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4  Diskussion

4.1 20S Proteasom-Subtypen aus Einzelzellen unterscheiden sich strukturell und funktionell voneinander

Zu Beginn dieser Arbeit wurden die 20S Proteasomen aus T2-Zellen und aus HeLa-Zellen auf ihre Subtypen hin untersucht. Es zeigte sich, dass zwei bzw. drei Subtypen trennbar waren, obwohl in diesen Zellen ausschließlich konstitutive Proteasomen exprimiert werden. Dies war ein eindeutiger Hinweis darauf, dass das Vorhandensein verschiedener Subtypen nicht nur auf den Austausch der ß-Untereinheiten zurückzuführen ist, sondern dass hier offensichtlich noch andere Modifikationen vorliegen, die zu Ladungsunterschieden an der Oberfläche der Komplexe führen. In zweidimensionalen Auftrennungen von 20S Proteasom wurde in dieser und anderen Arbeiten (u.a. Kristensen et al, 1994; Hendil et al.,1995) eine Heterogenität der proteasomalen Untereinheiten festgestellt. Claverol et al.., 2002 fanden, dass fast alle der α- und ß-Untereinheiten von mehreren Spots mit verschiedenen pI-Werten repräsentiert wurden. Auch hier sind als Ursache post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Glykosylierung, N-Acetylierung, Alkylierung und oxidative Veränderungen denkbar. Für die Untereinheiten C8 und C9 sind Phosphorylierungen beschrieben (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Claverol et al., 2002). Möglicherweise unterscheiden sich die 20S Proteasom-Subtypen in HeLa-Zellen im Hinblick auf die Mengenverteilung dieser modifizierten Untereinheiten voneinander, Vergleiche der 2D-PAGE-Muster der einzelnen Subtypen von induzierten HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen miteinander stützten diese Hypothese (siehe Abbildungen 10, 12, 20, 21 und 22). Ein endgültiger Beweis konnte aber noch nicht erbracht werden. Bei allen drei 20S Proteasom Subtypen aus HeLa-Zellen zeigte sich beim Vergleich der proteolytischen Aktivitäten die Verteilung folgendermaßen: PGPH > chymotryptisch > tryptisch (Abb.23). Die Messungen erfolgten mit fluorigenen Peptidsubstraten mit einer Länge von drei bis vier Aminosäuren, die unabhängig von Ubiquitinierung und aktivem Transport bzw. Entfaltung durch den 19S bzw. 11S Regulator-Komplex von dem 20S Proteasom gespalten wurden. Auch bei den Untersuchungen von Khan et al. (2001) und Dahlmann et al. (2000) war die Verteilung der spezifischen Aktivitäten mit den Substraten Z-LLE-MCA (bzw. Z-LLE-ßNA), Suc-LLVY-MCA und Bz-VGR-MCA wie oben beschrieben. Die Umsatzrate und -geschwindigkeit der fluorigenen Substrate hängt von ihren chemischen Eigenschaften und den Bedingungen im Test ab. Das hydrophobe Substrat Suc-LLVY-MCA für die Messung der chymotryptischen Aktivität wird wesentlich schneller in Anwesenheit von SDS, Phospholipiden oder Fettsäuren umgesetzt. Ähnlich verhält es sich mit dem Umsatz des Substrates Z-LLE-MCA für die PGPH-Aktivität, hier wirkt die Anwesenheit von Mg2+- Ionen zusätzlich aktivitätssteigernd. Für die PGPH-Aktivität wurde auch das Vorhandensein von zwei kinetisch verschiedenen Aktivitäten berichtet, welche sich durch allosterische Effekte positiv beeinflussen und zu einer sigmoidalen Abhängikeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration führen. Es werden auch Bindungseffekte von benachbarten, katalytisch inaktiven Untereinheiten diskutiert (Djaballah et al., 1992 bzw. 1993). Zahlreiche Untersuchungen haben ergeben, dass die proteolytischen Aktivitäten von bestimmten ß-Untereinheiten ausgeführt werden und dass diese unterschiedlich in ihrer Reaktion auf spezifische Inhibitoren und Effektoren sind, obwohl ihr katalytischer Mechanismus derselbe ist (Orlowski & Wilk, 2001). In der Arbeit von Dahlmann et al. (2000) wurden die 20S Proteasom-Subtypen aus dem Skelettmuskel der Ratte in Aktivitätstests verglichen. Die drei konstitutiven Subtypen unterschieden sich in ihren vmax- und Km-Werten sowohl untereinander, als auch von den intermediären und Immuno-Subtypen. Der Unterschied zwischen konstitutiven, intermediären und Immuno-Subtypen im Hinblick auf die proteolytischen Aktivitäten ist in erster Linie durch den Austausch der katalytisch aktiven ß-Untereinheiten zu erklären. Aktivitätsunterschiede von Subtypen mit der gleichen Zusammensetzung von aktiven ß-Untereinheiten könnten mit sterischen und ladungsbedingten Effekten und Konformationsänderungen durch Modifikationen an benachbarten Untereinheiten der katalytischen Zentren erklärt werden. In der vorliegenden Arbeit waren bei den rein konstitutiven 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen Unterschiede zu erkennen. Die PGPH-Aktivität und die tryptische Aktivität von Subtyp III waren doppelt so hoch wie die von Subtyp I, die chymotryptische Aktivität war ca.1,5fach erhöht (Abb.23).


