Material Chemikalien

Acrylamid/Bisacrylamid Lösung 30 und 40%

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Agar

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Agarose

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Ammoniumpersulfat (APS)

Merck, Darmstadt

Ampicillin

Merck, Darmstadt

Aqua ad injectabilia (ddH₂O)

Delta Pharma, Pfüllingen

Baktotrypton

DIFCO, Detroit, USA

Bromphenolblau

Serva, Heidelberg

Chloroform

Merck, Darmstadt

Calf Intestinal Phosphatase (CIP)

Promega GmbH, Mannheim

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Serva, Heidelberg

Dithiotreitol (DTT)

Sigma, Steinheim

Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM)

Seromed, Berlin

Ethanol

Baker Analyzed, Deventer, N

Ethidiumbromid

Stratagene, Heidelberg

Ethylendiamin-tetraessigsäure-Na-Salz (EDTA)

Sigma, Saint Louis, USA

Ethylenglycol-bis-aminoethyl Ether (EGTA)

Sigma, Saint Louis, USA

Fetales Kälberserum (FKS)

Seromed, Berlin

Geneticin (G-418 Sulfat)

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

L-Glutamin

Sigma, Steinheim

Glycerol

Serva, Heidelberg

Glycin

Merck, Darmstadt

Hefeextrakt

Merck, Darmstadt

Hepes-Puffersubstanz

Sigma, Steinheim

Isopropanol

Baker Analyzed, Deventer, N

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Kaliumchlorid

Merck, Darmstadt

Kalziumchlorid

Merck, Darmstadt

Lipofectamin

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Methanol

Baker Analyzed, Deventer

Microcystin-LR

Sigma, Steinheim

β-Mercaptoethanol

Merck, Darmstadt

3-Morpholinopropansulfonsäure

Merck, Darmstadt

N,N,N´,N´-Tetramethylendiamin (TEMED)

Serva, Heidelberg

Natriumacetat-Trihydrat

Merck, Darmstadt

Natriumazid

Sigma, Steinheim

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

Natriumcitrat

Merck, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Serva, Heidelberg

Natriumfluorid

Sigma, Steinheim

2-Natriumhydrogenphosphat-2-hydrat

Merck, Darmstadt

Natriumorthovanadat

Sigma, Steinheim

Natriumpyrophosphat

Sigma, Steinheim

Natriumpyruvat

Seromed, Berlin

Natrium-ß-glycerophosphat

Sigma, Steinheim

Natronlauge

Merck, Darmstadt

Paraformaldehyd

Sigma, Steinheim

Penicillin-Streptomycin

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Ponceau S

Sigma, Steinheim

RPMI 1640 Medium

Seromed, Berlin

Saccharose

Merck, Darmstadt,

Salzsäure (HCl)

Merck, Darmstadt

Skim Milk Powder

Becton Dickenson, San Jose, USA

Small Fragment Agarose

Appligene Oncor

Tris-aminomethan

Merck, Darmstadt

Triton X-100

Serva, Heidelberg

Trypan Blue

Sigma, Steinheim

Trypsin-EDTA

Life Technologies, Karlsruhe

Tween 20

Serva, Heidelberg

X-Gal

Roth, Karlsruhe

Biochemikalien und Kits

AmpliTaq DNA-Polymerase, Puffer, MgCl₂

Applied Biosystems, PE, Rodgau-Jügesheim

Bovines Serum Albumin (BSA)

Sigma, Steinheim

Coomassie Protein Assay Reagent-Kit

PIERCE, Rockford,Il., USA

ConcanvalinA (ConA)

Sigma, München

DNA-Marker 1kb

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

DNA-T4-Ligase

Pharmacia Biotech, Uppsala, S

ECL-Kit^TM

Amersham Buchler, Braunschweig

Gel-Extraktions-Kit Jetsorb

GENOMED, Bad Oeynhausen

Geneticin (G-418 Sulfat)

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

MMLV-Reverse Transkriptase, First strand buffer, DTT

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

dNTP´s

Pharmacia Biotech, Uppsala, S

Oligonukleotide

metabion, Martinsried

p123T-Vektor Cloning Kit

Mo Bi Tec, Göttingen

Pancoll

Pan Biotech, Aidenbach

Plasmid-Präparations-Kit Jet Star

Genomed, Bad Oeynhausen

Precision Protein Marker (broad range)

BIO-RAD, Hercules, CA, USA

Proteasen Inhibitoren Cocktail

Roche, Mannheim

Qiagen Plasmid Kit 2.0 Maxi

Qiagen, Hilden

Ratten IFNγ ELISA

Biosource, Solingen

Ratten IL-2 ELISA

Biosource,Solingen

Re-Blot Plus Stripping solution

Chemicon, Temecula, USA

Rekombinantes humanes Interleukin-2

Cetus Corporation,Emeryville, CA,USA

Rekombinantes murines Interleukin-15

PeproTech, London, UK

Restriktionsendonukleasen, Puffer

Pharmacia Biotech, Uppsala, S

RNA 6000 Reagents & Supplies

Agilent Technologies, Waldbronn

RNA-Marker 0,24-9,5 kb ladder

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

RNAse A

Boehringer, Mannheim

RNAsin

Promega, Madison, USA

Strata Prep Total RNA Mini Kit

Statagene, La Jolla, CA, USA

SYBR-PCR Core Reagents+ Mastermix

Applied Biosystems PE, Rodgau-Jügesheim

TA-Kloning-Kit

Invitrogen, Leek, N

Taq-Polymerase, Puffer, MgCl₂

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Radiochemikalien

[³H]-Thymidin

Amersham Buchler, Braunschweig

Verbrauchsmaterial

3MM-Whatman-Papier

Schleicher & Schöell, Dassel, D

Eppendorfgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml)

