1 Einleitung

1.1 Proteinmetabolismus als wichtiges regulatorisches Prinzip

In der belebten Materie findet man als Grundprinzip ein Gleichgewicht zwischen Anabolismus und Katabolismus, das in unterschiedlicher Art und Weise reguliert wird und den jeweiligen Organismus auf sich verändernde Umwelteinflüsse reagieren lässt. Auf makro- wie auf mikrokosmischer Ebene existieren natürliche Rohstoffkreisläufe, in welchen die beim Abbau anfallenden Grundbausteine wieder dem Aufbau neuer Strukturen zugeführt werden.

Auf zellulärer Ebene wird besonders deutlich, dass es sich hierbei nicht ausschließlich um reines Recycling handelt, sondern dass über kontrollierten Auf- und Abbau z.B. von Proteinen die Regulation lebenswichtiger Prozesse in der Zelle stattfindet. Die Selektivität der intrazellulären Proteolyse kann einerseits durch eine räumliche Trennung gewährleistet werden, wie es z.B. beim lysosomalen Proteinabbau der Fall ist. Lysosomale Proteasen sind hochaktiv aber relativ unspezifisch und die Auswahl der Substrate findet in diesem Falle bei ihrem Eintritt in das membranumschlossene Zellorganell statt. Dem stehen hochspezifische proteolytische Systeme gegenüber, die ihre Substrate an bestimmten Markierungen erkennen und diese gezielt abbauen. Diese Systeme sind entscheidend an verschiedenen Regulationsprozessen im Cytoplasma und Zellkern beteiligt. Ein solches System ist die multikatalytische Proteinase – auch Proteasom genannt.

1.2 Das Ubiquitin-Proteasom-System

Der Ubiquitin-abhängige Proteinabbau erfolgt durch das 26S Proteasom und dient dem Recycling und dem Entfernen gealterter bzw. schädlicher Proteine in der Zelle. Regulatorische Funktion hat das Proteasom vor allem durch den Abbau von Transkriptions-Faktoren oder deren Inhibitoren. Das Proteasom generiert Peptide, welche von den MHC-I-Molekülen an der Zelloberfläche aller kernhaltigen Zellen präsentiert werden. Antigene Peptide werden so von den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) über den CD8+ - T-Zellrezeptor erkannt und die betreffende Zelle wird eliminiert, z.B. indem sie über Cytokinsignale aktiviert wird und die Apoptose durchläuft. Diese Antigene können viraler oder auch körpereigener Natur sein und werden über diesen Weg dem Immunsystem zugänglich gemacht. Es handelt sich dabei um falsch gefaltete, funktionslose Proteine, welche in großer Zahl bei neoplastischen Zell-Transformationen auftreten. Aber auch im physiologischen Proteinstoffwechsel erreichen etwa 30-40% der neusynthetisierten Proteine auf Grund von Fehlern in der Translation oder bei der post-translationalen Modifikation nie ihre eigentliche Form und Struktur und werden in kurzer Zeit wieder abgebaut. Die Existenz von solchen sogenannten metastabilen Proteinen ist schon seit langem bekannt (Wheatley, 1982). Hershko & Ciechanover (1982) fanden, dass kurzlebige Proteine von einem ATP-Ubiquitin-abhängigen Proteolyse-System abgebaut werden. Hough et al. (1986) identifizierten das Proteasom als proteolytischen Bestandteil dieses Systems. Es hat sich gezeigt, dass diese kurzlebigen Proteine, auch als DRiPs (defective ribosomal products) bezeichnet, eine Quelle für antigene Peptide darstellen, die über den MHC-KlasseI-Weg präsentiert werden und durch die das Immunsystem praktisch ständig über den Zustand einer Zelle informiert wird. Beim Auftreten von körperfremden Antigenen infolge pathologischer Prozesse wird die Zelle möglichst schnell aus dem Zellverband isoliert und abgetötet und somit die Verbreitung einer viralen Infektion oder Tumorwachstum zu verhindert.


