Institut für Biochemie der Charite´

Dissertation

Strukturelle und biochemische Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus humanen Zellen

Zur Erlangung des akademischen Grades doctorum rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

Dipl.-Biochemikerin Nicola Klare

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. B. Dahlmann
2. Prof. Dr. P.-M. Kloetzel
3. Prof. Dr. W. Lockau

eingereicht: 27.10.2004

Datum der Promotion: 15.02.2005

gewidmet meinen Kindern Saskia und Amelie

Abstract

Das Ubiquitin-Proteasom-System sorgt in eukaryontischen Zellen für einen kontrollierten Abbau von Proteinen. Das 20S Proteasom ist als Multikatalytischer Protease Komplex der zentrale Bestandteil dieses Systems. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich gereinigtes 20S Proteasom aus HeLa-Zellen chromatographisch in Subtypen auftrennen lässt, die sich strukturell und in ihrer proteolytischen Aktivität unterscheiden. Nach Induktion der Zellen mit gamma-Interferon (gamma-IFN) werden Immuno-Proteasomen gebildet und es kommt zu einer Veränderung des Subtypen-Musters und der Aktivitäten. Unter dem Einfluss von gamma-IFN bilden sich hauptsächlich Mischkomplexe mit sowohl konstitutiven als auch Immuno-Untereinheiten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den Zellkompartimenten Cytoplasma, Zellkern und Microsomen von HeLaS3-Zellen unterschiedliche 20S Proteasom-Subtypen vorkommen. Dies war unter anderem auf eine unterschiedliche Glykosylierung einzelner proteasomaler Untereinheiten zurückzuführen. Die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion der 20S Proteasom-Subtypen ist im Hinblick auf neue diagnostische und therapeutische Ansätze in der Humanmedizin von großem Interesse.

Eigene Schlagworte: 20S Proteasom, Subtypen, Glykosylierung, HeLa, gamma-Interferon

Abstract

The Ubiquitin-proteasome system is responsible for the regulated protein degradation in eucaryotic cells. The 20S proteasome is as a multicatalytic protease the central complex of these system. This study has shown that it is possible to separate 20S proteasome subtypes from HeLa cells by chromatography. 20s proteasome subtypes differ in structure and proteolytic activity. The subtype-pattern and the activity are significantly changed after an induction of the cells with gamma-Interferon (gamma-IFN) under formation of immuno proteasomes. After gamma-IFN induction mainly mixed complexes have been formed with both constitutive and immuno subunits. Further it has been shown that in cell compartements cytoplasm, microsomes and nucleus of HeLaS3 cells different 20S proteasome subtypes are located. Among other things glycosylation of some subunits is responsible for that phenomenon. With regard to new strategies in diagnostic and therapy of human diseases the exactly knowledge of structure and function of the proteasome subtypes is a case of interest.