Eppendorf, Hamburg, D

Filterpapier,Rotrand

Schleicher & Schöell, Dassel, D

Gewebekulturröhrchen

Greiner, Nürtingen, D

Nylon-Membran Hybond N

Amersham Buchler, Braunschweig, D

Gewebekulturröhrchen (15 ml, 50 ml)

Falcon, Oxnard, USA

Röntgenfilm Hybond MP

Amersham Buchler, Braunschweig, D

Röntgenfilmentwickler, -fixierer

Kodak, Chalon, F

Einwegpipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml)

Greiner, Nürtingen

Einmal-Injektions-Kanülen (Gr.16)

B.Braun Melsungen AG, Melsungen

96, 24, 6 well Flachbodenplatten

Nunc, Roskilde, Dänemark

96-well Rundbodenplatten

Nunc, Roskilde, Dänemark

Einfrierröhrchen

Nunc, Roskilde, Dänemark

Kulturflaschen (50ml)

Falcon, Oxnard, USA

Zellsiebe, 40 und 100µm Porengrösse

Falcon, Oxnard, USA

Pasteurpipetten

Roth, Karlsruhe

Geräte

Agilent 2100 Bioanalyser

Agilent Technologies, Waldbronn

Autoklav

Gössner, Hamburg

Autoradiographiekassette

Amersham Buchler, Braunschweig

Bestrahlungsanlage Gamma Cell 40

Atomic Energy, Mississauga, Canada

ELISA-reader Anthos 2001

Anthos Mikrosysteme GmbH, Köln

Elektrophoresekammer

Renner GmbH, Dannstadt

Durchflußzytometer FACSort

Becton Dicinson, San Jose, USA

Feinpipetten Research

Eppendorf, Hamburg

Gel Imager & E.A.S.Y.Enhanced Analyses System

Herolab, Wiesloch

Gelkammer

Renner GMB,Dannstadt

Heizblock

Kleinfeld Labortechnik, Berlin

Lasermikroskop

Zeiss, Jena

Lichtmikroskop

Leica, Braunschweig

Microwellengerät

Bosch, Stuttgart

Minigel für SDS-PAGE

Biometra, Göttingen

pH-Meter

wiss.-techn. Werkstätte, Weilheim

RNA/DNA-Kalkulator Gene Quant II

Pharmacia, Uppsala, S

Schüttelinkubator Thermostat 5320

Eppendorf, Hamburg

Schüttler, Vortex MS2 Minishaker

IKA-Werke GmbH & Co KG, Staufen

Semidry-Blotter (Fastblot)

Biometra, Göttingen

Stromversorgungsgerät Consort 835

AGS, Heidelberg

System für Zell-Harvesting und Filtermessung

INOTECH AG, Doltikon, Schweiz

Thermocycler 9600

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Thermocycler 9700

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Vakuum Blotter Biometra

biomed. Analytik, Göttingen

Waagen

Sartorius, Göttingen

Wasserbad

GFL, Burgwedel

Zentrifugen:

Biofuge Fresco

Heraeus, Berlin

CentriconT-324

Kontron, Neufahrn

Centrifuge 5410 eppendorf

Eppendorf,Hamburg

Megafuge 1.0

Heraeus, Osterode

Vakuum-Zentrifuge Concentrator 5301

Eppendorf, Hamburg

Verwendete Oligonukleotide

NAME

SEQUENZ

QUELLE

a) Primer für die cDNA Synthese:

Oligo-dT

keine Angabe

Pharmacia

b) Primer zum Sequenzieren:

M13 universal

5´-GTTTTCCCAGTCACGAC-3´

MediGenomix

M13 reverse

5´-GGATAACAATTTCACACAGGA-3´

MediGenomix

pLXSN-Primer

5´- CTT TAT CCA GCC CTC A – 3´

IRES- Primer

5´- TAT TCC AAG CGG CTT CGGG CC – 3´

c) Oligonukleotide für die „Real-Time“ TaqMan PCR:

rat p23 universal

5´- AGC ATA AAA GAA CGG ACA GAT CGA – 3´

rat p23 reverse

5´- CCT TTG TTA ACC TAG GCC AGG ATT – 3´

human p23 universal

5´- TTT ACG AAA AGG AGA ATC TGG CC – 3´

human p23 reverse

5´- TCT TCC CAG TCT TTC CAA TTA TTG AA – 3´

rat IL-2 universal

5‘-ctc ccc atg atg ctc acg tt-3‘

rat IL-2 reverse

5‘-tca ttt tcc agg cac tga aga tg-3‘

rat IL-2 Sonde

5‘-caa ttc tgt ggc ctg cttggg caa-3‘

rat IFNγ universal

5‘- aac agt aaa gca aaa aag gat gca tt - 3‘

rat IFNγ reverse

5‘- ttc att gac agc ttt gtg ctg g - 3‘

rat IFNγ Sonde

5‘-cgc caa gtt cga ggt gaa caa ccc-3‘

rat CD3 universal

5‘-caa aga aac taa cat gga gca ggg-3‘

rat CD3 reverse

5‘-ctt ttt gct ggg cca tgg t-3‘

rat CD3 Sonde

5‘-agg ttt ggc tgg cct ctt cct ggt g-3‘

d) Primer für p23 Antisense-Klonierung:

p23 (Eco) sense

5´- CCG GAA TTC CTG GCC CTC TGC CCC – 3´

p23 (Eco) antisense

5´- CCG GAA TTC GAT ACC ACT CTT TAC – 3´

p23-5´-universal

5´- AGA GGA GTC GAC TCG CCA G –3´

p23-5´-reverse

5´- TTC TCA AGC AAC AAT GTA CAG C – 3´

Vektoren

pLXSN-IRES-GFP

Amp R , Neo R , pBR322ori, Ψ + ,P SV40 , 5´/3´-LTR-Promoter

Dr.A. Flügel, MPI, München

p123T

Ap R , lacI, lacZ α , M13ori, ColE1ori, T3/T7-Promoter

Mo Bi Tec

Antikörper

anti-Aktin-IgG

Santa Cruz, Santa Cruz, USA

anti-eIF4E

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-human-CD28

Becton Dickinson, San Jose, USA

anti-human-CD3 (OKT3)

