Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

• 1  Einleitung

  • 1.1 Mechanismen der Transplantatabstoßung

    • 1.1.1 T-Zellaktivierung und Effektormechanismen

  • 1.2 Signaltransduktion der T-Zellaktivierung

  • 1.3 Herkömmliche Immunsuppressiva

  • 1.4  Induktion einer Transplantat-Toleranz

  • 1.5  Mögliche Wirkungsweisen nicht-depletierender anti-CD4 monoklonaler Antikörper

  • 1.6 Wirkungsweise des Toleranz-induzierenden anti-CD4 monoklonalen Ak RIB5/2

  • 1.7 Analyse unterschiedlicher Genexpression in anti-CD4-behandelten und unbehandelten mononukleären Zellen

  • 1.8  Chaperone: Hsp90 und p23

    • 1.8.1 Rolle der Chaperone in Signaltransduktion und Zellzyklus-Regulation

• 2  Zielstellung

• 3  Material und Methoden

  • 3.1 Material

    • 3.1.1 Chemikalien

    • 3.1.2 Biochemikalien und Kits

    • 3.1.3 Radiochemikalien

    • 3.1.4  Verbrauchsmaterial

    • 3.1.5 Geräte

    • 3.1.6  Verwendete Oligonukleotide

    • 3.1.7 Vektoren

    • 3.1.8  Antikörper

    • 3.1.9 Inhibitoren

    • 3.1.10 Bakterienstämme

    • 3.1.11 Rattenstämme

    • 3.1.12 Zellinien

    • 3.1.13  Puffer und Medien

  • 3.2  Methoden

    • 3.2.1 Isolierung, Modifizierung und Analyse von Nukleinsäuren

      • 3.2.1.1 Isolierung von Gesamt-RNA

      • 3.2.1.2 RNA-Quantifizierung

      • 3.2.1.3 cDNA-Synthese

    • 3.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

      • 3.2.2.1 konventionelle PCR

      • 3.2.2.2  “Real Time“ TaqMan-PCR

    • 3.2.3  Detektion und Analyse von Proteinen

      • 3.2.3.1 Zell-Lysis und Gesamtproteinbestimmung

      • 3.2.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese + Western-Blot

      • 3.2.3.3 Zytokinbestimmung im Zellkulturüberstand

    • 3.2.4 Gemischte Lymphozytenkultur (MLC)

      • 3.2.4.1  Isolierung lymphatischen Gewebes

      • 3.2.4.2 Kultivierung der Zellen

      • 3.2.4.3 Intrazelluläre IFNγ Expression

      • 3.2.4.4 Proliferationsassay

      • 3.2.4.5 Inkubation mit „Antisense“-Oligonukleotiden

    • 3.2.5 Generierung von p23 Antisense-transgenen Zellen

      • 3.2.5.1 Klonierung von p23 in den pLXSN-Vektor

      • 3.2.5.2 Transfektion

      • 3.2.5.3 Generierung stabiler GP+E-p23 Klone („limited dilution“)

      • 3.2.5.4  Retrovirale Transduktion von T-Zellen

      • 3.2.5.5 Analyse der p23 transgenen T-Zellen

• 4  Ergebnisse

  • 4.1 Auswirkung der anti-CD4-Antikörper Behandlung auf die Proliferation und die Expression Zellzyklus-assoziierter Proteine alloreaktiver T-Zellen

    • 4.1.1 Proliferationskontrolle

    • 4.1.2 Expression des Kochaperons p23 während der Gemischten Lymphozytenkultur

    • 4.1.3 Einfluss von Zellzyklus (ZZ)-Inhibitoren auf die Regulation der p23mRNA Expression / Transkription

    • 4.1.4 p23-Regulation in verschiedenen Stimulationsmodellen

    • 4.1.5  Einfluß von rekombinantem IL-2 und einer IL-2 Rezeptor Blockade auf die p23 Expression