Keywords: 20S proteasome, Subtypes, Glycosylation, HeLa, gamma-IFN

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• 1 Einleitung
  • 1.1 Proteinmetabolismus als wichtiges regulatorisches Prinzip
  • 1.2 Das Ubiquitin-Proteasom-System
  • 1.3 Das 20S Proteasom
  • 1.4 Die Regulatorkomplexe und das 26S Proteasom
  • 1.5 Assemblierung des 20S Proteasoms
  • 1.6 Das Immuno-Proteasom
  • 1.7  Subzelluläre Lokalisation des Proteasoms
  • 1.8 Subpopulationen des Proteasoms
  • 1.9 Ziel der vorliegenden Arbeit
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Geräte 
    • 2.1.2 Chromatographie-Materialien und Fertigsäulen
    • 2.1.3 Reagenzien, Lösungen, Verbrauchsmaterialien
    • 2.1.4 Antikörper
    • 2.1.5 Enzyme und Lectine
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1 Zellkultur
      • 2.2.1.1 Zelllinien
      • 2.2.1.2 Kultur von adherenten Zellen:
      • 2.2.1.3 Kultur von Suspensionszellen:
      • 2.2.1.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen
    • 2.2.2 Proteinbiochemische Methoden
      • 2.2.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
      • 2.2.2.2 TCA Präzipitation
      • 2.2.2.3 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresen
      • 2.2.2.4 2D-Gelelektrophorese Non-Equilibrium-pH-Gradient-Elektrophorese (NEpHGE)
      • 2.2.2.5 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen
      • 2.2.2.6 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen
      • 2.2.2.7 Immunpräzipitation
      • 2.2.2.8 Westernblot und Immunodetektion
      • 2.2.2.9 ECL Detektion
    • 2.2.3 Isolierung von 20S Proteasomen aus HeLa- bzw. HeLa S3-Zellen 
      • 2.2.3.1 Differentielle Zentrifugation
      • 2.2.3.2 Isolation von 20S Proteasom aus Cytoplasma
        • 2.2.3.2.1 Anionenaustausch-Chromatographie
        • 2.2.3.2.2 Ammoniumsulfatfällung
        • 2.2.3.2.3 Gelfiltration
        • 2.2.3.2.4 FPLC - Anionenaustausch-Chromatographie
        • 2.2.3.2.5 Hydrophobe Interaktions-Chromatographie an Phenylsepharose
      • 2.2.3.3 Isolation von 20S Proteasom aus Zellkernen
      • 2.2.3.4 . Isolation von 20S Proteasom aus Microsomen
    • 2.2.4 Isolation von 20S Proteasomen mittels Affinitäts –Chromatographie 
    • 2.2.5  Analytik der gereinigten 20S Proteasomen
      • 2.2.5.1 Trennung der Proteasomen-Subtypen
      • 2.2.5.2 Bestimmung der proteolytischen Aktivität mit fluorogenen Substraten
      • 2.2.5.3  Verdau der 20S Proteasomen mit Glykosidasen
      • 2.2.5.4 Lectindetektion
      • 2.2.5.5 Kohlenhydrat-Analytik
        • 2.2.5.5.1 Monosaccharidanalyse
        • 2.2.5.5.2 Neuraminsäure-Analyse
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Einzelzellen enthalten mehrere 20S Proteasom-Subtypen
    • 3.1.1 20S Proteasom-Subtypen aus T2- und T2/LMP2+7-Zellen  
    • 3.1.2 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen
      • 3.1.2.1 Reinigung von 20S Proteasom aus dem Gesamtzell-Lysat von HeLa-Zellen
      • 3.1.2.2 Auftrennung der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen
      • 3.1.2.3  Analyse von 20S Proteasomen aus HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 48 bzw. 72 Stunden  
      • 3.1.2.4  Analyse von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 144 Stunden
  • 3.2 Gibt es 20S Proteasom-Mischkomplexe, in denen sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten vorkommen?
  • 3.3 Sind 20S Proteasom-Subtypen in verschiedenen Zellkompartimenten verteilt?
    • 3.3.1 Isolierung und Analyse von 20S Proteasom aus dem Gesamt-Zellysat von HeLaS3-Zellen 
    • 3.3.2 Isolierung von 20S Proteasom aus verschiedenen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen
  • 3.4  Strukturelle Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus verschiedenen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen
  • 3.5 Proteolytische Aktivitäten der einzelnen 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen
    • 3.5.1 Proteolytische Aktivitäten der uninduzierten HeLa –Zellen
    • 3.5.2  Proteolytische Aktivitäten der γIFN- induzierten adhärenten HeLa-Zellen
    • 3.5.3 Vergleich der proteolytischen Aktivitäten der 20S Proteasomen-Subtypen aus den einzelnen Zellkompartimenten
  • 3.6 Untersuchungen zur Glykosylierung von 20S Proteasom aus HeLa- und HeLaS3-Zellen
    • 3.6.1 Glykannachweis mit Lectinen
    • 3.6.2 Chemischer Nachweis von Kohlenhydraten in 20S Proteasom
      • 3.6.2.1 Nachweis der neutralen Monosaccharide
      • 3.6.2.2 Nachweis der Neuraminsäuren
    • 3.6.3 Proteolytische Aktivität von cytoplasmatischen 20S Proteasom-Subtypen nach Desialylierung 
• 4  Diskussion
  • 4.1 20S Proteasom-Subtypen aus Einzelzellen unterscheiden sich strukturell und funktionell voneinander
  • 4.2  Einfluß von γIFN und Bildung von 20S Proteasomen-Mischkomplexen führt zu einer Änderung des Subtypen-Musters und der proteolytischen Aktivitäten.
  • 4.3 Intermediär-Subtypen des 20S Proteasoms repräsentieren verschiedene Arten von Mischkomplexen
  • 4.4 Subzelluläre Lokalisation von 20S Proteasom-Subtypen in HeLaS3-Zellen
  • 4.5  Die 20S Proteasom-Subtypen aus den verschiedenen Zellkompartimenten unterscheiden sich strukturell und in ihren proteolytischen Aktivitäten.
  • 4.6 Glykosylierung als post-translationale Modifikation
    • 4.6.1 Nucleäre und cytoplasmatische Glykosylierung
    • 4.6.2 Die Rolle von O-GlcNAc-Modifikationen
    • 4.6.3 Glykosylierung des Proteasoms ?
• Literatur
• Anhang
  • Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Physiologische Funktionen des Ubiquitin-Proteasom-Systems
• Tab. 2: Nomenklatur der 20S Proteasom-Untereinheiten (Groll et al., 1997)
• Tab. 3: Reinigungsschema von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen
• Tab. 4: Reinigunsschema variiert nach Knühl (1999) von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen
• Tab. 5: Reaktion der 20S Proteasom-Untereinheiten aus HeLaS3 Cytoplasma, HeLaS3 Microsomen und HeLa Cytoplasma (20U/ml γIFN, 144h) mit den Lectinen TML (erkennt NANA) und STA bzw. WGA (erkennen GlcNAc). Ausgewertet wurden die 2D-Bilder aus den Abb. 25, 26, 27 und 28. (starke Intensität des Spots ++ ; Spot deutlich sichtbar + ; Spot nur sehr schwach sichtbar (+) ; Spot nicht sichtbar - )
• Tab. 6: Monosaccharidanalyse von cytoplasmatischen und microsomalen 20S Proteasom. Die Angaben erfolgten in pmol Monosaccharid / µg Protein. Monosaccharide: Fucose (Fuc), N-Acetyl-Galaktosamin (GalNAc), N-Acetyl-Glucosamin (GclNac), Galaktose (Gal), Glucose (Glc), Mannose (Man).
• Tab. 7: Neuraminsäureanalyse von 20S Proteasom aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen, Angabe in pmol/µg Protein.
• Tab. 8: Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 h bzw. 144 h mit γIFN inkubiert . (Auswertung der 2D-PAGE, optische Intensität: ++ stark; + gut sichtbar; (+) schwach).
• Tab. 9: Zusammenstellung möglicher Mischkomplexe des 20S Proteasoms unter Beachtung der Daten aus Assemblierungsuntersuchungen. (farbig gekennzeichnet sind Komplexe mit identischen Hemiproteasomen)
• Tab. 10: Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen der einzelnen Zellkompartimente in HeLaS3-Zellen (Auswertung der 2D-PAGE, optische Intensität: ++ stark; + gut sichtbar; (+) schwach). MECL-1 konnte bei den microsomalen Subtypen nicht eindeutig lokalisiert werden.