Janssen-Cilag, Neuss

anti-Kaninchen-IgG-HRP

Santa Cruz, Santa Cruz, USA

anti-Maus-IgG-HRP

Santa Cruz, Santa Cruz, USA

anti-p23-IgG

Alexis Deutschland GmbH, Grünberg

anti-phospho-4EBP1

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-Akt

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-ERK, anti-ERK

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-GSK3

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-Mnk1

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-p38, anti-p38

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-p70S6

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-phospho-S6

Cell Signaling, Beverly, USA

anti-Ratten-CD25

Serotec GmbH, Düsseldorf

anti-Ratten-CD28

Pharmingen, San Diego, CA, USA

anti-Ratten-CD3

Pharmingen, San Diego, CA, USA

anti-Ratten-CD4 (RIB5/2)

Dr. Lehmann, Rostock

Inhibitoren

2-Aminopurin (PKR-Inhibitor)

Sigma, Deisenhofen

Aphidicolin (Zellzyklus-Inhibitor)

AG Radbruch, DRFZ Berlin

Bisindolylmaleimide-1(PKC-Inhibitor)

Calbiochem, Darmstadt

Cyclosporin A (Sandimmun)

Sandoz AG, Nürnberg

L-Mimosine (Zellzyklus-Inhibitor)

AG Radbruch, DRFZ Berlin

Ly294002 (PI3 Kinase Inhibitor)

Cell Signaling, Beverly, USA

Mycophenolic acid (Zellzyklus-Inhibitor)

AG Radbruch, DRFZ Berlin

Nocodazole (Zellzyklus-Inhibitor)

AG Radbruch, DRFZ Berlin

PD184352 (MEK-Inhibitor)

Calbiochem, Darmstadt

Rapamycin (mTOR-Inhibitor)

Sigma, Deisenhofen

SB203580 (p38-Inhibitor)

Sigma, Deisenhofen

Bakterienstämme

DH5α

supE44, ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1

Rattenstämme

Dark Agouti (DA), Haplotyp: RT-1^avl

Moellegard, Dänemark

Lewis (LE), Haplotyp: RT-1^l

Moellegard, Dänemark

Zellinien

GP+E 86 Verpackungszellinie

Dr. A. Flügel, MPI f. Neurobiologie,
Abteilung Neuroimmunologie, München

Phoenix Verpackungszellinie

AG A. Radbruch, DRFZ, Berlin

Puffer und Medien

DEPC-H₂O:

1 ml

Diethyl Pyrocarbonate

add 1l ddH₂O, autoklavieren

DMEM-Medium:

1 mM

Natriumpyruvat

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

10 % (v/v)

FKS (56°C hitze-inaktiviert)

DNA-Marker:

50 µl

1kb-Marker (1µg/µl)

100 µl

Ladepuffer

350 µl

TAE-Puffer (1x)

Elektrodenlaufpuffer:

15,1 g

Tris-Base

72 g

Glycin

5 g

SDS

add 5 l ddH₂O

Erylysispuffer:

8,3 g

NH₄Cl

10 mM

NaHCO₃

0,1 mM

EDTA

FACS-Puffer:

2 % (v/v)

FKS

0,1 % (w/v)

NaN₃

in PBS

2 x HBSP-Puffer:

50 mM

Hepes

10 mM

KCl

12 mM

Dextrose (Glucose)

280 mM

NaCl

1,5 mM

Na₂HPO₄ x 2 H₂O

pH 7,05

LB-Agarplatte:

zum LB-Medium wurde 1.5 % (w/v) Agar gegeben und aufgekocht

LB-Medium:

10 g

Baktotrypton

5 g

Hefeextrakt

10 g

NaCl

add 1 l ddH₂O

Lösung D:

3,676 g

(tri)-Nacitrat-Dihydrat

236,32 g

Guanidine-Isothiocyanate

2,5 g

N-Lauroylsarcosin

ad 500 ml DEPC-H₂O, pH 7,0

PBS:

8 g

NaCl

0,2 g

KCl

1,15 g

Na₂HPO₄ x 2H₂O

0,2 g

KH₂PO₄

ad 1l ddH₂O

Probenpuffer DNA:

50 % (v/v)

Glycerin

0.2 % (w/v)

SDS

0.05 % (v/v)

Bromphenolblau

10 mM

EDTA

in 1x TAE

Probenpuffer Protein:

2 ml

0,625 M

Tris-HCl (pH 6,8)

0,2 g

SDS

5 ml

Glycerin

0,5 ml

β-Mercaptoethanol

0,1 ml

1 % (w/v)

Bromphenolblau (in Ethanol)

2,4 ml

ddH₂O

Protein-Lysispuffer

50 mM

Tris-HCl pH7.5

1 mM

EGTA

1 mM

EDTA

1% (w/v)

Triton-X 100

1 mM

Natriumorthovanadat

50 mM

Natriumfluorid

5 mM

Natriumpyrophosphat

10 mM

Natrium-β-glycerophosphat

0.27 M

Saccharose

1 μM

Microcystin-LR

0.1% (w/v)

β-Mercaptoethanol

1 tablet/ 50 ml

‘complete’ Proteasen Inhibitor Cocktail

RPMI-Medium:

1 mM

Natriumpyruvat

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

10 % (v/v)

