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2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Blockthermostat BT 100

Cryo 1°C Freezing Container

Eismaschine AF-10

Elektrophorese Einheit Mighty Small II SE250/SE260

Elisareader MR5000

Feinwaage MC1

Fluorimeter Fluostar Reader mit Easy Software

FPLC

Gefrierschrank -20 °C

Gefrierschrank -80 °C

Geltrockner Drystar

GS-158 Zentrifuge

Homogenisator

inverses Mikroskop DMI

Konduktometer Cond Level 1

Kühlzentrifuge 54178

Kühlzentrifuge Avanti J-25

Kühlzentrifuge J2-HS

Kühlzentrifuge RC24

Magnetrührer MR 3001 K

Medifuge

Mikrowelle Micro Chef FM 8935

Netzgerät DC PS3000

pH-Meter pH Level 1

Photometer UV-2102 PC Software UV-X101 PC

Pipetten

Pipettus-Akku

Röntgenfilmentwickler Hyperprocessor

Rotor GA/18

Rotor SS34

Rotor SW40

RT-System

Schüttler

Semidry-Blot-Kammer

Steril gard Hood classll A1 B3

Stickstofftank

Ultraschall Sonoplus GM70

Ultrazenrifuge L-70

Ultrazentrifuge Ultra Pro 80

Vakuumtrockner

Vortexer VF2

Waage BP210OS

Wasserbad TWB 12

Wasserbad U3

Zellkultur-Inkubator BB4220CV

Kleinfeld

Nalgene

Scotsman

Hoefer

Dynatech

Sartorius

SLT

Amersham Pharmacia

Liebherr

puffer hubbard

Hölzel

Beckman

Braun

Leica

InoLab

Eppendorf

Beckman

Beckman

Sorvall

Heidolph

Heraeus

Moulinex

Hoefer

InoLab

Shimadzu

Gilson

Hirschmann

Amersham

Beckman

Sorvall

Beckman

Amersham Pharmacia

Infors

pQLAB

Baker

Taylor-Wharton

Bandelin

Beckman

Sorvall

Labcono

Janke & Kunkel

Sartorius

Julabo

Julabo

Heraeus


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2.1.2 Chromatographie-Materialien und Fertigsäulen

DEAE Toyopearls 650 S

MiniQ PC 3.2/3 230 µl

Resource™ Q (1ml bzw. 6ml)

Resource™ Phe (1ml)

Sepharose 6B

IgG-Sepharose

TosoHaas

Amersham Pharmacia

Amersham Pharmacia

Amersham Pharmacia

Amersham Pharmacia

Amersham Pharmacia

2.1.3 Reagenzien, Lösungen, Verbrauchsmaterialien

3MM Papier

Acrylamid (30 %, 29:1)

Acrylamid (40 %, 39:1)

Ampholine, Isodalt 3-10

Ampholine, Isodalt 5-7

BSA, Fraktion V

Coomassie® Plus Protein Assay

DMSO

FCS

fluorogene Peptid-Substrate

Interferon-γ rekombinant, human

Cryoröhrchen

L-Glutamin

Lab-trol-E normal

Magermilchpulver

Molekulargewichtsstandard, prestained

PVDF Membran

Paraformaldehyd

Penicillin/Streptomycin

PMSF

Röntgenfilme: Xomat-UV/AR/Biomax-MR

schwarze Mikrotiter-Platten

Serva Blue G (Coomassie- Farbstoff)

Sterilfilter 4.5, 0.2 µm

TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylen-Amin) Trifluoressigsäure