    • 4.1.6 Analyse der Signalwege zur p23 Transkriptions-Induktion

    • 4.1.7 Vergleich der p23 Expressionsanalyse mit Kinaseaktivitäten

    • 4.1.8 Assoziative Funktionsanalyse des Kochaperons p23: Generierung und Analyse p23 Antisense-transgener Zellen

      • 4.1.8.1 Klonierung von pLXSN-IRES-GFP-p23 ( Sense + Antisense )

      • 4.1.8.2 Transfektion und Generierung stabiler GP+E p23 Klone

      • 4.1.8.3 Transiente Transfektion und Transduktion mittels Virusüberstandes

  • 4.2  Auswirkung der anti-CD4-Behandlung auf die Effektor-Zytokinexpression während der Gemischten Lymphozytenkultur

    • 4.2.1 Transkriptionelle und translationelle Regulation von IFNγ

    • 4.2.2  Einfluss von rekombinantem IL-2 und neutralisierenden anti-CD25 Antikörpern auf die IFNγ Expression

    • 4.2.3  Analyse des Signalweges der IFNγ Translationskontrolle

      • 4.2.3.1 Analyse der IFNγ Translationskontrolle mittels Kinase-Inhibitoren

      • 4.2.3.2 Analyse der IFNγ Translationskontrolle mittels Aktivitätsnachweis involvierter Kinasen

• 5  Diskussion

  • 5.1  Analyse der Regulation der Proliferation und der p23 Expression in der Gemischten Lymphozytenkultur

    • 5.1.1 Hemmung der Proliferation und der Expression des Kochaperons p23 unter anti-CD4-Behandlung

    • 5.1.2 Ist die p23 Regulation proliferationsabhängig ?

    • 5.1.3 Bedeutung von IL-2 für die p23Expression allo-aktivierter T-Zellen

    • 5.1.4  Signalwegsanalyse der p23 Transkriptionsinduktion

    • 5.1.5 Funktionsanalyse: Ist die Proliferation der T-Zellen abhängig von der p23 Expression oder ist p23 essentiell für die T-Zell-Proliferation?

  • 5.2 Analyse der Auswirkung der anti-CD4-Behandlung auf die Expression von Effektorzytokinen

  • 5.3 Zusammenfassende Schlussbemerkung zu den molekularen Effekten der anti-CD4-Behandlung

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Veröffentlichungen und Präsentationen

• LEBENSLAUF

• DANKSAGUNG

• SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG

• Tabelle 1: spezifische Kinase-Inhibitoren, die auf TCR- und/ oder IL-2-induzierte Signalkaskaden hemmend einwirken

• Tabelle 2: Vergleich der p23 Expressions- und Proliferationsdaten mit den Kinaseaktivierungsdaten. Die grau markierten Spalten zeigen eine Übereinstimmung zwischen der p23-Expression, der Proliferation und dem Akt/TOR-Signalweg (p70S6K).

• Tabelle 3: Transfektionskontrolle polyklonaler p23+/GFP+-Verpackungszellinien (Phoenix). 2 Tage nach Transfektion der Phoenix mit p23 Sense bzw. p23 Antisense Plasmiden erfolgte eine FACS-Analyse der GFP-Fluoreszenzintensität

• Tabelle 3: Zusammenfassende Darstellung der zellulären Effekte (IFNγ Translation, Proliferation, p23 Expression), der Kinaseaktivitäten drei wichtiger Signaltransduktionswege und der Hemmversuche in verschiedenen MLC-Ansätzen. (Blau=Hemmung der Kinase p38 durch den Inhibitor SB, Braun=Hemmung der Kinase ERK durch den Inhibitor PD, Grün=Hemmung der Kinase TOR durch den Inhibitor Rapamycin)

• Abb.1: Vereinfachte schematische Darstellung der Interaktionen zwischen T-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle über spezifische Oberflächenmoleküle, die für eine vollständige T-Zellaktivierung erforderlich sind (Signal 1-3).

• Abb.2: Signaltransduktion in T-Zellen. Vereinfachte schematische Darstellung der 3 Hauptwege der T-Zellaktivierung, die gemeinsam eine Expression früher Gene induzieren.

