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3  Ergebnisse

3.1 Einzelzellen enthalten mehrere 20S Proteasom-Subtypen

3.1.1 20S Proteasom-Subtypen aus T2- und T2/LMP2+7-Zellen

Gereinigte 20S Proteasomen aus T2- und T2/ LMP2+7- Zellen, die mir freundlicherweise von U. Kuckelkorn (Institut für Biochemie, Charite´) zur Verfügung gestellt wurden, konnten mittels Anionenaustausch-Chromatographie an MiniQ P 3.2/3 in mehrere Subtypen getrennt werden. T2-Zellen exprimieren die katalytischen ß-Untereinheiten ß1 (δ), ß5 (MB1), ß2 (Z) und ß2i (MECL-1). Die Untereinheit MECL-1 wird nur in geringem Maß in die 20S Proteasomen-Komplexe eingebaut, da dieser Prozeß stark von der Anwesenheit der Untereinheit LMP2 abhängig ist (Groettrup et al., 1997). Bei den T2/ LMP2+7-Zellen handelt es sich um dieselbe Zelllinie, welche aber mit den murinen Untereinheiten LMP2 und LMP7 transfiziert wurde. Das unterschiedliche Subtypen-Muster ist hier offensichtlich auf den Austausch der ß-Untereinheiten zurückzuführen (Abb.5). Die 20S Proteasomen aus diesen Zellen besitzen kein δ und kein MB1 (Kuckelkorn et al., 1995).

Abb. 5: 20S Proteasom-Subtypen aus T2- und T2/LMP2+7-Zellen. Die Subtypen wurden an MiniQ P3.2/3 getrennt.

Nachfolgend wurden die Subtypen beider Zelllinien auf ihre Untereinheiten-Zusammensetzung hin mittels Westernblot untersucht (Abb.6). Eine Analyse mit Antikörpern gegen die katalytischen ß-Untereinheiten zeigten, dass in allen Subtypen die gleichen Untereinheiten vorkamen. Lediglich bei Subtyp I bei den T2/LMP2+/-Zellen sind bei LMP2 zwei Banden zu erkennen., was hier eventuell für ein Vorhandensein der Proform oder einer Modifikation von LMP2 in diesem Subtyp spricht.


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Abb. 6: Westernblotanalyse der 20S Proteasomen-Subtypen aus T2 und T2/LMP2+7-Zellen. Es wurden die Peak-Fraktionen der einzelnen Subtypen auf einer SDS-PAGE aufgetrennt und die konstitutiven sowie die Immuno-Untereinheiten mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen.

Die untersuchten Zelllinien stellen ein artefizielles System dar. Weitere Untersuchungen wurden deshalb mit HeLa-Zellen durchgeführt, da sie unter Anwesenheit von γIFN Immuno-Proteasomen synthetisieren und eine Beobachtung von dynamischen Veränderungen möglich war.

3.1.2 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen

3.1.2.1 Reinigung von 20S Proteasom aus dem Gesamtzell-Lysat von HeLa-Zellen

Für die folgenden Untersuchungen wurden adhärent wachsende HeLa-Zellen verwendet. Die Präparation erfolgte im Wesentlichen nach dem von Sobek (1995) erarbeiteten Schema (siehe Tabelle 1 und B:2.3.6.). Am Schluß der Präparation wurde die Reinheit des Präparats anhand einer SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung überprüft.

Tab. 3: Reinigungsschema von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen

Reinigungsschritt

Gesamtproteinmenge (mg)

Gesamt-volumen (ml)

Gesamtaktivität (pmol MCA/min x Gesamtvol.)

Spezifische Aktivität (pmol MCA/min x mg)

Anreiche-rungsfaktor

Gesamtzell-Lysat

178,9

32

0,9

0,148

1

UZ-Überstand S100

155,2

28

0,867

0,156

1,05

DEAE-Toyopearl

3

15

0,167

0,759

5,13

Affinitäts-Chromatographie

0,802

33

0,168

6,9

46,6

3.1.2.2 Auftrennung der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen

Aus HeLa-Zellen konnten mit der oben genannten Methode drei Subtypen isoliert werden. HeLa-Zellen besitzen konstitutive Proteasomen. Zunächst vermuteten Dahlmann et al. (2000), dass die Ursache für die unterschiedlichen Subtypen der 20S Proteasomen im Austausch der katalytisch aktiven ß-Untereinheiten gegen ihre induzierbaren Homologen liegt. Es wurde eine Einteilung in Konstitutiv-, Intermediär- und Immuno-Subtypen vorgenommen, wobei vermutet wurde, dass die Intermediär-Subtypen sowohl Immuno- als auch Konstitutiv-Proteasomen enthalten. Außerdem [Seite 32↓]wurden noch andere Modifikationen, wie Phosphorylierung, Glykosylierung u. ä. als Ursache für Subtypen diskutiert. Abb.7A zeigt das Subtypenpattern der gereinigten 20S Proteasomen. In Abb.3B ist zu erkennen, dass HeLa-Zellen konstitutive Proteasomen besitzen. In Abb.7C ist die Untereinheiten-Aufteilung in den einzelnen Subtypen dargestellt. Auffällig sind auch hier die Mehrfachbanden bei δ, die möglicherweise Ausdruck für das Vorhandensein von Modifikationen oder alternativer Spleißprodukte sind, aber auch eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit anderen proteasomalen Untereinheiten (LMP2 ist in diesen Zellen nicht vorhanden) darstellen könnten. Die unterschiedliche Intensität der Banden ist auf die Proteinmenge der Peaks zurückzuführen, da die kompletten Elutionsfraktionen aufgetragen wurden. Es ist unwahrscheinlich, dass es sich hier um Proformen der Untereinheit handelt, da die Präparationen von 20S Komplexen über mehrere Tage erfolgte und die Proben proteolytisch aktiv waren, was für die kurzlebigen Precursor-Komplexe nicht zutrifft. Die positive Reaktion mit MECL-1 in Abb.7B ist wahrscheinlich eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit Z, da die Prozessierung und der Einbau von MECL-1 die Anwesenheit von LMP2 erfordert (Groettrup et al., 1997).

Abb. 7: 20S Proteasom aus dem Gesamtlysat von HeLa-Zellen. A: Mittels Anionenaustausch-Chromatographie an MiniQ P3.2/3 wurden drei Subtypen getrennt (links). Die Reinheit der aufgetragenen Probe wurde zuvor im SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung überprüft (rechts). B: Immunoblot-Analyse nach SDS-PAGE des Gesamtproteasoms. C: Immunoblotanalyse nach SDS-PAGE der einzelnen Fraktionen des Elutionsprofils (26µl/Fraktion). Veränderungen im Muster der 20S Proteasom-Subtypen unter dem Einfluss von γIFN in adhärenten HeLa-Zellen

Um zu untersuchen, ob sich das Subtypen-Muster unter dem Einfluss von Immuno-Untereinheiten bei HeLa-Zellen verändert, wurden diese unter Anwesenheit von γIFN für unterschiedlich lange Zeiträume kultiviert. Die Präparation von 20S Proteasom und die Auftrennung der Subtypen erfolgte wie unter 1.2. beschrieben. Die Abb.8 zeigt die Veränderung der Elutionsprofile in Abhängigkeit von der Zeit.


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3.1.2.3  Analyse von 20S Proteasomen aus HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 48 bzw. 72 Stunden

Abb. 8: Elutionsprofile der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen kultiviert in Ab- und Anwesenheit von 20U/ml γIFN für 48 bzw. 72 Stunden.

Unter dem Einfluss von γIFN erschien ein zusätzlicher Subtyp, bezeichnet mit IIA, zwischen den Subtypen II und III, der nach länger dauernder Kultivierung mit dem Cytokin an Menge zunahm. Eine nachfolgende SDS-PAGE der Elutionsfraktionen mit anschließender Westernblot-Analyse sollte über die Untereinheiten-Zusammensetzung Aufschluss geben.

Abb. 9: SDS-PAGE und Westernblot-Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert. Es wurden die einzelnen Fraktionen (26µl/Fraktion) des Elutionsprofils aufgetragen.

Aus der Abb.9 geht hervor, dass die Immuno-Untereinheiten über das gesamte Elutionsprofil verteilt sind, während die konstitutiven Untereinheiten sich mehr in den spät eluierenden Subtypen II bis III befinden. Alle vier Subtypen sind Intermediär-Typen, wobei in Subtyp III in Anbetracht der Proteinmenge, die er im Profil einnimmt, verhältnismäßig wenig Immuno-Untereinheiten zu erkennen sind. Diese konzentrieren sich am stärksten in Subtyp II und IIA. Von Subtyp I war nur sehr wenig Material vorhanden, was die Aussage über die Untereinheiten-Zusammensetzung erschwert. Bei [Seite 34↓]LMP2 und LMP7 sind Mehrfachbanden zu erkennen, die möglicherweise eine Kreuzreaktion mit der jeweils homologen Untereinheit darstellen. Bemerkenswert ist, dass nach 72 Stunden Inkubation mit γIFN weiterhin konstitutive Proteasomen vorhanden sind und offenbar kein kompletter Umbau in Immuno-Proteasomen stattgefunden hat. Die Stabilität von 20S Proteasom in HeLa-Zellen wird mit einer Halblebenszeit von 5,2 Tagen angegeben (Hendil et al., 1988). Anhand neuester Daten aus unserer Arbeitsgruppe wurde eine Halblebenszeit von konstitutiven 20S Proteasomen in HeLa-Zellen von 54 Stunden ermittelt, für Immuno-Proteasomen ist die Halblebenszeit etwas kürzer (Heink, persönliche Mitteilung). Die Anwesenheit von γIFN induziert zunächst die Neusynthese von Immuno-Proteasomen, wobei noch viele konstitutive 20S Proteasomen vorhanden sind. Damit ist zu erklären, dass nach 48 Stunden unter Wirkung von γIFN verstärkt die Proformen der Immuno-Untereinheiten, aber auch noch konstitutive Proteasomen nachweisbar sind. Nach 72 Stunden ist allerdings noch immer keine komplette Umwandlung von konstitutiven zu Immuno-Proteasomen zu beobachten. Um eine eindeutigere Zuordnung der Untereinheiten zu ermöglichen, wurden die einzelnen Subtypen an MiniQ P3.2/3 rechromatographiert und die erhaltenen Proben mittels NEpHGE aufgetrennt und anschließend mit Silberfärbung entwickelt (Die NEpHGE wurde mittels Kleingeltechnik von I.Wagner, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin, durchgeführt).