Trypanblau-Lösung

Trypsin-EDTA

Tween 20

Zellkultur-Medien

Zellkultur-Plastikwaren, steril Falcon

Zephiranchlorid, 17 %

β -Mercaptoethanol

Whatman

Roth

Roth

Serva

Serva

Serva

Pierce

Fluka

Biochrom

Bachem Biochemica bzw. Calbiochem

Roche

Nunc

Biochrom

Merz-Dade Switzerland

Difco

BioRad

Roth

Merck

Seromed

Sigma

Kodak

Dynatec

Serva

Schleicher und Schuell

Serva

Fluka

Sigma

Gibco BRL

Serva

Biochrom

Greiner

ICN

Serva


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2.1.4 Antikörper

Untereinheit/Bezeichnung

Origin

Verwendung

Herkunft

LMP2

mAK, Maus

1:1000, Western

Affinity

LMP2 / K863

Kaninchen

1:1000, Western

Institut für Biochemie/Charite´

δ / mcp 421

mAK, Maus

1:2000, Western

Hendil

MECL1 / mc 14

Kaninchen

1:1000, Western

Institut für Biochemie/Charite´

LMP7 / K63

Kaninchen

1:500, Western

Institut für Biochemie/Charite´

MB1 K93250

Kaninchen

1:1000, Western

Institut für Biochemie/Charite´

20S Proteasom / Nr.67

Kaninchen

1:1000, Western

Institut für Biochemie/Charite´

C9 / mcp257

mAK, Maus

1:500, Western

Hendil et al. 1992

C2 / mcp20

mAK, Maus

1:1000, Western

Hendil et al. 1992

C6 / mcp34

mAK, Maus

1:500, Western

Hendil et al. 1992

Zeta / mcp196

mAK, Maus

1:500, Western

Hendil et al. 1992

Z / mcp168

mAK, Maus

1:1000, Western

Hendil et al. 1992

α KaninchenIgG Peroxidase-konjugiert

Ziege

1:20000, Western

Dianova

α HumanIgG Peroxidase-konjugiert

Ziege

1:10.000, Western

Santa Cruz Biotechnology

α MausIgG Peroxidase-konjugiert

Kaninchen

1:10000, Western

Dianova

α C3 human / MCP21 an Prot.-A-Sepharose gekoppelt

mAK, Maus

Affinitätschromatographie

Hendil et al. 1992

2.1.5 Enzyme und Lectine


[Seite 21↓]

Enzyme

 

Neuraminidase (Sialidase)
aus Arthrobacter ureafaciens 1U/100 µl

Roche

Neuraminidase (Sialidase) aus Vibrio cholerae 1U/66µl

Sigma

O-Glycosidase (O-Glycan-Peptidhydrolase)
aus Diplococcus pneumoniae 25mU/50µl

Roche

PNGase F aus Chryseobacterium meningosepticum, 50U/10 µl

Sigma

N – Acetylhexosaminidase aus Canavalia ensiformis 5U/100µl

Sigma

  

Lectine

 

Lectin aus Tritrichomonas mobilensis (TML), Biotin – Konjugat

Calbiochem

Lectin aus Solanum tuberosum (STA), Biotin – Konjugat

Biomol

Lectin aus Sambucus nigra I (SNA I), Biotin – Konjugat

Biomol

Lectin aus Triticum vulgaris, wheat germ agglutinin (WGA)

Sigma

Extravidin (Streptavidin), Peroxidase – Konjugat

Sigma

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Zelllinien

HeLa (adherent wachsend) : humane Cervical Carcinom Zellinie
HeLa S3 (als Suspensionskultur) : s. European tissue culture collection
T2-Zellen : humane lymphoblastoid B-Zelllinie, TAP-, LMP2- und LMP7-defizient, für MECL1 besteht ein funktioneller knock out.
T2/LMP2+7-Zellen: transfizierte T2-Zellen (s.o.), welche konstitutiv die murinen Proteasomen-Untereinheiten LMP2 und LMP7 exprimiert, funktioneller knock out für MB1 und δ
ZZ-Zellen: HeLa (adherent wachsend) transfiziert mit den Untereinheiten LMP2 -ZZ bzw. δ - ZZ. Diese Untereinheiten sind mit der ZZ-Domäne aus Protein A gekoppelt, welche die Fc-Region von IgG-Molekülen bindet. Es wurde der Vektor pRS304-ZZ von Pharmacia verwendet. Die Transfektion wurde von S. Standera und M. Seeger, Institut für Biochemie/Charite´ durchgeführt, die mir die Zellen freundlicherweise zur Verfügung stellten.

2.2.1.2 Kultur von adherenten Zellen:

Medien: RPMI Medium bzw. ISCOVE Medium mit 10 % FCS 100U/100 µg/ml Penicillin/Streptomycin, 2mM L-Glutamin, bei den ZZ-Klonen enthielt das ISCOVE Medium zusätzlich 2 µg/ml Puromycin
Ø Freezing Medium(2x): 40% RPMI-Medium, 40% FCS, 20% DMSO
Ø PBS: 137 mM NaCl/ 2,7 mM KCl/ 8 mM Na2 HPO 4 x 2H2O/ 1,5 mM NaH2 PO4 / pH 7,2
Ø Trypsin/EDTA-Lösung, 1 : 4 verdünnt mit PBS zum ablösen der Zellen von der Kulturschale
HeLa-Zellen wurden in RPMI Medium bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Das Wasser zum Befeuchten der Luft im Inkubator war mit 0,068 % Zephiranchlorid versetzt. Zur Induktion der Zellen wurden dem Medium 20U recombinantes humanes γ - Interferon pro ml Medium zugesetzt und die Inkubation über 48h bis 72h fortgesetzt. Bei langen Induktionen über 5 Tage wurde das Medium nach 3 Tagen einmal gewechselt unter erneuter Zugabe von 20U/ml γ - Interferon. Zum „Ernten“ der Zellen wurde von den konfluent bewachsenen Schalen das Mediuim entfernt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit verdünnter Trypsinlösung von der Schale abgelöst. Entweder erfolgte eine neue Ausplattierung in einer Verdünnung 1 : 3 bis 1 : 10, oder die abgelösten Zellen wurden in eisgekühltem Medium gesammelt, pelletiert und nach einmaligem Waschen mit PBS in flüssigem Stickstoff schockgefroren und später bei -80°C gelagert. Zentrifugationsschritte erfolgten bei 200g für 5 min bei 4°C.

