Das Ubiquitin-Proteasom-System sorgt in eukaryontischen Zellen für einen kontrollierten Abbau von Proteinen. Das 20S Proteasom ist als Multikatalytischer Protease Komplex der zentrale Bestandteil dieses Systems. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich gereinigtes 20S Proteasom aus HeLa-Zellen chromatographisch in Subtypen auftrennen lässt, die sich strukturell und in ihrer proteolytischen Aktivität unterscheiden. Nach Induktion der Zellen mit gamma-Interferon (gamma-IFN) werden Immuno-Proteasomen gebildet und es kommt zu einer Veränderung des Subtypen-Musters und der Aktivitäten. Unter dem Einfluss von gamma-IFN bilden sich hauptsächlich Mischkomplexe mit sowohl konstitutiven als auch Immuno-Untereinheiten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den Zellkompartimenten Cytoplasma, Zellkern und Microsomen von HeLaS3-Zellen unterschiedliche 20S Proteasom-Subtypen vorkommen. Dies war unter anderem auf eine unterschiedliche Glykosylierung einzelner proteasomaler Untereinheiten zurückzuführen. Die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion der 20S Proteasom-Subtypen ist im Hinblick auf neue diagnostische und therapeutische Ansätze in der Humanmedizin von großem Interesse.
The Ubiquitin-proteasome system is responsible for the regulated protein degradation in eucaryotic cells. The 20S proteasome is as a multicatalytic protease the central complex of these system. This study has shown that it is possible to separate 20S proteasome subtypes from HeLa cells by chromatography. 20s proteasome subtypes differ in structure and proteolytic activity. The subtype-pattern and the activity are significantly changed after an induction of the cells with gamma-Interferon (gamma-IFN) under formation of immuno proteasomes. After gamma-IFN induction mainly mixed complexes have been formed with both constitutive and immuno subunits. Further it has been shown that in cell compartements cytoplasm, microsomes and nucleus of HeLaS3 cells different 20S proteasome subtypes are located. Among other things glycosylation of some subunits is responsible for that phenomenon. With regard to new strategies in diagnostic and therapy of human diseases the exactly knowledge of structure and function of the proteasome subtypes is a case of interest.
Das Ubiquitin-Proteasom-System sorgt in eukaryontischen Zellen für einen kontrollierten Abbau von Proteinen. Im diesem Rahmen erfüllt es essentielle regulatorische Aufgaben, z.B. innerhalb des Zellzyklus, bei der Immunabwehr und in der Apoptose. Das 20S Proteasom ist als Multikatalytischer Protease Komplex der zentrale Bestandteil dieses Systems und spielt somit auch in vielen pathophysiologischen Prozessen eine wichtige Rolle.
In der vorliegenden Arbeit sollte vor allem der Zusammenhang von strukturellen und funktionellen Merkmalen der 20S Proteasom-Subtypen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass sich gereinigtes 20S Proteasom aus HeLa- und HeLaS3-Zellen chromatographisch in Subtypen auftrennen lässt, die sich in ihrer Struktur und proteolytischen Aktivität unterscheiden. Nach Induktion der HeLa-Zellen mit γIFN und Ausbildung von Immuno-Proteasomen konnte eine Veränderung des Subtypen-Musters und der Aktivitäten beobachtet werden. Es wurde festgestellt, dass sich hauptsächlich Mischkomplexe bilden, welche sowohl konstitutive als auch Immuno-Untereinheiten enthalten. Mittels HeLa-Zellklonen, welche die ZZ-getagten proteasomalen Untereinheiten LMP2-ZZ bzw. δ-ZZ exprimierten, konnte die Kenntnis über das Spektrum der möglichen Mischkomplexe erweitert werden.
Es wurde weiterhin festgestellt, dass sich die 20S Proteasomen aus den Zellkompartimenten Cytoplasma, Microsomen und Zellkern in ihrem Subtypen-Muster, ihrer Untereinheiten-Zusammensetzung und ihrer Aktivität unterscheiden.
In einigen früheren Publikationen wurden bereits Hinweise auf Glykosylierungen als post-translationale Modifikationen des 20S Proteasoms gefunden (Schmid et al., 1993). Nach Inkubation von cytoplasmatischen 20S Proteasomen mit Neuraminidase veränderten sich die Proteinmengenverhältnisse der Subtypen zugunsten einer positiveren Oberflächenladung. Einige proteasomale Untereinheiten reagierten positiv im 2D-PAGE-Blot mit Lectinen spezifisch für Neuraminsäuren (TML, SNA I), N-Acetylglucosamin (WGA, STA) und Mannose (ConA). Auch gelang der Nachweis von Kohlenhydratanteilen in 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen. Erste Untersuchungen der proteolytischen Aktivität zeigten einen schwächeren Umsatz fluorigener Substrate mit den desialylierten Proteasom-Proben.
Die genaue Kenntnis von Strukur und Funktion des 20S Proteasoms ist von großem Interesse im Hinblick auf neue Ansätze in Diagnostik und Therapie vieler humaner Krankheiten.
In der belebten Materie findet man als Grundprinzip ein Gleichgewicht zwischen Anabolismus und Katabolismus, das in unterschiedlicher Art und Weise reguliert wird und den jeweiligen Organismus auf sich verändernde Umwelteinflüsse reagieren lässt. Auf makro- wie auf mikrokosmischer Ebene existieren natürliche Rohstoffkreisläufe, in welchen die beim Abbau anfallenden Grundbausteine wieder dem Aufbau neuer Strukturen zugeführt werden.
Auf zellulärer Ebene wird besonders deutlich, dass es sich hierbei nicht ausschließlich um reines Recycling handelt, sondern dass über kontrollierten Auf- und Abbau z.B. von Proteinen die Regulation lebenswichtiger Prozesse in der Zelle stattfindet. Die Selektivität der intrazellulären Proteolyse kann einerseits durch eine räumliche Trennung gewährleistet werden, wie es z.B. beim lysosomalen Proteinabbau der Fall ist. Lysosomale Proteasen sind hochaktiv aber relativ unspezifisch und die Auswahl der Substrate findet in diesem Falle bei ihrem Eintritt in das membranumschlossene Zellorganell statt. Dem stehen hochspezifische proteolytische Systeme gegenüber, die ihre Substrate an bestimmten Markierungen erkennen und diese gezielt abbauen. Diese Systeme sind entscheidend an verschiedenen Regulationsprozessen im Cytoplasma und Zellkern beteiligt. Ein solches System ist die multikatalytische Proteinase – auch Proteasom genannt.
Der Ubiquitin-abhängige Proteinabbau erfolgt durch das 26S Proteasom und dient dem Recycling und dem Entfernen gealterter bzw. schädlicher Proteine in der Zelle. Regulatorische Funktion hat das Proteasom vor allem durch den Abbau von Transkriptions-Faktoren oder deren Inhibitoren. Das Proteasom generiert Peptide, welche von den MHC-I-Molekülen an der Zelloberfläche aller kernhaltigen Zellen präsentiert werden. Antigene Peptide werden so von den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) über den CD8+ - T-Zellrezeptor erkannt und die betreffende Zelle wird eliminiert, z.B. indem sie über Cytokinsignale aktiviert wird und die Apoptose durchläuft. Diese Antigene können viraler oder auch körpereigener Natur sein und werden über diesen Weg dem Immunsystem zugänglich gemacht. Es handelt sich dabei um falsch gefaltete, funktionslose Proteine, welche in großer Zahl bei neoplastischen Zell-Transformationen auftreten. Aber auch im physiologischen Proteinstoffwechsel erreichen etwa 30-40% der neusynthetisierten Proteine auf Grund von Fehlern in der Translation oder bei der post-translationalen Modifikation nie ihre eigentliche Form und Struktur und werden in kurzer Zeit wieder abgebaut. Die Existenz von solchen sogenannten metastabilen Proteinen ist schon seit langem bekannt (Wheatley, 1982). Hershko & Ciechanover (1982) fanden, dass kurzlebige Proteine von einem ATP-Ubiquitin-abhängigen Proteolyse-System abgebaut werden. Hough et al. (1986) identifizierten das Proteasom als proteolytischen Bestandteil dieses Systems. Es hat sich gezeigt, dass diese kurzlebigen Proteine, auch als DRiPs (defective ribosomal products) bezeichnet, eine Quelle für antigene Peptide darstellen, die über den MHC-KlasseI-Weg präsentiert werden und durch die das Immunsystem praktisch ständig über den Zustand einer Zelle informiert wird. Beim Auftreten von körperfremden Antigenen infolge pathologischer Prozesse wird die Zelle möglichst schnell aus dem Zellverband isoliert und abgetötet und somit die Verbreitung einer viralen Infektion oder Tumorwachstum zu verhindert.
Die meisten wachsenden Zellen durchlaufen eine Serie von kontrollierten Übergängen von einer Phase zur nächsten im Zellzyklus. Dies wird durch den zeitgenauen Abbau von Zell-Zyklus-Regulatoren kontrolliert.
In letzter Zeit wurden sehr viele Untersuchungen mit verschiedenen Proteasom-Inhibitoren durchgeführt, vor allem im Hinblick auf neue Strategien in der Krebstherapie. Diese Substanzen verhindern den Abbau von z.B. Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinase Inhibitoren und stoppen so den Fortschritt der Zellteilung. Auch werden Entzündungsmediatoren beeinflusst wie NFκB, dessen Inhibitor IκB normalerweise durch das Proteasom abgebaut wird und so eine Aktivierung von NFκB bewirkt. Dieser Prozess wird durch Proteasominhibitoren gestoppt. Sie induzieren außerdem eine Caspase-abhängige Apoptose in Tumorzellen (Hideshima et al., 2003 ; Liu et al., 2003).
Das 20S Proteasom ist das sogenannte core-Partikel des ATP-Ubiquitin-abhängigen Proteolyse-Systems und stellt eine sehr alte Struktur in der Evolution dar. Das Proteasom ist in Eukaryonten ubiquitär und essentiell (Heinemeyer, 2000), in Archaea ist es ubiquitär, aber nicht essentiell (Ruepp et al., 1998) und in Bakterien kommt es selten vor und ist nicht essentiell (De Mot et al., 1999). Die Quartärstruktur des 20S Proteasoms ist hochkonserviert. Das Archaebakterium Thermoplasma acidophilum besitzt das einfachste Proteasom aus zwei verschiedene Untereinheiten, die mit αund ß bezeichnet wurden (Dahlmann et al., 1989). Die Untereinheiten sind in vier heptameren Ringen übereinander angeordnet , wobei die beiden α-Ringe außen und die katalytisch aktiven ß-Ringe innen liegen (Löwe et al., 1995). Das eukaryontische Proteasom zeigt einen komplexeren Aufbau:
28 Untereinheiten, je14 verschiedene α- und ß-Untereinheiten, bilden 4 heptamere Ringe und formen zusammen den zylinderförmigen Komplex mit einer Länge von 15 nm und einem Durchmesser von 11 nm. Die Einteilung von α- und ß-Untereinheiten erfolgte aufgrund von Sequenzhomologien zu den Untereinheiten von Thermoplasma acidophilum (Tanaka et al. 1992). Die beiden Ringe aus ß-Untereinheiten befinden sich in der Mitte des Komplexes und bilden eine zentrale Kammer, welche das katalytische Zentrum beherbergt. Die beiden Ringe aus α - Untereinheiten bilden mit den angrenzenden Ringen aus ß-Untereinheiten außen jeweils zwei flankierende Kammern. Außerdem dienen sie der Bindung von Regulatorkomplexen (siehe unter 2.2) und bestimmte Aminosäurereste einiger α - Untereinheiten verschließen die katalytische Kammer und führen so zum sogenannten latenten 20S Proteasom (siehe unten). Die katalytische Aktivität geht von den ß-Untereinheiten ß1 (δ) , ß2 (Z) und ß5 (MB-1) aus. Aufgrund von Untersuchungen in S. cerevisiae mit kurzen, fluorigenen Peptidsubstraten (Orlowski, 1990; Rivett , 1989; Heinemeyer et al., 1991; Hilt et al., 1993) wurden zunächst die einzelnen Untereinheiten für verschiedene proteolytische Aktivitäten verantwortlich gemacht: ß1 (δ) für die PGPH-Aktivität (Spaltung nach sauren Aminosäuren), ß2 (Z) für die tryptische Aktivität (Spaltung nach basischen Aminosäuren) und ß5 (MB1) für die chymotryptische Aktivität (Spaltung nah hydrophoben Aminosäuren). In späteren Arbeiten an Mammalia
-Proteasom mit längeren Peptidsubstraten von physiologischer Relevanz zeigte sich jedoch, dass diese Zuordnung nicht eindeutig erfolgen kann (Eleuteri et al., 1997; Schmidtke et al., 1998; Kisselev et al., 1999). Die
Die zwei äußeren α-Ringe formen in der Mitte ein hydrophobes Zentrum und verschließen das Proteasom. Die N-Termini der α-Untereinheiten sind sehr flexibel und interagieren alle mit dem N-Terminus der α3-Untereinheit. Eine einzige Punktmutation in diesem Bereich führt zu einer geöffneten Konformation des Hefeproteasoms (Groll et al., 2000). Durch diese Interaktion wird der Substratzugang kontrolliert.
In vivo findet ein kontrollierter Substratabbau unter Bindung verschiedener Regulatoren an die α-Ringe des 20S Proteasoms statt. Solche aktivierenden Regulatoren sind der 11S Komplex PA28 (Yang et al., 1992) und der 19S Regulator auch als PA700 bezeichnet (Chu-Ping et al.,1994; Rechsteiner et al.,1993). In der Zelle ist das 20S Proteasom häufig mit dem 19S Regulator assoziiert. Die Bindung von zwei 19S Komplexen an die α- Ringe des core-Partikels ist ATP-abhängig und lässt das 26S Proteasom entstehen, einen etwa 2000 kDa großen Komplex. Dieses ist der zentrale Bestandteil des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbaus in der Zelle. Ubiquitin (Ub) ist ein 76 Aminosäuren langes Protein, welches ubiquitär in vielen Organismen vorkommt. Zum Abbau bestimmte Proteine werden durch Polyubiquitin-Ketten markiert, wobei das Ubiquitin zunächst durch das Ub-aktivierende Enzym E1 ATP-abhängig aktiviert wird. Es wird dann auf das Ub-konjugierende Enzym E2 übertragen, welches dann an die Ub-Ligase E3 bindet. E3 ist seinerseits mit sogenannten F-Box-Proteinen assoziiert, die Target-Proteine erkennen und binden. Findet eine solche Bindung statt, wird die Polyubiquitinkette von E2 auf das abzubauende Target-Protein übertragen. Dieses markierte Target-Protein wird vom 19S Regulator des 26S Proteasoms gebunden, entfaltet und vom Proteasom abgebaut (Goldberg et al., 2001).
Der 19S Regulator setzt sich aus mindestens 18 Untereinheiten zusammen und wird in Basis- (base-) und Deckel- (lid-) Komplex eingeteilt (Glickman et al., 1998). Der Basis-Komplex bindet an das 20S Proteasom und enthält 6 ATPasen, welche zu den TripleA-ATPasen gehören (ATPases associated with a variety of cellular activities) (Confalonieri et al., 1995; Dubiel et al.,1992). Des weiteren enthält er noch zwei nicht-ATPase-Untereinheiten. Der Deckel-Komplex besteht aus bis zu 10 nicht-ATPase-Untereinheiten. Die ATPasen des Basis-Komplexes besitzen chaperon-ähnliche Funktionen und sorgen für die Bindung und Entfaltung des ubiquitinylierten Substrates. Die Funktion des Deckelkomplexes ist noch weitgehend unbekannt. Durch die Bindung des 19S Regulators wird das Proteasom stark aktiviert, was vermutlich auf ein Öffnen des α- Ringes beruht. Ein weiterer Regulator-Komplex ist der 11S- oder PA28-Komplex. PA28 bindet ATP-unabhängig an das 20S Proteasom und wird nach γ-Interferoninduktion hochreguliert. In Verbindung mit dem 20S Proteasom werden dann verstärkt antigene Peptide gebildet, welche von MHC-Klasse I-Molekülen gebunden und an der Zellaußenseite präsentiert werden. Der PA28-Komplex besteht im Wesentlichen aus den Untereinheiten α und ß und es besteht außerdem eine große Homologie zu dem sogenannten Ki-Antigen, welches auch als PA28γ bezeichnet wird (Wilk et al., 2000). PA28 ist ein ringförmiger, wahrscheinlich heteroheptamerer Komplex mit der Stöchiometrie α3ß4 (Knowlton et al., 1997; Zhang et al., 1999).