Abb. 10: Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert, mittels 2D-PAGE. Die rechromatographierten Subtypen wurden in Kleingeltechnik mittels NEpHGE in die Untereinheiten getrennt und anschließend mit Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Menge von Subtyp I reichte für diese Analyse nicht aus. Von Subtyp II wurden 8,6 µg und von Subtype IIA und III wurden 11µg Protein aufgetragen. Die Zuordnung der Proteinspots zu den Proteasom-Untereinheiten erfolgte nach Claverol et al. (2002).

In den in Abb.10 gezeigten 2D-Mustern sind bei allen Subtypen deutlich mehr als 17 Spots zu erkennen. Claverol et al. (2002) konnten im 2D-PAGE von 20S Proteasom aus humanen Erythrozyten 32 Spots isolieren, wobei sich die Spots der einzelnen Untereinheiten hinsichtlich ihres isoelektrischen Punktes unterschieden. Dieses Phänomen beruht auf der Existenz von alternativen Spleißprodukten, verschiedenen post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) oder auch auf experimentell bedingten Modifikationen der Untereinheiten. Obwohl nicht äquivalente Proteinmengen von den einzelnen Subtypen aufgetragen wurden, erkennt man in Abb.10 deutlich einige qualitative Unterschiede zwischen den 2D-Mustern. Die Positionen der katalytischen ß-Untereinheiten wurden mit spezifischen Antikörpern überprüft (Daten nicht gezeigt). Zunächst ist LMP7 in allen dreien enthalten, während LMP2 am stärksten in Subtyp IIA und etwas geringer in Subtyp II vertreten ist. Subtyp IIA enthält die geringste Menge an MB1, dafür relativ viel von δ und Z. In Subtyp IIA ist MECL-1 am deutlichsten zu erkennen. Es ist hierbei bemerkenswert, dass sich offenbar alle Subtypen zu Intermediär-Subtypen umgewandelt haben und nicht, wie man aus Abb.8 hätte erwarten können, nur der Subtyp IIA. Subtyp III ist zwar weiterhin der am meisten konstitutive, aber auch hier ist ein Austausch von MB1 zu LMP7 bzw. erfolgt.


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3.1.2.4  Analyse von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 144 Stunden

Interessant war nun zu erfahren, ob nach längerer Inkubation mit γIFN ein komplettes Verschwinden von konstitutiven 20S Proteasomen erreicht wird. Deshalb wurden 20S Proteasom-Subtypen aus einer Präparation von HeLa-Zellen, die über 144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert wurden, gereinigt und die Gesamtproteasomen in die Subtypen aufgetrennt (Abb.11). In Abb.11A ist ein im Vergleich zu Abb.8 verändertes Subtypen-Pattern zu sehen. Der Subtyp IIA ist nach längerer Inkubationszeit mit γIFN in Abb.9A nicht mehr vorhanden (vgl. mit Abb.8 nach 72 Stunden Inkubation mit γIFN). In der Westernblot-Analyse (Abb.11B) konnten wiederum alle 6 katalytisch aktiven ß-Untereinheiten nachgewiesen werden. In Abb. 11C ist auffällig, dass Subtyp III kein LMP2 und weniger LMP7 enthält als die anderen beiden Subtypen. Es handelt sich bei den getrennten Subtypen wiederum um Intermediär-Subtypen, wobei Subtyp III wieder der stärker konstitutive Subtyp ist.

Abb. 11: 20S Proteasom aus HeLa-Zellen, die 144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert wurden. A: Auftrennung in Subtypen an MiniQ P3.2/3. B: Immunoblot-Analyse des Gesamtproteasoms. (Es wurden je 8µg Protein aufgetragen.) C: Immunoblot-Analyse der 20S Proteasom-Subtypen nach Rechromatographie an MiniQ P3.2/3 (C3 diente als Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge, je 5µg).

Auch nach einer langen Inkubationszeit von 144 Stunden hat kein kompletter Austausch von konstitutiven gegen Immuno-Untereinheiten stattgefunden. Nach 144 Stunden unter Wirkung von γIFN hatten die HeLa-Zellen stark an Vitalität verloren und teilten sich kaum noch, viele Zellen waren bereits abgestorben. Es ist also nicht davon auszugehen, dass nach noch längerer Inkubationszeit ein kompletter Umbau in Immuno-Proteasomen zu beobachten gewesen wäre. Um die Untereinheiten-Zusammensetzung noch besser untersuchen zu können, wurden zusätzlich noch 2D-Pattern angefertigt.


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Abb. 12: Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 144 Stunden unter 20U/ml γIFN kultiviert, mittels 2D-PAGE. Die rechromatographierten Subtypen wurden in Kleingeltechnik mittels NEpHGE in die Untereinheiten getrennt und anschließend mit Silberfärbung sichtbar gemacht. Es wurden je 5µg Protein aufgetragen. Die Zuordnung der Proteinspots zu den Proteasom-Untereinheiten erfolgte nach Claverol et al. (2002).

In den 2D-Pattern der Abb.12 sieht man im Vergleich zu Abb.10 nur die Hauptspots der einzelnen Untereinheiten und nur sehr schwach die Nebenspots der modifizierten Formen. Der Grund dafür ist die geringere Proteinmenge in Abb.12, diese Beobachtung machten auch Claverol et al. (2002), wenn sie 2D-Pattern von 20S Proteasom mit 40 und 10µg aufgetragenem Protein verglichen. Deutlich ist zu erkennen, dass die Immuno-Untereinheiten in Subtyp I am stärksten vorhanden sind und iß1 (LMP2) in Subtyp III gänzlich fehlt. Dies bestätigt die Immunoblot-Analyse in Abb.11C.

3.2 Gibt es 20S Proteasom-Mischkomplexe, in denen sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten vorkommen?

Die Ergebnisse der bisher beschriebenen Versuche zeigen, dass die wenigsten Proteasom-Subtypen den „klassischen“ Konstitutiv- bzw. Immuno-Proteasomen zuzuordnen sind. Die meisten Subtypen enthalten nach den Immunoblot-Analysen sowohl ß1, ß2 und ß5 als auch iß1, iß2 und iß5 in unterschiedlicher Zusammensetzung. Obwohl diese Subpopulation als „intermediate-type“-Proteasomen bezeichnet wurden (Dahlmann et al., 2000), ist bisher nicht bekannt, ob es sich hierbei um eine Mischung aus Konstitutiv- und Immuno-Proteasomen handelt oder ob diese Proteasomen als Einzelenzyme beide Sorten von ß-Untereinheiten, γIFN-induzierbare und konstitutive, enthalten. Ebenso war nicht bekannt, ob beide Halbproteasomen immer jeweils die gleiche Untereinheit eines Homologen-Paares haben müssen, oder ob hier auch Mischformen möglich sind. Um diese Frage zu beantworten wurden transfizierte HeLa-Zellklone verwendet, die mir freundlicherweise von Seeger (Institut für Biochemie der Charite´) zur Verfügung gestellt wurden. Die Klone exprimieren entweder die Untereinheit δ oder die Untereinheit LMP2, beide waren jeweils mit der IgG-bindenden ZZ-Domäne (15kDa) aus Protein A markiert. Über diesen „tag“ lassen sich 20S Proteasomen mittels IgG-Sepharose aus dem Zellysat präzipitieren und auf ihre Untereinheiten-Zusammensetzung hin untersuchen. Die transfizierten Zellen wurden in An- und Abwesenheit von γIFN kultiviert. Die präzipitierten 20S Proteasomenproben wurden mittels SDS-PAGE eindimensional bzw. mittels NEpHGE zweidimensional in ihre Untereiheiten aufgetrennt und anschließend auf PVDF-Membranen geblottet. Die weitere Analyse erfolgte mittels Antikörpern gegen δ bzw. LMP2 (Abb.13).


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Abb. 13: Analyse von 20S Proteasom aus adhärent wachsenden HeLa-Zellen, die mit δ-ZZ bzw. LMP2-ZZ transfiziert worden sind. Die Proteasomen aus den transfizierten Zellen wurden mit IgG-Sepharose isoliert und anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblot auf das Vorhandensein der Untereinheiten δ und LMP2 getestet. Als Kontrollen dienten Extrakte aus adhärend wachsenden HeLa-Zellen und in Suspension wachsenden HeLaS3-Zellen. Erstere exprimieren nur konstitutive Proteasom-ß-Untereinheiten (siehe Abb. 3B), während letztere auch in Abwesenheit von γIFN konstitutive und Immuno-Untereinheiten exprimieren und somit als Positivkontrolle für LMP2 benutzt wurden.

