussen, möglich. Der von den Klonen produzierte Virus wäre vielleicht effektiv genug, um in unseren allogenen T-Zellen trotzdem einen Einfluss auszuüben, denn die zu untersuchenden allo-aktivierten T-Zell-Blasten sind vor der Restimulation gestarvt worden (siehe 7.1.2. und Abb.7) und hatten bewiesenermaßen ihre p23 Expression wieder reduziert. Für die Aufklärung dieser Fragestellung sind weiterführende Untersuchungen angestrebt.

Im Zusammenhang mit den schwachen Unterschieden in der p23-Proteinexpression auf dem Westernblot ist zu beachten, dass es innerhalb des ORF-Bereiches zwischen unserer klonierten Rattensequenz und der Maussequenz (GP+E = Maus-Fibroblastenzellinie) Differenzen von 9 Basenpaaren gab. Es muss in Betracht gezogen werden, dass dieser Sequenzunterschied von 1,8 % ausreicht, um die relativ geringe p23-inhibitorische Wirkung der p23 Antisense⁺-Klone zu verursachen.

Es sind für die Zukunft fortführende Arbeiten in der Funktionsanalyse beabsichtigt, wobei zur Optimierung zusätzlich die Klonierung der p23 Maussequenz des ORF-Bereiches in den retroviralen Vektor geplant ist. Falls die Verwendung des retroviralen Antisense-Konstruktes keine Reduktion der p23 Translation bewirkt, gibt es inzwischen die Alternative der Verwendung von siRNAs/dsRNAs (short interfering RNAs/ double stranded RNA). Hierbei wird das System prozessierter oder synthetisierter dsRNA von ca. 20-30 Nukleotiden (siRNA´s) genutzt, die mit verschiedenen Proteinen und Faktoren einen Komplex bilden, der die sequenzspezifische Degradierung der Zieltranskripte vermittelt (202). Außerdem sollen mit den am besten p23-inhibierten Klonen (z.B. p23 Antisense⁺-Klon B) funktionelle Studien durchgeführt werden. Dies soll helfen, die Bedeutung von p23 für die Aktivierung und Proliferation von T-Tellen aufzuklären. Falls die p23 Expression essentiell für die [Seite 93↓]Aktivierung von T-Zellen ist, wäre es als Zielprotein für eine immunmodulatorische Therapie denkbar.

Die Ergebnisse ergaben, dass der von uns verwendete Antikörper gegen das T-Zell-Oberflächenmolekül CD4 die Proliferation und sowohl die IL-2 Transkription als auch Translation allo-aktivierter T-Zellen verhindert. Diese Beobachtungen stimmen mit den bisher beschriebenen Ergebnissen überein (103, 203). Überraschenderweise bewirkte jedoch in unserer Studie die anti-CD4mAk-Behandlung keine Hemmung der IFNγ-Transkription allo-aktivierter T-Zellen, was im Gegensatz zu den veröffentlichten Daten steht, die von einer kompletten Hemmung der IFNγ Produktion berichten (103, 203, 204). In diesen Studien wurde jedoch nicht zwischen Transkription und Translation unterschieden. Außerdem können diese gegensätzlichen Ergebnisse auch auf unterschiedliche Wirkmechanismen der verwendeten anti-CD4 Ak´s beruhen. Es gibt neben den depletierenden anti-CD4 Antikörpern auch solche, die ausschließlich modulierend, also signalverändernd, auf die CD4+-positiven T-Zellen einwirken. Zusätzlich unterscheiden sich anti-CD4 Antikörper in ihrer heterogenen Fähigkeit, den reaktionslosen Zustand einer T-Zelle zu induzieren (76). Der von uns verwendete nicht-depletierende anti-CD4mAk RIB5/2 induziert sehr effektiv Toleranz gegenüber Alloantigenen.