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4.2  Einfluß von γIFN und Bildung von 20S Proteasomen-Mischkomplexen führt zu einer Änderung des Subtypen-Musters und der proteolytischen Aktivitäten.

Wurden die HeLa-Zellen in Anwesenheit von γIFN inkubiert, änderte sich das Muster und die Untereinheiten-Zusammensetzung der 20S Proteasom-Subtypen signifikant. Es entstanden hauptsächlich Intermediär-Subtypen, die sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten aufweisen. Die Veränderungen zeigen eine zeitliche Dynamik und auch nach 144 Stunden γIFN-Inkubation weit über die Halblebenszeit der konstitutiven 20S Proteasomen in HeLa-Zellen (54 Stunden, Information von Heink) hinaus, sind noch konstitutive Untereinheiten in den 20S Komplexen nachweisbar. Tabelle 8 gibt einen Überblick über die Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen aus γIFN-induzierten HeLa-Zellen. Die Lokalisation von MECL-1 ist schwierig, weil die Position zum Teil nicht eindeutig mit dem spezifischen Antikörper bestimmt werden konnte, da dieser oft Kreuzreaktionen mit anderen Untereinheiten, vor allem mit Z, zeigt. Um die Intensitäten der einzelnen Spots bestimmter Untereinheiten und ihrer modifizierten Varianten vergleichen zu können, müssten sehr viel mehr 2D-PAGE-Bilder der Subtypen angefertigt werden, damit eine statistische Auswertung möglich ist.

Tab. 8: Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen aus HeLa-Zellen, 72 h bzw. 144 h mit γIFN inkubiert . (Auswertung der 2D-PAGE, optische Intensität: ++ stark; + gut sichtbar; (+) schwach).

Subtyp

Unter- einheit

II (72 h)

IIA (72 h)

III (72 h)

I (144 h)

II (144 h)

III (144 h)

δ

+

++

+

+

+

+

MB1

+

(+)

++

+

(+)

+

Z

+

++

++

+

+

+

LMP2

(+)

+

-

+

+

-

LMP7

+

++

+

+

+

+

MECL-1

(+)

+

+

(+)

(+)

(+)

Griffin et al. (1998) zeigten in ihren Experimenten einen kooperativen Einbau von Immuno-Untereinheiten in transfizierten T2-Zellen und schlussfolgerten daraus, dass in erster Linie reine Immuno- oder reine konstitutive 20S Komplexe entstehen und dass Mischkomplexe nur auf eher untergeordneten Nebenwegen gebildet werden. Khan et al. (2001) beschreiben in ihren Experimenten mit viral infizierten Mäusen eine maximale Reduktion der konstitutiven ß-Untereinheiten MB1 um das achtfache und δ um das vierfache (die Verdrängung von Z durch MECL-1 wird mit 50% angegeben). Dies geschieht nach 8 Tagen in der Hochphase der Infektion, wenn der Virustiter beginnt abzunehmen und die Expansion der spezifischen CD8+ -T-Zellen am größten ist. Danach nimmt der Anteil der konstitutiven Untereinheiten wieder zu, der der Immuno-Untereinheiten entsprechend ab. Hier wurde von einer Halblebenszeit von 12-15 Tagen der konstitutiven 20S Proteasomen in Rattenleber ausgegangen. Die Autoren sprechen von einem nahezu kompletten Austausch von 20S Proteasomen nach 8 Tagen und erklären den relativen Verlust an konstitutiven 20S Proteasomen durch die massive Zerstörung von Hepatozyten durch cytotoxische T-Zellen und durch die starke Infiltration mit Leukozyten in den infizierten Lebern. Allerdings nehmen sie auch eine eventuell kürzere Halblebenszeit von konstitutiven 20S Proteasomen in entzündetem Gewebe an. HeLa-Zellen sind humane neoplastisch transformierte Epithelzellen und aufgrund dieser Tatsache wahrscheinlich auch [Seite 62↓]als Sonderfall zu betrachten, sowohl im Hinblick auf die Halblebenszeit der konstitutiven 20S Proteasomen, als auch auf ihre Reaktion auf Entzündungsmediatoren und Cytokine. Auch die humane Lymphoblastoid-Zelllinie T2 stellt sicher einen Sonderfall dar, da sie nur eine Kopie des Chromosoms 6 mit einer Deletion in der MHC-II-Region besitzt, welche die Gene für LMP2 und LMP7 einschließt. Es ist fraglich, inwieweit diese Zelllinien in Bezug auf ihre Regulationsmechanismen miteinander vergleichbar sind bzw. inwieweit sie „normale“ physiologische Reaktionen auf äußere Einflüsse (wie Cytokine oder Stress) zeigen. In HeLa-Zellen scheinen hauptsächlich Mischkomplexe zu entstehen, wenn die Zellen mit γIFN induziert werden. Die Aktivität der 20S Proteasomen verändert sich im Vergleich zu denen der uninduzierten Zellen (Abb.24). Die PGPH-Aktivität sinkt um mehr als die Hälfte, während die chymotryptische Aktivität um das dreifache und die tryptische Aktivität um das fünffache ansteigt. Es ergibt sich folgendes Verhältnis der Aktivitäten: chymotryptisch > tryptisch > PGPH. Ein Grund hierfür sind sicher die unterschiedlichen Schnittpräferenzen der ausgetauschten Untereinheiten gegenüber ihren konstitutiven Homologen. Der Austausch von δ gegen LMP2 führt hauptsächlich zum Absinken der PGPH- und zum Anstieg der chymotryptischen Aktivität, da LMP2 bevorzugt nach hydrophoben Aminosäuren schneidet. Genauer ließe sich das mit einer massenspektrometrischen Analyse der aus längeren Peptidsubstraten generierten Peptide der einzelnen Subtypen untersuchen. Zahlreiche Studien, u.a. von Sijts et al. (2000), haben das unterschiedliche Schnittverhalten von Immuno- gegenüber konstitutiven Proteasomen gezeigt. Einige Epitope werden nur von Immunoproteasomen generiert, wobei aber generell die MHC-I-relevante Antigenpräsentation auch mit konstiutitven Proteasomen stattfindet. Es scheint so, als würde durch die Bildung von Immuno- und Intermediär-Proteasom-Komplexen neben den konstitutiven die Diversität des Proteasom-Pools einer Zelle erhöht und so die Produktion einer größeren Bandbreite von Peptiden für die Antigen-Präsentation ermöglicht (Kloetzel, 2001).