Alle Komplexe wurden über den ZZ-tag präzipitiert, das heißt die Komplexe enthielten mindestens eine evtl. zwei der jeweils getagten Untereinheit. Im Falle nur einer getagten Untereinheit in dem einen Hemiproteasom kann das zweite Hemiproteasom entweder die jeweilige ungetagte oder die homologe Untereinheit enthalten. Ohne Induktion mit γIFN enthalten die 20S Komplexe mit δ-ZZ kein LMP2, aber die ungetagte Untereinheit δ (22kDa). Die 20S Proteasomen mit LMP2-ZZ enthalten sowohl die ungetagte Untereinheit LMP2 als auch δ, hier findet eine Expression von LMP2 in Abwesenheit von γIFN statt. Die Ergebnisse in Abb.14 zeigen, dass Mischkomplexe, welche sowohl LMP2 als auch δ enthalten, prinzipiell gebildet werden können. Es war nun interessant zu erfahren, ob Zellen, die das δ-ZZ-Konstrukt enthalten nach Expression von LMP2 mittels γIFN-Induktion auch diese Untereinheit neben δ-ZZ in die Proteasomen einbauen. Die Zellen wurden mit γIFN (20U/ml) für 24 Stunden induziert und danach geerntet. Die Aufarbeitung erfolgte wie oben beschrieben. Die präzipitierten 20S Proteasomen wurden mittels NEpHGE zweidimensional aufgetrennt, auf PVDF-Membranen geblottet und mit Antikörpern gegen LMP2 und δ analysiert (Abb.14).


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Abb. 14: 20S Proteasom aus HeLa-Zellen mit den getagten Untereinheiten LMP2-ZZ bzw. δ-ZZ nach Induktion mit γIFN (20U/ml, 24 Stunden). Die 2D-Pattern oben zeigen die Coomassie-gefärbten Gele. Die Bilder darunter zeigen Immunoblots der 2D-Pattern.

Man erkennt in Abb.14 in den oberen Bildern der 2D-Gele, dass jeweils die getagte Untereinheit und auch beide ungetagten, homologen Untereinheiten vorhanden sind. Nach Induktion exprimieren auch die Zellen mit δ-ZZ die Untereinheit LMP2 und bauen sie in die Enzym-Komplexe ein. Dies zeigt, dass Mischkomplexe mit jeder theoretisch möglichen Kombination der Untereinheiten δ und LMP2 praktisch vorkommen. Wenn dies für das Untereinheitenpaar δ/LMP2 zutrifft ist es sehr wahrscheinlich, dass es auch bei MB1/LMP7 und Z/MECL-1 gleichermaßen der Fall ist, natürlich unter Beachtung bestimmter Assemblierungs-Phänomene (siehe Diskussion, Abschnitt 4.3.).

3.3 Sind 20S Proteasom-Subtypen in verschiedenen Zellkompartimenten verteilt?

3.3.1 Isolierung und Analyse von 20S Proteasom aus dem Gesamt-Zellysat von HeLaS3-Zellen

Während alle bislang beschriebenen Untersuchungen mit 20S Proteasomen durchgeführt wurden, die aus dem Gesamtzell-Extrakt isoliert worden waren, sollten im folgenden die Subtypen-Pattern von Proteasom aus den verschiedenen Zellkompartimenten untersucht werden. Da für die Fraktionierung in verschiedene Zellkompartimente und vor allem für die Isolierung von 20S Proteasom aus dem Zellkern eine wesentlich größere Menge an Zellen erforderlich war, wurden für die nachfolgenden Versuche in Suspensionskultur wachsende HeLaS3-Zellen verwendet, die zum Teil selbst in Spinnerflaschen gezogen, zum Teil aber auch als Zellpellets von der Firma 4C Biotech (Belgien) bezogen wurden. So konnten Mengen von 2,5 x 109 bis 5 x 109 Zellen für die Präparation von 20S Proteasom verwendet werden. Da die Reinigungsmethode mit der Affinitätschromatographie durch die Bindungskapazität der Säule auf eine Menge von maximal 5 x 108 Zellen begrenzt war, kam hier ein anderes Reinigungsverfahren zur Anwendung, was im Wesentlichen der Methode von Knühl (1999) folgte. Zunächst wurde mit dieser Methode 20S Proteasom aus dem Gesamtzellysat von HeLaS3-Zellen isoliert und diese in Subtypen aufgetrennt und anschließend mittels Immunoblot auf ihre [Seite 39↓]Untereinheiten-Zusammensetzung analysiert. Das Reinigungsschema ist in Tabelle 2 dargestellt. Eine Übersicht über die Analyse-Ergebnisse zeigt Abb. 15.

Tab. 4: Reinigunsschema variiert nach Knühl (1999) von 20S Proteasom aus HeLa-Zellen

Reinigungs-schritt

Gesamt-protein-menge (mg)

Gesamt-volumen (ml)

Gesamt-aktivität (pmol MCA/min x Gesamt-volumen)

Spezifische Aktivität (pmol MCA/min x mg)

Anreicherungs-faktor

Gesamtzell - Lysat

354,6

90

0,29

0,074

1

UZ-Überstand S100

257,6

70

0,33

0,09

1,2

DEAE- Toyopearl

131,5

40

0,57

0,17

2,3

Gelfiltration

46,6

50

0,41

0,44

5,9

1. Resource Q

21,35

70

0,24

0,78

10,6

Phenylsepharose

3,52

65

0,098

1,82

24,5

2. Resource Q

2,25

14

0,455

2,83

38,2

Abb. 15: 20S Proteasom aus dem Gesamtlysat von HeLaS3-Zellen. A: Auftrennung in Subtypen an MiniQ P3.2/3. B: Immunoblot-Analyse, aufgetragen wurden jeweils 5µg gereinigtes 20S Proteasom. C: NEpHGE-2D-Pattern des gereinigten 20S Proteasoms (aus 5µg).

HeLaS3-Zellen exprimieren im Gegensatz zu adhärent wachsenden HeLa-Zellen auch ohne Induktion durch γIFN Immuno-Untereinheiten, wie deutlich in Abb.15B und C zu erkennen ist. Auch das Subtypen-Pattern in Abb.15A unterscheidet sich von dem der HeLa-Zellen. Die Position von MECL-1 unterscheidet sich von der bei den adhärenten, induzierten HeLa-Zellen, der Spot liegt mehr im sauren Bereich und bei höherem Molekulargewicht (Abb. 15C). MECL-1 hat im reifen Zustand ein Molekulargewicht von 25kDa, die Proform wird mit 29kDa angegeben (Foss et al.,1998; Groettrup et al., 1997). Auch in Abb.15B ist sind mit dem spezifischen Antikörper gegen MECL-1 zwei Banden [Seite 40↓]angefärbt worden. Es ist unklar, ob es sich hier eventuell um die unprozessierte Form von MECL-1 handelt.

3.3.2 Isolierung von 20S Proteasom aus verschiedenen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen

Wie im Methodenteil beschrieben, erfolgte die Lysis der HeLaS3-Zellen unter Bedingungen, welche die Zerstörung der Kernmembran verhindern sollten. Die Trennung der Kompartimente Zellkerne, Microsomen und Cytoplasma erfolgte im Wesentlichen über differentielle Zentrifugation. Die einzelnen Fraktionen wurden danach separat weiter nach der Methode von Knühl (1999) aufgearbeitet. Um die Trennung der Kompartimente zu kontrollieren, wurde die An- bzw. Abreicherung bestimmter Markerproteine mittels Immunoblot-Analyse verfolgt. Für die Kernfraktion wurden humane Antiseren mit snRNP-Antikörpern verwendet, da snRNPs sich im Nucleoplasma befinden und ihr Vorhandensein in der Kernfraktion sowohl eine Anreicherung von Zellkernen als auch einen Erhalt der Kernmembran und Kernporen anzeigt. Die Microsomen bestehen aus Resten von ER- und Golgi-Membranen, die nach der Zell-Lysis neue Vesikel formen und membran-assoziierte Proteine teilweise einschliessen, so dass diese in der microsomalen Fraktion angereichert werden. Als Marker für die microsomale Fraktion wurden Antikörper gegen GPR94 (94kDa) und gegen MHC-Klasse I heavy chain (MHC-I hc, 43kDa) verwendet. GPR94 ist ein Protein, das sich löslich im ER-Lumen befindet, während MHC-I hc-Moleküle integrale Membranproteine sind, die aus dem ER über Golgi-Apparat in Vesikeln schließlich zur Zellmembran transportiert werden. Letzteres erwies sich somit auch als der bessere Marker für die microsomale Fraktion. Das heat shock protein 90 (HSP90, 90kDa) diente als Kontrolle für die cytoplasmatische Fraktion, da dies ein cytosolisches Protein ist.

Abb. 16: Kontrolle der Kompartiment-Trennung von Cytoplasma und Microsomen aus HeLaS3-Zellen mittels Immunoblot-Analyse. A: Es wurden jeweils 10µg Protein aufgetragen vom Microsomen-Pellet der Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P. 100.000g); Cytoplasma-Überstand der Ultrazentrifugation bei 100.000g (Cyt.S 100.000g); Microsomen-Pellet der Ammo-niumsulfat-Fällung (Mic.P AS); Cytoplasma nach Gelfiltration (Cyt. GF); gereinigtes cyto-plasmatisches 20S Proteasom (Cyt. 20S); gereinigtes microsomales 20S Proteasom (Mic. 20S). B: Es wurden jeweils 10µg Protein aufge-tragen vom Gesamtzell-Lysat (Lysat ges.); Cyto-plasma-Überstand ohne Zellorganellen nach der Zentrifugation bei 15.000g (Cyt. S 15.000g); Cytoplasma-Überstand nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Cyt. S 100.000g); Microsomen-Pellet nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P 100.000g).