Es existieren Erkenntnisse über die Bedeutung von IL-2 für die IFNγ Produktion von allo-aktivierten T-Zellen und NK-Zellen (18, 20). Wir konnten diese bestätigen, indem wir mit dem Zusatz von rekombinantem IL-2 zu anti-CD4mAk-behandelten T-Zellen die fehlende IFNγ Produktion wiederherstellen konnten. Auch die Verhinderung der IL-2 Bindung an seinen hochaffinen IL-2 Rezeptor durch den neutralisierenden anti-CD25 Antikörper führte zum Block der IFNγ Translation ohne Beeinflussung der Transkription. Zusätzlich wollten wir austesten, ob auch andere Zytokine, deren Rezeptor die gleiche gamma-Kette enthält, ebenso in der Lage sind, die IFNγ Produktion wiederherzustellen. Unsere Beobachtung, dass rekombinantes IL-15 im Gegensatz zu rekombinantem IL-2 unfähig war, den IFNγ Translationsblock zu revertieren und die Inhibierung des IL-15 Rezeptors keine Auswirkung auf die IFNγ Translation zeigte, schob die Bedeutung von IL-2 stärker in den Mittelpunkt. Es muss erwähnt werden, dass kürzlich die Arbeitsgruppe Liew herausfand, dass IL-15 zwar Proliferation induziert, aber keine Zytokinproduktion in Abwesenheit einer TCR-Aktivierung [Seite 94↓]antreiben kann (205).

Die Signalwege, die nach einer IL-2 Stimulation von T-Zellen und NK-Zellen aktiviert werden, schließen die MAPK p38 und ERK1/2 ein (18, 20, 40). Auch das Zytokin IL-12 kann IFNγ in T-Zellen und NK-Zellen induzieren und aktiviert dabei eine Signalkaskade über die p38 MAP Kinase (206). So ist beschrieben worden, dass der p38-Inhibitor SB203580 die IFNγ Sekretion aktivierter T-Zellen hemmt (durch IL-12/IL-18 induziert), was mit einer Reduzierung in der IFNγ Transkription einherging (40). Die MAPK Signalwege über die p38 und ERK1/2 aktivieren durch Phosphorylierung den Initiationsfaktor eIF4E und führen damit zur Verstärkung der Translationsinitierung bei (207, 208). Auch wenn die Translationskontrolle auf 3 Ebenen stattfindet (Initiation, Elongation, Termination), spielt die Kontrolle der Initiation eine besondere Rolle. Hierbei wird die mRNA zum Ribosom rekrutiert und am Initiationskodon positioniert. Die Initiationsphase der Translation spielt auch während der T-Zellaktivierung eine wesentliche Rolle, um die Proteinsynthese anzuschieben (209). Dennoch konnten wir keine Reduzierung in der Aktivität der MAPK p38 und ERK1/2 in den anti-CD4mAk-behandelten Kulturansätzen detektieren, obwohl die spezifischen MAPK Inhibitoren in allo-aktivierten T-Zellen einen IFNγ Translationsblock hervorriefen.

Ein weiterer Signalweg, der durch IL-2 induziert wird, involviert die PI3 Kinase. Wir konnten mit dem spezifischen Inhibitor LY294002 den direkten Einfluss von PI3K auf die IFNγ Translation zeigen. Die PI3K reguliert elementare zelluläre Prozesse, wie die der Proliferation, der Induktion des Zelltodes, Zellaktivität und Adhäsion (210). Sasaki et al konnten zeigen, dass PI3K-defekte T-Zellen in vitro eine gestörte Zytokinproduktion aufweisen und in vivo hinsichtlich ihrer Immunantwort beeinträchtigt sind. Dabei werden unter anderem verschiedene Kinasen aktiviert, so auch die PKB, p70S6 Kinase und ERK1/2 (211). Die PKB wiederum phosphoryliert und aktiviert mTOR (212, 213), welche für die Translationskontrolle verantwortlich ist, was durch zahlreiche Versuche mit dem spezifischen TOR-Inhibitor Rapamycin bewiesen wurde (214-217). Für die IFNγ Translation in unseren allo-aktivierten T-Zellen spielt die mTOR Kinase offenbar keine Rolle, da Rapamycin keine hemmenden Effekte auf die IFNγ Translation ausübte. Andererseits wurde kürzlich davon berichtet, dass unter Rapamycinbehandlung zwar ein Zellzyklus-Arrest erfolgte, aber nur relativ geringfügig die Proteinsynthese (ca.15%-20%) gehemmt war (218). Zusätzlich zeigten unsere Daten eine verringerte Kinaseaktivität der p70S6 Kinase, die durch die Zugabe von IL-2 oder IL-15 revertiert werden konnte. Da aber in den anti-CD4mAk-behandelten T-Zellen [Seite 95↓]die inhibierte IFNγ Produktion durch IL-15 Gabe nicht aufgehoben wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die reduzierte p70S6 Kinaseaktivität als Ursache für den Translationsblock eine Rolle spielt.