Eine wichtige Rolle bei der Assemblierung und Reifung des core-Partikels spielen Chaperone, wie z.B. hsc70 und das proteasome maturation protein POMP (Schmidt et al.,1999). Es werden zwei verschiedene Hypothesen zur Zeit diskutiert: Zum einen vermutet man, dass sich zunächst die α-Ringe zu noch instabilen Heptameren formieren. Erst nach Bindung der ß-Untereinheiten ß2, ß3 und ß4 entsteht ein langlebiges Intermediat, sogenannter 13S Precursor, welches in Eukaryonten nachgewiesen wurde (Yang et al., 1995, Schmidtke et al., 1996). Vermutlich binden dann unter Mitwirkung von POMP die noch fehlenden ß-Untereinheiten, wobei ß1, ß2 und ß5 in der Proform vorliegen, es bilden sich sogenannte Hemi-Proteasomen (300kDa). Durch Dimerisierung entstehen sogenannte 16S Pre-Holo-Proteasomen (600kDa), welche proteolytisch inaktiv sind und den kompletten Satz an Untereinheiten, zum Teil in Form von Proproteinen, enthalten. Erst nach Abspaltung von POMP und autokatalytischer Abspaltung der Prosequencen der ß-Untereinheiten entsteht das reife 20S Proteasom. Das unterschiedliche Sedimentationsverhalten von 16S und 20S Proteasom, obwohl die gleichen molekularen Massen vorliegen, wird der kompakteren globulären Form des 16S Komplexes zugeschrieben (Heinemeyer, 2000). Dieses Modell entspricht hinsichtlich der Präassemblierung des α-Ringes der Biogenese von Thermoplasma-Proteasom (Zwickl et al. 1992). Das zweite Modell orientiert sich mehr an Daten, welche bei Untersuchungen an Rhodococcus gefunden wurden (Zühl et al., 1997). Rhodococcus ist ein Eubakterium mit je 2 α- und 2 ß-Untereinheiten, welche sehr ähnliche Strukturen haben, wobei die ß-Untereinheiten ein sehr langes Propeptid aufweisen. Hier wurde kein freier α7-Ring beobachtet, vielmehr lagern sich hier jeweils eine α- und eine ß-Untereinheit zu Heterodimeren zusammen, wobei jede Kombination möglich ist. Es folgt dann eine schrittweise Zusammenlagerung und die finale Prozessierung zum reifen 20S Proteasom. Neuere Daten aus Experimenten mit Yeast-2-Hybrid-System lieferten Indizien für die Hypothese der frühen Interaktion zwischen α- und ß-Untereinheiten (Cagney et al., 2001).Beim Übergang vom 16S zum reifen 20S Proteasom und daraus folgenden Konformationsänderungen sind vermutlich
Wie bereits dargelegt ist das Proteasom bei höheren Eukaryonten eine wichtige Komponente des Immunsystems. Das antivirale Cytokin γ-Interferon (γIFN) wird in Mammalia während einer Immunantwort von T-Zellen gebildet und induziert in den Zellen eines entzündeten Gewebes die Synthese von immun-relevanten Strukturen, wie z.B. MHC-Klasse I-heavy chain (major histocompatibility complex), TAP-Proteine (transporter associated with antigen processing), den Proteasom-Aktivator PA28 und die ß-Untereinheiten ß1i (LMP2), ß2i (MECL-1) und ß5i (LMP7). Während LMP2 und LMP7 auf den MHC-loci codiert werden, trifft dies für MECL1 nicht zu, was ein Grund für die wesentlich spätere Entdeckung dieser dritten Immuno-Untereinheit war. Es werden per
de novo Assemblierung Immuno-Proteasomen gebildet, wobei die Immuno-Untereinheiten die konstitutiven ß-Untereinheiten ß1(δ), ß2 (Z) und ß5 (MB1) ersetzen (Frentzel et al. 1994). Der Einbau der Immuno-Untereinheiten erfolgt kooperativ: MECL-1 wird verstärkt eingebaut, wenn LMP2 vorhanden ist, während der Einbau von LMP2 unabhängig von MECL-1 ist. LMP7 hat auf den Einbau von MECL-1 keinen Einfluss, scheint die Kinetik der Immuno-Proteasom-Formierung zu beeinflussen
Die Aussage über die Lokalisation des Proteasoms in eukaryotischen Zellen ist generell schwierig. Problematisch dabei ist nicht nur die relativ große Menge an Proteasom in den meisten Zellen (z.B. 0,6% des Gesamtproteingehaltes in HeLa-Zellen), sondern auch die Gewebe-, Entwicklungs- und Zellzyklus-abhängige Variation ihrer Lokalisation. Außerdem ergaben verschiedene Nachweismethoden sehr unterschiedliche und zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. Immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen mit GFP-getagten Untereinheiten oder Antikörpern zeigten meistens eine relativ gleichmäßige Verteilung von 20S-Proteasom im Cytoplasma mit Ausnahme von vakuolären Strukturen wie Lysosomen etc. und eine etwas stärkere Färbung des Zellkernes mit Ausnahme des Nukleolus. Diese etwas höhere Intensität der Zellkernfärbung beruht aber wohl hauptsächlich auf der höheren Dichte der gefärbten Partikel in diesem Kompartiment und nicht auf einem tatsächlich höheren Gehalt. Untersuchungen von Palmer et al. (1996), die Rattenleber in die einzelnen Zellkompartimente fraktioniert und die Fraktionen danach mittels Immunoblot gegen 20S-Proteasom-Untereinheiten getestet haben, ergaben folgende Verteilung von 83% cytoplasmatisch, 11% microsomal und 5% nukleär. In der gleichen Arbeitsgruppe wurden zuvor mittels Immunogoldfärbung und Elektronenmikroskopie an kultivierten Rattenhepatozyten 17% der 20S Proteasomen im Zellkern lokalisiert (Rivett et al., 1992). Der Unterschied wurde auf die Nachweismethode und nicht auf Verluste bei der Aufarbeitung zurückgeführt. Generell erfolgte zunächst eine Einteilung in cytoplasmatische und nukleäre Proteasomen, wobei die ER-assoziierten mit zu den ersteren gezählt wurden.Cytoplasmatische 20S Proteasomen diffundieren zum größten Teil frei, einige sind mit dem ER und dem cis Golgi assoziiert, einige sind mit Anteilen des Cytoskeletts (z.B. mit Actin- und Intermediärfilamenten und Centrosom) verbunden. Die cytoplasmatischen 20S Proteasomen gewährleisten den “normalen“ Proteinturnover, den Abbau von sogenannten DRiPs und innerhalb des UPS (Ubiquitin- Proteasomen-System) den Abbau von nicht mehr benötigten und überalterten Proteinen (s.o.). Den Cytoskelett-assoziierten Proteasomen werden Funktionen innerhalb des Zellzyklus zugeschrieben, z.B. Abbau von Cyclinen und anderen Zellzykluskomponenten. Die ER-assoziierten Proteasomen sind wohl hauptsächlich am ERAD (ER associated degradation) und an der Antigen-Präsentation über den MHC-I-Weg beteiligt. Die Anzahl der 20S Proteasomen im Zellkern unterliegt sehr starken Schwankungen innerhalb des Zellzyklus. Nach einem Modell von Reits et al. (1997) findet ein aktiver Transport von 20S-Proteasom aus dem Cytoplasma in den Kern in der G1-, S- und G2-Phase statt, 20S Proteasomen akkumulieren am kondensierten Chromosom. Während der Prophase löst sich die Kernmembran auf und 20S Proteasomen diffundieren zurück ins Cytoplasma und mischen sich in Meta- und Anaphase mit den cytoplasmatischen Proteasomen. Bei der Neubildung der Kernhülle in der Telophase werden frei diffundierende 20S Proteasomen „zufällig mit eingefangen“ und so nucleär lokalisiert. Es wird hier keine strukturelle oder funktionelle Unterscheidung zwischen 20S Proteasomen aus Kern und Cytoplasma vorgenommen. Im Allgemeinen geht man aber davon aus, dass die nukleären Proteasomen hauptsächlich an der Transkriptionsregulation durch den Abbau von Transkriptionsfaktoren und Inhibitoren beteiligt sind (z.B. beim NFκB-Inhibitor IκB).
Wie aus Untersuchungen an Drosophila melanogaster hervorgeht, verändert sich die Untereinheiten-Zusammensetzung des Proteasoms während der Individualentwicklung (Falkenburg & Kloetzel, 1989). Für Mammalia
haben Hong et al., 1994, die α- und ß- Untereinheiten des 20S Proteasoms in drei Kategorien eingeteilt: Konstitutiv, gewebespezifisch und entwicklungsspezifisch, basierend auf der Beobachtung, dass das Untereinheiten-Muster abhängig von seinem Ursprung im Organismus differiert. Dahlmann et al. (2000) zeigten, dass das 20S Proteasom in mehreren, chromatographisch voneinander trennbaren Subtypen existiert. Es wurden hier 20S Proteasomen aus verschiedenen Geweben der Ratte untersucht und miteinander verglichen, wobei deutliche Unterschiede der Subtypen-Muster der einzelnen Gewebe erkennbar waren. Als Hauptgrund für das unterschiedliche chromatographische Verhalten der 20S Proteasomen-Subtypen wurde hier der Austausch der katalytischen ß-Untereinheiten mit ihren homologen Immuno-Untereinheiten beschrieben und die Subtypen in drei verschiedene Gruppen eingeteilt: Konstitutiv-, Intermediär- und Immuno-Subtypen. Allerdings gab es in jeder Gruppe mehr als einen Subtyp, was dafür spricht, dass nicht nur der Austausch der ß-Untereinheiten eine Rolle bei der veränderten Oberflächenladung spielt, sondern
In Geweben sind immer unterschiedliche Zellarten vorhanden, wie Epithelzellen, Fibroblasten, diverse Blutzellen und je nach Gewebe Skelettmuskelzellen, Hepatocyten etc. Aufgrund der o.g. Daten aus Rattengeweben, in welchen unterschiedliche 20S Proteasomen-Subtypen existieren, war es interessant zu erfahren, ob in einzelnen Zellen ebenfalls verschiedene Subtypen vorkommen und wie sie sich gegebenenfalls unterscheiden. Einige Untersuchungen an Rattengewebe und Mammalia-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen einzelne proteasomale Untereinheiten haben gezeigt, dass die Verteilung von z.B. LMP2 und LMP7 in den einzelnen Zellkompartimenten nicht mit der von Gesamtproteasom übereinstimmt (Palmer et al., 1996; Brooks et al., 2000). Möglicherweise existieren in den einzelnen Zellkompartimenten 20S Proteasomen-Komplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung, was sich dann in Form unterschiedlicher Subtypen bemerkbar machen könnte und eventuell auf spezifische Funktionen hindeutet. Außerdem könnten proteasomale Untereinheiten in den einzelnen Zellkompartimenten unterschiedlich modifiziert oder prozessiert sein. Da anzunehmen ist, dass das Proteasom in den verschiedenen Zellkompartimenten spezifische Aufgaben erfüllt, wäre eine strukturelle und funktionelle Diversität durchaus denkbar und sinnvoll. Die vorliegende Arbeit sollte zur Aufklärung dieser Fragen anhand von Untersuchungen mit HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen beitragen.
HeLa (adherent wachsend) : humane Cervical Carcinom Zellinie
HeLa S3 (als Suspensionskultur) : s. European tissue culture collection
T2-Zellen : humane lymphoblastoid B-Zelllinie, TAP-, LMP2- und LMP7-defizient, für MECL1 besteht ein funktioneller knock out.
T2/LMP2+7-Zellen: transfizierte T2-Zellen (s.o.), welche konstitutiv die murinen Proteasomen-Untereinheiten LMP2 und LMP7 exprimiert, funktioneller knock out für MB1 und δ
ZZ-Zellen: HeLa (adherent wachsend) transfiziert mit den Untereinheiten LMP2 -ZZ bzw. δ - ZZ. Diese Untereinheiten sind mit der ZZ-Domäne aus Protein A gekoppelt, welche die Fc-Region von IgG-Molekülen bindet. Es wurde der Vektor pRS304-ZZ von Pharmacia verwendet. Die Transfektion wurde von S. Standera und M. Seeger, Institut für Biochemie/Charite´ durchgeführt, die mir die Zellen freundlicherweise zur Verfügung stellten.
Medien: RPMI Medium bzw. ISCOVE Medium mit 10 % FCS 100U/100 µg/ml Penicillin/Streptomycin, 2mM L-Glutamin, bei den ZZ-Klonen enthielt das ISCOVE Medium zusätzlich 2 µg/ml Puromycin
Ø Freezing Medium(2x): 40% RPMI-Medium, 40% FCS, 20% DMSO
Ø PBS: 137 mM NaCl/ 2,7 mM KCl/ 8 mM Na2 HPO 4 x 2H2O/ 1,5 mM NaH2 PO4 / pH 7,2
Ø Trypsin/EDTA-Lösung, 1 : 4 verdünnt mit PBS zum ablösen der Zellen von der Kulturschale
HeLa-Zellen wurden in RPMI Medium bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Das Wasser zum Befeuchten der Luft im Inkubator war mit 0,068 % Zephiranchlorid versetzt. Zur Induktion der Zellen wurden dem Medium 20U recombinantes humanes γ - Interferon pro ml Medium zugesetzt und die Inkubation über 48h bis 72h fortgesetzt. Bei langen Induktionen über 5 Tage wurde das Medium nach 3 Tagen einmal gewechselt unter erneuter Zugabe von 20U/ml γ - Interferon. Zum „Ernten“ der Zellen wurde von den konfluent bewachsenen Schalen das Mediuim entfernt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit verdünnter Trypsinlösung von der Schale abgelöst. Entweder erfolgte eine neue Ausplattierung in einer Verdünnung 1 : 3 bis 1 : 10, oder die abgelösten Zellen wurden in eisgekühltem Medium gesammelt, pelletiert und nach einmaligem Waschen mit PBS in flüssigem Stickstoff schockgefroren und später bei -80°C gelagert. Zentrifugationsschritte erfolgten bei 200g für 5 min bei 4°C.
Die HeLa S3- bzw. T2-Zellen wurden zunächst Kunststoff-Kulturflaschen bis zu einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml gezogen und dann in 250ml-Glaskulturflaschen mit eingebautem Rührer in einer 1:2 Verdünnung umgesetzt. Nach Erreichen einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml wurden die Zellen 1:5 verdünnt und in 3l-Glaskulturflaschen mit Rührer umgesetzt und unter langsamem Rühren weiterkultiviert und alle zwei Tage unter Zugabe von frischem Medium 1:5 verdünnt bis zu einer 2l-Kultur. Die Zellen wurden durch Abzentrifugieren geerntet und die Zellpellets wie oben beschrieben gewaschen und weggefroren.
1 – 2 x 106 Zellen/ml wurden in Cryo-Röhrchen in 1 Volumen 2 x Freezing Medium (in Eis) gegeben und in einem Cryo 1°C Freezing Container über Nacht bei –80°C langsam gefroren (-1°C/min). Eine längere Lagerung erfolgte dann in flüssigem Stickstoff. Zum Auftauen von Zellen aus dem Stickstoff-
(nach Bradford, 1976)
Jeweils 20µl der zu bestimmenden Probe wurden mit je 200 µl der fertigen Gebrauchslösung Coomassie Plus Protein Reagent von Pierce versetzt und nach 5 min Inkubation bei 37°C im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 590nm vermessen. Eine Eichgerade wurde mit einer Verdünnungsreihe aus Lab-trol-E Proteinstandard erstellt.
Die Proben wurden mit 1 Volumen 10% Trichloressigsäure versetzt, auf dem Vortex gemixt und 10 min im Eis stehengelassen. Die Proteine wurden dann durch Zentrifugation bei 14.000g für 5 min (4°C) präzipitiert und die Pellets zweimal mit kaltem Aceton gewaschen.
( variiert nach Laemmli, 1970)
Puffer und Lösungen:
Upper-Tris-Puffer: 250 mM Tris / HCl pH 6,8 / 0,8 w/v SDS (4 fach konzentriert)
Lower-Tris-Puffer : 150 mM Tris / HCl pH 8,8 / 0,4 w/v SDS (4 fach konzentriert)
Laufpuffer : 190 mM Glycin / 25 mM Tris / 0,1 w/v SDS
Probenpuffer: 120 mM Tris / HCl pH 6,8 / 20 v/v Glycerin / 10 w/v ß-Mercaptoethanol / 4 w/v SDS / 0,1 w/v Bromphenolblau
Acrylamidlösung: 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid
Der Polymerisationsstart erfolgte durch Zugabe von Ammoniumpersulfat 10% und TEMED.