In Abb. 16A ist deutlich zu erkennen, dass in der microsomalen Fraktion kein cytoplasmatischer Marker (HSP90) mehr nachweisbar ist, während es in der cytoplasmatischen Fraktion angereichert wird. GRP94 findet sich sowohl im Membranpellet als auch in der löslichen Fraktion, was ein Indiz dafür ist, dass ER-Membranen bei der Reinigungsprozedur zerstört werden. In Abb.16B ist deutlich die Anreicherung von ER-Membranen in der microsomalen Fraktion anhand der intensiver werdenden [Seite 41↓]Bande von MHC-I hc zu erkennen.

Abb. 17: Kontrolle der Anreicherung von Kern-extrakt aus HeLaS3-Zellen mittels Immunoblot-Analyse. A und B: Es wurden jeweils 10 µg Protein aufgetragen vom Gesamtzell-Lysat (Lysat ges.); Cytoplasma-Überstand nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Cyt. S 100.000g); Microsomen-Pellet nach Ultrazentrifugation bei 100.000g (Mic. P 100.000g); angereicherte Kern-fraktion nach Dichtegradienten-Zentrifugation (Nuc. DG); Kernextrakt, Überstand nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Nuc. S 100.000g); Kernmembran und assoziierte ER-Membranen, Pellet nach Ultra-zentrifugation bei 100.000g (Nuc. P 100.000g).

Bei der Isolierung des Kernextraktes war es nötig, dass die Kernmembran möglichst erhalten blieb, damit die im Nucleoplasma löslichen 20S Proteasomen angereichert werden konnten. Erst nach dem enzymatischen Verdau der Nucleinsäuren wurden mit 0,5M KCl die Kernporen und -membran permeabel gemacht, so dass das Nucleoplasma austreten konnte und durch Ultrazentrifugation bei 100.000g von den Kernmembranen (Pellet) abgetrennt wurde. In Abb. 17A ist zu erkennen, dass sich die ER-Membranreste des nuclear envelope nach der Ultrazentrifugation im Pellet befinden (Mic. P 100.000g als Positivkontrolle). Die Abtrennung von cytoplasmatischen Komponenten wurde mittels Nachweis des cytosolischen Proteins HSP90 überprüft. In Abb.17A (unteres Bild) ist ein deutliches Signal von HSP90 im Gesamtlysat und in der cytoplasmatischen Fraktion zu erkennen. Die microsomale sowie die nucleäre Fraktion zeigt nur noch ein sehr schwaches Signal, HSP90 wird bei der Präparation zu einem geringen Anteil mit 20S Proteasom copräpariert und erst im letzten Reinigungsschritt, der hydrophoben Interaktions-Chromatographie, vollständig abgetrennt. In Abb. 17B wurde ein humanes Antiserum mit anti-snRNP-IgG ( Titer 1 : 2.000) für den Blot verwendet. Die small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) sind essentielle Komponenten für das eukaryontische pre-mRNA-splicing, sie befinden sich löslich im Nucleoplasma und waren somit ein guter Marker für dessen Anreicherung. Es finden sich die stärksten positiven Signale im Kernextrakt-Überstand nach Ultrazentrifugation, auch in der Kernmembranfraktion (Nuc. P 100.000g) sind snRNPs nachzuweisen, allerdings schwächer als im Kernextrakt. Es handelt sich hierbei wahrscheinlich um snRNPs, welche mit Kernmatrix assoziiert sind. In den verschiedenen eukaryontischen Zelltypen variiert die Verteilung von 20S und 26S Proteasom sehr stark. Umfangreiche Untersuchungen hierzu wurden von Palmer et al. (1996) durchgeführt. Bei Isolation von 20S Proteasom aus Rattenleber ermittelten sie eine Verteilung 83 % zytoplasmatisch, 5,4 % nuclear und 11,3 % microsomal, wobei die Verteilung einzelner proteasomaler Untereinheiten nicht einheitlich war.In HeLaS3-Zellen konnte im Rahmen dieser Arbeit folgende Verteilung von 20S Proteasom ermittelt werden, bezogen auf Gesamtproteasom der Zelle (100%) anhand der im einzelnen präparierten Proteinmengen:

Cytoplasma

70 – 72 %

Microsomen

25 – 27 %

Nuclei

3 – 5 %


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3.4  Strukturelle Analyse der 20S Proteasom-Subtypen aus verschiedenen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen

Die gereinigten 20S Proteasomen aus den einzelnen Zellkompartimenten wurden an MiniQ P3.2/3 in ihre Subtypen aufgetrennt. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede der Elutionsprofile von cytoplasmatischen, microsomalen und nucleären 20S Proteasomen-Subtypen (Abb. 18).

Abb. 18: Elutionsprofile der 20S Proteasomen-Subtypen aus den einzelnen Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen

Obwohl sich die 20S Proteasomen aus allen drei Zellkompartimenten jeweils in vier Subtypen auftrennen ließen, ist deren quantitative Verteilung allerdings unterschiedlich. Um Informationen über die Untereinheiten-Zusammensetzung der Gesamt-Proteasomen der einzelnen Zellkompartimente zu erhalten, wurde zunächst eine SDS-PAGE mit nachfolgender Immunoblot-Analyse durchgeführt.

Abb. 19: Immunoblot-Analyse der 20S Proteasomen der einzelnen Zellkompar-timente von HeLaS3-Zellen. A: Cyto-plasma; B: Microsomen; C: Nuclei. Es wurden jeweils 10µg gereinigtes 20S Proteasom aufgetragen.In Abb.19 ist zu sehen, dass in allen Kompartimenten sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten vorhanden sind. Aber auch hier sind deutliche Unterschiede zwischen den 20S Proteasomen aus den einzelnen Zell-Kompartimenten erkennbar. Die cytoplasmatischen Proteasomen zeigen bei MB1, LMP7, Z und MECL-1 höhermolekulare Banden über denen der reifen Untereinheit. Es sind hier, wie schon erwähnt, eher Kreuzreaktionen mit anderen Untereinheiten als Proformen anzunehmen, da die 20S Proteasomen proteolytisch aktiv waren. Bei MECL-1 ist allerdings wegen der veränderten Position des Spots in der 2D-PAGE auch das Vorhandensein der Proform möglich. Es wurden bei allen Analysen für die einzelnen Untereinheiten derselbe Antikörper verwendet, es zeigten sich aber zum Teil deutliche Unterschiede im Hinblick auf die Bandenmuster. Möglicherweise ist dies ein Hinweis auf verschiedene Modifikationen der entsprechenden Untereinheit. Eventuell könnten dies Gründe für die unterschiedlichen Subtypen-Pattern der 20S Proteasomen sein.

Nachfolgend wurden 2D-Pattern der einzelnen Subtypen aus den drei Zellkompartimenten erstellt.

Abb. 20: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen CI-CIV aus der cytoplasmatischen Fraktion von HeLaS3-Zellen. Es wurden 5µg (CI) bzw. 8,5µg (CII-CIV) in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).

In Abb.20 können alle vier cytoplasmatischen Subtypen dem intermediären Typus zugeordnet werden, wobei CI und CII einen verhältnismäßig höheren Anteil an Immuno-Untereinheiten als CIII und CIV. Dies entspricht auch der zuvor bei den induzierten adhärenten Zellen gemachten Beobachtung. Auch bei den microsomalen Subtypen können alle vier dem Intermediär-Typ zugeordnet werden (Abb.21). Der Gehalt an LMP2 nimmt wieder von MI nach MIV hin ab und ist höher als in den cytoplasmatischen 20S Proteasomen. Der Pfeil markiert einen Spot über der


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Abb. 21: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen MI-MIV aus der microsomalen Fraktion von HeLaS3-Zellen. Es wurden 8µg in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).

Untereinheit ζ, der so intensiv nur in microsomalen Präparationen zu sehen war. Es konnte bisher nicht geklärt werden, um welche Untereinheit es sich hier handelt, es könnte eine Modifikation von ζ oder aber auch von C8 (α7) sein. Als strukturellen Unterschied zwischen den meistens 3 Spots der Untereinheit C8 stellten Claverol et al.(2002) eine Phosphorylierung an Ser250 fest, eventuell spielt hier noch eine weitere Modifikation eine Rolle. MECL-1 konnte hier im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Subtypen nicht eindeutig lokalisiert werden.

Abb. 22: 2D-Pattern der 20S Proteasom-Subtypen NII und NIII aus der nucleären Fraktion von HeLaS3-Zellen (von NI und NIV war nicht genug Material vorhanden). Es wurden 5µg in NEpHGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht (angefertigt in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin).

Die nucleären Proteasomen haben einen Anteil am Gesamtproteasom von ca. 2%, deshalb war hier nur von den beiden dominanten Subtypen NII und NIII genügend Material für die NEpHGE vorhanden. Man sieht in Abb.22 deutlich LMP2 und LMP7 in beiden Subtypen. In NII sieht man zwei Spots an den Positionen von MECL-1, die sich in Ladung und Größe unterscheiden. In NIII ist nur ein Spot zu erkennen, dafür ist hier Z nur sehr wenig vorhanden. Aus physiologischer Sicht würde man vermuten, dass in der microsomalen Fraktion der größte Anteil an Immunountereinheiten zu finden ist, da diese Proteasomen mit dem Endoplasmatischen Reticulum assoziiert und an der Generierung von [Seite 45↓]Antigenen und MHC-I-relevanten Epitopen im Rahmen des ERAD (ER associated degradation) beteiligt sind. Dies haben die 2D-PAGE-Analysen bestätigt. Die nucleären Proteasomen sollten aufgrund ihrer Lokalisation hauptsächlich am turnover von Transkriptionsfaktoren und ihrer Regulatoren beteiligt sein. Weiteren Aufschluss über die Funktion der Proteasomen in den einzelnen Zellkompartimenten sollten Aktivitätstests ergeben.