2.2.1.3 Kultur von Suspensionszellen:

Die HeLa S3- bzw. T2-Zellen wurden zunächst Kunststoff-Kulturflaschen bis zu einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml gezogen und dann in 250ml-Glaskulturflaschen mit eingebautem Rührer in einer 1:2 Verdünnung umgesetzt. Nach Erreichen einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml wurden die Zellen 1:5 verdünnt und in 3l-Glaskulturflaschen mit Rührer umgesetzt und unter langsamem Rühren weiterkultiviert und alle zwei Tage unter Zugabe von frischem Medium 1:5 verdünnt bis zu einer 2l-Kultur. Die Zellen wurden durch Abzentrifugieren geerntet und die Zellpellets wie oben beschrieben gewaschen und weggefroren.

2.2.1.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen

1 – 2 x 106 Zellen/ml wurden in Cryo-Röhrchen in 1 Volumen 2 x Freezing Medium (in Eis) gegeben und in einem Cryo 1°C Freezing Container über Nacht bei –80°C langsam gefroren (-1°C/min). Eine längere Lagerung erfolgte dann in flüssigem Stickstoff. Zum Auftauen von Zellen aus dem Stickstoff-[Seite 22↓]Tank wurden diese im Wasserbad bei 37°C vorsichtig angetaut und dann sofort tropfenweise mit kaltem Kulturmedium (DMSO-frei) versetzt, abzentrifugiert und in 10 ml Medium aufgenommen und ausplattiert bzw. in eine Kulturflasche umgesetzt.

2.2.2 Proteinbiochemische Methoden

2.2.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration

(nach Bradford, 1976)
Jeweils 20µl der zu bestimmenden Probe wurden mit je 200 µl der fertigen Gebrauchslösung Coomassie Plus Protein Reagent von Pierce versetzt und nach 5 min Inkubation bei 37°C im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 590nm vermessen. Eine Eichgerade wurde mit einer Verdünnungsreihe aus Lab-trol-E Proteinstandard erstellt.

2.2.2.2 TCA Präzipitation

Die Proben wurden mit 1 Volumen 10% Trichloressigsäure versetzt, auf dem Vortex gemixt und 10 min im Eis stehengelassen. Die Proteine wurden dann durch Zentrifugation bei 14.000g für 5 min (4°C) präzipitiert und die Pellets zweimal mit kaltem Aceton gewaschen.

2.2.2.3 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresen

( variiert nach Laemmli, 1970)
Puffer und Lösungen:
Upper-Tris-Puffer: 250 mM Tris / HCl pH 6,8 / 0,8 w/v SDS (4 fach konzentriert)
Lower-Tris-Puffer : 150 mM Tris / HCl pH 8,8 / 0,4 w/v SDS (4 fach konzentriert)
Laufpuffer : 190 mM Glycin / 25 mM Tris / 0,1 w/v SDS
Probenpuffer: 120 mM Tris / HCl pH 6,8 / 20 v/v Glycerin / 10 w/v ß-Mercaptoethanol / 4 w/v SDS / 0,1 w/v Bromphenolblau
Acrylamidlösung: 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid
Der Polymerisationsstart erfolgte durch Zugabe von Ammoniumpersulfat 10% und TEMED.
12,5%iges Trenn-Gel: 3,75 ml Acrylamid-Lösung / 2,25 ml Lower-Tris-Puffer / 3,0 ml Wasser / 50 µl APS / 5 µl TEMED
4,5%iges Sammel-Gel: 0,4 ml Acrylamidlösung / 0,75 ml Upper-Tris-Puffer / 1,85 ml
Wasser / 12 µl APS / 3 µl TEMED

Molekulargewichtsstandard:
Low Range Marker: 97,4 bis 14,4 kDa (BioRad)
Prestained KaleidokopMarker: 206 bis 7 kDa (BioRad)
Gelgröße: 70 x 80 x 0,75/1,5 mm
Die pelletierten Proben wurden entweder in 1x Probenpuffer aufgenommen bzw. die gelöste Probe wurde mit 1/5 Volumen 5-fach-konzentriertem Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C im Heizblock inkubiert und anschliessend mit einer Hamiltonspritze auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte 2h bei 3 Watt.

2.2.2.4 2D-Gelelektrophorese Non-Equilibrium-pH-Gradient-Elektrophorese (NEpHGE)

Bei dieser Form der Gelelektrophorese wurden die Proteine in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF), nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) und in der zweiten Dimension, einer SDS-PAGE, nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die in dieser Arbeit vorgestellten NEpHGE-Analysen wurden von I. Wagner, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie Berlin, durchgeführt nach der Kleingeltechnik von Jungblut, P.R. (Jungblut & Seifert, 1990).

2.2.2.5 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen

Färbelösung: 0,25 % (w/v) Servablue G 250 gelöst in Methanol (10% Endkonzentration) , Essigsäure (40% Endkonzentration), Wasser.
Entfärbelösung: 10% Essigsäure, 40 % Methanol, Wasser
[Seite 23↓]Nach beendeter SDS-PAGE wurden die Gele je nach Dicke 20 min bis 1 h gefärbt und bis zur gewünschten Farbintensität entfärbt ( 1- 3 h ). Die Gele wurden bei Bedarf eingescannt oder in dem Geltrockner auf Whatman-Papier getrocknet.