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Tab. 1: Physiologische Funktionen des Ubiquitin-Proteasom-Systems

Funktion

Beispiele für Substrate

Immunabwehr

körpereigene und -fremde Proteine im Cytosol und im Kern

Zellzyklus

Cycline, p21

Onkogenese

P53, p27Kip1, bax, IκB

Apoptose

Bcl-2, IAP (Inhibitors of apoptosis proteins), IκB

Entzündungsreaktion

IκB, p105

Stoffwechselregulation

Ornithindecarboxylase, HMG-CoA-Reduktase

Regulation der Genexpression

c-Jun, c-Myk, c-Fos E2F1, IκB, ß-Catenin

Die meisten wachsenden Zellen durchlaufen eine Serie von kontrollierten Übergängen von einer Phase zur nächsten im Zellzyklus. Dies wird durch den zeitgenauen Abbau von Zell-Zyklus-Regulatoren kontrolliert.

In letzter Zeit wurden sehr viele Untersuchungen mit verschiedenen Proteasom-Inhibitoren durchgeführt, vor allem im Hinblick auf neue Strategien in der Krebstherapie. Diese Substanzen verhindern den Abbau von z.B. Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinase Inhibitoren und stoppen so den Fortschritt der Zellteilung. Auch werden Entzündungsmediatoren beeinflusst wie NFκB, dessen Inhibitor IκB normalerweise durch das Proteasom abgebaut wird und so eine Aktivierung von NFκB bewirkt. Dieser Prozess wird durch Proteasominhibitoren gestoppt. Sie induzieren außerdem eine Caspase-abhängige Apoptose in Tumorzellen (Hideshima et al., 2003 ; Liu et al., 2003).

1.3 Das 20S Proteasom

Das 20S Proteasom ist das sogenannte core-Partikel des ATP-Ubiquitin-abhängigen Proteolyse-Systems und stellt eine sehr alte Struktur in der Evolution dar. Das Proteasom ist in Eukaryonten ubiquitär und essentiell (Heinemeyer, 2000), in Archaea ist es ubiquitär, aber nicht essentiell (Ruepp et al., 1998) und in Bakterien kommt es selten vor und ist nicht essentiell (De Mot et al., 1999). Die Quartärstruktur des 20S Proteasoms ist hochkonserviert. Das Archaebakterium Thermoplasma acidophilum besitzt das einfachste Proteasom aus zwei verschiedene Untereinheiten, die mit αund ß bezeichnet wurden (Dahlmann et al., 1989). Die Untereinheiten sind in vier heptameren Ringen übereinander angeordnet , wobei die beiden α-Ringe außen und die katalytisch aktiven ß-Ringe innen liegen (Löwe et al., 1995). Das eukaryontische Proteasom zeigt einen komplexeren Aufbau:

28 Untereinheiten, je14 verschiedene α- und ß-Untereinheiten, bilden 4 heptamere Ringe und formen zusammen den zylinderförmigen Komplex mit einer Länge von 15 nm und einem Durchmesser von 11 nm. Die Einteilung von α- und ß-Untereinheiten erfolgte aufgrund von Sequenzhomologien zu den Untereinheiten von Thermoplasma acidophilum (Tanaka et al. 1992). Die beiden Ringe aus ß-Untereinheiten befinden sich in der Mitte des Komplexes und bilden eine zentrale Kammer, welche das katalytische Zentrum beherbergt. Die beiden Ringe aus α - Untereinheiten bilden mit den angrenzenden Ringen aus ß-Untereinheiten außen jeweils zwei flankierende Kammern. Außerdem dienen sie der Bindung von Regulatorkomplexen (siehe unter 2.2) und bestimmte Aminosäurereste einiger α - Untereinheiten verschließen die katalytische Kammer und führen so zum sogenannten latenten 20S Proteasom (siehe unten). Die katalytische Aktivität geht von den ß-Untereinheiten ß1 (δ) , ß2 (Z) und ß5 (MB-1) aus. Aufgrund von Untersuchungen in S. cerevisiae mit kurzen, fluorigenen Peptidsubstraten (Orlowski, 1990; Rivett , 1989; Heinemeyer et al., 1991; Hilt et al., 1993) wurden zunächst die einzelnen Untereinheiten für verschiedene proteolytische Aktivitäten verantwortlich gemacht: ß1 (δ) für die PGPH-Aktivität (Spaltung nach sauren Aminosäuren), ß2 (Z) für die tryptische Aktivität (Spaltung nach basischen Aminosäuren) und ß5 (MB1) für die chymotryptische Aktivität (Spaltung nah hydrophoben Aminosäuren). In späteren Arbeiten an Mammalia -Proteasom mit längeren Peptidsubstraten von physiologischer Relevanz zeigte sich jedoch, dass diese Zuordnung nicht eindeutig erfolgen kann (Eleuteri et al., 1997; Schmidtke et al., 1998; Kisselev et al., 1999). Die [Seite 11↓]ß-Untereinheiten werden mit einer N-terminalen Prosequenz synthetisiert. Während der Assemblierung des 20S Proteasoms kommt es durch autokatalytische Abspaltung der Prosequenz zur Freisetzung der katalytisch aktiven Threonin-Reste (Schmidtke et al.,1996), deren Hydroxylgruppen als Nucleophil an der proteolytischen Spaltung beteiligt sind. Das Proteasom ist somit der Gruppe der N-terminalen nucleophilen Hydrolasen zuzuordnen (Bochtler et al., 1999). In höheren Eukaryonten mit einem adaptiven Immunsystem werden unter dem Einfluss von α-Interferon drei zusätzliche ß-Untereinheiten exprimiert: die sogenannten Immunountereinheiten ß1i (LMP2), ß2i (MECL-1) und ß5i (LMP7). Diese ersetzen die konstitutiven katalytischen Untereinheiten ß1, ß2 und ß5 und bilden sogenannte Immunoproteasomen (Groll et al., 1997). ß1i (LMP2) hat im Vergleich zu ß1 (δ) eine geringere PGPH-Aktivität, ß5i (LMP7) zeigt wie ß5 (MB1) auch chymotryptische Aktivität und ß2i (MECL1) hat wie ß2 (Z) tryptische Aktivität.