12,5%iges Trenn-Gel: 3,75 ml Acrylamid-Lösung / 2,25 ml Lower-Tris-Puffer / 3,0 ml Wasser / 50 µl APS / 5 µl TEMED
4,5%iges Sammel-Gel: 0,4 ml Acrylamidlösung / 0,75 ml Upper-Tris-Puffer / 1,85 ml
Wasser / 12 µl APS / 3 µl TEMED
Molekulargewichtsstandard:
Low Range Marker: 97,4 bis 14,4 kDa (BioRad)
Prestained KaleidokopMarker: 206 bis 7 kDa (BioRad)
Gelgröße: 70 x 80 x 0,75/1,5 mm
Die pelletierten Proben wurden entweder in 1x Probenpuffer aufgenommen bzw. die gelöste Probe wurde mit 1/5 Volumen 5-fach-konzentriertem Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C im Heizblock inkubiert und anschliessend mit einer Hamiltonspritze auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte 2h bei 3 Watt.
Bei dieser Form der Gelelektrophorese wurden die Proteine in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF), nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) und in der zweiten Dimension, einer SDS-PAGE, nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die in dieser Arbeit vorgestellten NEpHGE-Analysen wurden von I. Wagner, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie Berlin, durchgeführt nach der Kleingeltechnik von Jungblut, P.R. (Jungblut & Seifert, 1990).
Färbelösung: 0,25 % (w/v) Servablue G 250 gelöst in Methanol (10% Endkonzentration) , Essigsäure (40% Endkonzentration), Wasser.
Entfärbelösung: 10% Essigsäure, 40 % Methanol, Wasser
Nach beendeter SDS-PAGE wurden die Gele fixiert:
Fixierer 1: 50 % Methanol / 12 % Essigsäure / 0,5 % Formaldehyd (37% Stammlösung) in Wasser / 20 min Inkubation
Fixierer 2: 3 x 20 min in 50 % Ethanol in Wasser
Danach folgte eine Inkubation für 1 min in Reduktionslösung : 0,8 mM Na2S2O2 x 5 H2O Färbung: 20 min in Silbernitratlösung: 10 mM AgNO3, 0,5% Formaldehyd (37% Stammlösung)
Danach wurden die Gele 3 x 5 min in Wasser gewaschen und anschließend entwickelt nach Sicht bzw. 20 min:
Entwickler: 560 mM Na2CO3 , 20 mM Na2S2O2 x 5 H2O , 0,5% Formaldehyd (37% Stammlösung)
Zum Stoppen der Entwickler-Reaktion wurde eine Lösung 1 % Glycin in Wasser benutzt. Nach Erreichen der gewünschten Farbintensität wurden die Gele noch einmal in Wasser gewaschen erneut fixiert in Fixierer 1.
IP-Puffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,5 / 10 mM MgCl2 / 50 mM KCl /10 % Glycerol / 0,1 % Triton X-100 / 100µM PMSF
Waschpuffer: 150 mM bzw. 200 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Elutionspuffer: 100 mM Glycin / HCl pH 3,0
Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt.
Die Zellpellets von 3 x 10 7 HeLa-Zellen, welche die Fusionsproteine LMP2 – ZZ bzw. δ - ZZ exprimieren, wurden in 500µl IP-Puffer resuspendiert und mit mehrmaliggem Gefrieren und Auftauen wurden die Zellen aufgeschlossen (N2 flüssig/37°C Heizblock). Anschließend erfolgte noch ein Aufschluss der Suspension mit dem Ultraschall – Stab (10 sec). Die Lysate wurden 10 min bei 600g in der Eppendorf-Kühlzentrifuge zentrifugiert um Zelldebris und Zellkerne zu pelletieren. Die Überstände wurden in neue Gefäße überführt und mit je 100µl IgG-Sepharose, welche vorher mit IP-Puffer äquillibriert wurde, im Batch-Verfahren für eine Stunde bei 4°C unter konstanter Durchmischung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Ansätze erneut 5 min bei 600g in der Kühlzentrifuge zentrifugiert und die Überstände in ein neues Gefäß überführt. Die pelletierte IgG-Sepharose wurde wie folgt gewaschen, zwischen den Waschschritten wurde in der Tischzentrifuge pelletiert:
Waschen mit 1ml IP-Puffer
Waschen mit 1ml 100 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Waschen mit 1ml 250 mM KCl gelöst in IP-Puffer
Die Elution der gebundenen 20S Proteasomen erfolgte mit 200 µl Elutionspuffer pro Pellet. Die Elutionsüberstände wurden nach 5 min Zentrifugation bei 600g vorsichtig abpipettiert und in ein neues Gefäß überführt, das enthaltene Protein mit TCA 10% gefällt und die Proben dann einer SDS-PAGE bzw. NEpHGE unterzogen.
Transferpuffer: 50 mM Tris / 40 mM Glycin
Um einzelne Protein- Banden bzw. -Spots nach SDS-PAGE immunochemisch nachweisen zu können, wurden die Gele im Semidry-Blotverfahren auf PVDF-Membranen immobilisiert. Dazu wurden die Gele zunächst nach beendeter Elektrophorese 20 min in Transferpuffer äquilibriert. Die zugeschnittene PVDF-Membran wurde zunächst einige Sekunden in Methanol aktiviert und dann ebenfalls in Transferpuffer für 5 min äquilibriert. Auf die Anode der Semidry-Blotkammer wurde dreilagig mit Transferpuffer getränktes Whatman-Papier gelegt, darauf die PVDF-Membran, darauf das Gel und auf das Gel wurde wiederum eine dreilagige Schicht puffergetränktes Whatman-Papier gelegt. Nun wurde der Kathoden-Deckel darauf gelegt und befestigt, die Kammer mit der Haube verschlossen und der Transfer bei konstanter Stromstärke von 250 mA gestartet. Der Vorgang war je nach Dicke und Anzahl der Gele nach 15 bis max. 60 min abgeschlossen.Nach erfolgtem Transfer wurden die Proteine auf der Membran mit Ponceau-Rot- Färbung nachgewiesen (siehe Ponceau-Färbung). Wenn kein prestained Marker verwendet wurde, konnten die Marker-Banden auf der Membran gekennzeichnet werden. Die Membran wurde in mit 5 % Milchpulver gelöst in TTBS (50mM
Lösung A: 5 ml 0,1M Tris/HCl pH 8,0 / 22 µl 90 mM Cumarinsäure gelöst in DMSO / 50 µl 250 mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid) gelöst in DMSO
Lösung B: 5 ml 0,1M Tris/HCl pH 8,0 / 3 µl 30 % H2O2
Filme: Kodak X-Omat DS Filme
Die Lösungen wurden vor der Reaktion jeweils frisch zubereitet und im Dunkeln aufbewahrt. Die Lösungen wurden zusammengegeben und die Memran 1 min darin inkubiert. Je nach Intensität erfolgte die Exposition der Filme einige Sekunden bis zu 5 min.
Puffer: (Lysispuffer) 10 mM Tris/HCl pH 8,0 / 250 mM Sucrose / 2,5 mM KCl / 2,5 mM MgCl2 / 0,5 mM PMSF / ggf. 0,02% NP-40 (bei Gesamtzellysaten und Microsomenpräparation)
Zellen: Bei -80°C gefrorene aus HeLa bzw. HeLa S3 Zellpellets. Für eine Präparation wurden 5 x 108 bis 5 x 109 Zellen verwendet. Die verwendeten Zellen stammten entweder aus eigener Kultur oder wurden von der Firma 4C Biotech (Belgien) als gefrorene, teilweise vorfraktionierte Zellpellets (HeLa S3 whole cells, HeLa S3 nuclei, HeLa S3 cytoplasm) bezogen.
Zellaufschluss:
Zellpellets wurden in 5-fachen Volumen mit Lysispuffer unter Eiskühlung resuspendiert und mit einem Homogenisator mit Teflon-Pistill mit 20 Hüben lysiert. Die Zellyse wurde unter dem Mikroskop mit Trypanblau kontrolliert.
1. Zentrifugation: 1000g, 10 min, 4°C, SS34-Rotor Sorvall
Bei diesem Schritt wurden Zellkerne und größere Zellbruchstücke (Pellet) abgetrennt. Das Pellet wurde für eine spätere Zellkernisolierung zweimal mit Puffer gewaschen und bei – 80°C gelagert. Der Überstand wurde mit NP-40, Endkonzentration 0,02% versetzt, gut durchmischt und 10 min im Eisbad gerührt. Danach wurde er der nächsten Zentrifugation unterworfen.
2. Zentrifugation: 15.000g, 20 min, 4°C, SS-34 Rotor Sorvall
In diesem Schritt wurden Zellorganellen wie Lysosomen, Mitochondrien und Peroxisomen pelletiert. Im Überstand befanden sich nach diesem Schritt cytosolische Bestandteile und Microsomen.
3. Zentrifugation: 100.000g, 1 h ,4°C, SW-40 Rotor, Sorvall, Ultrazentrifuge
Nach dieser Zentrifugation befanden sich im S100-Überstand die löslichen cytosolischen Bestandteile und im Pellet die Microsomen, kleinere Fargmente der ER-Membran mit assoziierten Proteinen und Ribosomen. Diese wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei
– 80 °C gelagert.
Die weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgten bei 4 °C bzw. auf Eis.
Puffer:(TEAD) 20 mM Tris / Hcl pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM NaN3 / 1 mM DTT
DEAE-Toyopearl 650S mit TEAD äquilibriert
Der Überstand der Ultrazentrifugation bei 100.000g wurde auf die äquilibrierte DEAE-Toyopearl-Säule (30 ml Gelbett) aufgetragen (Flow 1ml/min). Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina TEAD gewaschen. Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 0 - 0,5 M NaCl in TEAD. Das Volumen des Gradienten betrug zwei Säulenvolumina (bei 30ml Gelbett, 60 ml Elutionsvolumen).
Flußrate: 1ml/min
Die erhaltenen Fraktionen wurden auf ihre proteolytische Aktivität gegenüber dem chymotryptischen Substrat Suc-LLVY-MCA getestet (s. unter Aktivitätstest ) und die aktiven Fraktionen anschließend gepoolt.
Die so erhaltene Enzymlösung wurde mittels fraktionierter Ammonium-Sulfat-Fällung weiter aufgetrennt.
1. Fällung bis 35% Sättigung (langsame Zugabe des Salzes unter Rühren im Eis). Nach vollständiger Zugabe des Salzes wurde die Probe noch 30 min im Eisbad gerührt und danach bei 12.000g und 4°C abzentrifugiert.
2. Fällung bis 80% Sättigung: Der Überstand der 1. Fällung wurde durch weitere Zugabe von Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% gebracht ( gleiche Durchführung wie oben ) und nach 30 min Rühren im Eisbad wie oben beschrieben abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in TEAD-Puffer ( max. 2 ml ) aufgenommen.
Die Gelfiltration wurde mittels FPLC-Anlage durchgeführt.
Säule: präparative Superose 6B, 130 ml Gelbett (50 x 2,0 cm),
Puffer: TEAD
Flußrate: 0,5 ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Die Probe wurde mittels einer 2 ml- Probenschleife aufgetragen. Nach dem Lauf wurden die proteolytisch aktiven Fraktionen gepoolt.
Auch diese Trennung wurde mit dem FPLC – System durchgeführt. Der Auftrag der Probe erfolgte mittels Superloop mit einer Flussrate von 1 ml/min. Säule: Resource Q (6 ml) bzw. Resource Q (1 ml). Die Größe der Säule richtete sich nach der zu trennenden Proteinmenge.
Puffer: TEAD (A) bzw. TEAD + 0,5 M NaCl (B)
Flußrate: 1ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Elutionsschema:
Säule: Resource Q (6 ml)
65 ml von 0 % auf 80 % Puffer B
3 ml von 80 % auf 100 % Puffer B
2 ml 100 % Puffer B
5 ml von 100 % auf 0 % Puffer B
10 ml 0 % Puffer B
Säule: Resource Q (1 ml)
5 ml von 0 % auf 40 % Puffer B
25 ml von 40 % auf 80 % Puffer B
3 ml von 80 % auf 100 % Puffer B
2 ml 100 % Puffer B
5 ml von 100 % auf 0 % Puffer B
Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen TEAD dialysiert.
Als nächster Reinigungsschritt schloss sich eine hydrophobe Interaktions-Chromatographie an. Dazu wurde die dialysierte Probe mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 1,4 M (NH4)2SO4 gebracht, auf die Säule aufgetragen und die gebundenen Proteine mittels eines absteigenden Ammoniumsulfatgradienten (von 1,4 M auf 0 M (NH4)2SO4) eluiert.
Puffer: TEAD (A) bzw. TEAD + 1,4 M (NH4)2SO4,pH 7,5 (B)
Säule: Resource Phe (1ml)
Flußrate: 1ml/min
Fraktionsgröße: 1ml
Die Säule wurde zunächst mit Puffer B äquilibriert und die Probe mittels Superloop mit einer Flussrate
Elutionsschema:
10 ml 100 % Puffer B
65 ml von 100 % Puffer B auf 0 % Puffer B
Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen TEAD, pH 7,5 dialysiert (Puffer nach 2 h Dialyse einmal gewechselt).
Zur Kontrolle der Reinheit des Proteasomen-Präparates erfolgte eine SDS-PAGE (12,5%) und Coomassie-Färbung.
Die pelletierten Zellkerne wurden entweder aus der zuvor beschriebenen Aufarbeitung der Gesamtzellen erhalten oder von der Firma 4C Biotech (Belgien) bezogen.
Das bei -80°C gelagerte Pellet wurde langsam aufgetaut und zweimal im Lysispuffer gewaschen.
Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 2-3 Volumina TEAD/1,6 M Sucrose /5mM MgCl2 aufgenommen und in einem SW40-Ultrazentrifugen-Röhrchen auf ein 2 ml- Kissen von TEAD/2,1 M Sucrose geschichtet. Die Röhrchen wurden mit TEAD/1,6 M Sucrose /5mM MgCl2 aufgefüllt und in der Ultrazentrifuge 90 min bei 100.000g und 4°C zentrifugiert. Die hochaufgereinigten Kerne sammelten sich an der Grenzschicht zwischen 1,6 M und 2,1 M Sucrose- Puffer als festes Pellet, welches mit einem Mikrospatel herausgenommen werden konnte. Das Pellet wurde im fünffachen Volumen TEAD aufgenommen, resuspendiert und es erfolgte ein Verdau mit DNaseI und RNase (jeweils 100 µg /ml) für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde die Probe mit dem gleichen Volumen TEAD mit 1M KCl aufgefüllt und 30 min in Eis gerührt. Es folgte eine Homogenisation der Probe mit dem Ultraschall-Stab (3 x 5-10 sec). Die homogene Suspension wurde 60 min bei 100.000g und 4°C abzentrifugiert, wodurch die Kernmembranen pelletiert wurden. Aus dem Nucleoplasma im Überstand wurde das 20S Proteasom durch fraktionierte Ammoniumsulfatfällung wie für das Cytoplasma beschrieben gefällt und über Gelfiltration, ResourceQ- und Resource Phe- Säulen weiter gereinigt.
Das Pellet aus dem dritten Schritt der differentiellen Zentrifugation (siehe unter 2.3.2.) wurde langsam aufgetaut, in Lysispuffer resuspendiert und erneut bei 100.000g für 60 min bei 4°C abzentrifugiert .Anschliessend wurden die gewaschenen Microsomen in Lysispuffer/ 0,1 % NP-40 aufgenommen und im Eis mit dem Ultraschall-Stab 3 x 5-10 sec resuspendiert und danach 30 min unter Durchmischung bei 4°C inkubiert. Es folgte eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und die weitere Reinigung wie für Cytoplasma-Proteasom beschrieben.
