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3  Material und Methoden

3.1 Patienten und Erfassung der Daten

Es wurden 85 Patienten nach Leber-, Herz- und Lungentransplantation in die Untersuchungen eingeschlossen.

Die Patienten suchten die Charité (Campus Virchow-Klinikum) zur regulären Untersuchung in der Transplantationsambulanz auf oder wurden noch stationär betreut.

Die Patienten gaben ihr schriftliches Einverständnis und wurden über das Vorhaben aufgeklärt (siehe Anhang).

Patientendaten wie Datum, Art und Ursache der Transplantation, Alter, Geschlecht, medikamentöse Therapie, Alkoholabusus, Tabakkonsum sowie das Tragen von Prothesen wurden in einem Erfassungsbogen vermerkt (siehe Anhang). Die notwendigen Blutparameter, in der Regel vom Untersuchungstag, wurden später der Patientenakte entnommen.

3.2 Intraorale Untersuchung und Abstrichnahme mittels Fungi-quick®-System

Bei allen Probanden der Studie wurde die Mundschleimhaut inspiziert sowie Lokalisation, Farbe, Charakter und die klinische Diagnose aller auffälligen Läsionen vermerkt. Prothesen wurden während der Untersuchung aus der Mundhöhle entfernt.

Die Abstrichnahme erfolgte mit Fungi-quick® (Hain Diagnostik, Berlin, Deutschland) nach Herstellervorschrift auf dem hinteren Drittel des Zungenrückens, unabhängig davon, ob eine Candidiasis beobachtet werden konnte oder nicht.

Das Fungi-quick®-System besteht aus zwei sterilen Röhrchen, wobei das eine einen Wattestab enthält und das andere mit ca. 3 ml Sabouraudmedium gefüllt ist.

Der sterile Watteträger wurde mehrmals kräftig auf der Zunge gedreht und dann in das Sabouraudmedium getränkt. Die Aufbewahrung der verschlossenen Röhrchen erfolgte im Dunkeln und bei Raumtemperatur bis zu einigen Monaten. Die Proben wurden in Hong Kong (Prof. L. Samaranayake, University of Hong Kong, Dept. of Oral Science) analysiert.


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benötigte Materialien:

- Fungi-quick®-Röhrchen

Hain Diagnostik, Berlin, Deutschland

- Mundspiegel

 

- Diagnostiklampe

 

Die Proben der Patienten wurden nach folgendem Schema isoliert und identifiziert:

3.3 Anzüchten auf Sabouraud-Glukose-Agar

Für die primäre Anzucht hat sich das klassische Medium Sabouraud-Glukose-Agar (SDA, pH‑Wert= 5,6) bewährt.

Die Abstriche wurden auf Sabouraud-Glukose-Agar ausgestrichen und 7 Tage lang bei 37 °C aerob inkubiert. Der Agar enthält zur Unterdrückung der bakteriellen Flora Chloramphenicol (0,5 g/l) und Gentamicin (0,04 g/l). Das Patientenmaterial wurde auf eine konventionelle Petrischale mit SDA aufgetupft und mit einer Impföse ausgestrichen.

Die Kulturen wurden jeden Tag inspiziert; die Identifizierung erfolgte nach Farbe und Morphologie der Einzelkolonien und Existenz eines Halo.

Die Kultur und die Identifizierung der Spezies erfolgte nach Herstellervorschrift.

Einzelkolonien wurden in Glyzerin bei –70 °C bis zur Spezifikation durch den Keimschlauchtest und das API 20C AUX-System aufbewahrt.

benötigte Materialien:


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3.4  Anzüchten auf CHROMagar®

Die Proben wurden zusätzlich auf CHROMagar® (Chromagar, Paris, Frankreich), ein Differentialnährmedium, das eine Differenzierung unterschiedlicher Candida-Spezies gestattet, ausgestrichen. Auf CHROM-Agar-Platten können C. albicans/C. dubliniensis, C. krusei, C. glabrata und C. tropicalis aufgrund ihrer Pigmentbildung voneinander unterschieden werden. Die Hefen wachsen durch Reaktion von speziesspezifischen Enzymen mit einem Chrom-Substrat mit unterschiedlicher Farbe (Abb. 2). Chromagar setzt sich aus Pepton (10 g/l), Glukose (20 g/l), Agar (15 g/l), Chloramphenicol (0,5 g/l) und einem chromogenem Mix (2 g/l) zusammen (pH‑Wert=6,1).

Nach 48 h Inkubation bei 37 °C wurden die Kolonien je nach Morphologie und Pigmentierung nach Odds et Bernaerts (1994) beurteilt.

benötigte Materialien:

- Petrischale

 

- Chromagar®

Chromagar, Paris, Frankreich

- Impföse

 

- Brutschrank 37 °C

 

Abb. 2: Chromagar® zur Differenzierung von Candida spp.; zu sehen sind
unterschiedliche Farbreaktionen der Hefen: A) C. albicans (grün)
B) C. glabrata (hellviolett) C) C. tropicalis (blau) D) C. krusei (blass rosa)


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3.5  Keimschlauchtest

Als „Schnelltest“ dient der Keimschlauchtest. Keimschläuche sind schlanke, zylindrische Fäden, die ohne Verengung von der Pilzbasis wachsen. Sie stellen eine Übergangsphase zwischen der Hefe- und Myzelform dar. Die Bildung wird als diagnostisches Kriterium von C. albicans genutzt. C. albicans und C. dubliniensis sind als einzige Spezies in der Lage, sehr schnell Keimschläuche zu bilden. Durch die Fähigkeit zur Ausbildung von Keimschläuchen wird die Adhärenz und damit die Virulenz der Spezies erhöht.