Tab. 2: Nomenklatur der 20S Proteasom-Untereinheiten (Groll et al., 1997)

systematischer Name

H. sapiens (M. musculus)

systematischer Name / induzierbare Untereinheit

H. sapiens (M. musculus)/ induzierbare Untereinheit

α1

ι (iota)

ß1 / ß1i

Y (δ) / LMP2

α2

C3

ß2 / ß2i

Z / MECL-1

α3

C9

ß3

C10

α4

C6

ß4

C7

α5

ζ (zeta)

ß5 / ß5i

X (MB1) / LMP7

α6

C2

ß6

C5

α7

C8

ß7

N3

Die zwei äußeren α-Ringe formen in der Mitte ein hydrophobes Zentrum und verschließen das Proteasom. Die N-Termini der α-Untereinheiten sind sehr flexibel und interagieren alle mit dem N-Terminus der α3-Untereinheit. Eine einzige Punktmutation in diesem Bereich führt zu einer geöffneten Konformation des Hefeproteasoms (Groll et al., 2000). Durch diese Interaktion wird der Substratzugang kontrolliert.

1.4 Die Regulatorkomplexe und das 26S Proteasom

In vivo findet ein kontrollierter Substratabbau unter Bindung verschiedener Regulatoren an die α-Ringe des 20S Proteasoms statt. Solche aktivierenden Regulatoren sind der 11S Komplex PA28 (Yang et al., 1992) und der 19S Regulator auch als PA700 bezeichnet (Chu-Ping et al.,1994; Rechsteiner et al.,1993). In der Zelle ist das 20S Proteasom häufig mit dem 19S Regulator assoziiert. Die Bindung von zwei 19S Komplexen an die α- Ringe des core-Partikels ist ATP-abhängig und lässt das 26S Proteasom entstehen, einen etwa 2000 kDa großen Komplex. Dieses ist der zentrale Bestandteil des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbaus in der Zelle. Ubiquitin (Ub) ist ein 76 Aminosäuren langes Protein, welches ubiquitär in vielen Organismen vorkommt. Zum Abbau bestimmte Proteine werden durch Polyubiquitin-Ketten markiert, wobei das Ubiquitin zunächst durch das Ub-aktivierende Enzym E1 ATP-abhängig aktiviert wird. Es wird dann auf das Ub-konjugierende Enzym E2 übertragen, welches dann an die Ub-Ligase E3 bindet. E3 ist seinerseits mit sogenannten F-Box-Proteinen assoziiert, die Target-Proteine erkennen und binden. Findet eine solche Bindung statt, wird die Polyubiquitinkette von E2 auf das abzubauende Target-Protein übertragen. Dieses markierte Target-Protein wird vom 19S Regulator des 26S Proteasoms gebunden, entfaltet und vom Proteasom abgebaut (Goldberg et al., 2001).