• Abb.3: Vereinfachte schematische Darstellung der IL-2 Rezeptor-induzierten Signalwege

• Abb.4: Intrazelluläre Wirkungsweise der herkömmlichen Immunsuppressiva CyA, Rapamycin, Steroide und anti-IL-2R monoklonaler Antikörper

• Abb.5: Anti-CD4mAk hemmte dieT-Zellproliferation in der Gemischten Lymphozytenkultur.

• Abb.6: Einfluss der anti-CD4mAk-Behandlung auf das p23 Expressionsmuster allo-aktivierter T-Zellen

• Abb.7: p23 mRNA-Expression und Proliferation restimulierter T-Zellen

• Abb.8: Einfluss von Zellzyklus-Inhibitoren auf die T-Zellaktivierung

• Abb.9: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in aCD3/aCD28-stimulierten Lewis-T-Zellen

• Abb.10: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in ConA-stimulierten Lewis-T-Zellen

• Abb.11: TaqMan PCR-Analyse der p23 mRNA Expression in humanen aCD3/aCD28-stimulierten T-Zellen

• Abb.12: Einfluss des anti-CD4mAk´s auf die IL-2 Transkription und IL-2 Sekretion allo-reaktiver T-Zellen

• Abb.13: Bedeutung von IL-2 für die p23 Expression allo-aktivierter T-Zellen

• Abb.14: Vergleich der Proliferation in einer syngenen, unbehandelten allogenen, anti-CD25-behandelten allogenen und Rapamycin-behandelten allogenen MLC

• Abb.15: Vereinfachte Darstellung der Gemeinsamkeiten des IL-2 und IL-15 Rezeptors

• Abb.16: Schematische Übersicht der TCR- und IL-2R-induzierten Signaltransduktionswege während der T-Zellaktivierung.

• Abb.17: Einfluss verschiedener Kinase-Inhibitoren auf die p23 Transkription während der allogenen MLC

• Abb.18: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand von Kinasen der Mitogen-aktivierten Signaltransduktionswege (p38 und ERK) mit der p23 Expression

• Abb.19: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand von Kinasen und Substraten des mTOR-kontrollierten Signalweges (S6K und 40S6) mit der p23 Expression

• Abb.20: Retroviraler Expressionsvektor p23-pLXSN

• Abb.21: Analyse der p23 Expression in monoklonalen p23+/GFP+-Verpackungszellinien (GP+E).

• Abb.22: Effizienz der T-Zelltransduktion

• Abb.23: Einfluss des anti-CD4mAk´s auf die IFNγ Transkription und Sekretion allo-aktivierter T-Zellen

• Abb.24: Intrazelluläre IFNg Expression in unbehandelten allo-aktivierten und anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten CD4+-T-Zellen

• Abb.25: Einfluss von rekombinantem IL-2 (1U/ml) auf die gehemmte IFNγ Proteinproduktion in anti-CD4mAk-behandelten allo-aktivierten T-Zellen

• Abb.26: IFNg Expression anti-CD25mAk-behandelter allo-aktivierter T-Zellen (10µg/ml)

• Abb.27: Bedeutung von IL-15 für die IFNγ Expression

• Abb.28: Auswirkungen spezifischer Inhibitoren der p38- und MEK-Kinase (jeweils 10µM) auf die IFNγ Expression allo-aktivierter T-Zellen

• Abb.29: Einfluss von Rapamycin (50ng/ml) auf die IFNγ Regulation allo-aktivierter T-Zellen

• Abb.30: Effekte des PI3 Kinase-Inhibitors Ly294002 (10µM) auf die IFNγ Translation während der Alloaktivierung von T-Zellen

• Abb.31: Vergleich zwischen dem Aktivierungszustand IL-2-induzierter mTOR-kontrollierte Kinasen und Substrate mit der IFNγ Expression

• Abb.32: Inhibitorische Einflüsse der Kinase-Hemmstoffe auf die T-Zellaktivierung

• Abb.33: Hsp90-Kinasen-Komplexe während der T-Zellaktivierung