4.3 Intermediär-Subtypen des 20S Proteasoms repräsentieren verschiedene Arten von Mischkomplexen

Gerade im Hinblick auf die Intermediär-Subtypen war es interessant, ob es tatsächlich Mischkomplexe gibt und ob sogar innerhalb eines Proteasom-Komplexes sowohl die konstitutive, als auch die Immuno-Untereinheit eines Homologen-Paares vorkommen können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dies der Fall ist. Es wurden über einen ZZ-tag Komplexe isoliert, die sowohl die konstitutive als auch die Immuno-Untereinheit des homologen Paares δ/LMP2 enthielten (Abb.14). Eine Spekulation über mögliche Mischkomplexe erfordert hier eine gründliche Betrachtung der Assemblierung des 20S Proteasoms. Griffin et al. (1998) und De et al. (2003) lieferten dazu umfangreiche Daten. Zunächst ist es wichtig zu beachten, dass LMP2 frühzeitig in die Preproteasomen eingebaut wird, δ dagegen spät. Auch die ß5-Homologen MB1 und LMP7 erscheinen spät in den Precursor-Komplexen. Griffin et al. (1998) und Groettrup et al. (1996) fanden, dass bevorzugt reine Immunoproteasomen gebildet werden, wenn alle sechs katalytischen ß-Untereinheiten vorhanden sind. Der Einbau von MECL-1 wird verstärkt, sobald LMP2 vorhanden ist, LMP7 übt darauf keinen Einfluß aus. De et al. (2003) untersuchten u.a. den Einfluß der Propeptide von Z und MECL-1auf die Assemblierung. Sie fanden heraus, dass das Propeptid von Z (ppZ) den Einbau von MECL-1 in konstitutive δ/MB1-Proteasomen bzw. den Einbau von MB1 in LMP2/MECL-1-Immuno-Proteasomen ermöglicht. Das Propeptid von MECL-1 (ppMECL-1) hemmt allerdings nicht den Einbau oder die Prozessierung von Z in konstitutive Proteasomen. Es erhöht auch nur minimal den Einbau von Z in Immuno-Proteasomen gegenüber dem Z-Propeptid. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Proformen von LMP2 und LMP7 nicht akkumulieren, wenn kein MECL-1 vorhanden ist, was bedeutet, dass Z/LMP2/LMP7-Mischkomplexe gebildet werden. LMP7 wiederum kann in jede Kombination von ß1/ß2-Untereinheiten eingebaut werden. Ist es nicht vorhanden, akkumulieren aber Precursor-Proteasomen mit MECL-1/LMP2. Die Untereinheit Z scheint vor δ eingebaut zu werden, folglich braucht Z für seinen Einbau keine benachbarte ß1-Untereinheit. Weiterhin vermuteten die Autoren, dass MB1 nicht eingebaut wird, wenn bereits eine ß1-Untereinheit vorhanden ist. Deshalb ist es kaum in Preproteasomen mit dem frühen LMP2 zu finden. Das Z-Propeptid in Kombination mit MECL-1 verstärkt dessen Einbau in Preproteasomen ohne ß1-Untereinheit und somit den Einbau von MB1. Deshalb fanden die Autoren auch Komplexe der Kombination δ/MECL-1/MB1 in ihren Präzipitationen unter Verwendung von ppZ-MECL-1.


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Abb. 35: Alternative Wege für den Einbau von katalytischen Untereinheiten in die Ringe aus ß-Untereinheiten. Die durchgestrichenen Mög-lichkeiten führen nicht zu reifen Proteasomen, sondern zur Akkumulation von Pre-proteasomen. M: MECL-1; 2: LMP2; 7: LMP7; δ; Z. Immuno-Untereinheiten sind gelb und konstitutive sind blau dargestellt. Quadrate: ß1; Kreise: ß2; Dreiecke: ß5. (De et al., 2003)

Unter Beachtung dieser Informationen wären also vier verschiedene Halbproteasomen als Precursor-Komplexe möglich und kombinierbar (Abb.35). Daraus könnten theoretisch zehn 20S Proteasom-Komplexe gebildet werden (siehe Tabelle 9).