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Abb. 1: Das Ubiquitin-Proteasom-System. (Annual Reviews Collection von Weissman, 1997)

Der 19S Regulator setzt sich aus mindestens 18 Untereinheiten zusammen und wird in Basis- (base-) und Deckel- (lid-) Komplex eingeteilt (Glickman et al., 1998). Der Basis-Komplex bindet an das 20S Proteasom und enthält 6 ATPasen, welche zu den TripleA-ATPasen gehören (ATPases associated with a variety of cellular activities) (Confalonieri et al., 1995; Dubiel et al.,1992). Des weiteren enthält er noch zwei nicht-ATPase-Untereinheiten. Der Deckel-Komplex besteht aus bis zu 10 nicht-ATPase-Untereinheiten. Die ATPasen des Basis-Komplexes besitzen chaperon-ähnliche Funktionen und sorgen für die Bindung und Entfaltung des ubiquitinylierten Substrates. Die Funktion des Deckelkomplexes ist noch weitgehend unbekannt. Durch die Bindung des 19S Regulators wird das Proteasom stark aktiviert, was vermutlich auf ein Öffnen des α- Ringes beruht. Ein weiterer Regulator-Komplex ist der 11S- oder PA28-Komplex. PA28 bindet ATP-unabhängig an das 20S Proteasom und wird nach γ-Interferoninduktion hochreguliert. In Verbindung mit dem 20S Proteasom werden dann verstärkt antigene Peptide gebildet, welche von MHC-Klasse I-Molekülen gebunden und an der Zellaußenseite präsentiert werden. Der PA28-Komplex besteht im Wesentlichen aus den Untereinheiten α und ß und es besteht außerdem eine große Homologie zu dem sogenannten Ki-Antigen, welches auch als PA28γ bezeichnet wird (Wilk et al., 2000). PA28 ist ein ringförmiger, wahrscheinlich heteroheptamerer Komplex mit der Stöchiometrie α3ß4 (Knowlton et al., 1997; Zhang et al., 1999).


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Abb. 2: Das Proteasom: Das 20S Proteasom setzt sich aus 28 (14 verschiedenen) Untereinheiten zusammen, die beiden äußeren Ringe werden von jeweils sieben α-Untereinheiten gebildet (grün). Die beiden inneren Ringe aus jeweils sieben ß-Untereinheiten beherbergen das katalytische Zentrum. Für die katalytischen Aktivitäten sind ß1, ß2 und ß5 (rot) verantwortlich. Der 19S Regulator-Komplex (auch PA700) besteht aus zwei Subkomplexen: dem Basis-Komplex (Base), welcher 6 AAA-ATPasen und zwei Nicht-ATPasen enthält, und dem Deckel-Komplex (Lid), welcher aus 10 Nicht-ATPasen besteht. Das 20S Proteasom mit zwei gebundenen 19S Regulator-Komplexen bildet das 26S Proteasom. (Kloetzel, 2001)