Bilder

• Abb. 1: Das Ubiquitin-Proteasom-System. (Annual Reviews Collection von Weissman, 1997)
• Abb. 2: Das Proteasom: Das 20S Proteasom setzt sich aus 28 (14 verschiedenen) Untereinheiten zusammen, die beiden äußeren Ringe werden von jeweils sieben α-Untereinheiten gebildet (grün). Die beiden inneren Ringe aus jeweils sieben ß-Untereinheiten beherbergen das katalytische Zentrum. Für die katalytischen Aktivitäten sind ß1, ß2 und ß5 (rot) verantwortlich. Der 19S Regulator-Komplex (auch PA700) besteht aus zwei Subkomplexen: dem Basis-Komplex (Base), welcher 6 AAA-ATPasen und zwei Nicht-ATPasen enthält, und dem Deckel-Komplex (Lid), welcher aus 10 Nicht-ATPasen besteht. Das 20S Proteasom mit zwei gebundenen 19S Regulator-Komplexen bildet das 26S Proteasom. (Kloetzel, 2001)
• Abb. 3: Assemblierung des 20S Proteasoms (Graphik von Krüger). Dieses Modell folgt im Wesentlichen den Daten von Schmidt et al., 1997 und Schmidtke et al. , 1997.
• Abb. 4: 20S Proteasom aus Hefe mit gebundenen PA26-Regulatorkomplexen aus Trypanosoma. In dieser Darstellung sieht man die gestreckte Konformation der C-termini der α-Untereinheiten nach Bindung von PA26, welche in der Regulatorkomplex hineinragen und somit die Öffnung des Kanals des 20S Komplexes bewirken. ( Whitby et al., 2000)
• Abb. 5: 20S Proteasom-Subtypen aus T2- und T2/LMP2+7-Zellen. Die Subtypen wurden an MiniQ P3.2/3 getrennt.
• Abb. 6: Westernblotanalyse der 20S Proteasomen-Subtypen aus T2 und T2/LMP2+7-Zellen. Es wurden die Peak-Fraktionen der einzelnen Subtypen auf einer SDS-PAGE aufgetrennt und die konstitutiven sowie die Immuno-Untereinheiten mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen.
• Abb. 7: 20S Proteasom aus dem Gesamtlysat von HeLa-Zellen. A: Mittels Anionenaustausch-Chromatographie an MiniQ P3.2/3 wurden drei Subtypen getrennt (links). Die Reinheit der aufgetragenen Probe wurde zuvor im SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung überprüft (rechts). B: Immunoblot-Analyse nach SDS-PAGE des Gesamtproteasoms. C: Immunoblotanalyse nach SDS-PAGE der einzelnen Fraktionen des Elutionsprofils (26µl/Fraktion). Veränderungen im Muster der 20S Proteasom-Subtypen unter dem Einfluss von γIFN in adhärenten HeLa-Zellen
• Abb. 8: Elutionsprofile der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen kultiviert in Ab- und Anwesenheit von 20U/ml γIFN für 48 bzw. 72 Stunden.
• Abb. 9: SDS-PAGE und Westernblot-Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert. Es wurden die einzelnen Fraktionen (26µl/Fraktion) des Elutionsprofils aufgetragen.
• Abb. 10: Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert, mittels 2D-PAGE. Die rechromatographierten Subtypen wurden in Kleingeltechnik mittels NEpHGE in die Untereinheiten getrennt und anschließend mit Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Menge von Subtyp I reichte für diese Analyse nicht aus. Von Subtyp II wurden 8,6 µg und von Subtype IIA und III wurden 11µg Protein aufgetragen. Die Zuordnung der Proteinspots zu den Proteasom-Untereinheiten erfolgte nach Claverol et al. (2002).
• Abb. 11: 20S Proteasom aus HeLa-Zellen, die 144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert wurden. A: Auftrennung in Subtypen an MiniQ P3.2/3. B: Immunoblot-Analyse des Gesamtproteasoms. (Es wurden je 8µg Protein aufgetragen.) C: Immunoblot-Analyse der 20S Proteasom-Subtypen nach Rechromatographie an MiniQ P3.2/3 (C3 diente als Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge, je 5µg).