FKS

Sammelgel:

0,33 ml

30 %/ 0,8%

Acrylamidstammlösung

0,4 ml

0,625 M

Tris-HCl (pH 6,8)

0,4 ml

0,5 % (w/v)

SDS

0,87 ml

ddH₂O

2 µl

TEMED

10 µl

10 % (w/v)

APS

TAE:

40 mM

Tris-Base

20 mM

Essigsäure

2 mM

EDTA (pH 8,0)

TBE:

450 mM

Tris-Base

20 mM

Borsäure

10 mM

EDTA (pH 8,0)

TBST-Waschpuffer:

10 mM

Tris-Base

150 mM

NaCl

0,05 % (v/v)

Tween 20

Transferpuffer:

25 mM

Tris-Base

150 mM

Glycin

10 % (v/v)

Methanol

Trenngel 15 %-ig:

3 ml

30 %/ 0,8 %

Acrylamidstammlösung

1,2 ml

1,88 M

Tris-HCl (pH 8,8)

1,2 ml

0,5 % (w/v)

SDS

0,6 ml

ddH₂O

5 µl

TEMED

30 µl

10 % (w/v)

APS

T-Zell-Medium (TCM):

5 mM

β-Mercaptoethanol

2 % (v/v)

autologes Serum in DMEM-Medium

Methoden Isolierung, Modifizierung und Analyse von Nukleinsäuren

Folgende Methoden wurden nach Standardprotokollen [Sambrook et al.] oder Herstellerprotokollen (von kommerziell erhältlichen Kits) durchgeführt:

Agarosegelelektrophorese
Mini-Präparation von Plasmid-DNA (Jetstar, Genomed)
Maxi-Präparation von Plasmid-DNA (Qiagen Maxi Plasmid Kit, Qiagen)
Präparation und CaCl₂-Transformation
Transformation = Einführung nackter DNA in eine Bakterienzelle
von kompetenten Bakterien
DNA-Extraktion aus Agarosegelen (Jetstar, Genomed)
Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Ligation von DNA-Fragmenten

Isolierung von Gesamt-RNA

Da die quantitative Aussagekraft der PCR-Methode wesentlich durch die Qualität und Quantität der umzuschreibenden RNA abhängt, wurde für die Präparierung der RNA der Kit „Absolutely RNA Miniprep Kit” (Stratgene) verwendet. Er beinhaltet den sorgfältigen Probenaufschluss über einen Prefilter und einen DNAse-Verdau von 15 Minuten bei 37°C, um eine hohe Reinheit der RNA zu gewährleisten.

RNA-Quantifizierung

Die Verwendung eines RNA-Chips und des dazugehörigen Kits „RNA 6000 Nano Assay Reagents & Supplies“ (Stratagene) ermöglichte die präzise und schnelle Quantifizierung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent).

cDNA-Synthese

Eventuelle Kontaminationen mit genomischer DNA während der RNA-Präparation wurden durch einen zusätzlichen DNAse-Verdau vor der cDNA-Synthese beseitigt. Trotzdem wurden als Qualitätskontrolle von jeder Probe sogenannte „–RT“ (Reverse Transkriptase) - Proben mitgeführt.

Zur Auffaltung der Sekundärstrukturen (intramolekulare H₂-Brückenbindungen) wurde 1 µg RNA mit 1 µl der Oligo-dT-Primer 10 min bei 70°C erhitzt und danach sofort wieder auf Eis gegeben. Hinzugegeben wurde folgender Mix pro Probe:

4 µl

FSB (5x)

2 µl

DTT

2 µl

dNTP´s

0,25 µl

Rnase-Inhibitor (40U/µl) (RI)

1 µl

DNAse (2U/µl)

Jetzt erfolgte der zusätzliche DNase-Verdau für 30 min bei 37°C mit anschließender 5 minütiger DNase-Inaktivierung bei 75°C. Nach 2 minütiger Eis-Inkubation wurde zu den cDNA-Proben jeweils 0,5 µl RT und RI gegeben. Bei den –RT-Proben wurde die Reverse Transkriptase durch 0,5 µl ddH₂O ersetzt. Nun folgte die eigentliche cDNA-Synthese bei 42°C für 60 min, die zum Schluss für 5 min bei 94°C gestoppt wurde.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) konventionelle PCR

Die PCR ist eine Methode, um ein bestimmtes DNA-Segment in vitro exponentiell zu amplifizieren.. Mittels zweier Oligonukleotide („Primer“), die an bekannte Sequenzbereiche des „sense“- und „antisense“- Stranges des DNA-Segmentes binden, findet eine Vervielfältigungsreaktion statt, die von einer hitzestabilen DNA-abhängigen Polymerase (z.B. Taq-Polymerase) katalysiert wird. Die DNA wird bei Temperaturen von 94°C in einzelsträngige Moleküle denaturiert, gefolgt von der Anlagerung der Oligonukleotidprimer an die spezifische Region der Matrize bei einer dafür kalkulierten Annaelingtemperatur (gewöhnlich zwischen 40-60°C) und einer anschließenden DNA-Synthese bei 72°C durch die hitzestabile Taq-Polymerase (Elongation). Der 25 µl Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:

17,9 µl

ddH2O

2,5 µl

PCR-Puffer

1,5 µl

MgCl2 (5mM)

1,0 µl

dNTPs (2,5mM)

0,5 µl

Forward Primer (10pmol/µl)

0,5 µl

Reverse Primer (10pmol/µl)

0,1 µl

Taq-DNA Polymerase (5U/µl)

Nach einer initialen Denaturierungsphase von 5 min bei 94°C folgten 30 bis 35 Zyklen, die jeweils die 3 Inkubationen für die Denaturierung (20 s), die Anlagerung (30 s) und die Verlängerung der Matrize (30 s) beinhalteten. Für eine vollständige Elongation schloss sich eine abschließende Inkubation für 5 min bei 72°C an.