Eine Hefesuspension des zu prüfenden Hefestammes wurde in Serum eingeimpft. Nach 2-3 h Inkubation bei 37 °C wurde die Suspension auf ein Deckglas geschichtet und mikroskopiert (Vergrößerung 450).

benötigte Materialien:

3.6 Identifikation der Biotypen durch das API 20 AUX-System

Die biochemische Identifizierung von Candida-Spezies beruht auf der unterschiedlichen Assimilation von Kohlenhydratsubstraten. Die Assimilation ist die Fähigkeit eines Organismus bestimmte Komponenten als einzige Energiequelle für das Wachstum in Anwesenheit von Sauerstoff zu nutzen. Mittels API 20 C AUX-System (Analytical Profile Index; Bio Merieux SA, Frankreich) können die folgenden 19 Substrate als Kohlenstoffquelle genutzt werden: Glukose, Glycerin, 2‑Keto‑D‑Gluconat, L‑Arabinose, D‑Xylose, Adonit, Xylit, Galaktose, Inosit, Sorbit, α‑Methyl‑D‑Glucosid, N‑Acetyl‑D‑Glucosamin, Celiobiose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Melezitose und Raffinose.

Die 19 Assimilationsreaktionen und eine Negativkontrolle wurden entsprechend der Methode nach Williamson et al. zur Unterscheidung von Candida-Biotypen verwendet. Die verschiedenen Spezies wachsen nur dann, wenn sie das entsprechende Substrat verwerten können (Williamson et al., 1987).


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benötigte Reagenzien und Materialien:

-

Ampullen C Medium:

(7 ml, End-pH-Wert:6,4-6,8)

Ammoniumsulfat

Kaliumhydrogenphosphat

Dikaliumhydrogenphosphat

Dinatriumphosphat

Natriumchlorid

Calciumchlorid

Magnesiumsulfat

Histidin

Tryptophan

Methionin

Agar

Vitamin-Lösung

Spurenelemente-Lösung

Wasser

5,000 g

0,310 g

0,450 g

0,920 g

0,100 g

0,050 g

0,200 g

0,005 g

0,020 g

0,020 g

0,500 g

1 ml

10 ml

ad 1000 ml

Bio Merieux SA, F

-

Ampulle Suspensionsmedium 2 ml:

demineralisiertes Wasser

 

Bio Merieux SA, F

 

oder

   
 

NaCl 0,85 % Medium, 2 ml:

Natriumchlorid

demineralisiertes Wasser

8,5 g

1000ml

 

-

RAT Medium (Reis-Agar-Tween)

 

Bio Merieux SA, F

-

Sabouraud Medium

 

Bio Merieux SA, F

-

McFarland Standard Nr.2

 

Bio Merieux SA, F

-

Analytischer Profil-Index API 20 C AUX oder Identifizierungssoftware

 

Bio Merieux SA, F

-

API 20 C AUX Streifen

 

Bio Merieux SA, F

-

Ampullenständer

  

-

Pipetten

  

-

Inkubationswanne

  

-

Brutschrank (30 °C)

  

-

Kühlschrank

  

-

Markierstift

  

-

Ergebnisblätter

  

Der Streifen API 20 C AUX besteht aus 20 Mikroröhrchen, in denen sich die dehydrierten Substrate zum Nachweis der Reaktionen befinden. Die Streifen und Medien wurden bei 2-8 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Einige Stunden vor Gebrauch wurden diese aus dem Kühlschrank entnommen, um die Medien auf Raumtemperatur (20-30 °C) zu temperieren.

1. Vorbereiten des Streifens


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2. Vorbereiten des Inokulums

3. Beimpfung des Streifens

Nach 48 h Inkubation erfolgte die Ablesung durch Vergleich mit der negativen Wachstumskontrolle im 1. Röhrchen. Oft war eine Inkubationszeit von 48 h bis 72 h notwendig, da einige Tests, vor allem die Glukose-Reaktion, noch nicht klar ablesbar waren. Wurden stärkere Trübungen als die der Kontrolle beobachtet, galt dies als positive Reaktion.

Die Identifizierung wurde anhand des Analytischen Profil-Indexes vorgenommen:

Die Identifizierung kann auch mit der Identifizierungssoftware erfolgen.


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3.7  Statistische Analysen

Die statistische Verarbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm SPSS® für Windows, Version 11.0. Für den Vergleich von Gruppen mit oder ohne Kolonisation bzw. Infektion bezüglich des Alters, der Blutwerte, der Zeitdifferenz nach Transplantation und der Medikamenteneinnahme wurden der U-Test nach Mann-Whitney oder der Kruskal-Wallis-Test angewandt. Beim Vergleich von Gruppen mit oder ohne Kolonisation bzw. Infektion bezüglich Geschlecht, Tabakkonsum, Prothesen und der Medikamenteneinnahme kam der Chi-Quadrat-Test zum Einsatz. Aussagen zur Korrelation wurden mit Hilfe des Pearson´schen Koeffizienten getroffen.

Unterschiede galten als signifikant, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p< 0,05 war.


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09.06.2005