1.5 Assemblierung des 20S Proteasoms

Eine wichtige Rolle bei der Assemblierung und Reifung des core-Partikels spielen Chaperone, wie z.B. hsc70 und das proteasome maturation protein POMP (Schmidt et al.,1999). Es werden zwei verschiedene Hypothesen zur Zeit diskutiert: Zum einen vermutet man, dass sich zunächst die α-Ringe zu noch instabilen Heptameren formieren. Erst nach Bindung der ß-Untereinheiten ß2, ß3 und ß4 entsteht ein langlebiges Intermediat, sogenannter 13S Precursor, welches in Eukaryonten nachgewiesen wurde (Yang et al., 1995, Schmidtke et al., 1996). Vermutlich binden dann unter Mitwirkung von POMP die noch fehlenden ß-Untereinheiten, wobei ß1, ß2 und ß5 in der Proform vorliegen, es bilden sich sogenannte Hemi-Proteasomen (300kDa). Durch Dimerisierung entstehen sogenannte 16S Pre-Holo-Proteasomen (600kDa), welche proteolytisch inaktiv sind und den kompletten Satz an Untereinheiten, zum Teil in Form von Proproteinen, enthalten. Erst nach Abspaltung von POMP und autokatalytischer Abspaltung der Prosequencen der ß-Untereinheiten entsteht das reife 20S Proteasom. Das unterschiedliche Sedimentationsverhalten von 16S und 20S Proteasom, obwohl die gleichen molekularen Massen vorliegen, wird der kompakteren globulären Form des 16S Komplexes zugeschrieben (Heinemeyer, 2000). Dieses Modell entspricht hinsichtlich der Präassemblierung des α-Ringes der Biogenese von Thermoplasma-Proteasom (Zwickl et al. 1992). Das zweite Modell orientiert sich mehr an Daten, welche bei Untersuchungen an Rhodococcus gefunden wurden (Zühl et al., 1997). Rhodococcus ist ein Eubakterium mit je 2 α- und 2 ß-Untereinheiten, welche sehr ähnliche Strukturen haben, wobei die ß-Untereinheiten ein sehr langes Propeptid aufweisen. Hier wurde kein freier α7-Ring beobachtet, vielmehr lagern sich hier jeweils eine α- und eine ß-Untereinheit zu Heterodimeren zusammen, wobei jede Kombination möglich ist. Es folgt dann eine schrittweise Zusammenlagerung und die finale Prozessierung zum reifen 20S Proteasom. Neuere Daten aus Experimenten mit Yeast-2-Hybrid-System lieferten Indizien für die Hypothese der frühen Interaktion zwischen α- und ß-Untereinheiten (Cagney et al., 2001).Beim Übergang vom 16S zum reifen 20S Proteasom und daraus folgenden Konformationsänderungen sind vermutlich [Seite 14↓]cytosolische Chaperone der Hsp70-Familie beteiligt, die nachweislich mit dem 16S Komplex assoziiert sind (Schmidt et al., 1997). Den bei einigen ß-Untereinheiten gefundenen C-terminalen Verlängerungen wird eine Funktion bei der Zusammenlagerung der zwei Halb-Proteasomen zugeschrieben, eine Deletion der C-terminalen Extension von ß7 in Hefe führte zu einer Akkumulation von Halbproteasomen (Ramos et al., 2004). Zur Funktion der Proproteine gibt es auch mehrere Hypothesen (Arendt & Hochstrasser, 1999; Groll et al., 1999): Da im Halb-Poteasom die ß-Untereinheiten noch nicht im Inneren des Proteasom-Zylinders verborgen sind, wird durch die N-terminalen Propeptide die proteolytische Aktivität blockiert und ein unkontrollierter Proteinabbau verhindert.Zum anderen wird eine intramolekulare „Chaperon“-Funktion diskutiert, bei welcher die ß-Proproteine für eine korrekte, einbaufähige Faltung und die richtige Positionierung der ß-Untereinheiten sorgen.Zusätzlich könnten die Prosequenzen auch als Schutz vor Inaktivierung durch eine N-α-Acetylierung des N1 aktiven Threoninrestes der reifen Form wichtig sein.

Abb. 3: Assemblierung des 20S Proteasoms (Graphik von Krüger). Dieses Modell folgt im Wesentlichen den Daten von Schmidt et al., 1997 und Schmidtke et al. , 1997.