“Real Time“ TaqMan-PCR

Diese quantitative PCR-Methode ermöglicht die Visualisierung der Amplifikation der Proben in Echtzeit. Unter Verwendung eines Farbstoffes, SYBR® Green, erhält man „Real Time“ PCR-Informationen, die pro Zyklus gemessen und über eine exponentielle Kurve verfolgt werden können. Aus dieser exponentiellen Probenanalyse wird bei der Real Time-PCR der sogenannte C_T-Wert („Theshold Cycle“) ermittelt, der die Zyklenzahl angibt, bei der zum ersten Mal ein statistisch signifikantes Reportersignal über dem Grundrauschen detektiert wird. SYBR® Green interkaliert während der Amplifikation in die Doppelstrang-DNA und lässt somit die Signalintensität proportional zur Produktmenge ansteigen. Das Problem hierbei sind unspezifische Signale, die von Primerdimeren stammen, die aber über eine Anzeige von Dissoziationskurven spezifischer Schmelztemperaturen detektiert werden können. Die Detektion des Fluoreszenzanstieges erfolgt für jeden Zyklus im geschlossenen Reaktionsgefäß mit Hilfe des ABI PRISM^TM 5700 Sequence Detectors.

Neben dem Einsatz des SYBR® Green–Farbstoffes, gibt es die Möglichkeit, eine spezielle fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonde zu verwenden, die zur Erhöhung der Spezifität beiträgt. Diese ist am 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) markiert und trägt am 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat), der zusätzlich mit einem Phosphatrest blockiert ist. Bei Anregung der intakten Sonde bei einer spezifische Wellenlänge (488 nm) wird deren Fluoreszenz durch die räumliche Nähe vom Reporter-Farbstoff zum Quencher-Farbstoff durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Während der PCR hybridisieren Sonde und Primer gleichermaßen an den Matrizenstrang. In der Extensionsphase kommt es zur Hydrolyse der Sonde durch die 5´- 3´- Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase, wobei die räumliche Nähe und somit auch der FET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen und die Emission des Reporters als Signal gemessen werden kann. Freie, nicht-gebundene Sonde wird nicht hydrolysiert. Die Fluoreszenz des Reporters steigt entsprechend der Akkumulation des PCR-Produktes mit jedem PCR-Zyklus an. Die Detektion des Fluoreszenzanstieges erfolgt für jeden Zyklus im geschlossenen Reaktionsgefäß mit Hilfe des ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detectors.

Die Etablierung eines TaqMan-Primerpaares erfolgte nach den Regeln der SOP (erstellt am Institut für Medizinische Immunologie, Charité Berlin, Fr. Vogt). Dazu gehören das Heraussuchen der Primer und Sonden mit der entsprechenden Software „Primer Express“, die Testung des Primerpaares und die Primertitration mit anschließender Effizienzbestimmung.

Zur Durchführung der PCR wurden folgende Bedingungen gewählt:

Sonde

SYBR-Green

TM-Mastermix

12,5µl TM-Mastermix

12,5µl SYBR-Green-Mastermix

Steriles Wasser ddH₂O

4,5µl

5,5µl

Primermix

6µl

6µl

Sonde

1µl

------

Template

1µl

1µl

Zykler:

1 Zyklus

50°C

2 min

1 Zyklus

95°C

10 min

40 Zyklen

95°C

15 sec

60°C

1 min

Der TM-Mastermix enthält die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTP´s mit dUTP, MgCl₂ (5mM Endkonzentration), ROX (passiver Referenzfarbstoff) und eine Uracil-N-Glycosylase. Der SYBR-Green- Mastermix enthält zusätzlich den Farbstoff SYBR-Green, dafür nicht die Glycosylase, die aber separat dazupipettiert werden kann (AmpErase).

Durch die Verwendung von dUTP´s statt dTTP´s werden eventuelle Kontaminationen mit bereits amplifizierten PCR-Produkten verhindert. Die Zugabe von dem Enzym Uracil-N-Glycosylase bewirkt während der 2-minütigen Inkubation bei 50°C die Hydrolyse Uracil-haltiger PCR-Produkte. Die anschließende 10-minütige Inkubation dient der Inaktivierung des Enzyms, der Denaturierung der verdauten DNA-Proben und der gleichzeitigen Aktivierung der Polymerase.

Die relative Quantifizierung der Expressionshöhe erfolgt unter Nutzung des ermittelten C_T-Wertes. Generell gilt, umso höher die Startkopienzahl der Probe, desto geringer der C_T-Wert. Arbeitet z.B. ein System mit 100 % Effizienz, nimmt der C_T-Wert mit jeder Verdopplung der Startkopienzahl um genau einen Zyklus ab. Außerdem benötigt man für die quantitative Aussage zur Expression der zu untersuchenden Gene die gleichzeitige Amplifikation eines konstitutiv exprimierten Gens („house-keeping“-Gen z.B. CD3 bei T-Zellen). Ein dimensionsloses Ergebniss ermittelt man, wenn beide Primerpaare mit annähernd gleicher Effizienz arbeiten, über folgende Formel:

Ergebnis = (1 + Effizienz) – ( C T Genx - C T CD3)

Detektion und Analyse von Proteinen Zell-Lysis und Gesamtproteinbestimmung

Suspensionszellen wurden geerntet, indem sie nach dem Resuspendieren zentrifugiert (1200 rpm, 5 min, 4°C) und anschließend kurz mit kaltem PBS gewaschen wurden. Der Überstand wurde so sauber wie möglich abgezogen und das Pellet schnellmöglichst in dem vorgekühlten Protein-Lysispuffer durch wiederholtes Scheren mit einer Kanüle (0,60 x 25 mm) resuspendiert. Dabei ist streng darauf zu achten, dass alle Arbeitsschritte bei 0°C - 4°C ablaufen. Die Lysate wurden zentrifugiert (13000 rpm, 5 min, 4°C), der Überstand überführt und in flüssigen Stickstoff sofort weggefroren. Bis zur Proteinanalyse mittels Western-Blot wurden die Proben bei –70°C gelagert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Bradford-Methode mit dem kommerziell erhältlichen Kit von PIERCE (“Coomassie Protein Assay Reagent”).