3.5 Proteolytische Aktivitäten der einzelnen 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen

3.5.1 Proteolytische Aktivitäten der uninduzierten HeLa –Zellen

Für die Aktivitätsmessungen wurden fluorigene Peptidsubstrate verwendet, welche mit Methylcumarinamid (MCA) gekoppelt sind (siehe Abschnitt 2.2.5.2., S.27). In den kinetischen Untersuchungen zur Ermittlung des Aktivitätsoptimums wurde eine konstante Menge Proteasom eingesetzt und die Substratmengen variiert. Die Inkubation erfolgte 60 Minuten bei 37°C (Daten nicht gezeigt).

Abb. 23: Vergleich der spezifischen proteo-lytischen Aktivitäten der 20S Proteasom-Subtypen aus adhären-ten uninduzierten HeLa-Zellen. Die Werte wurden aus fünf un-abhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt.

Die drei konstitutiven Subtypen aus adhärenten uninduzierten HeLa-Zellen zeigten quantitative Unterschiede ihrer katalytischen Aktivitäten gegenüber fluorigenen Peptidsubstraten, während das Verhältnis der drei unterschiedlichen proteolytischen Aktivitäten zueinander bei den einzelnen Subtypen gleich war (Abb.23). In den kinetischen Messungen war zu erkennen, dass das vmax bei ähnlichen Substratkonzentrationen erreicht wurde, was für eine ähnliche Km-Werte spricht (Daten nicht gezeigt). Bei allen drei Subtypen war der Substratumsatz bei der PGPH-Aktivität am höchsten und bei der tryptischen Aktivität am geringsten. Subtyp II hat die höchste tryptische und Subtyp III die höchste chymotryptische Aktivität. Subtyp I ist insgesamt weniger aktiv als die beiden anderen. Nach Orlowski & Wilk (2001) werden den Untereinheiten folgende Aktivitäten zugeordnet: Tryptische Aktivität (Spaltung nach basischen Aminosäuren): ß2 (Z), ß2i (MECL-1) Chymotryptische Aktivität (Spaltung nach hydrophoben und aromatischen Aminosäuren): ß5 (MB1), ß1i (LMP2), ß5i (LMP7)
PGPH-Aktivität (Spaltung nach sauren Aminosäuren): ß1 (δ) Die PGPH-Aktivität ist hier sehr hoch, da die Untereinheit δ nicht durch LMP2 ersetzt wird und somit in allen Komplexen zweimal vorhanden ist. Die tryptische Aktivität ist hier Z zuzuschreiben und die chymotryptische Aktivität wird von MB1 ausgeführt.


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3.5.2  Proteolytische Aktivitäten der γIFN- induzierten adhärenten HeLa-Zellen

Abb. 24: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen nach Inkubation mit γIFN für 144 Stunden. Die Werte wurden aus vier un-abhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt.

Vergleicht man Abb.24 mit Abb.23 wird deutlich, dass die PGPH-Aktivität der Mischkomplexe nach γIFN-Induktion geringer ist als bei den 20S Proteasomen aus den uninduzierten HeLa-Zellen. Dafür ist die chymotryptische Aktivität deutlich erhöht. Grund dafür ist der geringere Anteil an δ, welches für die PGPH-Aktivität verantwortlich gemacht wird und in den Immuno-Proteasomen zumindest teilweise durch LMP2 ersetzt wird, das wiederum die chymotryptische Aktivität steigert. Außerdem wird in Immuno-Proteasomen noch MB1 durch LMP7 teilweise komplementiert, beide Untereinheiten schneiden nach hydrophoben Aminosäuren, steigern also auch die chymotryptische Aktivität. In Subtyp II und III ist die chymotryptische Aktivität am höchsten, was mit dem Gehalt an LMP7, MB1 und LMP2 korreliert. Auch die tryptische Aktivität der Immuno-Subtypen ist deutlich höher als die der konstitutiven, was eventuell auf das zusätzliche Vorhandensein von MECL1 zurückzuführen ist.

3.5.3 Vergleich der proteolytischen Aktivitäten der 20S Proteasomen-Subtypen aus den einzelnen Zellkompartimenten

Die Tests wurden wie vormals mit den fluorigenen Substraten im Vergleich der drei proteolytischen Hauptaktivitäten durchgeführt. Es wurden die einzelnen Subtypen der verschiedenen Zellkompartimente getestet und ihre Aktivitäten miteinander verglichen. Grundlage für die Berechnungen waren drei unabhängige Tests (Abb.25). Die cytoplasmatischen Subtypen haben insgesamt eine etwas höhere Aktivität als die microsomalen. In beiden Fällen ist die PGPH-Aktivität die höchste, was bei den cytoplasmatischen Subtypen mit einem hohen Anteil an δ zu erklären ist. Diese Aktivität ist im Subtyp CIII am stärksten ausgeprägt, da hier auch der Gehalt an der komplementären Untereinheit LMP2 am geringsten ist, verglichen mit den anderen cytoplasmatischen Subtypen.


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Abb. 25: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma (C ), den Microsomen (M) und den Nuclei (N) von HeLaS3-Zellen. Die Werte wurden aus drei unabhängigen Messungen unter Substratsättigung ermittelt. Von Subtyp CI und NI konnten wegen der geringen Mengen keine auswertbaren Daten erstellt werden.

Bei den nucleären Subtypen war die PGPH-Aktivität deutlich geringer, ihr Anteil an LMP2 ist im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt auch höher als in Cytoplasma und Microsomen (vgl. Abb.22 mit Abb.21 und 20). Die tryptische und die chymotryptische Aktivität sind bei den microsomalen Subtypen geringer als bei cytoplasmatischen und nucleären. Die proteolytische Aktivität der microsomalen Proteasom-Subtypen folgt hier allerdings nicht der von Orlowski & Wilk (2001) aufgestellten Hypothese. Bei diesen Proteasomen ist die PGPH-Aktivität zwar nur halb so groß wie bei den cytoplasmatischen Proteasomen-Subtypen, aber immer noch die dominierende Aktivität, obwohl δ und LMP2 in etwa gleichen Mengen vorkommen. Nach der Theorie von Orlowski & Wilk (2001) wäre ein Anstieg der chymotryptischen Aktivität zu erwarten gewesen. Die tryptische Aktivität der nucleären Subtypen, assoziiert mit den Untereinheiten Z und MECL-1, ist vergleichbar mit den cytoplasmatischen Subtypen, in NII ist sie allerdings relativ hoch.

Abb. 26: Vergleich der proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom aus den Zellkompartimenten von HeLaS3-Zellen. Berechnung der Mittelwerte aus den Aktivitätsmessungen der einzelnen Subtypen.

In Abb.26 sind noch einmal die Aktivitäten der 20S Proteasomen aus den Zellkompartimenten insgesamt verglichen. Im Cytoplasma ist die PGPH-Aktivität der Proteasomen ca. doppelt so hoch wie in den beiden anderen Kompartimenten. Bei der tryptischen und chymotryptischen Aktivität sind die microsomalen 20S Proteasomen ca. nur halb so aktiv wie cytoplasmatische und nucleäre.

3.6 Untersuchungen zur Glykosylierung von 20S Proteasom aus HeLa- und HeLaS3-Zellen

In den vorangegangenen Untersuchungen ergaben sich Hinweise, dass das unterschiedliche Elutionsverhalten von 20S Proteasomen-Subtypen nicht allein durch einen Austausch von Untereinheiten zu erklären ist. Da es sich um Ladungsunterschiede an der Oberfläche des Komplexes handelt, liegt die Vermutung nahe, dass post-translationale Modifikationen der einzelnen Untereinheiten eine Rolle spielen könnten. In einigen Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Untereinheiten C8 (α7) und C9 (α3) und auch einige Untereinheiten des 19S-Regulators phosphoryliert werden können. Eine Behandlung der Zellen mit γIFN führte zu einem Absinken der Phosphorylierung, einer Abnahme von 26S Komplexen und zu einem Anstieg von PA28-Proteasom-Komplexen (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Bose et al., 2003). Es wurden hier regulatorische Funktionen dieser Modifikation durch Stabilisierung bzw. Destabilisierung der verschiedenen Komplexe vermutet. Post-translationale Modifikationen von Proteasom beschränken sich aber nicht nur auf deren Phosphorylierungen. Hinweise auf eine Glykosylierung von proteasomalen Untereinheiten gab es bereits 1991 von Schliepake et al.(1991) in höheren Pflanzen und von Schmid et al. (1993) in Mammalia . Beide Gruppen testeten 20S Proteasomen mit Lectinen. Schliepake et al. erhielten Hinweise auf ein Vorhandensein von Glucosyl- , Mannosyl- und N-Acetylgalactoaminylresten in 20S Untereinheiten. Schmid et al. konnten auf einem 2D- Blot von Kalbsleber-20S-Proteasom N-Acetyl-Neuraminsäure, N-Acetylglucosamin und Mannose nachweisen. Neuere Arbeiten von Sümegi et al., 2003 und Zhang et al., 2003, gaben Hinweise auf eine O-gekoppelte Glykosylierung mit N-Acetylglucosamin (GlcNAc) von Untereinheiten in 20S Proteasom und 19S Regulator in Drosophila - bzw. Mammalia -Geweben. Zhang et al. (2003) konnten in vitro und in vivo 26S Proteasom aus dem Kernextrakt von NRK-Zellen inhibieren, indem sie sie mit einer O-GlcNAc-Transferase behandelten, welche proteasomale Untereinheiten glykosylierte. Diese Modifikation bewirkte eine Hemmung der ATPase-Aktivität von 26S Proteasom und somit einen verzögerten Abbau der Transkriptionsfaktors Sp1 und des hydrophoben Peptidsubstrates Suc-LLVY-MCA. Sie stellten fest, dass nur die Aktivität von 26S- nicht die von 20S-Komplexen mit dieser Methode hemmbar ist. Sümegi et al. (2003) zeigten mit dem GlcNac-spezifischen Lectin Wheat Germ Agglutintin (WGA) und monoclonalen Antikörpern gegen O-gekoppeltes GlcNAc, dass neun Untereinheiten des 20S Proteasoms und fünf Untereinheiten des 19S Regulators aus Drosophila positiv reagierten.Aufgrund dieser Ergebnisse war es interessant zu untersuchen, ob evtl. auch Glykosylierungen im 20S Proteasom aus HeLa- bzw. HeLa S3-Zellen nachweisbar sind und eventuell das Subtypen-Pattern beeinflussen. Verdau von 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen mit Neuraminidase. Die Behandlungen von 20S Proteasom mit N-Acetylhexosaminidase (250mU/ml, 37°C, 16 Stunden), PNGaseF (1U/ml, 37°C, 16 Stunden) oder O-Glykosidase (2,5mU/ml, 37°C, 16 Stunden) zeigten keinerlei Veränderungen der Elutions-Muster (Daten nicht gezeigt). Die Ursache hierfür ist eventuell in der glykosidischen Bindung der vorhandenen Kohlenhydrate zu suchen, die nicht der Spezifität der Enzyme entspricht (siehe unter B:2.4.3.) PNGaseF spaltet N-Glykane vom Proteinrest ab. O-Glykosidase ist spezifisch für O-glykosidisch gebundene Gal- und GalNAc-Reste. N-Acetylhexosaminidase spaltet GlcNAc- und GalNAc-Reste in unterschiedlicher Verknüpfung von Protein- oder Kohlenhydratketten ab. Denkbar wären auch sterische Behinderungen des Enzyms durch die komplexe Struktur des Proteasoms. Nur die Behandlung mit Neuraminidase zeigte einen Effekt. Es wurden cytoplasmatische 20S Proteasomen aus HeLaS3-Zellen mit Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens (50mU/ml, 37°C, 16 Stunden) verdaut. Nach dem Verdau wurde die Probe an MiniQ P3.2/3 chromatographisch aufgetrennt, um zu sehen, ob sich das Muster der Subtypen verändert hat.