1.6 Das Immuno-Proteasom

Wie bereits dargelegt ist das Proteasom bei höheren Eukaryonten eine wichtige Komponente des Immunsystems. Das antivirale Cytokin γ-Interferon (γIFN) wird in Mammalia während einer Immunantwort von T-Zellen gebildet und induziert in den Zellen eines entzündeten Gewebes die Synthese von immun-relevanten Strukturen, wie z.B. MHC-Klasse I-heavy chain (major histocompatibility complex), TAP-Proteine (transporter associated with antigen processing), den Proteasom-Aktivator PA28 und die ß-Untereinheiten ß1i (LMP2), ß2i (MECL-1) und ß5i (LMP7). Während LMP2 und LMP7 auf den MHC-loci codiert werden, trifft dies für MECL1 nicht zu, was ein Grund für die wesentlich spätere Entdeckung dieser dritten Immuno-Untereinheit war. Es werden per de novo Assemblierung Immuno-Proteasomen gebildet, wobei die Immuno-Untereinheiten die konstitutiven ß-Untereinheiten ß1(δ), ß2 (Z) und ß5 (MB1) ersetzen (Frentzel et al. 1994). Der Einbau der Immuno-Untereinheiten erfolgt kooperativ: MECL-1 wird verstärkt eingebaut, wenn LMP2 vorhanden ist, während der Einbau von LMP2 unabhängig von MECL-1 ist. LMP7 hat auf den Einbau von MECL-1 keinen Einfluss, scheint die Kinetik der Immuno-Proteasom-Formierung zu beeinflussen [Seite 15↓](Groettrupp et al., 1996a). Die Immuno-Untereinheiten beeinflussen untereinander nicht nur ihren Einbau, sondern auch die Prozessierung. Griffin et al. (1998) zeigten, dass Preproteasomen mit MECL-1 und LMP2 für eine effiziente Prozessierung LMP7 benötigen. Dieser Effekt war nicht von der katalytischen Aktivität sondern von der Prosequenz von LMP7 abhängig. Sie vermuteten aufgrund ihrer Ergebnisse ein kooperatives Modell, bei welchem in den zwei „Haupt-Assemblierungs-Wegen“ entweder reine Immuno- oder reine konstitutive 20S Proteasomen gebildet werden und in untergeordneten „Neben-Wegen“ auch einige gemischte Komplexe entstehen können. Durch γIFN-Induktion ändert sich die proteolytische Aktivität der Proteasomen. Der Ersatz von δ durch LMP2 verringert die PGPH-Aktivität. LMP2 bildet eine kleinere, unpolare Substratbindungstasche (P1 pocket) aus, welche die Bindung von sauren Resten erschwert (Groll et al. 1997). Desweitern besitzt LMP7 zwar wie MB1 hauptsächlich chymotryptische Aktivität, schneidet aber mit größerer Präferenz nach verzweigten Aminosäuren (Eleuteri et al, 1997). MECL-1 hat wie Z tryptische Aktivität, bisher ist kein Unterschied in der Schnittpräferenz zwischen diesen beiden Untereinheiten bekannt. Das Immuno-Proteasom schneidet also verstärkt nach basischen und hydrophoben, sowie verzweigten Aminosäureresten und bildet somit Peptide, welche eine höhere Affinität zu TAP- und MHC-Klasse-I-Molekülen besitzen (Kuckelkorn et al. 1995). In Untersuchungen an transfizierten Mammalia -Zellinien, welche konstitutiv – also γIFN-unabhängig – Immuno-Untereinheiten exprimieren, wurden sowohl qualitative als auch quantitative Effekte hinsichtlich veränderter Substratspezifität beobachtet. Einige virale Epitope wurden ausschließlich von Immuno-Proteasomen generiert, während andere nur mit höherer Effizienz gebildet wurden (Sijts et al. 2000a und b). Welchen Einfluss hat PA28 auf die Antigen-Präsentation? In Untersuchungen an Zellinien, welche PA28 γIFN-unabhängig exprimieren, wurde gezeigt, dass die Präsentation einiger viraler Antigene gesteigert ist, obwohl keine Immuno-Untereinheiten vorhanden waren und sowohl der Gesamt-Proteinumsatz, als auch der Umsatz viraler Proteine nicht erhöht war (Groettrup et al. , 1996b; van Hall et al. 2000). Neuere kinetische Studien deuten darauf hin, dass die Bindung von PA28 die Substrataffinität des Proteasoms erhöht, ohne die maximale Aktivität des core-Partikels zu beeinflussen, vermutlich durch eine verstärkte Aufnahme von Substrat oder eine schnellere Abgabe von Peptiden (Stohwasser et al., 2000). Wahrscheinlich wird das durch eine allosterische Konformationsänderung des Proteasoms und somit eine Öffnung des zentralen Kanals bewirkt, wie es für den PA28-ähnlichen Regulatorkomplex PA26 aus Trypanosoma brucei beschrieben wurde (Whitby et al. 2000). Die Existenz von heterogenen Komplexen der Zusammensetzung 19S-20S-PA28 lässt vermuten, dass der 19S Regulator geschwindigkeitsbestimmend für die Bindung und den Transport der Substrate ist, während PA28 verantwortlich ist für die Produktfreisetzung (Tanahashi et al., 2000).