Tab. 9: Zusammenstellung möglicher Mischkomplexe des 20S Proteasoms unter Beachtung der Daten aus Assemblierungsuntersuchungen. (farbig gekennzeichnet sind Komplexe mit identischen Hemiproteasomen)

ß1

ß2

ß5

ß1

ß2

ß5

Subtyp

δ

Z

MB1

δ

Z

MB1

konstitutiv

δ

Z

MB1

δ

Z

LMP7

intermediär

δ

Z

MB1

LMP2

Z

LMP7

intermediär

δ

Z

MB1

LMP2

MECL-1

LMP7

intermediär

δ

Z

LMP7

δ

Z

LMP7

intermediär

δ

Z

LMP7

LMP2

Z

LMP7

intermediär

δ

Z

LMP7

LMP2

MECL-1

LMP7

intermediär

LMP2

Z

LMP7

LMP2

MECL-1

LMP7

intermediär

LMP2

Z

LMP7

LMP2

Z

LMP7

intermediär

LMP2

MECL-1

LMP7

LMP2

MECL-1

LMP7

Immuno-

Die Existenz von maximal vier 20S Proteasom-Subtypen in induzierten HeLa-Zellen bei 10 möglichen 20S Komplexen könnte bedeuten, dass ein Subtyp hier aus verschieden zusammengesetzten 20S Komplexen besteht, die die gleiche Oberflächenladung besitzen. In den 2D-PAGE-Analysen schienen alle Subtypen intermediär-Komplexe zu enthalten. Denkbar wäre natürlich auch, dass reine Immuno-Proteasomen gebildet wurden und dass diese aber nicht von einigen Mischkomplexen chromatographisch getrennt werden konnten, sodass in den 2D-PAGE-Mustern der Subtypen sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten zu sehen waren. Das würde allerdings den Daten von Dahlmann et al. (2000) widersprechen, die reine Immuno-Subtypen allerdings aus Rattengeweben [Seite 64↓]chromatographisch von Intermediär-Subtypen abtrennen konnten. Eine andere Möglichkeit wäre, dass sich nur gleichartige Halbproteasomen zusammenlagern und somit auch nur vier mögliche Komplexe gebildet werden können, die sich dann in vier Subtypen repräsentieren. Die chromatographische Trennung ist dann vielleicht nicht so exakt möglich, so dass die reinen konstitutiven und Immuno-Subtypen mit Untereinheiten aus den angrenzenden Intermediär-Subytpen verunreinigt werden. Allerdings sollte dieser Effekt durch Rechromatographie minimiert werden. Hier könnten aber auch die Modifikationen eine Rolle spielen, die eventuell vorhandene Ladungsunterschiede der verschiedenen Mischkomplexe maskieren.