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese + Western-Blot

Die Proben wurden für jeden Versuch mit einer Gesamtmenge an Protein von 30-50µg/20µl eingestellt, anschließend in einem Verhältnis von 1:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95°C denaturiert. Die Auftrennung der Proteine erfolgte nach der Vorschrift „Minigel und Minigel-Twin“ (Biometra, Göttingen) auf 15%-igen SDS-Gelen, die anschließend mit Hilfe des semi-trockenen Fastblot-System (Biometra) auf Nitrocellulosemembranen geblottet wurden. Der Transfer (48 cm² Gel) erfolgte für 1 Stunde bei 250 mA. Um den erfolgreichen Transfer einschätzen zu können, wurden die geblotteten Proteine auf der Membran durch eine kurze Färbung in Ponceaulösung sichtbar gemacht. Je nach verwendeten Antikörper wurden die Membranen entweder über Nacht bei 4°C oder für 1 Stunde bei RT (Antikörper von Cell Signaling) in 5% Milchpuder / TBST (Blockmilch) inkubiert, um nichtspezifische Bindungen abzudecken. Die Antikörper wurden wie folgt inkubiert:

Antikörper von Cell Signaling

Sonstige Antikörper

Primärantikörper

über Nacht, 4°C
in 3%-ig BSA / TBST

1 h, RT
in 5%-iger Blockmilch/ TBST

Waschen

3 x 5 min, RT
mit TBST

5 x 5 min, RT
mit TBST

Sekundärantikörper

1 h, RT
in 5%-iger Blockmilch/ TBST

1 h, RT
in 5%-iger Blockmilch/ TBST

Waschen

3 x 5 min, RT
mit TBST

5 x 5 min, RT
mit TBST

Die Detektion des gebundenen POD-markierten Sekundärantikörpers erfolgte mit dem ECL-Kit (Amersham). Reagenz A und B wurden dafür in einem Verhälnis 1:1 gemischt und die Membran für 1 Minute darin inkubiert. Anschließend konnte der Substratumsatz autoradiographisch nach entsprechenden Zeitpunkten sichtbargemacht werden.

Zytokinbestimmung im Zellkulturüberstand

Zur Konzentrationsbestimmung von Zytokinen in Zellkulturüberständen wurden kommerzielle ELISA-Kits eingesetzt. Es wurde bei allen Proteinbestimmungen gemäß den Herstellervorgaben verfahren. Die Messung wurde für folgende Zytokine durchgeführt: Ratten IFN-γ und Ratten IL-2. Die Auswertung fand am ELISA-Reader Anthos 2001 statt.

Gemischte Lymphozytenkultur (MLC)

Die MLC ist ein in vitro-Modell der T-Zell-Antwort, die im Laufe einer allogenen Transplantat-Abstoßungsreaktion ausgelöst wird. Hierfür wurden Lymphozyten der zwei verschiedenen Rattenstämme Lewis, als Empfänger, und DA, als Stimulator isoliert und gemeinsam kultiviert. Da Lewis und DA komplett in ihren MHC I- und MHC II- Molekülen differieren, ist dieses Rattenmodell besonders gut für die Analyse einer starken T-Zell-Antwort geeignet. Für die Gewährleistung der einseitigen Reaktion wurden die DA-Lymphozyten vorher bestrahlt (30Gray).

Isolierung lymphatischen Gewebes

Die Tötung der Tiere erfolgte durch ein Carbogen-Kohlendioxid-Gasgemisch mit einem Narkose- und Tötungsgerät. Im Anschluss wurden die Körper mit einer 70%-igen Ethanolspülung grob desinfiziert und sofort thorakal zur kardialen Blutabnahme geöffnet. Nach Entnahme des Thymus wurden mesenterial und subkutan die Lymphknoten sauber aus Bindegewebe und Fett herausgelöst und in steriles DMEM-Medium überführt. Die Aufarbeitung wurde möglichst sofort durchgeführt.

Kultivierung der Zellen

Die folgende Verarbeitung der lymphatischen Gewebe fand unter sterilen Bedingungen statt. Zur Gewinnung der Einzelzellsuspension wurden die Organe erst durch ein 100 µm Nylonsieb gedrückt, in T-Zell-Medium (TCM) aufgenommen und anschließend durch ein 40 µm Nylonsieb gespült. Die Zellzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer mittels Vitalfärbung mit Trypan-Blau bestimmt. Je nach Tieralter und Präparation ergaben die Lymphknoten 1-2x10⁸ lebende Zellen. Währenddessen wurde das kardial gewonnene Blut zur Serumgewinnung bei 4500 rpm, 4°C für 10 min zentrifugiert und der so entstandene Serumüberstand abgenommen und bis zur Anwendung bei 4°C gelagert.

Die für die MLC dienenden Stimulator-Zellen (DA) wurden vor der Kultivierung mit 30 Gray bestrahlt. Von den Stimulator-Zellen wurden 3x10⁵mit 3x10⁵ „Responder“-Zellen pro well einer 96 well Flachbodenplatte in 200 µl TCM/ well bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Je nach Fragestellung wurden zu den Reaktionsansätzen noch Antikörper, Inhibitoren oder Zytokine in entsprechender Verdünnung hinzugegeben. Die Auswertung erfolgte in einer 5 Tage-Kinetik, indem pro Tag und Ansatz die Zellen geerntet und die Überstände, sowie die Zellpellets nach einmaligen Waschen mit PBS für weitere Analysen bei –70°C weggefroren wurden.