Der Zellaufschluß erfolgte in Lysispuffer /0,02% NP-40 bzw. in TEAD/ 0,1% Triton X-100. Es folgte eine differentielle Zentrifugation wie oben beschrieben. Bei Gesamtzell-Präparationen wurden Zelldebris mit 1000g bei 4°C pelletiert und der Überstand nach Zentrifugation bei 100.000g für 60 min bei 4°C wurde weiterverarbeitet. Es folgte eine Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Toyopearl wie unter 2.3.3. beschrieben. Der Pool aus den proteolytisch aktiven Fraktionen wurde über Nacht gegen 20 mM Tris/HCl, pH 7,5/1mM NaN3 dialysiert um das DTT und das NaCl zu entfernen. Als Ligand der Affinitätschromatographie -Säule diente der monoclonale Antikörper mcp 21, der gegen die proteasomale Untereinheit C3 (α2) gerichtet ist und an eine BrCN-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt wurde. Die Säule hatte ein Gelbett von ca. 6 ml. Der Probenauftrag erfolgte auf die mit 20mM Tris/HCl, pH 7,5 äquilibrierte Säule zwei Stunden im Batch- Verfahren bei 4°C, oder eine Stunde mit langsamer Flussrate über eine Endlosschleife. Es folgten mehrere Waschschritte mit jeweils zweifachem Säulenvolumen:
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5/ 1mM NaN3
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3/ 50% Ethylenglykol
Waschschritt: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3/ 200 mM NaCl
Elution: 20 mM Tris/HCl, pH 8,0/ 1mM NaN3 / 2M NaCl, zwei Säulenvolumina
Das Eluat wurde anschließend gegen TEAD dialysiert und mittels SDS-PAGE auf seine Reinheit überprüft.
Die gereinigten 20S Proteasomen wurden im SMART-System einer Anionenaustausch-Chromatographie unterzogen.
Puffer A: TEAD pH 7,5; Leitfähigkeit k = 1,2 – 1,8 mS/cm bei 8°C bzw.
Puffer B: TEAD + 0,5 M NaCl pH 7,5 ; Leitfähigkeit k = 42 – 48 mS/cm bei 8°C
Säule: MiniQ PC 3.2/2, 230 µl
Probenmenge: 12 – 50 µg Protein pro Lauf
Programm:
Flussrate: 200 µl / min
0,1 ml – 1,1 ml Probeninjektion über Injektionsventil und Probenschleife ( Je nach Proteinkonzentration der Probe wurde eine 500µl- bzw. 1 ml- Schleife verwendet.)
1,1 - 7 ml von 0% B auf 100 % B
Fraktionierung von 5 ml bis 6,3 ml
Fraktionsgröße: 26,2 µl (48 Fraktionen)
7 ml – 8 ml 100% B
8 ml – 8,2 ml von 100 % auf 0 % B
8,2 – 9,5 ml 0 % B
Die Säule wurde mit Puffer A äquilibriert. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 280 nm, der Gradient wurde mittels Leitfähigkeitsmessung überwacht. Die Leitfähigkeitsmesszelle wurde zuvor mit den verwendeten Puffern kalibriert.
Die getrennten Subtypen der verschiedenen Läufe einer Probe wurden gepoolt und rechromatographiert. Die rechromatographierten Subtypen wurden dann folgendermaßen analysiert:
Aktivitätstests mit fluorogenen Substraten Westernblot 2D-Gelelektrophorese
(nach Barret, 1980)
Verwendete Substrate: Stammlösungen 10mM in DMSO
Für den Test wurden Verdünnungen von 50 – 400 µM mit Puffer hergestellt.
BzVGR-MCA wurde mit 50mM CAPS/ 0,5 mM DTT, pH 10,5 verdünnt, die anderen Substrate mit TEAD.
Die Substrate tragen am N-terminalen Ende eine Schutzgruppe und sind C-terminal mit einer 4-Methyl-7-cumarylamid-Gruppe (MCA) gekoppelt. Diese Gruppe wird proteolytisch abgespalten, so dass als Spaltprodukt Aminomethylcumarin entsteht, welches über Fluoreszenzmessung quantitativ bestimmt wird. Eine Eichgerade wurde aus einer Verdünnungsreihe aus MCA in TEAD- Puffer erstellt.
Für den Test wurden jeweils 20µl der Probe mit 20µl der Substratlösung in einer schwarzen Mikrotiterplatte (96 Loch) vermischt und 60 min bei 37°C inkubiert. Das freigesetzte Aminomethylcumarin wurde im Photometer bei einer Excitationswellenlänge von λ = 360 nm und einer Emmissionswellenlänge von λ = 450 nm vermessen. Als Leerwert diente Puffer. Die proteolytische Aktivität wurde folgendermaßen bestimmt:
Es wurden die folgenden deglykosylierenden Enzyme verwendet:
Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens: hydrolysiert endständige O- oder N-
Acylneuraminsäuren, die in α2-3, α2-6 oder α2-8 Bindung vorliegen
(α2-6 > α2-3 > α2-8)
Neuraminidase aus Vibrio cholerae: wie oben aber mit einer 260fachen Präferenz für
α2-3 gebundene Neuraminsäuren
O-Glykosidase aus Diplococcus pneumoniae: spaltet das Disaccharid Galß1-3GalNAc
von Serin bzw. Threonin des Proteins/Peptids, nur nach Desialylierung
PNGase F aus Chryseobacterium meningosepticum: spaltet das Disaccharid
GlcNAcß1-4GlcNAc von Asparagin (nicht terminal) ab, welches mit H oder
verschiedenen Oligosacchariden bzw. mit α1-6 Fucose substituiert sein kann.
N-Acetylhexosaminidase aus Canavalia ensiformis: spaltet GlcNAc und GalNAc in
ß1-2,3,4,6 Bindung von einem beliebigen Rest ab.
Ein Aliquot von 500µl 20 S Proteasomen (Proteinkonzentration: 40 µg/ml in TEAD) wurde mit 5 µl = 50 mU Neuraminidase (Sialidase) aus Arthrobacter ureafaciens (1U = 100µl) für 2 - 30 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert (Optimum bei 16 Stunden).
Ein Verdau mit O-Glykosidase (2,5 mU/ml Probe) und N-Acetyl-Hexosaminidase (0,25U/ml Probe) erfolgte sowohl mit einem Aliquot der gereinigten 20S Proteasomen (40 µg/ml) als auch mit der vorher desialylierten Probe für 16 h bei 37°C unter Schütteln. Die Probe wurde danach auf eventuelle Veränderungen im Elutionsmuster am SMART-System analysiert (siehe Trennung der Subtypen).
Bei auf PVDF – Membranen geblotteten Proben wurde die Membran für 16 Stunden bei 37°C in einer Lösung des jeweiligen Enzyms inkubiert
Neuraminidase: 100mU/10ml TEAD
O-Glykosidase: 25mU/10ml TEAD (nur nach vorheriger Neuramindasebehandlung, da nur desialylierte Zucker abgespalten werden können!)
N-Acetyl-Hexosaminidase: 0,25U/10ml TEAD
PNGase F: 1U/ml in PBS
Puffer:
Die mit SDS-PAGE bzw. NEpHGE aufgetrennten Proben wurden auf PVDF-Membran geblottet. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Blockpuffer unter Schütteln blockiert und anschließend zweimal mit TBS für 5 min gewaschen. Danach folgte die Inkubation mit dem entsprechenden Lectin über Nacht bei Raumtemperatur auf dem Schüttler:
Nach der Inkubation (die Lectinlösungen wurden mehrfach verwendet und bei + 4°C im Kühlschrank aufbewahrt) wurden die Membranen zweimal mit TTBS 5 min gewaschen und danach mit Extravidin-POD (1:2000 verdünnt in TTBS) für eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden die Membranen zweimal 5 min mit TTBS gewaschen und die Färbung mit ECL detektiert.
Die Kohlenhydrat-Analytik wurde von Grunow und Zimmermann-Kordmann am Institut für Molekularbiologie und Biochemie, Charite´-Campus Benjamin Franklin, Berlin, durchgeführt.
Die Kohlenhydrat-Reste wurden mittels starker saurer Hydrolyse von den Proteasom-Proben abgetrennt und in Monosaccharide zerlegt. Die Trennung der Monosaccharide erfolgte mittels HPLC an einer Anionenaustauscher-Säule (CarboPac PA1, 4 x 250 mm). Als Vorsäule wurde eine Aminotrap (10-32)-Säule verwendet. Die eluierenden Monosaccharide wurden über gepulste amperometrische Detektion (PAD) nachgewiesen. Die Berechnung der Kohlenhydrat-Mengen erfolgte durch Intergration der Peakflächen im Vergleich mit internen und externen Standards mit bekannter Konzentration.
Neuraminsäure-Reste sind meistens endständig an Kohlenhydrate gebunden. Sie wurden mit milder saurer Hydrolyse von den Proteasom-Proben abgetrennt. Die Trennung und Analyse erfolgte wie oben für die neutralen Monosaccharide beschrieben.
Gereinigte 20S Proteasomen aus T2- und T2/ LMP2+7- Zellen, die mir freundlicherweise von U. Kuckelkorn (Institut für Biochemie, Charite´) zur Verfügung gestellt wurden, konnten mittels Anionenaustausch-Chromatographie an MiniQ P 3.2/3 in mehrere Subtypen getrennt werden. T2-Zellen exprimieren die katalytischen ß-Untereinheiten ß1 (δ), ß5 (MB1), ß2 (Z) und ß2i (MECL-1). Die Untereinheit MECL-1 wird nur in geringem Maß in die 20S Proteasomen-Komplexe eingebaut, da dieser Prozeß stark von der Anwesenheit der Untereinheit LMP2 abhängig ist (Groettrup et al., 1997). Bei den T2/ LMP2+7-Zellen handelt es sich um dieselbe Zelllinie, welche aber mit den murinen Untereinheiten LMP2 und LMP7 transfiziert wurde. Das unterschiedliche Subtypen-Muster ist hier offensichtlich auf den Austausch der ß-Untereinheiten zurückzuführen (Abb.5). Die 20S Proteasomen aus diesen Zellen besitzen kein δ und kein MB1 (Kuckelkorn et al., 1995).
Nachfolgend wurden die Subtypen beider Zelllinien auf ihre Untereinheiten-Zusammensetzung hin mittels Westernblot untersucht (Abb.6). Eine Analyse mit Antikörpern gegen die katalytischen ß-Untereinheiten zeigten, dass in allen Subtypen die gleichen Untereinheiten vorkamen. Lediglich bei Subtyp I bei den T2/LMP2+/-Zellen sind bei LMP2 zwei Banden zu erkennen., was hier eventuell für ein Vorhandensein der Proform oder einer Modifikation von LMP2 in diesem Subtyp spricht.
Die untersuchten Zelllinien stellen ein artefizielles System dar. Weitere Untersuchungen wurden deshalb mit HeLa-Zellen durchgeführt, da sie unter Anwesenheit von γIFN Immuno-Proteasomen synthetisieren und eine Beobachtung von dynamischen Veränderungen möglich war.
Für die folgenden Untersuchungen wurden adhärent wachsende HeLa-Zellen verwendet. Die Präparation erfolgte im Wesentlichen nach dem von Sobek (1995) erarbeiteten Schema (siehe Tabelle 1 und B:2.3.6.). Am Schluß der Präparation wurde die Reinheit des Präparats anhand einer SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung überprüft.
Aus HeLa-Zellen konnten mit der oben genannten Methode drei Subtypen isoliert werden. HeLa-Zellen besitzen konstitutive Proteasomen. Zunächst vermuteten Dahlmann et al. (2000), dass die Ursache für die unterschiedlichen Subtypen der 20S Proteasomen im Austausch der katalytisch aktiven ß-Untereinheiten gegen ihre induzierbaren Homologen liegt. Es wurde eine Einteilung in Konstitutiv-, Intermediär- und Immuno-Subtypen vorgenommen, wobei vermutet wurde, dass die Intermediär-Subtypen sowohl Immuno- als auch Konstitutiv-Proteasomen enthalten. Außerdem
Um zu untersuchen, ob sich das Subtypen-Muster unter dem Einfluss von Immuno-Untereinheiten bei HeLa-Zellen verändert, wurden diese unter Anwesenheit von γIFN für unterschiedlich lange Zeiträume kultiviert. Die Präparation von 20S Proteasom und die Auftrennung der Subtypen erfolgte wie unter 1.2. beschrieben. Die Abb.8 zeigt die Veränderung der Elutionsprofile in Abhängigkeit von der Zeit.
Unter dem Einfluss von γIFN erschien ein zusätzlicher Subtyp, bezeichnet mit IIA, zwischen den Subtypen II und III, der nach länger dauernder Kultivierung mit dem Cytokin an Menge zunahm. Eine nachfolgende SDS-PAGE der Elutionsfraktionen mit anschließender Westernblot-Analyse sollte über die Untereinheiten-Zusammensetzung Aufschluss geben.
Aus der Abb.9 geht hervor, dass die Immuno-Untereinheiten über das gesamte Elutionsprofil verteilt sind, während die konstitutiven Untereinheiten sich mehr in den spät eluierenden Subtypen II bis III befinden. Alle vier Subtypen sind Intermediär-Typen, wobei in Subtyp III in Anbetracht der Proteinmenge, die er im Profil einnimmt, verhältnismäßig wenig Immuno-Untereinheiten zu erkennen sind. Diese konzentrieren sich am stärksten in Subtyp II und IIA. Von Subtyp I war nur sehr wenig Material vorhanden, was die Aussage über die Untereinheiten-Zusammensetzung erschwert. Bei
In den in Abb.10 gezeigten 2D-Mustern sind bei allen Subtypen deutlich mehr als 17 Spots zu erkennen. Claverol et al. (2002) konnten im 2D-PAGE von 20S Proteasom aus humanen Erythrozyten 32 Spots isolieren, wobei sich die Spots der einzelnen Untereinheiten hinsichtlich ihres isoelektrischen Punktes unterschieden. Dieses Phänomen beruht auf der Existenz von alternativen Spleißprodukten, verschiedenen post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) oder auch auf experimentell bedingten Modifikationen der Untereinheiten. Obwohl nicht äquivalente Proteinmengen von den einzelnen Subtypen aufgetragen wurden, erkennt man in Abb.10 deutlich einige qualitative Unterschiede zwischen den 2D-Mustern. Die Positionen der katalytischen ß-Untereinheiten wurden mit spezifischen Antikörpern überprüft (Daten nicht gezeigt). Zunächst ist LMP7 in allen dreien enthalten, während LMP2 am stärksten in Subtyp IIA und etwas geringer in Subtyp II vertreten ist. Subtyp IIA enthält die geringste Menge an MB1, dafür relativ viel von δ und Z. In Subtyp IIA ist MECL-1 am deutlichsten zu erkennen. Es ist hierbei bemerkenswert, dass sich offenbar alle Subtypen zu Intermediär-Subtypen umgewandelt haben und nicht, wie man aus Abb.8 hätte erwarten können, nur der Subtyp IIA. Subtyp III ist zwar weiterhin der am meisten konstitutive, aber auch hier ist ein Austausch von MB1 zu LMP7 bzw. erfolgt.
Interessant war nun zu erfahren, ob nach längerer Inkubation mit γIFN ein komplettes Verschwinden von konstitutiven 20S Proteasomen erreicht wird. Deshalb wurden 20S Proteasom-Subtypen aus einer Präparation von HeLa-Zellen, die über 144 Stunden mit 20U/ml γIFN inkubiert wurden, gereinigt und die Gesamtproteasomen in die Subtypen aufgetrennt (Abb.11). In Abb.11A ist ein im Vergleich zu Abb.8 verändertes Subtypen-Pattern zu sehen. Der Subtyp IIA ist nach längerer Inkubationszeit mit γIFN in Abb.9A nicht mehr vorhanden (vgl. mit Abb.8 nach 72 Stunden Inkubation mit γIFN). In der Westernblot-Analyse (Abb.11B) konnten wiederum alle 6 katalytisch aktiven ß-Untereinheiten nachgewiesen werden. In Abb. 11C ist auffällig, dass Subtyp III kein LMP2 und weniger LMP7 enthält als die anderen beiden Subtypen. Es handelt sich bei den getrennten Subtypen wiederum um Intermediär-Subtypen, wobei Subtyp III wieder der stärker konstitutive Subtyp ist.
Auch nach einer langen Inkubationszeit von 144 Stunden hat kein kompletter Austausch von konstitutiven gegen Immuno-Untereinheiten stattgefunden. Nach 144 Stunden unter Wirkung von γIFN hatten die HeLa-Zellen stark an Vitalität verloren und teilten sich kaum noch, viele Zellen waren bereits abgestorben. Es ist also nicht davon auszugehen, dass nach noch längerer Inkubationszeit ein kompletter Umbau in Immuno-Proteasomen zu beobachten gewesen wäre. Um die Untereinheiten-Zusammensetzung noch besser untersuchen zu können, wurden zusätzlich noch 2D-Pattern angefertigt.