2.2.2.6 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen

Nach beendeter SDS-PAGE wurden die Gele fixiert:
Fixierer 1: 50 % Methanol / 12 % Essigsäure / 0,5 % Formaldehyd (37% Stammlösung) in Wasser / 20 min Inkubation
Fixierer 2: 3 x 20 min in 50 % Ethanol in Wasser
Danach folgte eine Inkubation für 1 min in Reduktionslösung : 0,8 mM Na2S2O2 x 5 H2O Färbung: 20 min in Silbernitratlösung: 10 mM AgNO3, 0,5% Formaldehyd (37% Stammlösung)
Danach wurden die Gele 3 x 5 min in Wasser gewaschen und anschließend entwickelt nach Sicht bzw. 20 min:
Entwickler: 560 mM Na2CO3 , 20 mM Na2S2O2 x 5 H2O , 0,5% Formaldehyd (37% Stammlösung)

Zum Stoppen der Entwickler-Reaktion wurde eine Lösung 1 % Glycin in Wasser benutzt. Nach Erreichen der gewünschten Farbintensität wurden die Gele noch einmal in Wasser gewaschen erneut fixiert in Fixierer 1.

2.2.2.7 Immunpräzipitation

IP-Puffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,5 / 10 mM MgCl2 / 50 mM KCl /10 % Glycerol / 0,1 % Triton X-100 / 100µM PMSF
Waschpuffer: 150 mM bzw. 200 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Elutionspuffer: 100 mM Glycin / HCl pH 3,0
Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt.
Die Zellpellets von 3 x 10 7 HeLa-Zellen, welche die Fusionsproteine LMP2 – ZZ bzw. δ - ZZ exprimieren, wurden in 500µl IP-Puffer resuspendiert und mit mehrmaliggem Gefrieren und Auftauen wurden die Zellen aufgeschlossen (N2 flüssig/37°C Heizblock). Anschließend erfolgte noch ein Aufschluss der Suspension mit dem Ultraschall – Stab (10 sec). Die Lysate wurden 10 min bei 600g in der Eppendorf-Kühlzentrifuge zentrifugiert um Zelldebris und Zellkerne zu pelletieren. Die Überstände wurden in neue Gefäße überführt und mit je 100µl IgG-Sepharose, welche vorher mit IP-Puffer äquillibriert wurde, im Batch-Verfahren für eine Stunde bei 4°C unter konstanter Durchmischung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Ansätze erneut 5 min bei 600g in der Kühlzentrifuge zentrifugiert und die Überstände in ein neues Gefäß überführt. Die pelletierte IgG-Sepharose wurde wie folgt gewaschen, zwischen den Waschschritten wurde in der Tischzentrifuge pelletiert:
Waschen mit 1ml IP-Puffer
Waschen mit 1ml 100 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Waschen mit 1ml 250 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Die Elution der gebundenen 20S Proteasomen erfolgte mit 200 µl Elutionspuffer pro Pellet. Die Elutionsüberstände wurden nach 5 min Zentrifugation bei 600g vorsichtig abpipettiert und in ein neues Gefäß überführt, das enthaltene Protein mit TCA 10% gefällt und die Proben dann einer SDS-PAGE bzw. NEpHGE unterzogen.

2.2.2.8 Westernblot und Immunodetektion

Transferpuffer: 50 mM Tris / 40 mM Glycin
Um einzelne Protein- Banden bzw. -Spots nach SDS-PAGE immunochemisch nachweisen zu können, wurden die Gele im Semidry-Blotverfahren auf PVDF-Membranen immobilisiert. Dazu wurden die Gele zunächst nach beendeter Elektrophorese 20 min in Transferpuffer äquilibriert. Die zugeschnittene PVDF-Membran wurde zunächst einige Sekunden in Methanol aktiviert und dann ebenfalls in Transferpuffer für 5 min äquilibriert. Auf die Anode der Semidry-Blotkammer wurde dreilagig mit Transferpuffer getränktes Whatman-Papier gelegt, darauf die PVDF-Membran, darauf das Gel und auf das Gel wurde wiederum eine dreilagige Schicht puffergetränktes Whatman-Papier gelegt. Nun wurde der Kathoden-Deckel darauf gelegt und befestigt, die Kammer mit der Haube verschlossen und der Transfer bei konstanter Stromstärke von 250 mA gestartet. Der Vorgang war je nach Dicke und Anzahl der Gele nach 15 bis max. 60 min abgeschlossen.Nach erfolgtem Transfer wurden die Proteine auf der Membran mit Ponceau-Rot- Färbung nachgewiesen (siehe Ponceau-Färbung). Wenn kein prestained Marker verwendet wurde, konnten die Marker-Banden auf der Membran gekennzeichnet werden. Die Membran wurde in mit 5 % Milchpulver gelöst in TTBS (50mM [Seite 24↓]Tris/HCl pH 7,5 / 500 mM NaCl / 0,1 % Tween) mindestens 2 Stunden blockiert, danach dreimal 5 min in TTBS gewaschen. Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte in TTBS / 2 % Milchpulver für 2 Stunden bei Raumtemperatur bzw. über Nacht bei 8°C. Überschüssige Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit TTBS entfernt und es folgte die zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Sekundärantikörper, welcher mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt war. Nach abschliessendem Waschen der Membran mit TTBS zur Entfernung ungebundener Sekundärantikörper konnte die Detektion mittels ECL ( enhanced chemiluminescence ) erfolgen.