Abb. 4: 20S Proteasom aus Hefe mit gebundenen PA26-Regulatorkomplexen aus Trypanosoma. In dieser Darstellung sieht man die gestreckte Konformation der C-termini der α-Untereinheiten nach Bindung von PA26, welche in der Regulatorkomplex hineinragen und somit die Öffnung des Kanals des 20S Komplexes bewirken. ( Whitby et al., 2000)


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1.7  Subzelluläre Lokalisation des Proteasoms

Die Aussage über die Lokalisation des Proteasoms in eukaryotischen Zellen ist generell schwierig. Problematisch dabei ist nicht nur die relativ große Menge an Proteasom in den meisten Zellen (z.B. 0,6% des Gesamtproteingehaltes in HeLa-Zellen), sondern auch die Gewebe-, Entwicklungs- und Zellzyklus-abhängige Variation ihrer Lokalisation. Außerdem ergaben verschiedene Nachweismethoden sehr unterschiedliche und zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. Immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen mit GFP-getagten Untereinheiten oder Antikörpern zeigten meistens eine relativ gleichmäßige Verteilung von 20S-Proteasom im Cytoplasma mit Ausnahme von vakuolären Strukturen wie Lysosomen etc. und eine etwas stärkere Färbung des Zellkernes mit Ausnahme des Nukleolus. Diese etwas höhere Intensität der Zellkernfärbung beruht aber wohl hauptsächlich auf der höheren Dichte der gefärbten Partikel in diesem Kompartiment und nicht auf einem tatsächlich höheren Gehalt. Untersuchungen von Palmer et al. (1996), die Rattenleber in die einzelnen Zellkompartimente fraktioniert und die Fraktionen danach mittels Immunoblot gegen 20S-Proteasom-Untereinheiten getestet haben, ergaben folgende Verteilung von 83% cytoplasmatisch, 11% microsomal und 5% nukleär. In der gleichen Arbeitsgruppe wurden zuvor mittels Immunogoldfärbung und Elektronenmikroskopie an kultivierten Rattenhepatozyten 17% der 20S Proteasomen im Zellkern lokalisiert (Rivett et al., 1992). Der Unterschied wurde auf die Nachweismethode und nicht auf Verluste bei der Aufarbeitung zurückgeführt. Generell erfolgte zunächst eine Einteilung in cytoplasmatische und nukleäre Proteasomen, wobei die ER-assoziierten mit zu den ersteren gezählt wurden.Cytoplasmatische 20S Proteasomen diffundieren zum größten Teil frei, einige sind mit dem ER und dem cis Golgi assoziiert, einige sind mit Anteilen des Cytoskeletts (z.B. mit Actin- und Intermediärfilamenten und Centrosom) verbunden. Die cytoplasmatischen 20S Proteasomen gewährleisten den “normalen“ Proteinturnover, den Abbau von sogenannten DRiPs und innerhalb des UPS (Ubiquitin- Proteasomen-System) den Abbau von nicht mehr benötigten und überalterten Proteinen (s.o.). Den Cytoskelett-assoziierten Proteasomen werden Funktionen innerhalb des Zellzyklus zugeschrieben, z.B. Abbau von Cyclinen und anderen Zellzykluskomponenten. Die ER-assoziierten Proteasomen sind wohl hauptsächlich am ERAD (ER associated degradation) und an der Antigen-Präsentation über den MHC-I-Weg beteiligt. Die Anzahl der 20S Proteasomen im Zellkern unterliegt sehr starken Schwankungen innerhalb des Zellzyklus. Nach einem Modell von Reits et al. (1997) findet ein aktiver Transport von 20S-Proteasom aus dem Cytoplasma in den Kern in der G1-, S- und G2-Phase statt, 20S Proteasomen akkumulieren am kondensierten Chromosom. Während der Prophase löst sich die Kernmembran auf und 20S Proteasomen diffundieren zurück ins Cytoplasma und mischen sich in Meta- und Anaphase mit den cytoplasmatischen Proteasomen. Bei der Neubildung der Kernhülle in der Telophase werden frei diffundierende 20S Proteasomen „zufällig mit eingefangen“ und so nucleär lokalisiert. Es wird hier keine strukturelle oder funktionelle Unterscheidung zwischen 20S Proteasomen aus Kern und Cytoplasma vorgenommen. Im Allgemeinen geht man aber davon aus, dass die nukleären Proteasomen hauptsächlich an der Transkriptionsregulation durch den Abbau von Transkriptionsfaktoren und Inhibitoren beteiligt sind (z.B. beim NFκB-Inhibitor IκB).