• Abb. 12: Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 144 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert, mittels 2D-PAGE. Die rechromatographierten Subtypen wurden in Kleingeltechnik mittels NEpHGE in die Untereinheiten getrennt und anschließend mit Silberfärbung sichtbar gemacht. Es wurden je 5µg Protein aufgetragen. Die Zuordnung der Proteinspots zu den Proteasom-Untereinheiten erfolgte nach Claverol et al. (2002).
• Abb. 13: Analyse von 20S Proteasom aus adhärent wachsenden HeLa-Zellen, die mit δ-ZZ bzw. LMP2-ZZ transfiziert worden sind. Die Proteasomen aus den transfizierten Zellen wurden mit IgG-Sepharose isoliert und anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblot auf das Vorhandensein der Untereinheiten δ und LMP2 getestet. Als Kontrollen dienten Extrakte aus adhärend wachsenden HeLa-Zellen und in Suspension wachsenden HeLaS3-Zellen. Erstere exprimieren nur konstitutive Proteasom-ß-Untereinheiten (siehe Abb. 3B), während letztere auch in Abwesenheit von γIFN konstitutive und Immuno-Untereinheiten exprimieren und somit als Positivkontrolle für LMP2 benutzt wurden.
• Abb. 14: 20S Proteasom aus HeLa-Zellen mit den getagten Untereinheiten LMP2-ZZ bzw. δ-ZZ nach Induktion mit γIFN (20U/ml, 24 Stunden). Die 2D-Pattern oben zeigen die Coomassie-gefärbten Gele. Die Bilder darunter zeigen Immunoblots der 2D-Pattern.
• Abb. 15: 20S Proteasom aus dem Gesamtlysat von HeLaS3-Zellen. A: Auftrennung in Subtypen an MiniQ P3.2/3. B: Immunoblot-Analyse, aufgetragen wurden jeweils 5µg gereinigtes 20S Proteasom. C: NEpHGE-2D-Pattern des gereinigten 20S Proteasoms (aus 5µg).
• Abb. 16: Kontrolle der Kompartiment-Trennung von Cytoplasma und Microsomen aus HeLaS3-Zellen mittels Immunoblot-Analyse. A: Es wurden jeweils 10µg Protein aufgetragen vom Microsomen-Pellet der Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P. 100.000g); Cytoplasma-Überstand der Ultrazentrifugation bei 100.000g (Cyt.S 100.000g); Microsomen-Pellet der Ammo-niumsulfat-Fällung (Mic.P AS); Cytoplasma nach Gelfiltration (Cyt. GF); gereinigtes cyto-plasmatisches 20S Proteasom (Cyt. 20S); gereinigtes microsomales 20S Proteasom (Mic. 20S). B: Es wurden jeweils 10µg Protein aufge-tragen vom Gesamtzell-Lysat (Lysat ges.); Cyto-plasma-Überstand ohne Zellorganellen nach der Zentrifugation bei 15.000g (Cyt. S 15.000g); Cytoplasma-Überstand nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Cyt. S 100.000g); Microsomen-Pellet nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P 100.000g).
• Abb. 17: Kontrolle der Anreicherung von Kern-extrakt aus HeLaS3-Zellen mittels Immunoblot-Analyse. A und B: Es wurden jeweils 10 µg Protein aufgetragen vom Gesamtzell-Lysat (Lysat ges.); Cytoplasma-Überstand nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Cyt. S 100.000g); Microsomen-Pellet nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P 100.000g); angereicherte Kern-fraktion nach Dichtegradienten-Zentrifugation (Nuc. DG); Kernextrakt, Überstand nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Nuc. S 100.000g); Kernmembran und assoziierte ER-Membranen, Pellet nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Nuc. P 100.000g).
• Abb. 18: Elutionsprofile der 20S Proteasomen-Subtypen aus den einzelnen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen
• Abb. 19: Immunoblot-Analyse der 20S Proteasomen der einzelnen Zellkompar-timente von HeLaS3-Zellen. A: Cyto-plasma; B: Microsomen; C: Nuclei. Es wurden jeweils 10µg gereinigtes 20S Proteasom aufgetragen.In Abb.19 ist zu sehen, dass in allen Kompartimenten sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten vorhanden sind. Aber auch hier sind deutliche Unterschiede zwischen den 20S Proteasomen aus den einzelnen Zell-Kompartimenten erkennbar. Die cytoplasmatischen Proteasomen zeigen bei MB1, LMP7, Z und MECL-1 höhermolekulare Banden über denen der reifen Untereinheit. Es sind hier, wie schon erwähnt, eher Kreuzreaktionen mit anderen Untereinheiten als Proformen anzunehmen, da die 20S Proteasomen proteolytisch aktiv waren. Bei MECL-1 ist allerdings wegen der veränderten Position des Spots in der 2D-PAGE auch das Vorhandensein der Proform möglich. Es wurden bei allen Analysen für die einzelnen Untereinheiten derselbe Antikörper verwendet, es zeigten sich aber zum Teil deutliche Unterschiede im Hinblick auf die Bandenmuster. Möglicherweise ist dies ein Hinweis auf verschiedene Modifikationen der entsprechenden Untereinheit. Eventuell könnten dies Gründe für die unterschiedlichen Subtypen-Pattern der 20S Proteasomen sein.
• Abb. 20: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen CI-CIV aus der cytoplasmatischen Fraktion von HeLaS3-Zellen. Es wurden 5µg (CI) bzw. 8,5µg (CII-CIV) in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).
• Abb. 21: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen MI-MIV aus der microsomalen Fraktion von HeLaS3-Zellen. Es wurden 8µg in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).
• Abb. 22: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen NII und NIII aus der nucleären Fraktion von HeLaS3-Zellen (von NI und NIV war nicht genug Material vorhanden). Es wurden 5µg in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).
• Abb. 23: Vergleich der spezifischen proteo-lytischen Aktivitäten der 20S Proteasom-Subtypen aus adhären-ten uninduzierten HeLa-Zellen. Die Werte wurden aus fünf un-abhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt.
• Abb. 24: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 144 Stunden. Die Werte wurden aus vier un-abhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt.
• Abb. 25: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma (C ), den Microsomen (M) und den Nuclei (N) von HeLaS3-Zellen. Die Werte wurden aus drei unabhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt. Von Subtyp CI und NI konnten wegen der geringen Mengen keine auswertbaren Daten erstellt werden.
• Abb. 26: Vergleich der proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom aus den Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen. Berechnung der Mittelwerte aus den Aktivitätsmessungen der einzelnen Subtypen.
• Abb. 27: 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen. Die Auftrennung der Subtypen erfolgte an MiniQ P3.2/3 A: ohne Behandlung und B: nach Behandlung mit Neuraminidase („D“ bedeutet desialyliert). Die Inkubation wurde mit 50mU/ml Neuraminidase und 25µg/ml Proteasom bei 37°C für 16 Stunden durchgeführt.
• Abb. 28: 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen. Die Auftrennung der Subtypen erfolgte an MiniQ P3.2/3. Die Inkubationen wurden mit jeweils 50mU/ml Neuraminidase und 25µg/ml Proteasom bei 37°C für 0, 2, 4, 16, 24 und 30 Stunden durchgeführt. Zu jeder Probe wurde ein entsprechender Ansatz ohne Enzym als Blindprobe mit inkubiert. Alle Blindproben zeigten unverändert das Muster wie die Probe „0h“ (nicht dargestellt).
• Abb. 29: NEpHGE-Auftrennung mit Silberfärbung von cytoplasmatischen 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen mit und ohne Behandlung mit Neuraminidase. Es wurden 10µg Proteasom mit 50mU/ml Neuraminidase bei 37°C für 16 Stunden inkubiert.