4.4 Subzelluläre Lokalisation von 20S Proteasom-Subtypen in HeLaS3-Zellen

Es ist seit längerem bekannt, dass das Proteasom in verschiedenen Zellkompartimenten vorkommt und dass die Verteilung innerhalb der Zellen von vielen Faktoren beeinflusst wird (Wojcek & DeMartino, Review, 2003). Palmer et al., 1996 fanden darüber hinaus Hinweise auf strukturelle Unterschiede der Proteasomen-Subpopulationen, indem sie die Verteilung bestimmter proteasomaler Untereinheiten auf die Zellfraktionen verglichen. Im Hinblick auf sehr spezielle Stoffwechsel- und Regulationsprozesse in den einzelnen Zellkompartimenten, wären strukturelle und damit verbundene funktionelle Unterschiede der 20S Proteasomen-Subpopulationen durchaus sinnvoll und denkbar. In der vorliegenden Arbeit sollte dies näher mit HeLaS3-Zellen untersucht werden, da diese wegen ihres nicht adhärenten Wachstums in Solubilisationskulturen kultiviert werden konnten und somit eine größere Menge an Zellen zur Verfügung stand. Auffallend war hier zunächst, dass HeLaS3-Zellen auch ohne Induktion mit γIFN Immuno-Untereinheiten ausbilden. Möglicherweise sind dafür die Kulturbedingungen verantwortlich. Die Zellen wurden unter Durchmischung in „spinnerflasks“ gezogen und erreichten eine hohe Zelldichte. Die Zellen waren unter dem Mikroskop kugelförmig und bei hohen Zelldichten bildeten sie untereinander Cluster und Perlenkettenähnliche Strukturen aus, adhärierten aber nie an den Oberflächen der Kulturgefäße. Denkbar wäre, dass die Zellen durch den fehlenden Kontakt zu Nachbarzellen und zur Matrix unter Stress geraten und so in eine Art Alarmzustand versetzt werden, wodurch in der Folge Immuno-Untereinheiten exprimiert werden. Es gibt bisher in der Literatur allerdings keine Hinweise auf diesen speziellen Fall. Kuckelkorn et al. (2000) fanden nach Stress erzeugenden Hitzeschock-Behandlungen eher den gegenteiligen Effekt bei murinen RMA-Zellen. Durch die Hitzeschock-Behandlung wurden die 20S Proteasomen inaktiv und resistent gegenüber einer Aktivierung mit SDS, was auf strukturelle Veränderungen der Untereinheiten α1 (ι) und α6 (C2) zurückgeführt wurde. Darüber hinaus wurde die de novo-Synthese von 20S Proteasom gehemmt. Es waren keine Immuno-Untereinheiten nachweisbar. Auch zellulärer Stress, erzeugt durch Proteasom-Inhibition, führt nicht zu einer Hochregulierung von proteasomalen Immuno-Untereinheiten (mündliche Information von Heyken). Gegen oxidativen Stress durch H2O2 oder andere Radikale ist das 20S Proteasom relativ resistent (Shringarpure et al., 2001), es wurde keine spontane Induktion von Immuno-Untereinheiten beobachtet. Es konnten aus dem Gesamt-Zelllysat von HeLaS3-Zellen drei 20S Proteasom-Subtypen getrennt werden, die sich in ihrem Muster von denen der adhärenten HeLa-Zellen unterschieden (Abb.15). Die Subtypen waren bei den HeLaS3-Zellen nicht so deutlich voneinander trennbar, dominierend war hier der Subtyp II. Das Subtypen-Muster unterscheidet sich auch deutlich von denen mit γIFN induzierten HeLa-Zellen nach 48, 72 bzw. 144 Stunden, obwohl der Vergleich der 2D-PAGE-Muster eine sehr ähnliche Untereinheiten-Zusammensetzung zeigt (Abbildungen 8, 10, 11, 12 und 15) . Als Grund dafür sind eher unterschiedliche Modifikationen der proteasomalen Untereinheiten anzunehmen, als ihre Zusammensetzung als solche. Aus den HeLaS3-Zellen wurden nun die 20S Proteasomen-Subpopulationen der einzelnen Zellkompartimente Cytoplasma, Microsomen und Zellkern näher betrachtet. Die Kompartiment-Trennung wurde über die An- bzw. Abreicherung bestimmter Markerproteine kontrolliert. Zunächst konnte anhand der präparierten Protein-Menge eine Aussage über die quantitative Verteilung von 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen auf die Zellkompartimente getroffen werden: es wurden vom Gesamtproteasom 70-72% im Cytoplasma, 25-27% in den Microsomen und 3-5% in den Zellkernen gefunden. In Hefe z.B., die kein adaptives Immunsystem und auch keine Immuno-Proteasomen besitzt, sind 80% der 26S Porteasomen im Nucleus und Nuclear Envelope lokalisiert (Enenkel et al., 1998), was ein Ausdruck dafür ist, dass bei der hohen Teilungsrate der Hefezellen der Protein-turnover hauptsächlich in diesen Kompartimenten stattfindet. Die subzelluläre Lokalisation von Proteasom unterliegt sehr starken Schwankungen, sowohl bei den unterschiedlichen Spezies, als auch innerhalb einer Spezies im Hinblick auf Zellzyklus, Reifegrad der [Seite 65↓]Zelle und unter pathophysiologischen Aspekten. All dies lässt Rückschlüsse auf eine Verbindung zwischen subzellulärer Lokalisation und Funktion der Proteasomen zu. Beim Vergleich der Elutionsprofile der 20S Proteasom-Subpopulationen fiel auf, dass der Elutionsbereich zwar bei allen Proben derselbe war, dass sich aber die Muster deutlich unterschieden (Abb.18). Das Profil der cytoplasmatischen 20S Proteasom-Subtypen war dem der HeLa-Zellen nach 144 stündiger Inkubation mit γIFN noch am ähnlichsten (vgl. Abb.11 und 18), wenn man die Nummerierung der Subtypen außer acht lässt. Da es sich bei den Subtypen eventuell um eine Summe verschiedener Mischkomplexehandelt, kann nicht davon ausgegangen werden, dass die Subtypen mit gleichem Elutionsverhalten auch strukturell identisch sind. Es bedeutet lediglich, dass die Oberflächenladung der Komplexe die gleiche ist. Es wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung mittels 2D-PAGE und Westernblot-Analyse verglichen. Tabelle 10 gibt einen Überblick über die Verteilung der katalytischen Untereinheiten der Subtypen aus HeLaS3-Zellen:

Tab. 10: Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen der einzelnen Zellkompartimente in HeLaS3-Zellen (Auswertung der 2D-PAGE, optische Intensität: ++ stark; + gut sichtbar; (+) schwach). MECL-1 konnte bei den microsomalen Subtypen nicht eindeutig lokalisiert werden.

Subtyp

Untereinheit

 

CII

CIII

CIV

MI

MII

MIII

MIV

NII

NIII

δ

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

MB1

(+)

+

+

+

+

+

++

+

(+)

+

Z

(+)

+

+

+

+

+

+

+

+

(+)

LMP2

+

(+)

(+)

(+)

+

+

+

-

+

+

LMP7

+

+

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

+

++

+

MECL-1

+

++

+

+

?

?

?

?