Ein weiterer Kandidat für die Translationskontrolle von IFNγ ist der Translations-Initiationsfaktor eIF2α. Die Phosphorylierung der α-Untereinheit des eIF2 führt zu dessen Deaktivierung und ist der Schlüsselmechanismus einer umfassenden Inhibierung der Translationsinitiation. Ausgeführt wird die Deaktivierung durch eIF2a Kinasen, zu denen 4 Gruppen gehören, die gewebsspezifisch exprimiert und induziert werden. Eine bekannte eIF2a Kinase ist die PKR, eine IFNγ-induzierbare Proteinkinase, die neben der Translationskontrolle auch in der Transkriptionsregulation und beim mRNA-Splicing eine Rolle spielt. Sie ist für Prozesse der Signaltransduktion, Apoptosis, Differenzierung und des Zellwachstums bedeutend (219-222). Die Aktivierung des Initiationsfaktors eIF2α wiederum erfolgt nach Dephosphorylierung durch die Phosphatasen 1 und 2A, welche nach Stimulierung von Zellen, z.B. durch Insulin aktiviert werden (223). Unsere Untersuchungen ergaben in allo-aktivierten T-Zellen eine Dephosphorylierung von eIF2α. Unter anti-CD4mAk-Behandlung mit RIB5/2 wird die Dephosphorylierung verhindert und kann nach Zugabe von IL-2 wieder induziert werden, im Gegensatz zu IL-15, das nicht diese Wirkung aufweist. Die Übereinstimmung der Phosphorylierungsmuster von eIF2α mit der IFNγ Produktion in den verschiedenen MLC-Modellen, macht ihn zu einem guten Kandidaten für eine Vermittlung der IFNγ -Kontrolle in unserem Experiment. Dazu gibt es Literaturhinweise, die diese These unterstützen. Es wurde gezeigt, dass IL-2 über die Phosphatase 1- und 2A- Aktivierung die β₂-Integrin-abhängige Adhäsion humaner T-Zellen vermittelt (224). Die Arbeitsgruppe um Ben-Asouli konnte weiterhin zeigen, dass phosphoryliertes und somit deaktiviertes eIF2α die Translation von IFNγ mRNA in humanen T-Zellen verhindert (225). Somit ist denkbar, dass der IL-2-induzierte Signalweg über die PI3 Kinase zu einer Aktivierung der Phosphatasen 1 und 2A führt und diese wiederum den Translations-Initiationsfaktor eIF2α dephosphorylieren und damit aktivieren. Für die Translation der TCR-induzierten IFNγ mRNA ist aktives eIF2α erforderlich. Eine Inhibierung der IL-2 Produktion würde damit die Dephosphorylierung und Aktivierung von eIF2α verhindern, welcher für die Translation der TCR-induzierten IFNγ mRNA notwendig ist.

IFNγ als wichtiges Zytokin während der adaptiven Immunantwort, kann in Überschuss nach Transplantation zu einer Gewebezerstörung und zum Verlust des Transplantates führen. Die [Seite 96↓]Fähigkeit der anti-CD4 Antikörper allo-spezifische Toleranz in vivo zu induzieren, könnte unter anderem auf dem Translationsblock der IFNγ mRNA beruhen, der auf einem Mangel an IL-2 zurückzuführen ist. Dies würde auch den Zusammenbruch der Toleranz (in vivo) nach Zugabe von exogenem IL-2 erklären.

Das Zelloberflächenmolekül CD4, das auf allen T-Helferzellen vorkommt, ist bei der Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC´s) wichtig für eine vollständige Aktivierung der T‑Zellen. Daher ist eine Möglichkeit zur Induktion einer Transplantattoleranz gegenüber einem allogenem Spenderorgan die Verhinderung einer vollständigen T-Zellaktivierung durch nicht-depletierende, blockierende anti-CD4 monoklonale Antikörper (mAK). Der in dieser Arbeit untersuchte anti-CD4mAk RIB5/2 kann im Rattentransplantationsmodell eine stabile Transplatattoleranz erzeugen.