• Abb. 30: 20S Proteasom der cytoplasmatischen Subtypen CIII und CIV aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amidoschwarz, TML-Biotin (erkennt NANA), STA-Biotin (erkennt GlcNAc) und ConA-Biotin (erkennt Mannose und Glucose) angefärbt. Die schwarzen Pfeile markieren Unterschiede zwischen den Subtypen, jeweils verglichen mit der gleichen Nachweis-Methode. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben.
• Abb. 31: 20S Proteasom der microsomalen Fraktion aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amido-schwarz, TML-Biotin (erkennt NANA), STA-Biotin (erkennt GlcNAc) und ConA-Biotin (er-kennt Mannose und Galaktose) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Posi-tionen der Unter-einheiten angegeben.Es wurden daraufhin die microsomalen 20S Proteasom-Subtypen MII und MIII untersucht (Abb.32). Wegen des geringen zur Verfügung stehenden Materials konnte hier nur die Reaktion mit TML der zwei Subtypen MII und MIII verglichen werden.
• Abb. 32: 20S Proteasom-Subtypen MII und MIII der microsomalen Fraktion aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amidoschwarz, TML-Biotin (erkennt NANA) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben.
• Abb. 33: 20S Proteasom der aus HeLa-Zellen (144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert). Die auf PVDF-Membranen geblotteten Probe (je 10µg) wurde mit Amidoschwarz, Antiproteasom-Antikörper, TML-Biotin (erkennt NANA), WGA-Biotin (erkennt GlcNAc) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben. Beim Westernblot mit dem Antiproteasom-Antikörper (Nr. 67 gegen humanes 20S Proteasom) fehlen die Untereinheiten ι und C10 (schwarze Pfeile). Die Position von MECL-1 ist mit einem blauen Pfeil markiert.
• Abb. 34: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen ohne (C) und nach Neuraminidase-Behandlung (D) mit 50mU/ml bei 37°C für 16 Stunden.
• Abb. 35: Alternative Wege für den Einbau von katalytischen Untereinheiten in die Ringe aus ß-Untereinheiten. Die durchgestrichenen Mög-lichkeiten führen nicht zu reifen Proteasomen, sondern zur Akkumulation von Pre-proteasomen. M: MECL-1; 2: LMP2; 7: LMP7; δ; Z. Immuno-Untereinheiten sind gelb und konstitutive sind blau dargestellt. Quadrate: ß1; Kreise: ß2; Dreiecke: ß5. (De et al., 2003)
• Abb. 36: Struktur von tetramerem ConA mit Trimannosidliganden (Kalottenmodell in lila und rot) und mit den koordinativ gebundenen Ca²⁺ und Mn²⁺ Ionen (grün und pink). (Naismith & Field, 1996)Es wurde gezeigt, dass Neuraminsäure-haltige Glykane an der cytoplasmatischen Seite des nuclear envelope vorkommen. Das Lectin SNA band an die Nucleoporine p62 und p180, von denen bekannt war, dass sie O-GlcNAc enthielten (Emig et al., 1995). Anfang der 90er Jahre haben Studien von Duverger, Monsigny und Kollegen Hinweise darauf gegeben, dass Kohlenhydrat-Reste eventuell als Nucleäre Lokalisationssignale fungieren könnten (Duverger et al., 1993, 1995, 1996; Roche & Monsigny, 1996).
• Abb. 37: Komplexes Zusammenspiel zwischen O-GlcNAc und Phosphat-Modifikation. Ein Protein kann glykosyliert (1 und 3) oder phosphoryliert (2) werden. Beide Modifikationen können alternativ an der selben Stelle (4) oder an unterschiedlichen Stellen (5) erfolgen oder die beiden Modifikationen bedingen und beeinflussen sich gegenseitig (1-6, 2-7). All diese Modifikationen können einer Modulierung der Proteinfunktion dienen (Comer & Hart, 2000).