In den 2D-Pattern der Abb.12 sieht man im Vergleich zu Abb.10 nur die Hauptspots der einzelnen Untereinheiten und nur sehr schwach die Nebenspots der modifizierten Formen. Der Grund dafür ist die geringere Proteinmenge in Abb.12, diese Beobachtung machten auch Claverol et al. (2002), wenn sie 2D-Pattern von 20S Proteasom mit 40 und 10µg aufgetragenem Protein verglichen. Deutlich ist zu erkennen, dass die Immuno-Untereinheiten in Subtyp I am stärksten vorhanden sind und iß1 (LMP2) in Subtyp III gänzlich fehlt. Dies bestätigt die Immunoblot-Analyse in Abb.11C.
Die Ergebnisse der bisher beschriebenen Versuche zeigen, dass die wenigsten Proteasom-Subtypen den „klassischen“ Konstitutiv- bzw. Immuno-Proteasomen zuzuordnen sind. Die meisten Subtypen enthalten nach den Immunoblot-Analysen sowohl ß1, ß2 und ß5 als auch iß1, iß2 und iß5 in unterschiedlicher Zusammensetzung. Obwohl diese Subpopulation als „intermediate-type“-Proteasomen bezeichnet wurden (Dahlmann et al., 2000), ist bisher nicht bekannt, ob es sich hierbei um eine Mischung aus Konstitutiv- und Immuno-Proteasomen handelt oder ob diese Proteasomen als Einzelenzyme beide Sorten von ß-Untereinheiten, γIFN-induzierbare und konstitutive, enthalten. Ebenso war nicht bekannt, ob beide Halbproteasomen immer jeweils die gleiche Untereinheit eines Homologen-Paares haben müssen, oder ob hier auch Mischformen möglich sind. Um diese Frage zu beantworten wurden transfizierte HeLa-Zellklone verwendet, die mir freundlicherweise von Seeger (Institut für Biochemie der Charite´) zur Verfügung gestellt wurden. Die Klone exprimieren entweder die Untereinheit δ oder die Untereinheit LMP2, beide waren jeweils mit der IgG-bindenden ZZ-Domäne (15kDa) aus Protein A markiert. Über diesen „tag“ lassen sich 20S Proteasomen mittels IgG-Sepharose aus dem Zellysat präzipitieren und auf ihre Untereinheiten-Zusammensetzung hin untersuchen. Die transfizierten Zellen wurden in An- und Abwesenheit von γIFN kultiviert. Die präzipitierten 20S Proteasomenproben wurden mittels SDS-PAGE eindimensional bzw. mittels NEpHGE zweidimensional in ihre Untereiheiten aufgetrennt und anschließend auf PVDF-Membranen geblottet. Die weitere Analyse erfolgte mittels Antikörpern gegen δ bzw. LMP2 (Abb.13).
Alle Komplexe wurden über den ZZ-tag präzipitiert, das heißt die Komplexe enthielten mindestens eine evtl. zwei der jeweils getagten Untereinheit. Im Falle nur einer getagten Untereinheit in dem einen Hemiproteasom kann das zweite Hemiproteasom entweder die jeweilige ungetagte oder die homologe Untereinheit enthalten. Ohne Induktion mit γIFN enthalten die 20S Komplexe mit δ-ZZ kein LMP2, aber die ungetagte Untereinheit δ (22kDa). Die 20S Proteasomen mit LMP2-ZZ enthalten sowohl die ungetagte Untereinheit LMP2 als auch δ, hier findet eine Expression von LMP2 in Abwesenheit von γIFN statt. Die Ergebnisse in Abb.14 zeigen, dass Mischkomplexe, welche sowohl LMP2 als auch δ enthalten, prinzipiell gebildet werden können. Es war nun interessant zu erfahren, ob Zellen, die das δ-ZZ-Konstrukt enthalten nach Expression von LMP2 mittels γIFN-Induktion auch diese Untereinheit neben δ-ZZ in die Proteasomen einbauen. Die Zellen wurden mit γIFN (20U/ml) für 24 Stunden induziert und danach geerntet. Die Aufarbeitung erfolgte wie oben beschrieben. Die präzipitierten 20S Proteasomen wurden mittels NEpHGE zweidimensional aufgetrennt, auf PVDF-Membranen geblottet und mit Antikörpern gegen LMP2 und δ analysiert (Abb.14).
Man erkennt in Abb.14 in den oberen Bildern der 2D-Gele, dass jeweils die getagte Untereinheit und auch beide ungetagten, homologen Untereinheiten vorhanden sind. Nach Induktion exprimieren auch die Zellen mit δ-ZZ die Untereinheit LMP2 und bauen sie in die Enzym-Komplexe ein. Dies zeigt, dass Mischkomplexe mit jeder theoretisch möglichen Kombination der Untereinheiten δ und LMP2 praktisch vorkommen. Wenn dies für das Untereinheitenpaar δ/LMP2 zutrifft ist es sehr wahrscheinlich, dass es auch bei MB1/LMP7 und Z/MECL-1 gleichermaßen der Fall ist, natürlich unter Beachtung bestimmter Assemblierungs-Phänomene (siehe Diskussion, Abschnitt 4.3.).
Während alle bislang beschriebenen Untersuchungen mit 20S Proteasomen durchgeführt wurden, die aus dem Gesamtzell-Extrakt isoliert worden waren, sollten im folgenden die Subtypen-Pattern von Proteasom aus den verschiedenen Zellkompartimenten untersucht werden. Da für die Fraktionierung in verschiedene Zellkompartimente und vor allem für die Isolierung von 20S Proteasom aus dem Zellkern eine wesentlich größere Menge an Zellen erforderlich war, wurden für die nachfolgenden Versuche in Suspensionskultur wachsende HeLaS3-Zellen verwendet, die zum Teil selbst in Spinnerflaschen gezogen, zum Teil aber auch als Zellpellets von der Firma 4C Biotech (Belgien) bezogen wurden. So konnten Mengen von 2,5 x 109 bis 5 x 109 Zellen für die Präparation von 20S Proteasom verwendet werden. Da die Reinigungsmethode mit der Affinitätschromatographie durch die Bindungskapazität der Säule auf eine Menge von maximal 5 x 108 Zellen begrenzt war, kam hier ein anderes Reinigungsverfahren zur Anwendung, was im Wesentlichen der Methode von Knühl (1999) folgte. Zunächst wurde mit dieser Methode 20S Proteasom aus dem Gesamtzellysat von HeLaS3-Zellen isoliert und diese in Subtypen aufgetrennt und anschließend mittels Immunoblot auf ihre
HeLaS3-Zellen exprimieren im Gegensatz zu adhärent wachsenden HeLa-Zellen auch ohne Induktion durch γIFN Immuno-Untereinheiten, wie deutlich in Abb.15B und C zu erkennen ist. Auch das Subtypen-Pattern in Abb.15A unterscheidet sich von dem der HeLa-Zellen. Die Position von MECL-1 unterscheidet sich von der bei den adhärenten, induzierten HeLa-Zellen, der Spot liegt mehr im sauren Bereich und bei höherem Molekulargewicht (Abb. 15C). MECL-1 hat im reifen Zustand ein Molekulargewicht von 25kDa, die Proform wird mit 29kDa angegeben (Foss et al.,1998; Groettrup et al., 1997). Auch in Abb.15B ist sind mit dem spezifischen Antikörper gegen MECL-1 zwei Banden
Wie im Methodenteil beschrieben, erfolgte die Lysis der HeLaS3-Zellen unter Bedingungen, welche die Zerstörung der Kernmembran verhindern sollten. Die Trennung der Kompartimente Zellkerne, Microsomen und Cytoplasma erfolgte im Wesentlichen über differentielle Zentrifugation. Die einzelnen Fraktionen wurden danach separat weiter nach der Methode von Knühl (1999) aufgearbeitet. Um die Trennung der Kompartimente zu kontrollieren, wurde die An- bzw. Abreicherung bestimmter Markerproteine mittels Immunoblot-Analyse verfolgt. Für die Kernfraktion wurden humane Antiseren mit snRNP-Antikörpern verwendet, da snRNPs sich im Nucleoplasma befinden und ihr Vorhandensein in der Kernfraktion sowohl eine Anreicherung von Zellkernen als auch einen Erhalt der Kernmembran und Kernporen anzeigt. Die Microsomen bestehen aus Resten von ER- und Golgi-Membranen, die nach der Zell-Lysis neue Vesikel formen und membran-assoziierte Proteine teilweise einschliessen, so dass diese in der microsomalen Fraktion angereichert werden. Als Marker für die microsomale Fraktion wurden Antikörper gegen GPR94 (94kDa) und gegen MHC-Klasse I heavy chain (MHC-I hc, 43kDa) verwendet. GPR94 ist ein Protein, das sich löslich im ER-Lumen befindet, während MHC-I hc-Moleküle integrale Membranproteine sind, die aus dem ER über Golgi-Apparat in Vesikeln schließlich zur Zellmembran transportiert werden. Letzteres erwies sich somit auch als der bessere Marker für die microsomale Fraktion. Das heat shock protein 90 (HSP90, 90kDa) diente als Kontrolle für die cytoplasmatische Fraktion, da dies ein cytosolisches Protein ist.
In Abb. 16A ist deutlich zu erkennen, dass in der microsomalen Fraktion kein cytoplasmatischer Marker (HSP90) mehr nachweisbar ist, während es in der cytoplasmatischen Fraktion angereichert wird. GRP94 findet sich sowohl im Membranpellet als auch in der löslichen Fraktion, was ein Indiz dafür ist, dass ER-Membranen bei der Reinigungsprozedur zerstört werden. In Abb.16B ist deutlich die Anreicherung von ER-Membranen in der microsomalen Fraktion anhand der intensiver werdenden
Bei der Isolierung des Kernextraktes war es nötig, dass die Kernmembran möglichst erhalten blieb, damit die im Nucleoplasma löslichen 20S Proteasomen angereichert werden konnten. Erst nach dem enzymatischen Verdau der Nucleinsäuren wurden mit 0,5M KCl die Kernporen und -membran permeabel gemacht, so dass das Nucleoplasma austreten konnte und durch Ultrazentrifugation bei 100.000g von den Kernmembranen (Pellet) abgetrennt wurde. In Abb. 17A ist zu erkennen, dass sich die ER-Membranreste des nuclear envelope nach der Ultrazentrifugation im Pellet befinden (Mic. P 100.000g als Positivkontrolle). Die Abtrennung von cytoplasmatischen Komponenten wurde mittels Nachweis des cytosolischen Proteins HSP90 überprüft. In Abb.17A (unteres Bild) ist ein deutliches Signal von HSP90 im Gesamtlysat und in der cytoplasmatischen Fraktion zu erkennen. Die microsomale sowie die nucleäre Fraktion zeigt nur noch ein sehr schwaches Signal, HSP90 wird bei der Präparation zu einem geringen Anteil mit 20S Proteasom copräpariert und erst im letzten Reinigungsschritt, der hydrophoben Interaktions-Chromatographie, vollständig abgetrennt. In Abb. 17B wurde ein humanes Antiserum mit anti-snRNP-IgG ( Titer 1 : 2.000) für den Blot verwendet. Die small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) sind essentielle Komponenten für das eukaryontische pre-mRNA-splicing, sie befinden sich löslich im Nucleoplasma und waren somit ein guter Marker für dessen Anreicherung. Es finden sich die stärksten positiven Signale im Kernextrakt-Überstand nach Ultrazentrifugation, auch in der Kernmembranfraktion (Nuc. P 100.000g) sind snRNPs nachzuweisen, allerdings schwächer als im Kernextrakt. Es handelt sich hierbei wahrscheinlich um snRNPs, welche mit Kernmatrix assoziiert sind. In den verschiedenen eukaryontischen Zelltypen variiert die Verteilung von 20S und 26S Proteasom sehr stark. Umfangreiche Untersuchungen hierzu wurden von Palmer et al. (1996) durchgeführt. Bei Isolation von 20S Proteasom aus Rattenleber ermittelten sie eine Verteilung 83 % zytoplasmatisch, 5,4 % nuclear und 11,3 % microsomal, wobei die Verteilung einzelner proteasomaler Untereinheiten nicht einheitlich war.In HeLaS3-Zellen konnte im Rahmen dieser Arbeit folgende Verteilung von 20S Proteasom ermittelt werden, bezogen auf Gesamtproteasom der Zelle (100%) anhand der im einzelnen präparierten Proteinmengen:
Die gereinigten 20S Proteasomen aus den einzelnen Zellkompartimenten wurden an MiniQ P3.2/3 in ihre Subtypen aufgetrennt. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede der Elutionsprofile von cytoplasmatischen, microsomalen und nucleären 20S Proteasomen-Subtypen (Abb. 18).
Obwohl sich die 20S Proteasomen aus allen drei Zellkompartimenten jeweils in vier Subtypen auftrennen ließen, ist deren quantitative Verteilung allerdings unterschiedlich. Um Informationen über die Untereinheiten-Zusammensetzung der Gesamt-Proteasomen der einzelnen Zellkompartimente zu erhalten, wurde zunächst eine SDS-PAGE mit nachfolgender Immunoblot-Analyse durchgeführt.
Nachfolgend wurden 2D-Pattern der einzelnen Subtypen aus den drei Zellkompartimenten erstellt.
In Abb.20 können alle vier cytoplasmatischen Subtypen dem intermediären Typus zugeordnet werden, wobei CI und CII einen verhältnismäßig höheren Anteil an Immuno-Untereinheiten als CIII und CIV. Dies entspricht auch der zuvor bei den induzierten adhärenten Zellen gemachten Beobachtung. Auch bei den microsomalen Subtypen können alle vier dem Intermediär-Typ zugeordnet werden (Abb.21). Der Gehalt an LMP2 nimmt wieder von MI nach MIV hin ab und ist höher als in den cytoplasmatischen 20S Proteasomen. Der Pfeil markiert einen Spot über der
Untereinheit ζ, der so intensiv nur in microsomalen Präparationen zu sehen war. Es konnte bisher nicht geklärt werden, um welche Untereinheit es sich hier handelt, es könnte eine Modifikation von ζ oder aber auch von C8 (α7) sein. Als strukturellen Unterschied zwischen den meistens 3 Spots der Untereinheit C8 stellten Claverol et al.(2002) eine Phosphorylierung an Ser250 fest, eventuell spielt hier noch eine weitere Modifikation eine Rolle. MECL-1 konnte hier im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Subtypen nicht eindeutig lokalisiert werden.
Die nucleären Proteasomen haben einen Anteil am Gesamtproteasom von ca. 2%, deshalb war hier nur von den beiden dominanten Subtypen NII und NIII genügend Material für die NEpHGE vorhanden. Man sieht in Abb.22 deutlich LMP2 und LMP7 in beiden Subtypen. In NII sieht man zwei Spots an den Positionen von MECL-1, die sich in Ladung und Größe unterscheiden. In NIII ist nur ein Spot zu erkennen, dafür ist hier Z nur sehr wenig vorhanden. Aus physiologischer Sicht würde man vermuten, dass in der microsomalen Fraktion der größte Anteil an Immunountereinheiten zu finden ist, da diese Proteasomen mit dem Endoplasmatischen Reticulum assoziiert und an der Generierung von
Für die Aktivitätsmessungen wurden fluorigene Peptidsubstrate verwendet, welche mit Methylcumarinamid (MCA) gekoppelt sind (siehe Abschnitt 2.2.5.2., S.27). In den kinetischen Untersuchungen zur Ermittlung des Aktivitätsoptimums wurde eine konstante Menge Proteasom eingesetzt und die Substratmengen variiert. Die Inkubation erfolgte 60 Minuten bei 37°C (Daten nicht gezeigt).
Die drei konstitutiven Subtypen aus adhärenten uninduzierten HeLa-Zellen zeigten quantitative Unterschiede ihrer katalytischen Aktivitäten gegenüber fluorigenen Peptidsubstraten, während das Verhältnis der drei unterschiedlichen proteolytischen Aktivitäten zueinander bei den einzelnen Subtypen gleich war (Abb.23). In den kinetischen Messungen war zu erkennen, dass das vmax bei ähnlichen Substratkonzentrationen erreicht wurde, was für eine ähnliche Km-Werte spricht (Daten nicht gezeigt). Bei allen drei Subtypen war der Substratumsatz bei der PGPH-Aktivität am höchsten und bei der tryptischen Aktivität am geringsten. Subtyp II hat die höchste tryptische und Subtyp III die höchste chymotryptische Aktivität. Subtyp I ist insgesamt weniger aktiv als die beiden anderen. Nach Orlowski & Wilk (2001) werden den Untereinheiten folgende Aktivitäten zugeordnet: Tryptische Aktivität (Spaltung nach basischen Aminosäuren): ß2 (Z), ß2i (MECL-1) Chymotryptische Aktivität (Spaltung nach hydrophoben und aromatischen Aminosäuren): ß5 (MB1), ß1i (LMP2), ß5i (LMP7)
PGPH-Aktivität (Spaltung nach sauren Aminosäuren): ß1 (δ) Die PGPH-Aktivität ist hier sehr hoch, da die Untereinheit δ nicht durch LMP2 ersetzt wird und somit in allen Komplexen zweimal vorhanden ist. Die tryptische Aktivität ist hier Z zuzuschreiben und die chymotryptische Aktivität wird von MB1 ausgeführt.