Intrazelluläre IFNγ Expression

Die Zellsuspensionen der MLC wurden geerntet und mit PBS (2% FKS, 0,02% Azid) gewaschen. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 15 min bei 4°C mit 4µg/ml FITC-markierten anti-Ratten-α,β-TCR Antikörper und/ oder PerCp-markierten anti-Ratten-CD8 Antikörper. Die Proben wurden danach mit einer Lysislösung von Becton Dickenson für 15 min bei RT fixiert und mittels 0,2% Saponin/ PBS permeabilisiert. Nach einem erneuten Waschschritt mit PBS wurden die Zellen mit 4µg/ml PE-markierten anti-Ratten-IFNγ Antikörper gefärbt und die IFNγ Expression in T-Zellen mittels 3-Farben-Durchflußzytometrie am FACScort (BD) bestimmt.

Proliferationsassay

Zur Bestimmung des Proliferationspotentials der Zellen wurden am Tag 3 einer MLC 18,5 kBq ³H-Thymidin / well dazupipettiert und die Zellen für weitere 16 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden entweder sofort geerntet oder bei –70°C gelagert. Zur Detektion des Thymidineinbaus wurde das System von INOTECH verwendet.

Inkubation mit „Antisense“-Oligonukleotiden

Zur Inhibierung der p23 Proteinexpression in den allogenen Kulturen wurden von der Firma Biognostik aufgrund der ermittelten Ratten-cDNA-Sequenz zwei verschiedene „Antisense“-Oligonukleotide mit den dazugehörigen „Nonsense“-Oligonukleotiden (Basensequenz der „Antisense“-Oligonukleotide zufällig angeordnet) synthetisiert. 4x10⁶ „Responder“-Zellen wurden dabei vor der MLC mit 10 µM Oligonukleotiden für 30-45 min bei 37°C in PBS mit oder ohne Lipofektaminzusatz (10 µg/ml) schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit TCM gewaschen und gemeinsam mit Stimulator-Zellen ausplattiert. Als Kontrolle diente der gleiche allogene Ansatz ohne Oligonukleotidbehandlung. Die Proteinanalyse der p23-Expression und die Proliferationskontrolle mittels ³H-Thymidin Essay erfolgte am Tag 4 der Kultur.

Generierung von p23 Antisense-transgenen Zellen Klonierung von p23 in den pLXSN-Vektor

Für die Klonierung von p23 in das retrovirale Expressionsplasmid pLXSN-IRES-GFP erfolgte zunächst eine Zwischenklonierung in den p123T-Vektor. Mit den p23-spezifischen Primern p23-5´-universal und p23-3´-reverse wurde aus cDNA (aCD4-behandelte Ratten-LK-MLC) ein ca. 1800 bp großes p23-Fragment amplifiziert. In diesem Fragment war der komplette ORF enthalten. Aufgrund der Größe des Fragments wurde das Expand High Fidelity PCR-Systems von Boehringer Mannheim eingesetzt, da dieses System eine Polymerase mit „proofreading activity“ enthält. Von dem PCR-Ansatz wurden 20 ng direkt für die Ligation in den p123T genutzt. Nach der Transformation kompetenter DH5α-Bakterien und einer anschliessenden Plasmid-Präparation zeigten Sequenzieranalysen die Richtigkeit der p23-Basefolge. Der pLXSN-IRES-GFP stellte nur eine unicale Schnittstelle (EcoRI) zur Verfügung, die nicht in dem zu klonierendem p23-Fragment vorkam. Deshalb musste diese erst mit Hilfe der Primer p23(Eco)sense und p23(Eco)antisense in die p23-Sequenz mittels PCR eingefügt werden. Damit die Primer mit der Basensequenz für die EcoRI-Schnittstelle trotzdem an die Matrize anlagern konnten, waren vor den 30 Zyklen mit der spezifischen Annealingtemperatur von 61°C 5 Zyklen bei 45°C eingefügt. Nach Aufreinigung der DNA aus dem Agarosegel wurde die Konzentration mit dem RNA / DNA Kalkulator Gene Quant II bestimmt. Anschließend wurden die p23-DNA und der pLXSN-Vektor mit EcoRI geschnitten, extrahiert und ligiert. Um Rezirkulationen und Religierungen der linearisierten Vektor´s zu vermeiden, wurde dieser vor der Ligation einer Phosphatase-Behandlung (CIP, Promega) unterzogen. Der folgenden Transformation schloss sich die Isolation der Plasmid-DNA an, die mit einer Restriktionskontrolle auf das Vorhandensein des p23-Inserts und dessen Orientierung analysiert wurde. Durch anschliessende Sequenzierung mittels spezifischer pLXSN- und IRES-Sequenzierprimer sollten die Ergebnisse bestätigt werden.