2.2.2.9 ECL Detektion

Lösung A: 5 ml 0,1M Tris/HCl pH 8,0 / 22 µl 90 mM Cumarinsäure gelöst in DMSO / 50 µl 250 mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid) gelöst in DMSO
Lösung B: 5 ml 0,1M Tris/HCl pH 8,0 / 3 µl 30 % H2O2
Filme: Kodak X-Omat DS Filme
Die Lösungen wurden vor der Reaktion jeweils frisch zubereitet und im Dunkeln aufbewahrt. Die Lösungen wurden zusammengegeben und die Memran 1 min darin inkubiert. Je nach Intensität erfolgte die Exposition der Filme einige Sekunden bis zu 5 min.

2.2.3 Isolierung von 20S Proteasomen aus HeLa- bzw. HeLa S3-Zellen

Puffer: (Lysispuffer) 10 mM Tris/HCl pH 8,0 / 250 mM Sucrose / 2,5 mM KCl / 2,5 mM MgCl2 / 0,5 mM PMSF / ggf. 0,02% NP-40 (bei Gesamtzellysaten und Microsomenpräparation)
Zellen: Bei -80°C gefrorene aus HeLa bzw. HeLa S3 Zellpellets. Für eine Präparation wurden 5 x 108 bis 5 x 109 Zellen verwendet. Die verwendeten Zellen stammten entweder aus eigener Kultur oder wurden von der Firma 4C Biotech (Belgien) als gefrorene, teilweise vorfraktionierte Zellpellets (HeLa S3 whole cells, HeLa S3 nuclei, HeLa S3 cytoplasm) bezogen.

Zellaufschluss:
Zellpellets wurden in 5-fachen Volumen mit Lysispuffer unter Eiskühlung resuspendiert und mit einem Homogenisator mit Teflon-Pistill mit 20 Hüben lysiert. Die Zellyse wurde unter dem Mikroskop mit Trypanblau kontrolliert.

2.2.3.1 Differentielle Zentrifugation

1. Zentrifugation: 1000g, 10 min, 4°C, SS34-Rotor Sorvall
Bei diesem Schritt wurden Zellkerne und größere Zellbruchstücke (Pellet) abgetrennt. Das Pellet wurde für eine spätere Zellkernisolierung zweimal mit Puffer gewaschen und bei – 80°C gelagert. Der Überstand wurde mit NP-40, Endkonzentration 0,02% versetzt, gut durchmischt und 10 min im Eisbad gerührt. Danach wurde er der nächsten Zentrifugation unterworfen.
2. Zentrifugation: 15.000g, 20 min, 4°C, SS-34 Rotor Sorvall
In diesem Schritt wurden Zellorganellen wie Lysosomen, Mitochondrien und Peroxisomen pelletiert. Im Überstand befanden sich nach diesem Schritt cytosolische Bestandteile und Microsomen.
3. Zentrifugation: 100.000g, 1 h ,4°C, SW-40 Rotor, Sorvall, Ultrazentrifuge
Nach dieser Zentrifugation befanden sich im S100-Überstand die löslichen cytosolischen Bestandteile und im Pellet die Microsomen, kleinere Fargmente der ER-Membran mit assoziierten Proteinen und Ribosomen. Diese wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei
– 80 °C gelagert.
Die weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgten bei 4 °C bzw. auf Eis.

2.2.3.2 Isolation von 20S Proteasom aus Cytoplasma

2.2.3.2.1 Anionenaustausch-Chromatographie

Puffer:(TEAD) 20 mM Tris / Hcl pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM NaN3 / 1 mM DTT
DEAE-Toyopearl 650S mit TEAD äquilibriert
Der Überstand der Ultrazentrifugation bei 100.000g wurde auf die äquilibrierte DEAE-Toyopearl-Säule (30 ml Gelbett) aufgetragen (Flow 1ml/min). Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina TEAD gewaschen. Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 0 - 0,5 M NaCl in TEAD. Das Volumen des Gradienten betrug zwei Säulenvolumina (bei 30ml Gelbett, 60 ml Elutionsvolumen).
[Seite 25↓]Fraktionsgröße: 1ml
Flußrate: 1ml/min
Die erhaltenen Fraktionen wurden auf ihre proteolytische Aktivität gegenüber dem chymotryptischen Substrat Suc-LLVY-MCA getestet (s. unter Aktivitätstest ) und die aktiven Fraktionen anschließend gepoolt.

2.2.3.2.2 Ammoniumsulfatfällung

Die so erhaltene Enzymlösung wurde mittels fraktionierter Ammonium-Sulfat-Fällung weiter aufgetrennt.
1. Fällung bis 35% Sättigung (langsame Zugabe des Salzes unter Rühren im Eis). Nach vollständiger Zugabe des Salzes wurde die Probe noch 30 min im Eisbad gerührt und danach bei 12.000g und 4°C abzentrifugiert.
2. Fällung bis 80% Sättigung: Der Überstand der 1. Fällung wurde durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% gebracht ( gleiche Durchführung wie oben ) und nach 30 min Rühren im Eisbad wie oben beschrieben abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in TEAD-Puffer ( max. 2 ml ) aufgenommen.