1.8 Subpopulationen des Proteasoms

Wie aus Untersuchungen an Drosophila melanogaster hervorgeht, verändert sich die Untereinheiten-Zusammensetzung des Proteasoms während der Individualentwicklung (Falkenburg & Kloetzel, 1989). Für Mammalia haben Hong et al., 1994, die α- und ß- Untereinheiten des 20S Proteasoms in drei Kategorien eingeteilt: Konstitutiv, gewebespezifisch und entwicklungsspezifisch, basierend auf der Beobachtung, dass das Untereinheiten-Muster abhängig von seinem Ursprung im Organismus differiert. Dahlmann et al. (2000) zeigten, dass das 20S Proteasom in mehreren, chromatographisch voneinander trennbaren Subtypen existiert. Es wurden hier 20S Proteasomen aus verschiedenen Geweben der Ratte untersucht und miteinander verglichen, wobei deutliche Unterschiede der Subtypen-Muster der einzelnen Gewebe erkennbar waren. Als Hauptgrund für das unterschiedliche chromatographische Verhalten der 20S Proteasomen-Subtypen wurde hier der Austausch der katalytischen ß-Untereinheiten mit ihren homologen Immuno-Untereinheiten beschrieben und die Subtypen in drei verschiedene Gruppen eingeteilt: Konstitutiv-, Intermediär- und Immuno-Subtypen. Allerdings gab es in jeder Gruppe mehr als einen Subtyp, was dafür spricht, dass nicht nur der Austausch der ß-Untereinheiten eine Rolle bei der veränderten Oberflächenladung spielt, sondern [Seite 17↓]auch post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Glykosylierung, N-Acetylierung und Alkylierungen, sowie alternative Spleißprodukte von Bedeutung sein könnten. Die 20S Proteasomen-Subtypen unterscheiden sich nicht nur hinsichtlich ihrer Untereinheiten-Zusammensetzung, sondern auch in ihrer Aktivität und zum Teil in ihrer Hemmbarkeit voneinander. Pathologische Prozesse wie z.B. Diabetes mellitus führen zu einer Veränderung im Subtypenmuster. Dies wurde von Merforth et al. (2002) anhand von Untersuchungen von 20S Proteasomsubtypen aus Ratten-Skelettmuskel festgestellt. Diabetes mellitus und andere pathologische Prozesse wie Sepsis, Tumorwachstum, chronische renale Dysfunktion und Polytraumata gehen oft mit einem Verlust an Körpergewicht einher, der u.a. auf einem verstärkten Abbau von Muskelprotein beruht, welcher entscheidend vom Ubiquitin-abhängigen Proteasomsystem katalysiert wird. Beweisend hierfür ist die Tatsache, dass der ATP-abhängige Muskelproteinabbau verstärkt ist und durch Proteasom-Inhibitoren gehemmt werden kann. Außerdem sind die Konzentrationen von mRNAs für Ubiquitin, E2 und E3-Enzyme und proteasomale Untereinheiten erhöht (Attaix et al. , 1998).

1.9 Ziel der vorliegenden Arbeit

In Geweben sind immer unterschiedliche Zellarten vorhanden, wie Epithelzellen, Fibroblasten, diverse Blutzellen und je nach Gewebe Skelettmuskelzellen, Hepatocyten etc. Aufgrund der o.g. Daten aus Rattengeweben, in welchen unterschiedliche 20S Proteasomen-Subtypen existieren, war es interessant zu erfahren, ob in einzelnen Zellen ebenfalls verschiedene Subtypen vorkommen und wie sie sich gegebenenfalls unterscheiden. Einige Untersuchungen an Rattengewebe und Mammalia-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen einzelne proteasomale Untereinheiten haben gezeigt, dass die Verteilung von z.B. LMP2 und LMP7 in den einzelnen Zellkompartimenten nicht mit der von Gesamtproteasom übereinstimmt (Palmer et al., 1996; Brooks et al., 2000). Möglicherweise existieren in den einzelnen Zellkompartimenten 20S Proteasomen-Komplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung, was sich dann in Form unterschiedlicher Subtypen bemerkbar machen könnte und eventuell auf spezifische Funktionen hindeutet. Außerdem könnten proteasomale Untereinheiten in den einzelnen Zellkompartimenten unterschiedlich modifiziert oder prozessiert sein. Da anzunehmen ist, dass das Proteasom in den verschiedenen Zellkompartimenten spezifische Aufgaben erfüllt, wäre eine strukturelle und funktionelle Diversität durchaus denkbar und sinnvoll. Die vorliegende Arbeit sollte zur Aufklärung dieser Fragen anhand von Untersuchungen mit HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen beitragen.


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13.07.2005