(+)

+

Nach Tabelle 10 zu urteilen haben nicht, wie erwartet, die microsomalen 20S Proteasom-Subtypen den höchsten Anteil an Immuno-Untereinheiten, sondern eher die nucleären Proteasomen. Bei den microsomalen Proteasomen wird angenommen, dass diese hauptsächlich am ER-assziierten Proteinabbau (ERAD) und an der Generierung von MHC I-relevanten Epitopen beteiligt sind, also immunologische Funktionen haben. In den 2D-PAGE-Mustern (Abb.21) haben sie aber verglichen mit den cytoplasmatischen Proteasom-Subtypen (Abb.20) lediglich einen höheren Anteil an LMP2, welcher wiederum niedriger als der der nucleären Subtypen zu sein scheint. Palmer et al. (1996) fanden ebenfalls bei den microsomalen Proteasomen aus Rattenleber einen höheren Anteil an LMP2 im Vergleich mit der cytoplasmatischen Fraktion. Allerdings fanden sie sehr wenig LMP2 in der nucleären Fraktion, was nicht den Beobachtungen in dieser Arbeit entspricht. Gründe hierfür sind möglicherweise in der anderen Art des von Palmer et al. untersuchten Materials (Rattenleber) oder in der unterschiedlichen experimentellen Prozedur zu suchen. Fabunmi et al. (2000) fanden in HeLa-Zellen nach Induktion mit γIFN eine Anreicherung von Immunoproteasomen und PA 28-Regulator im Zellkern in sogenannten PML (promyelocytic leukemia oncoprotein) bodies. PML bodies sind diskrete subnucleäre Domänen, welchen verschiedene Funktionen zugeschrieben werden, z.B. Transkriptionsregulation, Tumorsuppression, Apoptose und Speicherung nucleärer Proteine. Bei verschiedenen pathologischen Prozessen, wie viralen Infektionen und akuter promyeloischer Leukämie wird eine Auflösung dieser Strukturdomänen beobachtet, was auch eine Zerstreuung in ihnen gespeicherter Komponenten bedeutet. Es wird die hohe Pathogenität dieser Krankheiten teilweise auf die Tatsache zurückgeführt, dass dadurch Defekte in der Antigen-Prozessierung und Präsentation auftreten.


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4.5  Die 20S Proteasom-Subtypen aus den verschiedenen Zellkompartimenten unterscheiden sich strukturell und in ihren proteolytischen Aktivitäten.

Schaut man sich die proteolytischen Aktivitäten der einzelnen Subtypen gegenüber fluorigenen Peptidsubstraten an, so findet man auch hier Unterschiede (Abb.25). Bei den cytoplasmatischen und den microsomalen Subtypen ist die PGPH-Aktivität die höchste, obwohl in diesen Subtypen LMP2 zumindest teilweise gegen δ ausgetauscht ist, bei den cytoplasmatischen Subtypen allerdings nur in geringem Maße. Die chymotryptische und die tryptische Aktivität sind bei den microsomalen Subtypen am niedrigsten. In keiner Fraktion zeigte sich eine ähnliche Verteilung der Aktivitäten wie bei den adhärenten HeLa-Zellen nach 144 stündiger Inkubation mit γIFN (Abb.24), obwohl die Zusammensetzung der katalytischen Untereinheiten ähnlich ist. Denkbar wären hier veränderte Bindungseffekte der benachbarten Untereinheiten (Djaballah et al., 1992 bzw. 1993), welche durch post-translationale Modifikationen, wie Glykosylierung, Phosphorylierung u.a. hervorgerufen werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Glykosylierung als post-translationale Modifikation der 20S Proteasomen näher untersucht.

4.6 Glykosylierung als post-translationale Modifikation

Man weiß inzwischen, dass die meisten Proteine Glykoproteine sind, mit einem kovalent gebundenen Kohlenhydratanteil von < 1 bis > 90% Gewichtsanteil. Sie finden sich in sämtlichen Proteinklassen mit den unterschiedlichsten Funktionen, z.B. Strukturproteine, Hormone, Rezeptoren usw. Oligosaccharide können auf zweierlei Art mit dem Protein verknüpft sein: N-glykosidisch und O-glykosidisch. N-Glykane haben eine feste Kernstruktur. Sie sind ß-glykosidisch an die γ-Aminogruppe von Asparagin in der Sequenz Asn-X-Ser/Thr gebunden. Das Kernoligosaccharid besteht aus zwei N-Acetylglucosaminresten und drei verzweigten Mannoseresten, an welche sich mit großer Variationsbreite verschiedene Oligosaccharide mit oder ohne weitere Verzweigung anschließen können. Die häufigste O-glykosidische Fixierung wird über ein Kerndisaccharid vermittelt, welches α-glykosidisch mit Serin oder Threonin verknüpft ist und aus ß-Galactosyl- 1,3 -α- N-Acetylgalactosamin besteht. Es kommen aber auch Galaktose, Mannose und Xylose vor, die α-glykosidisch an Serin oder Threonin gebunden sind. O-Glykane sind weniger gut charakterisiert als N-Glykane. Sie sind oft an hochglycosylierten Bereichen im Protein konzentriert, die viel Serin und Threonin enthalten. N-Glykane sind meist gleichmäßiger auf das Protein verteilt, ihr Aufbau ist systematischer, oft sind sie stark verzweigt. Durch ihre Hydrophilie und ihre sterischen Ausmaße erzwingen Kohlenhydrate eine gestreckte Konformation, sie binden bevorzugt an ß-Faltblattregionen im Protein. O- und N-Glykane dienen u.a. als Marker für den Zustand und das Alter des Proteins, für seine Lokalisation oder als Mittler in Zell-Zell-Erkennungsprozessen. Auch als physiologische Schalter ähnlich wie Phosphorylierungen werden Glykosylierungen diskutiert.