2.2.3.2.3 Gelfiltration

Die Gelfiltration wurde mittels FPLC-Anlage durchgeführt.
Säule: präparative Superose 6B, 130 ml Gelbett (50 x 2,0 cm),
Puffer: TEAD
Flußrate: 0,5 ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Die Probe wurde mittels einer 2 ml- Probenschleife aufgetragen. Nach dem Lauf wurden die proteolytisch aktiven Fraktionen gepoolt.

2.2.3.2.4 FPLC - Anionenaustausch-Chromatographie

Auch diese Trennung wurde mit dem FPLC – System durchgeführt. Der Auftrag der Probe erfolgte mittels Superloop mit einer Flussrate von 1 ml/min. Säule: Resource Q (6 ml) bzw. Resource Q (1 ml). Die Größe der Säule richtete sich nach der zu trennenden Proteinmenge.
Puffer: TEAD (A) bzw. TEAD + 0,5 M NaCl (B)
Flußrate: 1ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Elutionsschema:

Säule: Resource Q (6 ml)
65 ml von 0 % auf 80 % Puffer B
3 ml von 80 % auf 100 % Puffer B
2 ml 100 % Puffer B
5 ml von 100 % auf 0 % Puffer B
10 ml 0 % Puffer B
Säule: Resource Q (1 ml)
5 ml von 0 % auf 40 % Puffer B
25 ml von 40 % auf 80 % Puffer B
3 ml von 80 % auf 100 % Puffer B
2 ml 100 % Puffer B
5 ml von 100 % auf 0 % Puffer B
Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen TEAD dialysiert.

2.2.3.2.5 Hydrophobe Interaktions-Chromatographie an Phenylsepharose

Als nächster Reinigungsschritt schloss sich eine hydrophobe Interaktions-Chromatographie an. Dazu wurde die dialysierte Probe mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 1,4 M (NH4)2SO4 gebracht, auf die Säule aufgetragen und die gebundenen Proteine mittels eines absteigenden Ammoniumsulfatgradienten (von 1,4 M auf 0 M (NH4)2SO4) eluiert.
Puffer: TEAD (A) bzw. TEAD + 1,4 M (NH4)2SO4,pH 7,5 (B)
Säule: Resource Phe (1ml)
Flußrate: 1ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Die Säule wurde zunächst mit Puffer B äquilibriert und die Probe mittels Superloop mit einer Flussrate [Seite 26↓]von 1 ml/min aufgetragen.
Elutionsschema:
10 ml 100 % Puffer B
65 ml von 100 % Puffer B auf 0 % Puffer B
Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen TEAD, pH 7,5 dialysiert (Puffer nach 2 h Dialyse einmal gewechselt).
Zur Kontrolle der Reinheit des Proteasomen-Präparates erfolgte eine SDS-PAGE (12,5%) und Coomassie-Färbung.

2.2.3.3 Isolation von 20S Proteasom aus Zellkernen

Die pelletierten Zellkerne wurden entweder aus der zuvor beschriebenen Aufarbeitung der Gesamtzellen erhalten oder von der Firma 4C Biotech (Belgien) bezogen.
Das bei -80°C gelagerte Pellet wurde langsam aufgetaut und zweimal im Lysispuffer gewaschen.
Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 2-3 Volumina TEAD/1,6 M Sucrose /5mM MgCl2 aufgenommen und in einem SW40-Ultrazentrifugen-Röhrchen auf ein 2 ml- Kissen von TEAD/2,1 M Sucrose geschichtet. Die Röhrchen wurden mit TEAD/1,6 M Sucrose /5mM MgCl2 aufgefüllt und in der Ultrazentrifuge 90 min bei 100.000g und 4°C zentrifugiert. Die hochaufgereinigten Kerne sammelten sich an der Grenzschicht zwischen 1,6 M und 2,1 M Sucrose- Puffer als festes Pellet, welches mit einem Mikrospatel herausgenommen werden konnte. Das Pellet wurde im fünffachen Volumen TEAD aufgenommen, resuspendiert und es erfolgte ein Verdau mit DNaseI und RNase (jeweils 100 µg /ml) für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde die Probe mit dem gleichen Volumen TEAD mit 1M KCl aufgefüllt und 30 min in Eis gerührt. Es folgte eine Homogenisation der Probe mit dem Ultraschall-Stab (3 x 5-10 sec). Die homogene Suspension wurde 60 min bei 100.000g und 4°C abzentrifugiert, wodurch die Kernmembranen pelletiert wurden. Aus dem Nucleoplasma im Überstand wurde das 20S Proteasom durch fraktionierte Ammoniumsulfatfällung wie für das Cytoplasma beschrieben gefällt und über Gelfiltration, ResourceQ- und Resource Phe- Säulen weiter gereinigt.