Vergleicht man Abb.24 mit Abb.23 wird deutlich, dass die PGPH-Aktivität der Mischkomplexe nach γIFN-Induktion geringer ist als bei den 20S Proteasomen aus den uninduzierten HeLa-Zellen. Dafür ist die chymotryptische Aktivität deutlich erhöht. Grund dafür ist der geringere Anteil an δ, welches für die PGPH-Aktivität verantwortlich gemacht wird und in den Immuno-Proteasomen zumindest teilweise durch LMP2 ersetzt wird, das wiederum die chymotryptische Aktivität steigert. Außerdem wird in Immuno-Proteasomen noch MB1 durch LMP7 teilweise komplementiert, beide Untereinheiten schneiden nach hydrophoben Aminosäuren, steigern also auch die chymotryptische Aktivität. In Subtyp II und III ist die chymotryptische Aktivität am höchsten, was mit dem Gehalt an LMP7, MB1 und LMP2 korreliert. Auch die tryptische Aktivität der Immuno-Subtypen ist deutlich höher als die der konstitutiven, was eventuell auf das zusätzliche Vorhandensein von MECL1 zurückzuführen ist.
Die Tests wurden wie vormals mit den fluorigenen Substraten im Vergleich der drei proteolytischen Hauptaktivitäten durchgeführt. Es wurden die einzelnen Subtypen der verschiedenen Zellkompartimente getestet und ihre Aktivitäten miteinander verglichen. Grundlage für die Berechnungen waren drei unabhängige Tests (Abb.25). Die cytoplasmatischen Subtypen haben insgesamt eine etwas höhere Aktivität als die microsomalen. In beiden Fällen ist die PGPH-Aktivität die höchste, was bei den cytoplasmatischen Subtypen mit einem hohen Anteil an δ zu erklären ist. Diese Aktivität ist im Subtyp CIII am stärksten ausgeprägt, da hier auch der Gehalt an der komplementären Untereinheit LMP2 am geringsten ist, verglichen mit den anderen cytoplasmatischen Subtypen.
Bei den nucleären Subtypen war die PGPH-Aktivität deutlich geringer, ihr Anteil an LMP2 ist im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt auch höher als in Cytoplasma und Microsomen (vgl. Abb.22 mit Abb.21 und 20). Die tryptische und die chymotryptische Aktivität sind bei den microsomalen Subtypen geringer als bei cytoplasmatischen und nucleären. Die proteolytische Aktivität der microsomalen Proteasom-Subtypen folgt hier allerdings nicht der von Orlowski & Wilk (2001) aufgestellten Hypothese. Bei diesen Proteasomen ist die PGPH-Aktivität zwar nur halb so groß wie bei den cytoplasmatischen Proteasomen-Subtypen, aber immer noch die dominierende Aktivität, obwohl δ und LMP2 in etwa gleichen Mengen vorkommen. Nach der Theorie von Orlowski & Wilk (2001) wäre ein Anstieg der chymotryptischen Aktivität zu erwarten gewesen. Die tryptische Aktivität der nucleären Subtypen, assoziiert mit den Untereinheiten Z und MECL-1, ist vergleichbar mit den cytoplasmatischen Subtypen, in NII ist sie allerdings relativ hoch.
In Abb.26 sind noch einmal die Aktivitäten der 20S Proteasomen aus den Zellkompartimenten insgesamt verglichen. Im Cytoplasma ist die PGPH-Aktivität der Proteasomen ca. doppelt so hoch wie in den beiden anderen Kompartimenten. Bei der tryptischen und chymotryptischen Aktivität sind die microsomalen 20S Proteasomen ca. nur halb so aktiv wie cytoplasmatische und nucleäre.
In den vorangegangenen Untersuchungen ergaben sich Hinweise, dass das unterschiedliche Elutionsverhalten von 20S Proteasomen-Subtypen nicht allein durch einen Austausch von Untereinheiten zu erklären ist. Da es sich um Ladungsunterschiede an der Oberfläche des Komplexes handelt, liegt die Vermutung nahe, dass post-translationale Modifikationen der einzelnen Untereinheiten eine Rolle spielen könnten. In einigen Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Untereinheiten C8 (α7) und C9 (α3) und auch einige Untereinheiten des 19S-Regulators phosphoryliert werden können. Eine Behandlung der Zellen mit γIFN führte zu einem Absinken der Phosphorylierung, einer Abnahme von 26S Komplexen und zu einem Anstieg von PA28-Proteasom-Komplexen (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Bose et al., 2003). Es wurden hier regulatorische Funktionen dieser Modifikation durch Stabilisierung bzw. Destabilisierung der verschiedenen Komplexe vermutet. Post-translationale Modifikationen von Proteasom beschränken sich aber nicht nur auf deren Phosphorylierungen. Hinweise auf eine Glykosylierung von proteasomalen Untereinheiten gab es bereits 1991 von Schliepake et al.(1991) in höheren Pflanzen und von Schmid et al. (1993) in Mammalia . Beide Gruppen testeten 20S Proteasomen mit Lectinen. Schliepake et al. erhielten Hinweise auf ein Vorhandensein von Glucosyl- , Mannosyl- und N-Acetylgalactoaminylresten in 20S Untereinheiten. Schmid et al. konnten auf einem 2D- Blot von Kalbsleber-20S-Proteasom N-Acetyl-Neuraminsäure, N-Acetylglucosamin und Mannose nachweisen. Neuere Arbeiten von Sümegi et al., 2003 und Zhang et al., 2003, gaben Hinweise auf eine O-gekoppelte Glykosylierung mit N-Acetylglucosamin (GlcNAc) von Untereinheiten in 20S Proteasom und 19S Regulator in Drosophila - bzw. Mammalia -Geweben. Zhang et al. (2003) konnten in vitro und in vivo 26S Proteasom aus dem Kernextrakt von NRK-Zellen inhibieren, indem sie sie mit einer O-GlcNAc-Transferase behandelten, welche proteasomale Untereinheiten glykosylierte. Diese Modifikation bewirkte eine Hemmung der ATPase-Aktivität von 26S Proteasom und somit einen verzögerten Abbau der Transkriptionsfaktors Sp1 und des hydrophoben Peptidsubstrates Suc-LLVY-MCA. Sie stellten fest, dass nur die Aktivität von 26S- nicht die von 20S-Komplexen mit dieser Methode hemmbar ist. Sümegi et al. (2003) zeigten mit dem GlcNac-spezifischen Lectin Wheat Germ Agglutintin (WGA) und monoclonalen Antikörpern gegen O-gekoppeltes GlcNAc, dass neun Untereinheiten des 20S Proteasoms und fünf Untereinheiten des 19S Regulators aus Drosophila positiv reagierten.Aufgrund dieser Ergebnisse war es interessant zu untersuchen, ob evtl. auch Glykosylierungen im 20S Proteasom aus HeLa- bzw. HeLa S3-Zellen nachweisbar sind und eventuell das Subtypen-Pattern beeinflussen. Verdau von 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen mit Neuraminidase. Die Behandlungen von 20S Proteasom mit N-Acetylhexosaminidase (250mU/ml, 37°C, 16 Stunden), PNGaseF (1U/ml, 37°C, 16 Stunden) oder O-Glykosidase (2,5mU/ml, 37°C, 16 Stunden) zeigten keinerlei Veränderungen der Elutions-Muster (Daten nicht gezeigt). Die Ursache hierfür ist eventuell in der glykosidischen Bindung der vorhandenen Kohlenhydrate zu suchen, die nicht der Spezifität der Enzyme entspricht (siehe unter B:2.4.3.) PNGaseF spaltet N-Glykane vom Proteinrest ab. O-Glykosidase ist spezifisch für O-glykosidisch gebundene Gal- und GalNAc-Reste. N-Acetylhexosaminidase spaltet GlcNAc- und GalNAc-Reste in unterschiedlicher Verknüpfung von Protein- oder Kohlenhydratketten ab. Denkbar wären auch sterische Behinderungen des Enzyms durch die komplexe Struktur des Proteasoms. Nur die Behandlung mit Neuraminidase zeigte einen Effekt. Es wurden cytoplasmatische 20S Proteasomen aus HeLaS3-Zellen mit Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens (50mU/ml, 37°C, 16 Stunden) verdaut. Nach dem Verdau wurde die Probe an MiniQ P3.2/3 chromatographisch aufgetrennt, um zu sehen, ob sich das Muster der Subtypen verändert hat.
In der Abb.27 ist zu sehen, dass der Proteinpeak des Subtyps IV sich verkleinert, während der Proteinpeak der Subtypen I und II deutlich größer werden. Das spricht dafür, dass einige negativ geladene Proteasomen, die in Peak IV eluierten, nach Abtrennen der negativen Ladung der N-Acetyl-Neuraminsäurereste nun früher unter Peak I und II eluieren, so dass der Proteingehalt hier erhöht wird. Denkbar wäre auch eine geringfügige Konformationsänderung einer Untereinheit nach Abspaltung eines oder mehrerer Neuraminsäurereste, so dass sich Ladungsverschiebungen an der Oberfläche des Komplexes ergeben. Die Kontrollprobe in Abb. 27A wurde ohne Neuraminidase unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Eine Wirkung von Proteaseaktivität kann ausgeschlossen werden. Bei der Behandlung von microsomalen 20S Proteasomen in gleicher Weise konnten keine Veränderungen des Elutions-Musters festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Um die Dynamik der enzymatischen Reaktion zu zeigen, erfolgte eine Behandlung von 20S Proteasom mit Neuraminidase in Abhängigkeit von der Zeit.
In Abb.28 kann man die Veränderungen der Subtypen-Pattern in Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit Neuraminidase verfolgen. Zunächst wird der am meisten negativ geladene Subtyp etwas kleiner wobei noch keine Zunahme der positiveren Subtypen zu beobachten ist. Signifikante Unterschiede sind nach 16 Stunden sichtbar, hier ist die Zunahme der positiveren Peaks deutlich zu sehen. Nach 24 Stunden verändern sich die Mengenverhältnisse nicht mehr wesentlich, allerdings scheint die Trennung schlechter zu erfolgen. Zwischen 24 und 30 Stunden ist kein Unterschied mehr zu erkennen. Damit ist die Dynamik der enzymatischen Reaktion nachgewiesen, es werden negative Ladungen abgespalten, wodurch ein größerer Anteil des Gesamtproteins bei geringeren Salzkonzentrationen eluiert. Da es sich bei den beobachteten Effekten um Ladungsunterschiede handelt, lag die Vermutung nahe, dass evtl. auch im 2D-PAGE-Muster nach der Behandlung mit Neuraminidase einige Untereinheiten bzw. deren modifizierte Varianten ihre Position verändern könnten. In Abb.29 sind die 2D-PAGE-Muster nach NEpHGE-Auftrennung und Silberfärbung gezeigt.
Nach Abtrennung einer negativen Ladung, wie z.B. von Sialinsäure, von einer Untereinheit, würde man erwarten, dass sich der isoelektrische Punkt dieser Untereinheit in Richtung Kathode, also mehr in den basischen Bereich verschiebt. In Abb. 29 ist im basischen pH-Bereich nach Neuraminidase-Behandlung ein zusätzlicher Spot (roter Pfeil) zu erkennen. Die Identität dieses Spots konnte bisher nicht geklärt werden. Die Untereinheit mit dem gleichen Molekulargewicht wäre C6 (α4), aber denkbar wären auch Iota (α1) und MECL-1. C6 zeigt meistens drei bis vier Spots in 2D-PAGE-Mustern humaner 20S Proteasomen (Claverol et al., 2002). Es sieht in Abb.29 allerdings so aus, als würde dort die Intensität der stärker sauren, also negativer geladenen Spots zunehmen. Allerdings ist unterschiedliche Anfärbbarkeit mit Silber bei Proteinen hier auch zu beachten. Man kann von der Zunahme der Intensität nicht eindeutig auf eine wirkliche Zunahme der Proteinmenge schließen.
Um einen direkten Nachweis der Glykosylierung zu erbringen, sollten Kohlenhydratreste in den Proteasomen nach ihrer 2D-PAGE-Auftrennung und Blot auf PVDF-Membranen mit Lectinen nachgewiesen werden. Es wurden folgende Lectine verwendet:
Tritrichomonas mobilensis Lectin (TML): erkennt spezifisch N-Acylneuraminsäurereste (Neu5Ac, NANA), die α2,3- und α2,6- gekoppelt sind, dabei N-Glycolylneuraminsäuren mit einer 8fach höheren Affinität als N-Acetylneuraminsäuren.
Sambucus nigra Agglutinin I (SNA I): erkennt N-Acylneuraminsäurereste mit einer α2,6-Kopplung an Galactose oder N-Acetyl-Galactosamin (Gal/GalNAc)
Solanum tuberosum Agglutinin (STA): erkennt Oligomere von N-Acetylglucosamin (GlcNAc), z.B. GlcNac -ß1,4 –GlcNac
Wheat Germ Agglutinin (WGA): erkennt GlcNAc-ß1,4-GlcNAc, mit etwas geringerer Affinität auch ß-GlcNAc und Neu5Ac
Concanavalin A (ConA): erkennt α-D-Mannose, verzweigte Mannose-Reste und α-D-Glucose.
Alle Lectine waren Biotin-gekoppelte Konjugate, der Nachweis erfolgte mit Streptavidin- Peroxidase und ECL-Detektion. Es wurden zunächst zwei cytoplasmatische 20S Proteasom-Subtypen aus HeLaS3-Zellen verglichen. In Abb.30 wurden die cytoplasmatischen 20S Proteasomen-Subtypen CIII und CIV aus HeLaS3-Zellen untersucht. Fast alle Untereinheiten reagierten mit WGA, einige allerdings nur sehr schwach, was auf eine Substitution mit N-Acetylglucosamin (GlcNAc) hinweist. Dies entspricht in etwa auch den von Sümegi et al. (2003) gefundenen Daten. Ebenso reagierten fast alle 20S Proteasom-Untereinheiten mit TML, welches spezifisch N-Acetylneuraminsäure (NANA) erkennt. Schmid et al. (1993) hatten mit dem Lectin Limulus polyphemus Agglutinin (LPA), spezifisch gegen NANA, ein ähnliches Ergebnis. Bei der Färbung mit TML-Biotin fehlen einige Spots bei CIII, die bei CIV angefärbt werden (Pfeile). Es handelt sich hierbei um die Untereinheiten ζ , Z , MECL-1, C7 und je eine Unterform von C9 und LMP7. Bei der STA-Biotin-Färbung ist ein Spot von δ und ein Spot von Z bei CIV deutlich stärker angefärbt (Pfeile). Die Färbung mit ConA zeigt bei beiden Subtypen die
Die TML-Reaktion bei Subtyp MIII ist intensiver als bei Subtyp MII, sehr deutlich ist das beim Vergleich der Untereinheit δ sichtbar (Markierung). Ein Spot von C2 fehlt bei der TML-Färbung in MII völlig (Pfeil). Auch diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der negativer geladene Subtyp MIII offensichtlich mehr NANA enthält als der positiver geladene MII.
Um die Glykosylierung von 20S Proteasom auch in adhärent wachsenden HeLa-Zellen beurteilen zu können, wurde cytoplasmatisches 20S Proteasom aus HeLa-Zellen in NEpHGE aufgetrennt und auf PVDF-Membran geblottet (in Kleingeltechnik von Wagner, MPI für Infektionsbiologie, Berlin). Es wurden die Zellen nach 144 stündiger Inkubation mit γIFN ausgewählt, um auch die Immuno-Untereinheiten untersuchen zu können (Abb. 33).