4.6.1 Nucleäre und cytoplasmatische Glykosylierung

In den letzten Jahren entfernte man sich mehr und mehr von der Ansicht, dass glykosylierte Proteine meist große komplexe Glykanstrukturen tragen und sich ausschließlich an der Zelloberfläche oder innerhalb des Lumens von subzellulären Organellen wie ER oder Golgi befinden. Mittlerweile wurden komplexe sowie einfache Glykosylierungen auch an cytoplasmatischen und nucleären Proteinen gefunden. Vielfach wurden diese Befunde mit Hilfe pflanzlicher Lectine ermittelt. An so erhaltenen Ergebnissen wurde vielfach Kritik geübt, da einige Lectine (z.B. ConA) unter bestimmten Umständen auch Moleküle über unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen binden können. Hypothesen über „ungewöhnliche“ Glykosylierungsphänomene, gefunden durch Lectintests, sollten daher unbedingt durch strukturelle Analysen gestützt werden. Nichtsdestoweniger zeigten Lectin-Bindungsstudien u.a., dass GlcNAc-, Mannose- und Fucose-haltige Glykane im Cytoplasma und im Nucleus zahlreich vorkommen, zum Teil in Form komplexer Glykane.


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Abb. 36: Struktur von tetramerem ConA mit Trimannosidliganden (Kalottenmodell in lila und rot) und mit den koordinativ gebundenen Ca2+ und Mn2+ Ionen (grün und pink). (Naismith & Field, 1996)Es wurde gezeigt, dass Neuraminsäure-haltige Glykane an der cytoplasmatischen Seite des nuclear envelope vorkommen. Das Lectin SNA band an die Nucleoporine p62 und p180, von denen bekannt war, dass sie O-GlcNAc enthielten (Emig et al., 1995). Anfang der 90er Jahre haben Studien von Duverger, Monsigny und Kollegen Hinweise darauf gegeben, dass Kohlenhydrat-Reste eventuell als Nucleäre Lokalisationssignale fungieren könnten (Duverger et al., 1993, 1995, 1996; Roche & Monsigny, 1996).

4.6.2 Die Rolle von O-GlcNAc-Modifikationen

Viele nucleäre und cytoplasmatische Proteine sind dynamisch modifiziert mit O-gekoppelten N-Acetylglucosaminresten an Serin oder Threonin, oft alternierend oder alternativ zu einer Phosphorylierung an diesen Aminosäuren (Comer & Hart, 2000). In einigen Fällen findet die Regulation der Proteinfunktion durch O-Phosphat oder O-GlcNAc reziprok an den selben Hydroxylresten statt. Studien an Casein Kinase II haben gezeigt, dass sich die glyokosylierte Form von der phosphorylierten unterscheidet, obwohl die Bindungsstellen nur wenige Aminosäuren voneinander entfernt sind. Diese Daten unterstützten die These, dass die Glykosylierung eine Phosphorylierung an benachbarter Stelle verhindern kann, vermutlich durch sterische Effekte oder Modulation der lokalen Proteinstruktur (Zachara & Hart, 2004).

Abb. 37: Komplexes Zusammenspiel zwischen O-GlcNAc und Phosphat-Modifikation. Ein Protein kann glykosyliert (1 und 3) oder phosphoryliert (2) werden. Beide Modifikationen können alternativ an der selben Stelle (4) oder an unterschiedlichen Stellen (5) erfolgen oder die beiden Modifikationen bedingen und beeinflussen sich gegenseitig (1-6, 2-7). All diese Modifikationen können einer Modulierung der Proteinfunktion dienen (Comer & Hart, 2000).

Die verantwortlichen Enzyme für die O-GlcNAcylierung bzw. Deglykosylierung sind die O-GlcNAc-Transferase (OGT) und die ß-N-Acetylglucosaminidase (O-GlcNAcase). Beide Enzyme werden komplex reguliert und sowohl cytosolisch als auch nucleär lokalisiert (Kreppel et al., 1997; Wells et al., 2002). Inhibitionsstudien beider Enzyme haben gezeigt, dass die korrekte O-GlcNAc-Modifikation für eukaryontische Zellen essentiell ist (Fang et al., 1996). Auch in vielen humanen Krankheiten spielt O-GlcNAc eine wichtige Rolle: Das ß-Amyloid-Precursor-Protein welches ß-Amyloid Peptide bei Morbus Alzheimer verursacht, ist O-GlcNAc-modifiziert (Griffith et al., 1995). Das microtubuli-assoziierte Protein Tau, welches eine Hauptkomponente der neurofibrillären Cluster im Hirngewebe von Alzheimer-Patienten ist, ist in gesundem Gewebe mit O-GlcNAc modifiziert. Bei Alzheimer-Patienten ist es dagegen hyperphosphoryliert (Arnold et al., 1996; Alonso et al., 1996). Es wird ein kausaler Zusammenhang zwischen der Störung des Glucosestoffwechsels in alternden Neuronen und der Abnahme an O-GlcNAc-Modifikationen und dadurch verursachten neurodegenerativen Erkrankungen vermutet. Ebenso gibt es Hinweise auf einen Zusammenhang mit gestörter O-GlcNAcylierung und Krebs; viele Transkriptionsfaktoren und auch das Tumor-Supressor Protein p53 werden durch GlcNAc modifiziert (Shaw et al., 1996).