2.2.3.4 . Isolation von 20S Proteasom aus Microsomen

Das Pellet aus dem dritten Schritt der differentiellen Zentrifugation (siehe unter 2.3.2.) wurde langsam aufgetaut, in Lysispuffer resuspendiert und erneut bei 100.000g für 60 min bei 4°C abzentrifugiert .Anschliessend wurden die gewaschenen Microsomen in Lysispuffer/ 0,1 % NP-40 aufgenommen und im Eis mit dem Ultraschall-Stab 3 x 5-10 sec resuspendiert und danach 30 min unter Durchmischung bei 4°C inkubiert. Es folgte eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und die weitere Reinigung wie für Cytoplasma-Proteasom beschrieben.

2.2.4 Isolation von 20S Proteasomen mittels Affinitäts –Chromatographie

Der Zellaufschluß erfolgte in Lysispuffer /0,02% NP-40 bzw. in TEAD/ 0,1% Triton X-100. Es folgte eine differentielle Zentrifugation wie oben beschrieben. Bei Gesamtzell-Präparationen wurden Zelldebris mit 1000g bei 4°C pelletiert und der Überstand nach Zentrifugation bei 100.000g für 60 min bei 4°C wurde weiterverarbeitet. Es folgte eine Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Toyopearl wie unter 2.3.3. beschrieben. Der Pool aus den proteolytisch aktiven Fraktionen wurde über Nacht gegen 20 mM Tris/HCl, pH 7,5/1mM NaN3 dialysiert um das DTT und das NaCl zu entfernen. Als Ligand der Affinitätschromatographie -Säule diente der monoclonale Antikörper mcp 21, der gegen die proteasomale Untereinheit C3 (α2) gerichtet ist und an eine BrCN-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt wurde. Die Säule hatte ein Gelbett von ca. 6 ml. Der Probenauftrag erfolgte auf die mit 20mM Tris/HCl, pH 7,5 äquilibrierte Säule zwei Stunden im Batch- Verfahren bei 4°C, oder eine Stunde mit langsamer Flussrate über eine Endlosschleife. Es folgten mehrere Waschschritte mit jeweils zweifachem Säulenvolumen:
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5/ 1mM NaN3
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3/ 50% Ethylenglykol
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3/ 200 mM NaCl
Elution: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3 / 2M NaCl, zwei Säulenvolumina
Das Eluat wurde anschließend gegen TEAD dialysiert und mittels SDS-PAGE auf seine Reinheit überprüft.


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2.2.5  Analytik der gereinigten 20S Proteasomen

2.2.5.1 Trennung der Proteasomen-Subtypen

Die gereinigten 20S Proteasomen wurden im SMART-System einer Anionenaustausch-Chromatographie unterzogen.
Puffer A: TEAD pH 7,5; Leitfähigkeit k = 1,2 – 1,8 mS/cm bei 8°C bzw.
Puffer B: TEAD + 0,5 M NaCl pH 7,5 ; Leitfähigkeit k = 42 – 48 mS/cm bei 8°C
Säule: MiniQ PC 3.2/2, 230 µl
Probenmenge: 12 – 50 µg Protein pro Lauf
Programm:
Flussrate: 200 µl / min
0,1 ml – 1,1 ml Probeninjektion über Injektionsventil und Probenschleife ( Je nach Proteinkonzentration der Probe wurde eine 500µl- bzw. 1 ml- Schleife verwendet.)
1,1 - 7 ml von 0% B auf 100 % B
Fraktionierung von 5 ml bis 6,3 ml
Fraktionsgröße: 26,2 µl (48 Fraktionen)
7 ml – 8 ml 100% B
8 ml – 8,2 ml von 100 % auf 0 % B
8,2 – 9,5 ml 0 % B
Die Säule wurde mit Puffer A äquilibriert. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 280 nm, der Gradient wurde mittels Leitfähigkeitsmessung überwacht. Die Leitfähigkeitsmesszelle wurde zuvor mit den verwendeten Puffern kalibriert.
Die getrennten Subtypen der verschiedenen Läufe einer Probe wurden gepoolt und rechromatographiert. Die rechromatographierten Subtypen wurden dann folgendermaßen analysiert:
Aktivitätstests mit fluorogenen Substraten Westernblot 2D-Gelelektrophorese

2.2.5.2 Bestimmung der proteolytischen Aktivität mit fluorogenen Substraten

(nach Barret, 1980)
Verwendete Substrate: Stammlösungen 10mM in DMSO

Z-G-G-L-MCA und
Suc-L-L-V-Y-MCA


zur Messung der chymotryptischen Aktivität

Bz-V-G-R-MCA

zur Messung der tryptischen Aktivität

Z-L-L-E-MCA

zur Messung der PGPH-Aktivität

Für den Test wurden Verdünnungen von 50 – 400 µM mit Puffer hergestellt.
BzVGR-MCA wurde mit 50mM CAPS/ 0,5 mM DTT, pH 10,5 verdünnt, die anderen Substrate mit TEAD.
Die Substrate tragen am N-terminalen Ende eine Schutzgruppe und sind C-terminal mit einer 4-Methyl-7-cumarylamid-Gruppe (MCA) gekoppelt. Diese Gruppe wird proteolytisch abgespalten, so dass als Spaltprodukt Aminomethylcumarin entsteht, welches über Fluoreszenzmessung quantitativ bestimmt wird. Eine Eichgerade wurde aus einer Verdünnungsreihe aus MCA in TEAD- Puffer erstellt.
Für den Test wurden jeweils 20µl der Probe mit 20µl der Substratlösung in einer schwarzen Mikrotiterplatte (96 Loch) vermischt und 60 min bei 37°C inkubiert. Das freigesetzte Aminomethylcumarin wurde im Photometer bei einer Excitationswellenlänge von λ = 360 nm und einer Emmissionswellenlänge von λ = 450 nm vermessen. Als Leerwert diente Puffer. Die proteolytische Aktivität wurde folgendermaßen bestimmt:



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2.2.5.3  Verdau der 20S Proteasomen mit Glykosidasen

Es wurden die folgenden deglykosylierenden Enzyme verwendet:

Ein Aliquot von 500µl 20 S Proteasomen (Proteinkonzentration: 40 µg/ml in TEAD) wurde mit 5 µl = 50 mU Neuraminidase (Sialidase) aus Arthrobacter ureafaciens (1U = 100µl) für 2 - 30 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert (Optimum bei 16 Stunden).
Ein Verdau mit O-Glykosidase (2,5 mU/ml Probe) und N-Acetyl-Hexosaminidase (0,25U/ml Probe) erfolgte sowohl mit einem Aliquot der gereinigten 20S Proteasomen (40 µg/ml) als auch mit der vorher desialylierten Probe für 16 h bei 37°C unter Schütteln. Die Probe wurde danach auf eventuelle Veränderungen im Elutionsmuster am SMART-System analysiert (siehe Trennung der Subtypen).
Bei auf PVDF – Membranen geblotteten Proben wurde die Membran für 16 Stunden bei 37°C in einer Lösung des jeweiligen Enzyms inkubiert
Neuraminidase: 100mU/10ml TEAD
O-Glykosidase: 25mU/10ml TEAD (nur nach vorheriger Neuramindasebehandlung, da nur desialylierte Zucker abgespalten werden können!)
N-Acetyl-Hexosaminidase: 0,25U/10ml TEAD
PNGase F: 1U/ml in PBS

2.2.5.4 Lectindetektion

Puffer:

Block-Puffer

20mM Tris/HCl, pH 7,5
0,5M NaCl
2 % Tween

Lectinpuffer I

10mM Tris/HCl, pH 7,5
1M NaCl
1mM CaCl2
1mM MgCl2
2mM NaN3

Lectinpuffer II

10mM Tris/HCl, pH 7,5
150mM NaCl
1mM MnCl2
1mM CaCl2
1mM NaN3
0,1 % Tween

Waschpuffer

TBS: 20mM Trsi/HCl, pH 7,5
500mM NaCl
bzw. TTBS: 20mM Tris/HCl pH 7,5
500mM NaCl , 0,1 % Tween


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Die mit SDS-PAGE bzw. NEpHGE aufgetrennten Proben wurden auf PVDF-Membran geblottet. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Blockpuffer unter Schütteln blockiert und anschließend zweimal mit TBS für 5 min gewaschen. Danach folgte die Inkubation mit dem entsprechenden Lectin über Nacht bei Raumtemperatur auf dem Schüttler:

Lectin

Konzentration

Lectinpuffer

TML

5µg/ml

I

STA

20µg/ml

II

SNA I

20µg/ml

II

WGA

1µg/ml

I

ConA

20µg/ml

II

Nach der Inkubation (die Lectinlösungen wurden mehrfach verwendet und bei + 4°C im Kühlschrank aufbewahrt) wurden die Membranen zweimal mit TTBS 5 min gewaschen und danach mit Extravidin-POD (1:2000 verdünnt in TTBS) für eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden die Membranen zweimal 5 min mit TTBS gewaschen und die Färbung mit ECL detektiert.

2.2.5.5 Kohlenhydrat-Analytik

Die Kohlenhydrat-Analytik wurde von Grunow und Zimmermann-Kordmann am Institut für Molekularbiologie und Biochemie, Charite´-Campus Benjamin Franklin, Berlin, durchgeführt.

2.2.5.5.1 Monosaccharidanalyse

Die Kohlenhydrat-Reste wurden mittels starker saurer Hydrolyse von den Proteasom-Proben abgetrennt und in Monosaccharide zerlegt. Die Trennung der Monosaccharide erfolgte mittels HPLC an einer Anionenaustauscher-Säule (CarboPac PA1, 4 x 250 mm). Als Vorsäule wurde eine Aminotrap (10-32)-Säule verwendet. Die eluierenden Monosaccharide wurden über gepulste amperometrische Detektion (PAD) nachgewiesen. Die Berechnung der Kohlenhydrat-Mengen erfolgte durch Intergration der Peakflächen im Vergleich mit internen und externen Standards mit bekannter Konzentration.

2.2.5.5.2 Neuraminsäure-Analyse

Neuraminsäure-Reste sind meistens endständig an Kohlenhydrate gebunden. Sie wurden mit milder saurer Hydrolyse von den Proteasom-Proben abgetrennt. Die Trennung und Analyse erfolgte wie oben für die neutralen Monosaccharide beschrieben.


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13.07.2005