In Abb.33 fällt auf, dass TML im Gegensatz zu den Proben aus HeLaS3-Zellen nur an sechs Untereinheiten bindet: δ, N3, C3, LMP7, C5 und MB1. Die Zuordnung der Untereinheiten erfolgte jeweils mit den entsprechenden Antikörpern auf derselben Membran (Daten nicht gezeigt). Mit WGA reagieren wieder fast alle Untereinheiten, aber auch deutlich schwächer als bei den HeLaS3-Zellen. Bis auf MB1 sind die mit TML positiven Untereinheiten auch mit WGA intensiver gefärbt. Auch WGA reagiert in geringem Maße mit NANA. Zwischen der Behandlung mit TML und WGA wurde die Membran mit Neuraminidase (50mU/ml, 37°C, 16 Stunden) inkubiert, worauf eine erneute Reaktion mit TML nicht möglich war. Es scheint so, dass die 20S Proteasomen aus HeLa-Zellen geringer glykosyliert sind als die aus HeLaS3-Zellen. Denkbar wäre hier allerdings ein Effekt durch die Langzeit-Inkubation mit γIFN, da auch die Vitalität der Zellen unter diesen Bedingungen beeinträchtigt war. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse noch einmal zusammengefasst.
Die cytoplasmatischen 20S Porteasom-Subtypen scheinen stärker glykosyliert zu sein als die microsomalen. Die Untereinheiten N3 und δ reagieren bei allen Proben mit den verschiedenen Lectinen, N3 zum Teil sehr stark. Auch ι, C2 und C10 reagieren bis auf eine Ausnahme (TML bei HeLa γIFN) mit allen verwendeten Lectinen. LMP2 und MECL-1 hingegen zeigen in allen Proben keine (bzw. MECL-1 in zwei Fällen eine sehr schwache) Reaktion. Alle Untereinheiten, die NANA enthalten, zeigten auch mit GlcNAc-spezifischen Lectinen eine Reaktion, allerdings nicht mit dem Mannose-spezifischen ConA.
Die positive Reaktion der Lectine mit proteasomalen Untereinheiten gibt einen Hinweis auf das Vorhandensein von Kohlenhydrat-Resten und darauf, um welche Kohlenhydrate es sich handeln
Von dem microsomalen 20S Proteasom war nur eine Analyse möglich, von dem cytoplasmatischen 20S Proteasom standen zwei Proben unterschiedlicher Menge zur Verfügung. Die Werte weisen zum Teil große Unterschiede auf, was daran liegt, dass die Methode bei den geringen Protein- und Kohlenhydratmengen an der Nachweisgrenze war. Die Messung von Glucose und Mannose zeigt oft überhöhte Werte aufgrund von Verunreinigungen aus der Umgebung. Die Retentionszeit von Mannose ist ausserdem mit der von Xylose identisch, so dass auch hier Überlagerungen auftreten können. Auffällig ist der hohe Gehalt an Mannose und Glucose in den microsomalen Proteasomen. Dies entspricht nicht den Erwartungen nach den Ergebnissen der Blots mit ConA, die schwächer gefärbt waren als die mit TML. Die Lectinuntersuchungen gaben auch einen Hinweis auf GlcNAc-Vorkommen, was zumindest in zwei Proben bestätigt wurde.
Auch diese Analyse wurde von D. Grunow und M. Zimmermann-Kordmann, Institut für Molekularbiologie und Biochemie der Charite’, Campus Benjamin Franklin, durchgeführt. Die Neuraminsäuren α-N-Acetyl-Neuraminsäure und α-N-Glycolyl-Neuraminsäure wurden mittels milder saurer Hydrolyse von den Proteinresten abgetrennt und dann über Anionenaustausch-Chromatographie (HPLC) mit gepulster amperometrischer Detektion nachgewiesen. Es konnte bisher nur 20S Proteasom aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen untersucht werden. Es wurden mehrere Auftragungen aus einer Probe vorgenommen und Mittelwerte errechnet (Tabelle 7).
Die Mengen an Neuraminsäure sind sehr viel geringer als die für die anderen Kohlenhydrat-Reste ermittelten Werte. Dies entspricht nicht dem Bild, das aus den Untersuchungen mit TML erhalten wurde. Bei den cytoplasmatischen Proben reagierten fast alle Untereinheiten mit TML, einige sehr stark. Das Lectin TML gilt als sehr spezifisch für Neu5Ac und Neu5Glc, so dass Kreuzreaktionen mit anderen Kohlenhydraten unwahrscheinlich sind. Aus den vorangegangenen Versuchen lässt sich schließen, dass die Intensität der Lectinbindung offensichtlich nicht mit der Menge an Kohlenhydrat korreliert.
Um einen eventuellen Einfluß der Sialylierung auf die proteolytische Aktivtität von 20S Proteasom zu untersuchen, wurden mit 20S Proteasom-Subtypen und 20S Proteasom-Subtypen nach Neuraminidase-Behandlung aus dem Cytoplasma von HeLaS3-Zellen Aktivitätstests mit fluorigenen Peptidsubstraten durchgeführt. Bisher ergaben aber erst zwei unabhängige Tests auswertbare Ergebnisse (Abb.34).
Anhand der Testergebnisse in Abb.34 ist zu vermuten, dass durch die Desialylierung am stärksten die PGPH-Aktivität beeinflusst wurde, sie war bei den Subtypen DII-DIII fast nur noch halb so hoch wie bei der unbehandelten Kontrolle. Die deutlichsten Unterschiede sind zwischen den Subtypen DIII und DIV im Vergleich mit den Subtypen CIII und CIV zu verzeichnen. Dies würde bedeuten, dass hier die Desialylierung zu einem Verlust an Aktivität führt. Die tryptische Aktivität ist bei DIII und DIV nur noch halb so groß wie bei CIII und CIV, während die der Subtypen DI/II nicht wesentlich geringer ist als die
Zu Beginn dieser Arbeit wurden die 20S Proteasomen aus T2-Zellen und aus HeLa-Zellen auf ihre Subtypen hin untersucht. Es zeigte sich, dass zwei bzw. drei Subtypen trennbar waren, obwohl in diesen Zellen ausschließlich konstitutive Proteasomen exprimiert werden. Dies war ein eindeutiger Hinweis darauf, dass das Vorhandensein verschiedener Subtypen nicht nur auf den Austausch der ß-Untereinheiten zurückzuführen ist, sondern dass hier offensichtlich noch andere Modifikationen vorliegen, die zu Ladungsunterschieden an der Oberfläche der Komplexe führen. In zweidimensionalen Auftrennungen von 20S Proteasom wurde in dieser und anderen Arbeiten (u.a. Kristensen et al, 1994; Hendil et al.,1995) eine Heterogenität der proteasomalen Untereinheiten festgestellt. Claverol et al.., 2002 fanden, dass fast alle der α- und ß-Untereinheiten von mehreren Spots mit verschiedenen pI-Werten repräsentiert wurden. Auch hier sind als Ursache post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Glykosylierung, N-Acetylierung, Alkylierung und oxidative Veränderungen denkbar. Für die Untereinheiten C8 und C9 sind Phosphorylierungen beschrieben (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Claverol et al., 2002). Möglicherweise unterscheiden sich die 20S Proteasom-Subtypen in HeLa-Zellen im Hinblick auf die Mengenverteilung dieser modifizierten Untereinheiten voneinander, Vergleiche der 2D-PAGE-Muster der einzelnen Subtypen von induzierten HeLa- bzw. HeLaS3-Zellen miteinander stützten diese Hypothese (siehe Abbildungen 10, 12, 20, 21 und 22). Ein endgültiger Beweis konnte aber noch nicht erbracht werden. Bei allen drei 20S Proteasom Subtypen aus HeLa-Zellen zeigte sich beim Vergleich der proteolytischen Aktivitäten die Verteilung folgendermaßen: PGPH > chymotryptisch > tryptisch (Abb.23). Die Messungen erfolgten mit fluorigenen Peptidsubstraten mit einer Länge von drei bis vier Aminosäuren, die unabhängig von Ubiquitinierung und aktivem Transport bzw. Entfaltung durch den 19S bzw. 11S Regulator-Komplex von dem 20S Proteasom gespalten wurden. Auch bei den Untersuchungen von Khan et al. (2001) und Dahlmann et al. (2000) war die Verteilung der spezifischen Aktivitäten mit den Substraten Z-LLE-MCA (bzw. Z-LLE-ßNA), Suc-LLVY-MCA und Bz-VGR-MCA wie oben beschrieben. Die Umsatzrate und -geschwindigkeit der fluorigenen Substrate hängt von ihren chemischen Eigenschaften und den Bedingungen im Test ab. Das hydrophobe Substrat Suc-LLVY-MCA für die Messung der chymotryptischen Aktivität wird wesentlich schneller in Anwesenheit von SDS, Phospholipiden oder Fettsäuren umgesetzt. Ähnlich verhält es sich mit dem Umsatz des Substrates Z-LLE-MCA für die PGPH-Aktivität, hier wirkt die Anwesenheit von Mg2+- Ionen zusätzlich aktivitätssteigernd. Für die PGPH-Aktivität wurde auch das Vorhandensein von zwei kinetisch verschiedenen Aktivitäten berichtet, welche sich durch allosterische Effekte positiv beeinflussen und zu einer sigmoidalen Abhängikeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration führen. Es werden auch Bindungseffekte von benachbarten, katalytisch inaktiven Untereinheiten diskutiert (Djaballah et al., 1992 bzw. 1993). Zahlreiche Untersuchungen haben ergeben, dass die proteolytischen Aktivitäten von bestimmten ß-Untereinheiten ausgeführt werden und dass diese unterschiedlich in ihrer Reaktion auf spezifische Inhibitoren und Effektoren sind, obwohl ihr katalytischer Mechanismus derselbe ist (Orlowski & Wilk, 2001). In der Arbeit von Dahlmann et al. (2000) wurden die 20S Proteasom-Subtypen aus dem Skelettmuskel der Ratte in Aktivitätstests verglichen. Die drei konstitutiven Subtypen unterschieden sich in ihren vmax- und Km-Werten sowohl untereinander, als auch von den intermediären und Immuno-Subtypen. Der Unterschied zwischen konstitutiven, intermediären und Immuno-Subtypen im Hinblick auf die proteolytischen Aktivitäten ist in erster Linie durch den Austausch der katalytisch aktiven ß-Untereinheiten zu erklären. Aktivitätsunterschiede von Subtypen mit der gleichen Zusammensetzung von aktiven ß-Untereinheiten könnten mit sterischen und ladungsbedingten Effekten und Konformationsänderungen durch Modifikationen an benachbarten Untereinheiten der katalytischen Zentren erklärt werden. In der vorliegenden Arbeit waren bei den rein konstitutiven 20S Proteasom-Subtypen aus adhärenten HeLa-Zellen Unterschiede zu erkennen. Die PGPH-Aktivität und die tryptische Aktivität von Subtyp III waren doppelt so hoch wie die von Subtyp I, die chymotryptische Aktivität war ca.1,5fach erhöht (Abb.23).
Wurden die HeLa-Zellen in Anwesenheit von γIFN inkubiert, änderte sich das Muster und die Untereinheiten-Zusammensetzung der 20S Proteasom-Subtypen signifikant. Es entstanden hauptsächlich Intermediär-Subtypen, die sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten aufweisen. Die Veränderungen zeigen eine zeitliche Dynamik und auch nach 144 Stunden γIFN-Inkubation weit über die Halblebenszeit der konstitutiven 20S Proteasomen in HeLa-Zellen (54 Stunden, Information von Heink) hinaus, sind noch konstitutive Untereinheiten in den 20S Komplexen nachweisbar. Tabelle 8 gibt einen Überblick über die Verteilung der katalytischen ß-Untereinheiten in den 20S Proteasom-Subtypen aus γIFN-induzierten HeLa-Zellen. Die Lokalisation von MECL-1 ist schwierig, weil die Position zum Teil nicht eindeutig mit dem spezifischen Antikörper bestimmt werden konnte, da dieser oft Kreuzreaktionen mit anderen Untereinheiten, vor allem mit Z, zeigt. Um die Intensitäten der einzelnen Spots bestimmter Untereinheiten und ihrer modifizierten Varianten vergleichen zu können, müssten sehr viel mehr 2D-PAGE-Bilder der Subtypen angefertigt werden, damit eine statistische Auswertung möglich ist.
Griffin et al. (1998) zeigten in ihren Experimenten einen kooperativen Einbau von Immuno-Untereinheiten in transfizierten T2-Zellen und schlussfolgerten daraus, dass in erster Linie reine Immuno- oder reine konstitutive 20S Komplexe entstehen und dass Mischkomplexe nur auf eher untergeordneten Nebenwegen gebildet werden. Khan et al. (2001) beschreiben in ihren Experimenten mit viral infizierten Mäusen eine maximale Reduktion der konstitutiven ß-Untereinheiten MB1 um das achtfache und δ um das vierfache (die Verdrängung von Z durch MECL-1 wird mit 50% angegeben). Dies geschieht nach 8 Tagen in der Hochphase der Infektion, wenn der Virustiter beginnt abzunehmen und die Expansion der spezifischen CD8+ -T-Zellen am größten ist. Danach nimmt der Anteil der konstitutiven Untereinheiten wieder zu, der der Immuno-Untereinheiten entsprechend ab. Hier wurde von einer Halblebenszeit von 12-15 Tagen der konstitutiven 20S Proteasomen in Rattenleber ausgegangen. Die Autoren sprechen von einem nahezu kompletten Austausch von 20S Proteasomen nach 8 Tagen und erklären den relativen Verlust an konstitutiven 20S Proteasomen durch die massive Zerstörung von Hepatozyten durch cytotoxische T-Zellen und durch die starke Infiltration mit Leukozyten in den infizierten Lebern. Allerdings nehmen sie auch eine eventuell kürzere Halblebenszeit von konstitutiven 20S Proteasomen in entzündetem Gewebe an. HeLa-Zellen sind humane neoplastisch transformierte Epithelzellen und aufgrund dieser Tatsache wahrscheinlich auch
Gerade im Hinblick auf die Intermediär-Subtypen war es interessant, ob es tatsächlich Mischkomplexe gibt und ob sogar innerhalb eines Proteasom-Komplexes sowohl die konstitutive, als auch die Immuno-Untereinheit eines Homologen-Paares vorkommen können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dies der Fall ist. Es wurden über einen ZZ-tag Komplexe isoliert, die sowohl die konstitutive als auch die Immuno-Untereinheit des homologen Paares δ/LMP2 enthielten (Abb.14). Eine Spekulation über mögliche Mischkomplexe erfordert hier eine gründliche Betrachtung der Assemblierung des 20S Proteasoms. Griffin et al. (1998) und De et al. (2003) lieferten dazu umfangreiche Daten. Zunächst ist es wichtig zu beachten, dass LMP2 frühzeitig in die Preproteasomen eingebaut wird, δ dagegen spät. Auch die ß5-Homologen MB1 und LMP7 erscheinen spät in den Precursor-Komplexen. Griffin et al. (1998) und Groettrup et al. (1996) fanden, dass bevorzugt reine Immunoproteasomen gebildet werden, wenn alle sechs katalytischen ß-Untereinheiten vorhanden sind. Der Einbau von MECL-1 wird verstärkt, sobald LMP2 vorhanden ist, LMP7 übt darauf keinen Einfluß aus. De et al. (2003) untersuchten u.a. den Einfluß der Propeptide von Z und MECL-1auf die Assemblierung. Sie fanden heraus, dass das Propeptid von Z (ppZ) den Einbau von MECL-1 in konstitutive δ/MB1-Proteasomen bzw. den Einbau von MB1 in LMP2/MECL-1-Immuno-Proteasomen ermöglicht. Das Propeptid von MECL-1 (ppMECL-1) hemmt allerdings nicht den Einbau oder die Prozessierung von Z in konstitutive Proteasomen. Es erhöht auch nur minimal den Einbau von Z in Immuno-Proteasomen gegenüber dem Z-Propeptid. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Proformen von LMP2 und LMP7 nicht akkumulieren, wenn kein MECL-1 vorhanden ist, was bedeutet, dass Z/LMP2/LMP7-Mischkomplexe gebildet werden. LMP7 wiederum kann in jede Kombination von ß1/ß2-Untereinheiten eingebaut werden. Ist es nicht vorhanden, akkumulieren aber Precursor-Proteasomen mit MECL-1/LMP2. Die Untereinheit Z scheint vor δ eingebaut zu werden, folglich braucht Z für seinen Einbau keine benachbarte ß1-Untereinheit. Weiterhin vermuteten die Autoren, dass MB1 nicht eingebaut wird, wenn bereits eine ß1-Untereinheit vorhanden ist. Deshalb ist es kaum in Preproteasomen mit dem frühen LMP2 zu finden. Das Z-Propeptid in Kombination mit MECL-1 verstärkt dessen Einbau in Preproteasomen ohne ß1-Untereinheit und somit den Einbau von MB1. Deshalb fanden die Autoren auch Komplexe der Kombination δ/MECL-1/MB1 in ihren Präzipitationen unter Verwendung von ppZ-MECL-1.