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Abb. 27: 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen. Die Auftrennung der Subtypen erfolgte an MiniQ P3.2/3 A: ohne Behandlung und B: nach Behandlung mit Neuraminidase („D“ bedeutet desialyliert). Die Inkubation wurde mit 50mU/ml Neuraminidase und 25µg/ml Proteasom bei 37°C für 16 Stunden durchgeführt.

In der Abb.27 ist zu sehen, dass der Proteinpeak des Subtyps IV sich verkleinert, während der Proteinpeak der Subtypen I und II deutlich größer werden. Das spricht dafür, dass einige negativ geladene Proteasomen, die in Peak IV eluierten, nach Abtrennen der negativen Ladung der N-Acetyl-Neuraminsäurereste nun früher unter Peak I und II eluieren, so dass der Proteingehalt hier erhöht wird. Denkbar wäre auch eine geringfügige Konformationsänderung einer Untereinheit nach Abspaltung eines oder mehrerer Neuraminsäurereste, so dass sich Ladungsverschiebungen an der Oberfläche des Komplexes ergeben. Die Kontrollprobe in Abb. 27A wurde ohne Neuraminidase unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Eine Wirkung von Proteaseaktivität kann ausgeschlossen werden. Bei der Behandlung von microsomalen 20S Proteasomen in gleicher Weise konnten keine Veränderungen des Elutions-Musters festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Um die Dynamik der enzymatischen Reaktion zu zeigen, erfolgte eine Behandlung von 20S Proteasom mit Neuraminidase in Abhängigkeit von der Zeit.


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Abb. 28: 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen. Die Auftrennung der Subtypen erfolgte an MiniQ P3.2/3. Die Inkubationen wurden mit jeweils 50mU/ml Neuraminidase und 25µg/ml Proteasom bei 37°C für 0, 2, 4, 16, 24 und 30 Stunden durchgeführt. Zu jeder Probe wurde ein entsprechender Ansatz ohne Enzym als Blindprobe mit inkubiert. Alle Blindproben zeigten unverändert das Muster wie die Probe „0h“ (nicht dargestellt).

In Abb.28 kann man die Veränderungen der Subtypen-Pattern in Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit Neuraminidase verfolgen. Zunächst wird der am meisten negativ geladene Subtyp etwas kleiner wobei noch keine Zunahme der positiveren Subtypen zu beobachten ist. Signifikante Unterschiede sind nach 16 Stunden sichtbar, hier ist die Zunahme der positiveren Peaks deutlich zu sehen. Nach 24 Stunden verändern sich die Mengenverhältnisse nicht mehr wesentlich, allerdings scheint die Trennung schlechter zu erfolgen. Zwischen 24 und 30 Stunden ist kein Unterschied mehr zu erkennen. Damit ist die Dynamik der enzymatischen Reaktion nachgewiesen, es werden negative Ladungen abgespalten, wodurch ein größerer Anteil des Gesamtproteins bei geringeren Salzkonzentrationen eluiert. Da es sich bei den beobachteten Effekten um Ladungsunterschiede handelt, lag die Vermutung nahe, dass evtl. auch im 2D-PAGE-Muster nach der Behandlung mit Neuraminidase einige Untereinheiten bzw. deren modifizierte Varianten ihre Position verändern könnten. In Abb.29 sind die 2D-PAGE-Muster nach NEpHGE-Auftrennung und Silberfärbung gezeigt.


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Abb. 29: NEpHGE-Auftrennung mit Silberfärbung von cytoplasmatischen 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen mit und ohne Behandlung mit Neuraminidase. Es wurden 10µg Proteasom mit 50mU/ml Neuraminidase bei 37°C für 16 Stunden inkubiert.

Nach Abtrennung einer negativen Ladung, wie z.B. von Sialinsäure, von einer Untereinheit, würde man erwarten, dass sich der isoelektrische Punkt dieser Untereinheit in Richtung Kathode, also mehr in den basischen Bereich verschiebt. In Abb. 29 ist im basischen pH-Bereich nach Neuraminidase-Behandlung ein zusätzlicher Spot (roter Pfeil) zu erkennen. Die Identität dieses Spots konnte bisher nicht geklärt werden. Die Untereinheit mit dem gleichen Molekulargewicht wäre C6 (α4), aber denkbar wären auch Iota (α1) und MECL-1. C6 zeigt meistens drei bis vier Spots in 2D-PAGE-Mustern humaner 20S Proteasomen (Claverol et al., 2002). Es sieht in Abb.29 allerdings so aus, als würde dort die Intensität der stärker sauren, also negativer geladenen Spots zunehmen. Allerdings ist unterschiedliche Anfärbbarkeit mit Silber bei Proteinen hier auch zu beachten. Man kann von der Zunahme der Intensität nicht eindeutig auf eine wirkliche Zunahme der Proteinmenge schließen.

3.6.1 Glykannachweis mit Lectinen

Um einen direkten Nachweis der Glykosylierung zu erbringen, sollten Kohlenhydratreste in den Proteasomen nach ihrer 2D-PAGE-Auftrennung und Blot auf PVDF-Membranen mit Lectinen nachgewiesen werden. Es wurden folgende Lectine verwendet:
Tritrichomonas mobilensis Lectin (TML): erkennt spezifisch N-Acylneuraminsäurereste (Neu5Ac, NANA), die α2,3- und α2,6- gekoppelt sind, dabei N-Glycolylneuraminsäuren mit einer 8fach höheren Affinität als N-Acetylneuraminsäuren.
Sambucus nigra Agglutinin I (SNA I): erkennt N-Acylneuraminsäurereste mit einer α2,6-Kopplung an Galactose oder N-Acetyl-Galactosamin (Gal/GalNAc)
Solanum tuberosum Agglutinin (STA): erkennt Oligomere von N-Acetylglucosamin (GlcNAc), z.B. GlcNac -ß1,4 –GlcNac
Wheat Germ Agglutinin (WGA): erkennt GlcNAc-ß1,4-GlcNAc, mit etwas geringerer Affinität auch ß-GlcNAc und Neu5Ac
Concanavalin A (ConA): erkennt α-D-Mannose, verzweigte Mannose-Reste und α-D-Glucose.
Alle Lectine waren Biotin-gekoppelte Konjugate, der Nachweis erfolgte mit Streptavidin- Peroxidase und ECL-Detektion. Es wurden zunächst zwei cytoplasmatische 20S Proteasom-Subtypen aus HeLaS3-Zellen verglichen. In Abb.30 wurden die cytoplasmatischen 20S Proteasomen-Subtypen CIII und CIV aus HeLaS3-Zellen untersucht. Fast alle Untereinheiten reagierten mit WGA, einige allerdings nur sehr schwach, was auf eine Substitution mit N-Acetylglucosamin (GlcNAc) hinweist. Dies entspricht in etwa auch den von Sümegi et al. (2003) gefundenen Daten. Ebenso reagierten fast alle 20S Proteasom-Untereinheiten mit TML, welches spezifisch N-Acetylneuraminsäure (NANA) erkennt. Schmid et al. (1993) hatten mit dem Lectin Limulus polyphemus Agglutinin (LPA), spezifisch gegen NANA, ein ähnliches Ergebnis. Bei der Färbung mit TML-Biotin fehlen einige Spots bei CIII, die bei CIV angefärbt werden (Pfeile). Es handelt sich hierbei um die Untereinheiten ζ , Z , MECL-1, C7 und je eine Unterform von C9 und LMP7. Bei der STA-Biotin-Färbung ist ein Spot von δ und ein Spot von Z bei CIV deutlich stärker angefärbt (Pfeile). Die Färbung mit ConA zeigt bei beiden Subtypen die [Seite 52↓]gleichen Untereinheiten, ist bei CIV aber etwas intensiver als bei CIII. Dies entspricht dem erwarteten Bild, dass der negativer geladene Subtyp CIV auch den höheren Anteil an Kohlenhydrat-Resten besitzt als der Subtyp CIII. Man sieht auch, dass die Intensität der Proteinfärbung der einzelnen Untereinheiten mit Amidoschwarz nicht in gleicher Weise der Intensität der Lectin-Färbung entspricht. Mit Amidoschwarz schwach gefärbte Untereinheiten zeigen eine sehr intensive Färbung mit den Lectinen und umgekehrt. So z.B. bei MB1 (schwache Proteinfärbung und sehr intensive Lectinfärbung), oder der umgekehrte Fall bei ζ. Einige Untereinheiten sind in der Amidoschwarz-Färbung gar nicht zu sehen. Die Reaktion mit TML ließ sich nach einer Behandlung der Membran mit Neuraminidase (50mU/ml, 37°C, 16 Stunden) komplett aufheben (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise könnte dies ein Hinweis auf eine unterschiedliche Glykosylierung der Subtypen und somit ein Grund für ihre unterschiedliche Oberflächenladung sein. Die Behandlungen der Membranen mit N-Acetylhexosaminidase (250mU/ml, 37°C, 16 Stunden), PNGaseF (1U/ml, 37°C, 16 Stunden) oder O-Glykosidase (2,5mU/ml, 37°C, 16 Stunden) führten nicht zur Unterbindung der Reaktion mit STA bzw. WGA (Daten nicht gezeigt). Wie schon bei der Behandlung von gelöstem 20S Proteasom könnten die Enzyme nicht für die glykosidischen Bindungen der vorliegenden Kohlenhydrate spezifisch sein. Sterische Behinderungen der Enzyme sind bei der denaturierenden Form der Auftrennung nicht denkbar.