Untersuchungen in einem in vitro Modell der allogenen T-Zellaktivierung (Gemischte Lymphozytenkultur = MLC) zeigten, dass es durch diesen anti-CD4mAk zu einer blockierten T-Zellaktivierung kommt. Ausdruck dieser defekten T-Zellaktivierung sind:

• eine verminderte T-Zell-Proliferation
• eine Reduzierung der Synthese der Th1-Effektorzytokine IL-2 und IFNγ

Th1-Zytokine fördern eine zelluläre Immunantwort, die zu einer Abstoßung des Spenderorgans führen kann. Interleukin IL-2 (IL‑2) ist ein wichtiger autokriner Wachstumsfaktor aktivierter T-Zellen, während Interferon γ (IFNγ) ein wichtiger Aktivator von APC´s ist. Im Gegensatz zu IL-2, das unter der anti-CD4mAk Behandlung schon auf Ebene der Transkription inhibiert wurde, erfolgte die Hemmung der IFNγ Produktion interessanterweise posttranskriptionell, da die Transkription bei verminderter Zytokinproduktion unbeeinflusst blieb.

Wird das fehlende IL-2 ersetzt, kann die defekte Proliferation als auch die posttranskriptionelle Blockade der IFNγ Produktion aufgehoben werden. Dies spiegelt sich ebenso in vivo wieder, da rekombinantes IL-2 auch hier den anti-CD4mAk-induzierten Toleranzstatus brechen kann. Es erschien daher, dass der Proliferations- und IFNγ-[Seite 97↓]inhibierende Effekt des anti-CD4mAk´s indirekt über eine Hemmung der TCR-induzierten IL-2 Produktion erzeugt wird. Die Vermutung wurde bekräftigt, indem Substanzen in der MLC verwendet wurden, die mit der IL-2 Wirkung interferieren. Naheliegend war die Hemmung der IL-2 Bindung an seinen hochaffinen IL-2 Rezeptor durch einen neutralisierenden anti-CD25mAk in der allogenen MLC. Aufgrund der Wirkung von rekombinanten IL-2 würde man hier eine Inhibierung der Proliferation und der IFNγ Translation erwarten. Erstaunlicherweise wirkte der anti-CD25 Antikörper jedoch nur blockierend auf die IFNγ Zytokinsynthese, während die Proliferation nicht beeinträchtigt wurde. Möglicherweise werden die proliferativen Effekte durch andere Zytokine hervorgerufen. Es gibt Zytokine, deren Rezeptoren die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors teilen und somit fehlende biologische Aktivitäten von IL-2 kompensieren könnten. Ein wichtiger Kandidat war IL-15, da es ebenso wie IL-2 ein starker T‑Zell-Wachstumsfaktor ist. Der Einsatz von rekombinantem IL-15 in einer anti-CD4mAk-behandelten allogenen MLC führte nicht, wie IL-2, zu einer Aufhebung der IFNγ Proteinhemmung, aber zur Revertierung der Proliferation. Daraus schlussfolgerten wir, dass IL-15 zwar die T-Zellproliferation beeinflussen kann, IL-2 jedoch neben der Proliferation noch die IFNγ Translation reguliert.

Die Regulation erfolgt über verschiedene Signalkaskaden, die über den IL-2 Rezeptor angeschaltet werden. Wir wollten herausfinden, welche Signaltransduktionswege zu den einzelnen Effekten der Proliferation und der IFNγ Translation führen und welche dieser Wege durch die anti-CD4mAk Behandlung beeinflusst werden. IL-2 induziert über seinen Rezeptor drei wichtige Signalkaskaden über die MAP Kinasen p38, ERK und TOR, die für die Kontrolle der Transkription, Translation und Proliferation eine große Rolle spielen. Zusätzlich wurde in diese Analyse das Kochaperon p23 einbezogen, welches in vorherigen Untersuchungen als differentiell exprimiertes Gen zwischen allogener und anti-CD4mAk-behandelter MLC identifiziert wurde. Da dieses p23 als Kofaktor von Hsp90 die Stabilität und Verfügbarkeit einiger dieser Kinasen regulieren könnte, war es wichtig zu wissen, mit welchem zellulären Effekt und welcher Kinaseaktivität die Regulation der Expression von p23 korreliert. In der folgenden Tabelle sind die Nachweise der zellulären Effekte, der Kinaseaktivitäten der Signalwege und die Hemmversuche der einzelnen MLC Kulturansätze zusammenfassend dargestellt:

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Tabelle 3: Zusammenfassende Darstellung der zellulären Effekte (IFNγ Translation, Proliferation, p23 Expression), der Kinaseaktivitäten drei wichtiger Signaltransduktionswege und der Hemmversuche in verschiedenen MLC-Ansätzen. (Blau=Hemmung der Kinase p38 durch den Inhibitor SB, Braun=Hemmung der Kinase ERK durch den Inhibitor PD, Grün=Hemmung der Kinase TOR durch den Inhibitor Rapamycin)

Aus der Tabelle wird ersichtlich., dass die p23 Expression nicht induziert wird, wenn eine Inhibierung der T-Zellproliferation vorliegt. Da unterschiedliche Modelle der T-Zellstimulation eine Korrelation zwischen Proliferation und p23 Regulation demonstrieren und zusätzlich Proliferationshemmer in der allogenen MLC die Hochregulation der p23 Expression inhibieren, schlussfolgern wir, dass p23 proliferationsabhängig aktiviert wird. Die Tabelle zeigt auch deutlich, dass die MAPK-Signalwege (p38 und ERK) zum Zeitpunkt der IL-2 Wirkung nicht für die Kontrolle der Proliferation (und damit der p23 Expressionsregulation) verantwortlich sind, da ihre Hemmung die Proliferation nicht beeinflusst und die Aktivität der Kinasen zu diesem Zeitpunkt nur schwach inhibiert ist. Dagegen zeigen die Experimente deutlich, dass der IL-2-induzierte TOR-Signalweg für die Proliferationskontrolle (und damit der p23 Expressionsregulation) essentiell ist, da sowohl die Hemmung von TOR durch Rapamycin die Proliferation verhindert als auch die komplett unterdrückte Aktivität der Kinasen im TOR-Signalweg in den zellulären Modellen mit inhibierter Proliferation diese These unterstützen.

Es kann auch ausgeschlossen werden, dass der TOR-Signalweg für die Regulation der IFNγ Produktion verantwortlich ist, da die Hemmung über Rapamycin zwar die Proliferation beeinflusst, aber nicht die IFNγ Produktion. Die Blockade der IFNγ Produktion scheint auch nicht über die MAP Kinase-Signalwege (p38 und ERK) zu erfolgen, da die beobachtete Hemmung der Kinaseaktivitäten unter anti‑CD4mAk Behandlung vergleichsweise mild [Seite 99↓]ausfällt, auch wenn eine Inhibierung der Kinasen zu einer Inhibierung der IFNγ Produktion führt. Weitere Untersuchungen sind hier nötig, um den Einfluss dieser Kinasen auf die IFNγ Produktion zu klären. Dafür hat diese Arbeit aber einen zusätzlichen Kandidaten für die Kontrolle dieses interessanten zellulären Effekt identifiziert. Es handelt sich hierbei um einen Translations-Initiationsfaktor eIF2α, der ebenfalls durch IL-2 induziert wird und für die Translationskontrolle eine entscheidende Rolle spielt.

Obwohl wir für die Regulation der p23 Expression in allogen-aktivierten T-Zellen die verantwortliche Signaltransduktionskaskade ermittelt haben, konnte die genaue Funktion und Bedeutung von p23 für die T-Zellaktivierung leider nicht weiter geklärt werden. Dagegen konnten wir einen Kandidaten der IFNγ Translationskontrolle ermitteln. Da IFNγ wesentlich die proinflammatorische Immunantwort beeinflusst und somit im Fall der Transplantation Gewebszerstörung und Organverlust hervorrufen kann, ist die weitere Aufklärung der Regulationsmechanismen von IFNγ für ein besseres Verständnis des Abstoßungsprozesses von großer Bedeutung.