Transfektion

Transfektion = Einbringen fremder DNA in eukaryontische Zellen

a) Kalzium-Phosphat Transfektion:

GP+E 86 Zellen bzw. Phoenix-Zellen wurden in DMEM-Medium in T75-Kulturflaschen bei 37°C, 5% CO₂ im Inkubator kultiviert. Bei Erreichen einer ca. 90%-igen Konfluenz wurden die Zellen je nach Bedarf im Verhältnis 1:3 bis 1:10 aufgeteilt. Einen Tag vor Transfektion wurden 1x10⁶ Zellen je 6 cm-Schale ausplattiert, so dass bis zum folgenden Tag möglichst 60% - 70% Konfluenz erreicht wurde. Zirka 4 Stunden vor der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel. Die Transfektion erfolgte nach dem Standardprotokoll für Kalzium-Phosphat-Präzipitation adhärenter Zellen [ Sambrook et al.] mit 10µg DNA. Die Vorbereitung zur Transduktion verlief für die Zellinien auf zwei verschiedenen Wegen:

1) GP+E-Zellen: Nach maximal 18 Stunden Inkubation wurde das Medium gewechselt unter Zugabe von Gentamycin (G-418, 1mg/ml) zur Selektionierung der positiven Zellen. Von diesem Zeitpunkt an wurde allen Passagen der GP+E-p23 Zellen (Sense bzw. Antisense) G-418 dem Medium zugesetzt. Die positiven GP+E-p23 Zellen wurden so expandiert und in Einfriermedium (FKS, 10% DMSO) zur Lagerung in Flüssigstickstoff weggefroren für die Generierung stabiler GP+E-p23-Klone.

2) Phoenix: Ungefähr 24 Stunden später erfolgte ein Mediumwechsel, wobei ab diesem Zeitpunkt RPMI-Medium verwendet wurde. 48 und 72 Stunden nach der Transfektion wurde der Virusüberstand gesammelt und sofort bei –70°C bis zur Transduktion

Transduktion = Übertragung genetischen Materials von Zelle zu Zelle durch Retrovirus

mittels Virusüberstandes zwischengelagert.

b) Lipofektamin-Transfektion:

Die Transfektion mit Lipofektamin erfolgte an Phoenix-Zellen, die 1 Tag vorher mit einer Konzentration von 1x10⁶pro well in einer 6-well-Platte in 2,5 ml DMEM ausplattiert wurden. Bei einer Zelldichte von 90% wurde das Gemisch aus 5 µg DNA und 15 µl Lipofektamin2000 (GibcoBRL) jeweils in 250 µl FKS-freiem DMEM-Medium kombiniert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser DNA-Lipofektamin-Komplex wurde vorsichtig zu den Phoenix-Zellen pipettiert und im Inkubator kultiviert. Ungefähr 24 Stunden später erfolgte ein Mediumwechsel, wobei ab diesem Zeitpunkt RPMI-Medium verwendet wurde. 48 und 72 Stunden nach der Transfektion wurde der Virusüberstand gesammelt und sofort bei –70°C bis zur Transduktion mittels Virusüberstandes zwischengelagert.

Generierung stabiler GP+E-p23 Klone („limited dilution“)

Die polyklonale Verpackungszellinie GP+E-p23Sense bzw. p23Antisense wurde zur Klonierung einer monoklonalen Verpackungszellinie einer Verdünnungsreihe nach folgendem Schemata unter G-418 (1 mg/ml)-Selektion unterzogen:

2 x 96 well Platte mit 3 Zellen / well

2 x 96 well Platte mit 0,3 Zellen / well

In den nächsten 4-6 Wochen der negativen Selektion konnten 2 GP+E-Klone mit p23 Sense und 4 Klone mit p23 Antisense expandiert werden. Zur Bestimmung der Höhe der p23 Expression wurden ca. 1x10⁶ Zellen in entweder 200 µl FACS-Puffer für eine anschließende FACS-Analyse des Reportergen GFP oder in 100 µl Proteinlysispuffer für einen p23- Proteinnachweis aufgenommen.

Retrovirale Transduktion von T-Zellen

Zur Durchführung der Transduktion wurde 1 Tag vorher eine Milz-T-Zellkultur (Maus) angesetzt. Dafür wurde die entnommene Milz in PBS durch ein 70 µm Nylon-Sieb gedrückt und die Erytrozyten durch Lyse entfernt. Dazu wurde das Zellpellet in PBS in einem Verhältnis von 1:4 in Ery-Lysispufferresuspendiert und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mittels zweifacher Menge an 0,5 % BSA in PBS gestoppt und anschließend bei 1200 rpm, 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde nach einem Waschschritt mit PBS in RPMI-Medium aufgenommen und mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (jeweils 3µg/ml) versetzt. Die Aussaat erfolgte in einer Konzentration von 3x10⁶ Zellen /well. Am folgenden Tag wurde ¾ des Mediums vorsichtig abgenommen, aber nicht verworfen. Die aufgetauten Virusüberstände wurden zusammen mit Polybren (8 µg/ml) auf die Zellen verteilt und dann für 1 Stunde bei 1800 rpm und 25°C zentrifugiert. Nach der Transduktion konnte der retrovirale Mediumüberstand von den wells gegen das aufbewahrte Medium ausgetauscht werden. Die Zellen wurden 24 Stunden später aufgrund starker Proliferation im Verhältnis 1:2 aufgeteilt und konnten dann für die folgenden 48 Stunden bei 37°C kultiviert werden.

Analyse der p23 transgenen

Transgen = eingeschleustes und stabil in das Genom integriertes Fremdgen

T-Zellen

Die Zellen konnten im Anschluss auf positive GP+E-p23Sense bzw. p23Antisense Zellen gesortet werden. Dafür wurden die Pellets bei 1200 rpm, 10 Minuten, 4°C zentrifugiert, in 750 µl 0,5 % BSA haltigem PBS resuspendiert und durch einen 40 µm Nylon-Filter aufgereinigt. Nach Zugabe von 3 µM Propidiumjodid zu den transduzierten Zellen, um die toten Zellen ausschließen zu können, wurden diese sofort im Anschluss am Durchflußzytometer „FACSort“ gesortet. Auch hier erfolgte die Detektion der positiven Zellen über das Reportergen GFP. Diese positiv gesorteten Zellen wurden für spätere Analysen verwendet.