Abb. 30: 20S Proteasom der cytoplasmatischen Subtypen CIII und CIV aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amidoschwarz, TML-Biotin (erkennt NANA), STA-Biotin (erkennt GlcNAc) und ConA-Biotin (erkennt Mannose und Glucose) angefärbt. Die schwarzen Pfeile markieren Unterschiede zwischen den Subtypen, jeweils verglichen mit der gleichen Nachweis-Methode. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben.


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Als nächstes wurde microsomales 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen in gleicher Weise untersucht (Abb.31). Obwohl eine Behandlung mit Neuraminidase des 20S Proteasoms aus dieser Fraktion keine Veränderungen gezeigt hat, konnten auch hier mit Lectinen Kohlenhydrat-Reste nachgewiesen werden. In Abb.31 fällt im Vergleich zu Abb.30 auf, dass mit TML deutlich weniger Untereinheiten bei den microsomalen als bei den cytoplasmatischen 20S Proteasomen angefärbt werden. Die beiden GlcNAc-erkennenden Lectine STA und WGA zeigen dagegen wieder fast das komplette Untereinheiten-Muster wie bei den cytoplasmatischen Proben, allerdings mit einer deutlich unterschiedlichen Intensität der einzelnen Untereinheiten. In der Amidoschwarz-Färbung sind auch hier nicht alle Untereinheiten zu erkennen, ihre Position ist schematisch markiert. Das Lectin WGA bindet außer an GlcNAc-Reste auch mit geringerer Affinität an NANA-Reste und wurde als Kontrolle zu TML und STA, das GlcNAc-Oligomere bindet, eingesetzt. Das Muster der WGA-Reaktion entspricht im Wesentlichen dem der STA-Reaktion, allerdings sind einige Untereinheiten intensiver gefärbt (N3, Z, C2), und ζ ist sehr viel schwächer mit WGA als mit STA gefärbt. Möglicherweise handelt es sich hier um Unterschiede in der glykosidischen Verknüpfung der Kohlenhydrate, WGA erkennt mit höherer Affinität GlcNAc -ß1,4-GlcNAc-Disaccharide als andere Oligosaccharide, STA ist weniger spezifisch. Die Untereinheiten C2, N3 und ι sind außerdem auch mit NANA-Resten substituiert, da sie mit TML reagieren, das könnte ihre verstärkte Anfärbung mit WGA ebenfalls erklären. Die Färbungen mit ConA und TML zeigen ein ähnliches Muster. Auch hier ist N3 am intensivsten gefärbt.

Abb. 31: 20S Proteasom der microsomalen Fraktion aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amido-schwarz, TML-Biotin (erkennt NANA), STA-Biotin (erkennt GlcNAc) und ConA-Biotin (er-kennt Mannose und Galaktose) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Posi-tionen der Unter-einheiten angegeben.Es wurden daraufhin die microsomalen 20S Proteasom-Subtypen MII und MIII untersucht (Abb.32). Wegen des geringen zur Verfügung stehenden Materials konnte hier nur die Reaktion mit TML der zwei Subtypen MII und MIII verglichen werden.

Abb. 32: 20S Proteasom-Subtypen MII und MIII der microsomalen Fraktion aus HeLaS3-Zellen. Die auf PVDF-Membranen geblotteten Proben (je 10µg) wurden mit Amidoschwarz, TML-Biotin (erkennt NANA) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben.

Die TML-Reaktion bei Subtyp MIII ist intensiver als bei Subtyp MII, sehr deutlich ist das beim Vergleich der Untereinheit δ sichtbar (Markierung). Ein Spot von C2 fehlt bei der TML-Färbung in MII völlig (Pfeil). Auch diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der negativer geladene Subtyp MIII offensichtlich mehr NANA enthält als der positiver geladene MII.

Um die Glykosylierung von 20S Proteasom auch in adhärent wachsenden HeLa-Zellen beurteilen zu können, wurde cytoplasmatisches 20S Proteasom aus HeLa-Zellen in NEpHGE aufgetrennt und auf PVDF-Membran geblottet (in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin). Es wurden die Zellen nach 144 stündiger Inkubation mit γIFN ausgewählt, um auch die Immuno-Untereinheiten untersuchen zu können (Abb. 33).


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Abb. 33: 20S Proteasom der aus HeLa-Zellen (144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert). Die auf PVDF-Membranen geblotteten Probe (je 10µg) wurde mit Amidoschwarz, Antiproteasom-Antikörper, TML-Biotin (erkennt NANA), WGA-Biotin (erkennt GlcNAc) angefärbt. Unten im Bild sind schematisch die Positionen der Untereinheiten angegeben. Beim Westernblot mit dem Antiproteasom-Antikörper (Nr. 67 gegen humanes 20S Proteasom) fehlen die Untereinheiten ι und C10 (schwarze Pfeile). Die Position von MECL-1 ist mit einem blauen Pfeil markiert.

In Abb.33 fällt auf, dass TML im Gegensatz zu den Proben aus HeLaS3-Zellen nur an sechs Untereinheiten bindet: δ, N3, C3, LMP7, C5 und MB1. Die Zuordnung der Untereinheiten erfolgte jeweils mit den entsprechenden Antikörpern auf derselben Membran (Daten nicht gezeigt). Mit WGA reagieren wieder fast alle Untereinheiten, aber auch deutlich schwächer als bei den HeLaS3-Zellen. Bis auf MB1 sind die mit TML positiven Untereinheiten auch mit WGA intensiver gefärbt. Auch WGA reagiert in geringem Maße mit NANA. Zwischen der Behandlung mit TML und WGA wurde die Membran mit Neuraminidase (50mU/ml, 37°C, 16 Stunden) inkubiert, worauf eine erneute Reaktion mit TML nicht möglich war. Es scheint so, dass die 20S Proteasomen aus HeLa-Zellen geringer glykosyliert sind als die aus HeLaS3-Zellen. Denkbar wäre hier allerdings ein Effekt durch die Langzeit-Inkubation mit γIFN, da auch die Vitalität der Zellen unter diesen Bedingungen beeinträchtigt war. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse noch einmal zusammengefasst.


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Tab. 5: Reaktion der 20S Proteasom-Untereinheiten aus HeLaS3 Cytoplasma, HeLaS3 Microsomen und HeLa Cytoplasma (20U/ml γIFN, 144h) mit den Lectinen TML (erkennt NANA) und STA bzw. WGA (erkennen GlcNAc). Ausgewertet wurden die 2D-Bilder aus den Abb. 25, 26, 27 und 28. (starke Intensität des Spots ++ ; Spot deutlich sichtbar + ; Spot nur sehr schwach sichtbar (+) ; Spot nicht sichtbar - )

Untereinheit

NANA/

HeLaS3 Cyt.

NANA/

HeLaS3 Mic.

NANA/

HeLa γIFN

GlcNAc/

HeLaS3

Cyt.

GlcNAc/

HeLaS3

Mic.

GlcNAc/
HeLa
γIFN

Man/

HeLaS3

Cyt.

Man/ HeLaS3 Mic.