4.6.3 Glykosylierung des Proteasoms ?

Das Proteasom ist in viele für die Zelle lebenswichtige Prozesse involviert und seine Aktivität wird über komplexe Mechanismen reguliert. Auch eine Phosphorylierung einiger proteasomaler Untereinheiten ist bekannt, so ist es durchaus wahrscheinlich, dass auch hier eine Regulierung der Aktivität durch O-GlcNAc-Modifikation stattfindet. Erste Hinweise darauf erhielten Zhang et al. (2003) in ihren Untersuchungen. Ebenso wahrscheinlich ist es, dass einzelne Untereinheiten des Proteasoms mit anderen Mono- oder Oligosacchariden assoziiert sind, da diese Form der Modifikation vielfache Möglichkeiten der Kontrolle der Proteasom-Assemblierung, der Bindung an andere Strukturen und der Lokalisation innerhalb der Zelle bietet. Die Stützung dieser Hypothese durch strukturelle Daten wird aber weiterhin schwierig sein, da die zur Verfügung stehenden Methoden begrenzt und oft für die sehr geringen Mengen an Kohlenhydraten nicht empfindlich genug sind. Außerdem sind die Bindungen der Zuckerreste oder die Zuckerreste selbst teilweise sehr instabil. In den Versuchen, in denen gereinigtes 20S Proteasom mit Neurminidase verdaut und danach an MiniQ in die Subtypen aufgetrennt wurde, war zu erkennen, dass es sich nur um minimale Veränderungen der Ladung handelt (Abb.27). Die Subtypen eluierten im selben Konzentrationsbereich des Salzgradienten, ihre Zahl blieb unverändert, lediglich die Mengenverteilung verschob sich etwas in Richtung der positiveren Oberflächenladung. Dem gegenüber steht die relativ starke Reaktion mit dem NANA-erkennenden Lectin TML, die in der 2D-PAGE fast das komplette Muster der 20S Proteasom-Untereinheiten zeigte (Abb.26). Ein Grund für diese Diskrepanz ist eventuell, dass für die Neuraminidase bei dem nativen Komplex nicht alle Neuraminsäure-Reste für die Abspaltung zugänglich waren. Die in der 2D-PAGE denaturierten Untereinheiten konnten dagegen mit dem Enzym komplett desialyliert werden, eine nachfolgende Inkubation mit dem Lectin ergab keine Reaktion mehr. Mit den anderen verwendeten deglykosylierenden Enzymen konnte weder eine Veränderung des Elutionsprofils, noch eine Entfernung der Lectinfärbung erreicht werden. Der Grund dafür können die Spezifitäten der Enzyme sein, die andere als die vorhandenen Bindungen und Sequenzen erkennen.

Tritrichomonas mobilensis ist ein Protozoon aus dem Darm von Totenkopfäffchen (Squirrel monkey). Das Tritrichomonas mobilensis Lectin formt multimere Komplexe mit dem Molekulargewicht 556 und 491 kDa. Es benötigt anders als die Pflanzenlectine keine bivalenten Kationen für die Reaktion mit Kohlenhydraten. TML ist hochglykosyliert mit ca. 20% Kohlenhydratanteil (Babal et al., 1994). Nach Inkubation mit Papain wurde eine Zunahme der Agglutinationsaktivität von TML beobachtet (Pindak et al., 1988). Es wird in der Literatur als hochspezifisch beschrieben (Babal et al., 1996 und 1999). Die sehr starke Reaktion mit den proteasomalen Untereinheiten in den 2D-PAGE-Analysen könnte der Tatsache geschuldet sein, dass das große multimere TML-Molekül eine starke Biotinylierung aufweist und somit auch stärker angefärbt wird.

Über die Funktion der Glykosylierung des Proteasoms kann bisher noch nicht viel gesagt werden. Erste Hinweise auf eine Auswirkung auf die Aktivität bei 26S Proteasom gibt es bereits. Zhang et al. (2003) fanden eine Hemmung der chymotryptischen Aktivität gegenüber Suc-LLVY-MCA von 26S Proteasom durch die OGT-vermittelte Glykosylierung mit GlcNAc, allerdings nicht bei 20S Proteasom. [Seite 69↓]Sie fanden keine Hemmung mit dem chymotryptischen Substrat Z-GGL-MCA und auch keine Hemmung der tryptischen Aktivität bei 26S und 20S Proteasom. Begründet wurde dies mit der höheren Hydrophobizität von Suc-LLVY-MCA, nicht mit einer Modifizierung der Untereinheit ß5. Andererseits beobachteten sie bei den glykosylierten Proben eine Hemmung des Abbaus von Sp1, eines proteasomalen Substrates, und eine Hemmung der ATPase-Aktivität des 19S Regulator-Komplexes.


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13.07.2005