α1 (ι)

+

+

-

+

++

+

+

+

α2 (C3)

+

(+)

+

+

+

+

-

-

α3 (C9)

+

(+)

-

(+)

(+)

-

-

-

α4 (C6)

+

-

-

+

+

(+)

-

-

α5 (ζ)

+

+

-

(+)

+

(+)

-

-

α6 (C2)

++

++

-

++

++

(+)

+

+

α7 (C8)

+

(+)

-

+

+

(+)

-

-

ß1 (δ)

+

+

+

+

+

+

+

+

iß1 (LMP2)

-

-

-

-

-

-

-

-

ß2 (Z)

(+)

(+)

-

(+)

+

+

-

-

iß2 (MECL-1)

(+)

-

-

-

(+)

-

-

-

ß3 (C10)

+

+

-

+

+

+

+

+

ß4 (C7)

(+)

-

-

(+)

+

(+)

+

+

ß5 (MB1)

++

-

+

++

+

-

+

-

iß5 (LMP7)

+

-

+

+

(+)

+

-

-

ß6 (C5)

+

-

(+)

+

+

(+)

+

-

ß7 (N3)

++

++

+

++

++

++

+

+

Die cytoplasmatischen 20S Porteasom-Subtypen scheinen stärker glykosyliert zu sein als die microsomalen. Die Untereinheiten N3 und δ reagieren bei allen Proben mit den verschiedenen Lectinen, N3 zum Teil sehr stark. Auch ι, C2 und C10 reagieren bis auf eine Ausnahme (TML bei HeLa γIFN) mit allen verwendeten Lectinen. LMP2 und MECL-1 hingegen zeigen in allen Proben keine (bzw. MECL-1 in zwei Fällen eine sehr schwache) Reaktion. Alle Untereinheiten, die NANA enthalten, zeigten auch mit GlcNAc-spezifischen Lectinen eine Reaktion, allerdings nicht mit dem Mannose-spezifischen ConA.

3.6.2 Chemischer Nachweis von Kohlenhydraten in 20S Proteasom

3.6.2.1 Nachweis der neutralen Monosaccharide

Die positive Reaktion der Lectine mit proteasomalen Untereinheiten gibt einen Hinweis auf das Vorhandensein von Kohlenhydrat-Resten und darauf, um welche Kohlenhydrate es sich handeln [Seite 57↓]könnte. Über die Menge an Oligosacchariden kann man keine Aussage machen. Deshalb sollte ein chemischer Nachweis der Monosaccharide in 20S Proteasom Aufschluß darüber geben. Die Analysen wurden von Grunow und Zimmermann-Kordmann, Institut für Molekularbiologie und Biochemie der Charite´, Campus Benjamin Franklin, durchgeführt. Die Kohlenhydrat-Reste wurden durch saure Hydrolyse vom Protein abgetrennt und die Analytik erfolgte mittels Anionenaustausch-Chromatographie (HPLC) mit gepulster amperometrischer Detektion. Es wurden cytoplasmatische (30 bzw. 110µg) und microsomale (20µg) 20S Proteasomen aus HeLaS3-Zellen untersucht (Tabelle 6).

Tab. 6: Monosaccharidanalyse von cytoplasmatischen und microsomalen 20S Proteasom. Die Angaben erfolgten in pmol Monosaccharid / µg Protein. Monosaccharide: Fucose (Fuc), N-Acetyl-Galaktosamin (GalNAc), N-Acetyl-Glucosamin (GclNac), Galaktose (Gal), Glucose (Glc), Mannose (Man).

Probe

Fuc

GalNAc

GlcNAc

Gal

Glc

Man

cyt. 20S 110µg

169 pmol

0

0,36 pmol/µg

0,234 pmol/pmol Proteasom

0,709 pmol/µg

0,46 pmol/pmol Proteasom

1,35 pmol/µg

0,879 pmol/pmol Proteasom

7,3 pmol/µg

4,75 pmol/pmol Proteasom

2,6 pmol/µg

1,69 pmol/pmol Proteasom

cyt. 20S

30µg

46,6 pmol

0,16 pmol/µg

0,107 pmol/pmol Proteasom

0,4 pmol/mg

0,26 pmol/pmol Proteasom

0

0,33 pmol/µg

0,212 pmol/pmol Proteasom

2,7 pmol/µg

1,74 pmol/pmol Proteasom

4,8 pmol/µg

3,09 pmol/pmol Proteasom

mic. 20S

20µg

30,7 pmol

0,3 pmol/µg

0,195 pmol/pmol Proteasom

0,65 pmol/µg

0,423 pmol/pmol Proteasom

0,3 pmol/µg

0,195 pmol/pmol Proteasom

2,45 pmol/µg

1,59 pmol/pmol Proteasom

12,65 pmol/µg

8,24 pmol/pmol Proteasom

18,15 pmol/µg

10,73 pmol/pmol Proteasom

Von dem microsomalen 20S Proteasom war nur eine Analyse möglich, von dem cytoplasmatischen 20S Proteasom standen zwei Proben unterschiedlicher Menge zur Verfügung. Die Werte weisen zum Teil große Unterschiede auf, was daran liegt, dass die Methode bei den geringen Protein- und Kohlenhydratmengen an der Nachweisgrenze war. Die Messung von Glucose und Mannose zeigt oft überhöhte Werte aufgrund von Verunreinigungen aus der Umgebung. Die Retentionszeit von Mannose ist ausserdem mit der von Xylose identisch, so dass auch hier Überlagerungen auftreten können. Auffällig ist der hohe Gehalt an Mannose und Glucose in den microsomalen Proteasomen. Dies entspricht nicht den Erwartungen nach den Ergebnissen der Blots mit ConA, die schwächer gefärbt waren als die mit TML. Die Lectinuntersuchungen gaben auch einen Hinweis auf GlcNAc-Vorkommen, was zumindest in zwei Proben bestätigt wurde.

3.6.2.2 Nachweis der Neuraminsäuren

Auch diese Analyse wurde von D. Grunow und M. Zimmermann-Kordmann, Institut für Molekularbiologie und Biochemie der Charite’, Campus Benjamin Franklin, durchgeführt. Die Neuraminsäuren α-N-Acetyl-Neuraminsäure und α-N-Glycolyl-Neuraminsäure wurden mittels milder saurer Hydrolyse von den Proteinresten abgetrennt und dann über Anionenaustausch-Chromatographie (HPLC) mit gepulster amperometrischer Detektion nachgewiesen. Es konnte bisher nur 20S Proteasom aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen untersucht werden. Es wurden mehrere Auftragungen aus einer Probe vorgenommen und Mittelwerte errechnet (Tabelle 7).


[Seite 58↓]

Tab. 7: Neuraminsäureanalyse von 20S Proteasom aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen, Angabe in pmol/µg Protein.

Probe

Neu5Gc

Neu5Ac

cyt. 20S aus HeLaS3 (30µg),

entspricht 46,6 pmol

0,04 pmol/µg oder

0,025 pmol/pmol Proteasom

0,024 pmol/µg oder

0,015 pmol/pmol Proteasom

Die Mengen an Neuraminsäure sind sehr viel geringer als die für die anderen Kohlenhydrat-Reste ermittelten Werte. Dies entspricht nicht dem Bild, das aus den Untersuchungen mit TML erhalten wurde. Bei den cytoplasmatischen Proben reagierten fast alle Untereinheiten mit TML, einige sehr stark. Das Lectin TML gilt als sehr spezifisch für Neu5Ac und Neu5Glc, so dass Kreuzreaktionen mit anderen Kohlenhydraten unwahrscheinlich sind. Aus den vorangegangenen Versuchen lässt sich schließen, dass die Intensität der Lectinbindung offensichtlich nicht mit der Menge an Kohlenhydrat korreliert.

3.6.3 Proteolytische Aktivität von cytoplasmatischen 20S Proteasom-Subtypen nach Desialylierung

Um einen eventuellen Einfluß der Sialylierung auf die proteolytische Aktivtität von 20S Proteasom zu untersuchen, wurden mit 20S Proteasom-Subtypen und 20S Proteasom-Subtypen nach Neuraminidase-Behandlung aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen Aktivitätstests mit fluorigenen Peptidsubstraten durchgeführt. Bisher ergaben aber erst zwei unabhängige Tests auswertbare Ergebnisse (Abb.34).

Abb. 34: Vergleich der spezifischen proteolytischen Aktivitäten von 20S Proteasom-Subtypen aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen ohne (C) und nach Neuraminidase-Behandlung (D) mit 50mU/ml bei 37°C für 16 Stunden.

Anhand der Testergebnisse in Abb.34 ist zu vermuten, dass durch die Desialylierung am stärksten die PGPH-Aktivität beeinflusst wurde, sie war bei den Subtypen DII-DIII fast nur noch halb so hoch wie bei der unbehandelten Kontrolle. Die deutlichsten Unterschiede sind zwischen den Subtypen DIII und DIV im Vergleich mit den Subtypen CIII und CIV zu verzeichnen. Dies würde bedeuten, dass hier die Desialylierung zu einem Verlust an Aktivität führt. Die tryptische Aktivität ist bei DIII und DIV nur noch halb so groß wie bei CIII und CIV, während die der Subtypen DI/II nicht wesentlich geringer ist als die [Seite 59↓]von CI/II. Die chymotryptische Aktivität ist in DIV um etwa die Hälfte geringer als im Subtyp CIV, bei den Subtypen DI/II ist eher ein Anstieg im Vergleich zu CI/II zu beobachten. Die größten Veränderungen der Aktivitäten sind wie erwartet in den mehr negativ geladenen Subtypen DIII und DIV zu verzeichnen. Nach diesen Daten scheint es so, als würde die Spaltung nach sauren Aminosäuren, die im Wesentlichen durch die Untereinheit δ erfolgt, nach Desialylierung schlechter vonstatten gehen. Auch die Spaltung nach basischen Aminosäuren scheint erschwert zu sein. Am wenigsten beeinflusst wird hiernach die Spaltung nach hydrophoben Aminosäuren. Es müssten dahingehend aber noch weitere Tests folgen, um die Reproduzierbarkeit zu überprüfen. Um Aussagen über die Bedeutung der Glykosylierung auf die Funktion des 20S Proteasoms machen zu können, wären hier auch Tests mit längeren Peptidsubstraten interessant.


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13.07.2005