Unter Beachtung dieser Informationen wären also vier verschiedene Halbproteasomen als Precursor-Komplexe möglich und kombinierbar (Abb.35). Daraus könnten theoretisch zehn 20S Proteasom-Komplexe gebildet werden (siehe Tabelle 9).
Die Existenz von maximal vier 20S Proteasom-Subtypen in induzierten HeLa-Zellen bei 10 möglichen 20S Komplexen könnte bedeuten, dass ein Subtyp hier aus verschieden zusammengesetzten 20S Komplexen besteht, die die gleiche Oberflächenladung besitzen. In den 2D-PAGE-Analysen schienen alle Subtypen intermediär-Komplexe zu enthalten. Denkbar wäre natürlich auch, dass reine Immuno-Proteasomen gebildet wurden und dass diese aber nicht von einigen Mischkomplexen chromatographisch getrennt werden konnten, sodass in den 2D-PAGE-Mustern der Subtypen sowohl Immuno- als auch konstitutive Untereinheiten zu sehen waren. Das würde allerdings den Daten von Dahlmann et al. (2000) widersprechen, die reine Immuno-Subtypen allerdings aus Rattengeweben
Es ist seit längerem bekannt, dass das Proteasom in verschiedenen Zellkompartimenten vorkommt und dass die Verteilung innerhalb der Zellen von vielen Faktoren beeinflusst wird (Wojcek & DeMartino, Review, 2003). Palmer et al., 1996 fanden darüber hinaus Hinweise auf strukturelle Unterschiede der Proteasomen-Subpopulationen, indem sie die Verteilung bestimmter proteasomaler Untereinheiten auf die Zellfraktionen verglichen. Im Hinblick auf sehr spezielle Stoffwechsel- und Regulationsprozesse in den einzelnen Zellkompartimenten, wären strukturelle und damit verbundene funktionelle Unterschiede der 20S Proteasomen-Subpopulationen durchaus sinnvoll und denkbar. In der vorliegenden Arbeit sollte dies näher mit HeLaS3-Zellen untersucht werden, da diese wegen ihres nicht adhärenten Wachstums in Solubilisationskulturen kultiviert werden konnten und somit eine größere Menge an Zellen zur Verfügung stand. Auffallend war hier zunächst, dass HeLaS3-Zellen auch ohne Induktion mit γIFN Immuno-Untereinheiten ausbilden. Möglicherweise sind dafür die Kulturbedingungen verantwortlich. Die Zellen wurden unter Durchmischung in „spinnerflasks“ gezogen und erreichten eine hohe Zelldichte. Die Zellen waren unter dem Mikroskop kugelförmig und bei hohen Zelldichten bildeten sie untereinander Cluster und Perlenkettenähnliche Strukturen aus, adhärierten aber nie an den Oberflächen der Kulturgefäße. Denkbar wäre, dass die Zellen durch den fehlenden Kontakt zu Nachbarzellen und zur Matrix unter Stress geraten und so in eine Art Alarmzustand versetzt werden, wodurch in der Folge Immuno-Untereinheiten exprimiert werden. Es gibt bisher in der Literatur allerdings keine Hinweise auf diesen speziellen Fall. Kuckelkorn et al. (2000) fanden nach Stress erzeugenden Hitzeschock-Behandlungen eher den gegenteiligen Effekt bei murinen RMA-Zellen. Durch die Hitzeschock-Behandlung wurden die 20S Proteasomen inaktiv und resistent gegenüber einer Aktivierung mit SDS, was auf strukturelle Veränderungen der Untereinheiten α1 (ι) und α6 (C2) zurückgeführt wurde. Darüber hinaus wurde die de novo-Synthese von 20S Proteasom gehemmt. Es waren keine Immuno-Untereinheiten nachweisbar. Auch zellulärer Stress, erzeugt durch Proteasom-Inhibition, führt nicht zu einer Hochregulierung von proteasomalen Immuno-Untereinheiten (mündliche Information von Heyken). Gegen oxidativen Stress durch H2O2 oder andere Radikale ist das 20S Proteasom relativ resistent (Shringarpure et al., 2001), es wurde keine spontane Induktion von Immuno-Untereinheiten beobachtet. Es konnten aus dem Gesamt-Zelllysat von HeLaS3-Zellen drei 20S Proteasom-Subtypen getrennt werden, die sich in ihrem Muster von denen der adhärenten HeLa-Zellen unterschieden (Abb.15). Die Subtypen waren bei den HeLaS3-Zellen nicht so deutlich voneinander trennbar, dominierend war hier der Subtyp II. Das Subtypen-Muster unterscheidet sich auch deutlich von denen mit γIFN induzierten HeLa-Zellen nach 48, 72 bzw. 144 Stunden, obwohl der Vergleich der 2D-PAGE-Muster eine sehr ähnliche Untereinheiten-Zusammensetzung zeigt (Abbildungen 8, 10, 11, 12 und 15) . Als Grund dafür sind eher unterschiedliche Modifikationen der proteasomalen Untereinheiten anzunehmen, als ihre Zusammensetzung als solche. Aus den HeLaS3-Zellen wurden nun die 20S Proteasomen-Subpopulationen der einzelnen Zellkompartimente Cytoplasma, Microsomen und Zellkern näher betrachtet. Die Kompartiment-Trennung wurde über die An- bzw. Abreicherung bestimmter Markerproteine kontrolliert. Zunächst konnte anhand der präparierten Protein-Menge eine Aussage über die quantitative Verteilung von 20S Proteasom aus HeLaS3-Zellen auf die Zellkompartimente getroffen werden: es wurden vom Gesamtproteasom 70-72% im Cytoplasma, 25-27% in den Microsomen und 3-5% in den Zellkernen gefunden. In Hefe z.B., die kein adaptives Immunsystem und auch keine Immuno-Proteasomen besitzt, sind 80% der 26S Porteasomen im Nucleus und Nuclear Envelope lokalisiert (Enenkel et al., 1998), was ein Ausdruck dafür ist, dass bei der hohen Teilungsrate der Hefezellen der Protein-turnover hauptsächlich in diesen Kompartimenten stattfindet. Die subzelluläre Lokalisation von Proteasom unterliegt sehr starken Schwankungen, sowohl bei den unterschiedlichen Spezies, als auch innerhalb einer Spezies im Hinblick auf Zellzyklus, Reifegrad der
Nach Tabelle 10 zu urteilen haben nicht, wie erwartet, die microsomalen 20S Proteasom-Subtypen den höchsten Anteil an Immuno-Untereinheiten, sondern eher die nucleären Proteasomen. Bei den microsomalen Proteasomen wird angenommen, dass diese hauptsächlich am ER-assziierten Proteinabbau (ERAD) und an der Generierung von MHC I-relevanten Epitopen beteiligt sind, also immunologische Funktionen haben. In den 2D-PAGE-Mustern (Abb.21) haben sie aber verglichen mit den cytoplasmatischen Proteasom-Subtypen (Abb.20) lediglich einen höheren Anteil an LMP2, welcher wiederum niedriger als der der nucleären Subtypen zu sein scheint. Palmer et al. (1996) fanden ebenfalls bei den microsomalen Proteasomen aus Rattenleber einen höheren Anteil an LMP2 im Vergleich mit der cytoplasmatischen Fraktion. Allerdings fanden sie sehr wenig LMP2 in der nucleären Fraktion, was nicht den Beobachtungen in dieser Arbeit entspricht. Gründe hierfür sind möglicherweise in der anderen Art des von Palmer et al. untersuchten Materials (Rattenleber) oder in der unterschiedlichen experimentellen Prozedur zu suchen. Fabunmi et al. (2000) fanden in HeLa-Zellen nach Induktion mit γIFN eine Anreicherung von Immunoproteasomen und PA 28-Regulator im Zellkern in sogenannten PML (promyelocytic leukemia oncoprotein) bodies. PML bodies sind diskrete subnucleäre Domänen, welchen verschiedene Funktionen zugeschrieben werden, z.B. Transkriptionsregulation, Tumorsuppression, Apoptose und Speicherung nucleärer Proteine. Bei verschiedenen pathologischen Prozessen, wie viralen Infektionen und akuter promyeloischer Leukämie wird eine Auflösung dieser Strukturdomänen beobachtet, was auch eine Zerstreuung in ihnen gespeicherter Komponenten bedeutet. Es wird die hohe Pathogenität dieser Krankheiten teilweise auf die Tatsache zurückgeführt, dass dadurch Defekte in der Antigen-Prozessierung und Präsentation auftreten.
Schaut man sich die proteolytischen Aktivitäten der einzelnen Subtypen gegenüber fluorigenen Peptidsubstraten an, so findet man auch hier Unterschiede (Abb.25). Bei den cytoplasmatischen und den microsomalen Subtypen ist die PGPH-Aktivität die höchste, obwohl in diesen Subtypen LMP2 zumindest teilweise gegen δ ausgetauscht ist, bei den cytoplasmatischen Subtypen allerdings nur in geringem Maße. Die chymotryptische und die tryptische Aktivität sind bei den microsomalen Subtypen am niedrigsten. In keiner Fraktion zeigte sich eine ähnliche Verteilung der Aktivitäten wie bei den adhärenten HeLa-Zellen nach 144 stündiger Inkubation mit γIFN (Abb.24), obwohl die Zusammensetzung der katalytischen Untereinheiten ähnlich ist. Denkbar wären hier veränderte Bindungseffekte der benachbarten Untereinheiten (Djaballah et al., 1992 bzw. 1993), welche durch post-translationale Modifikationen, wie Glykosylierung, Phosphorylierung u.a. hervorgerufen werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Glykosylierung als post-translationale Modifikation der 20S Proteasomen näher untersucht.
Man weiß inzwischen, dass die meisten Proteine Glykoproteine sind, mit einem kovalent gebundenen Kohlenhydratanteil von < 1 bis > 90% Gewichtsanteil. Sie finden sich in sämtlichen Proteinklassen mit den unterschiedlichsten Funktionen, z.B. Strukturproteine, Hormone, Rezeptoren usw. Oligosaccharide können auf zweierlei Art mit dem Protein verknüpft sein: N-glykosidisch und O-glykosidisch. N-Glykane haben eine feste Kernstruktur. Sie sind ß-glykosidisch an die γ-Aminogruppe von Asparagin in der Sequenz Asn-X-Ser/Thr gebunden. Das Kernoligosaccharid besteht aus zwei N-Acetylglucosaminresten und drei verzweigten Mannoseresten, an welche sich mit großer Variationsbreite verschiedene Oligosaccharide mit oder ohne weitere Verzweigung anschließen können. Die häufigste O-glykosidische Fixierung wird über ein Kerndisaccharid vermittelt, welches α-glykosidisch mit Serin oder Threonin verknüpft ist und aus ß-Galactosyl- 1,3 -α- N-Acetylgalactosamin besteht. Es kommen aber auch Galaktose, Mannose und Xylose vor, die α-glykosidisch an Serin oder Threonin gebunden sind. O-Glykane sind weniger gut charakterisiert als N-Glykane. Sie sind oft an hochglycosylierten Bereichen im Protein konzentriert, die viel Serin und Threonin enthalten. N-Glykane sind meist gleichmäßiger auf das Protein verteilt, ihr Aufbau ist systematischer, oft sind sie stark verzweigt. Durch ihre Hydrophilie und ihre sterischen Ausmaße erzwingen Kohlenhydrate eine gestreckte Konformation, sie binden bevorzugt an ß-Faltblattregionen im Protein. O- und N-Glykane dienen u.a. als Marker für den Zustand und das Alter des Proteins, für seine Lokalisation oder als Mittler in Zell-Zell-Erkennungsprozessen. Auch als physiologische Schalter ähnlich wie Phosphorylierungen werden Glykosylierungen diskutiert.
In den letzten Jahren entfernte man sich mehr und mehr von der Ansicht, dass glykosylierte Proteine meist große komplexe Glykanstrukturen tragen und sich ausschließlich an der Zelloberfläche oder innerhalb des Lumens von subzellulären Organellen wie ER oder Golgi befinden. Mittlerweile wurden komplexe sowie einfache Glykosylierungen auch an cytoplasmatischen und nucleären Proteinen gefunden. Vielfach wurden diese Befunde mit Hilfe pflanzlicher Lectine ermittelt. An so erhaltenen Ergebnissen wurde vielfach Kritik geübt, da einige Lectine (z.B. ConA) unter bestimmten Umständen auch Moleküle über unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen binden können. Hypothesen über „ungewöhnliche“ Glykosylierungsphänomene, gefunden durch Lectintests, sollten daher unbedingt durch strukturelle Analysen gestützt werden. Nichtsdestoweniger zeigten Lectin-Bindungsstudien u.a., dass GlcNAc-, Mannose- und Fucose-haltige Glykane im Cytoplasma und im Nucleus zahlreich vorkommen, zum Teil in Form komplexer Glykane.
Viele nucleäre und cytoplasmatische Proteine sind dynamisch modifiziert mit O-gekoppelten N-Acetylglucosaminresten an Serin oder Threonin, oft alternierend oder alternativ zu einer Phosphorylierung an diesen Aminosäuren (Comer & Hart, 2000). In einigen Fällen findet die Regulation der Proteinfunktion durch O-Phosphat oder O-GlcNAc reziprok an den selben Hydroxylresten statt. Studien an Casein Kinase II haben gezeigt, dass sich die glyokosylierte Form von der phosphorylierten unterscheidet, obwohl die Bindungsstellen nur wenige Aminosäuren voneinander entfernt sind. Diese Daten unterstützten die These, dass die Glykosylierung eine Phosphorylierung an benachbarter Stelle verhindern kann, vermutlich durch sterische Effekte oder Modulation der lokalen Proteinstruktur (Zachara & Hart, 2004).
Die verantwortlichen Enzyme für die O-GlcNAcylierung bzw. Deglykosylierung sind die O-GlcNAc-Transferase (OGT) und die ß-N-Acetylglucosaminidase (O-GlcNAcase). Beide Enzyme werden komplex reguliert und sowohl cytosolisch als auch nucleär lokalisiert (Kreppel et al., 1997; Wells et al., 2002). Inhibitionsstudien beider Enzyme haben gezeigt, dass die korrekte O-GlcNAc-Modifikation für eukaryontische Zellen essentiell ist (Fang et al., 1996). Auch in vielen humanen Krankheiten spielt O-GlcNAc eine wichtige Rolle: Das ß-Amyloid-Precursor-Protein welches ß-Amyloid Peptide bei Morbus Alzheimer verursacht, ist O-GlcNAc-modifiziert (Griffith et al., 1995). Das microtubuli-assoziierte Protein Tau, welches eine Hauptkomponente der neurofibrillären Cluster im Hirngewebe von Alzheimer-Patienten ist, ist in gesundem Gewebe mit O-GlcNAc modifiziert. Bei Alzheimer-Patienten ist es dagegen hyperphosphoryliert (Arnold et al., 1996; Alonso et al., 1996). Es wird ein kausaler Zusammenhang zwischen der Störung des Glucosestoffwechsels in alternden Neuronen und der Abnahme an O-GlcNAc-Modifikationen und dadurch verursachten neurodegenerativen Erkrankungen vermutet. Ebenso gibt es Hinweise auf einen Zusammenhang mit gestörter O-GlcNAcylierung und Krebs; viele Transkriptionsfaktoren und auch das Tumor-Supressor Protein p53 werden durch GlcNAc modifiziert (Shaw et al., 1996).
Das Proteasom ist in viele für die Zelle lebenswichtige Prozesse involviert und seine Aktivität wird über komplexe Mechanismen reguliert. Auch eine Phosphorylierung einiger proteasomaler Untereinheiten ist bekannt, so ist es durchaus wahrscheinlich, dass auch hier eine Regulierung der Aktivität durch O-GlcNAc-Modifikation stattfindet. Erste Hinweise darauf erhielten Zhang et al. (2003) in ihren Untersuchungen. Ebenso wahrscheinlich ist es, dass einzelne Untereinheiten des Proteasoms mit anderen Mono- oder Oligosacchariden assoziiert sind, da diese Form der Modifikation vielfache Möglichkeiten der Kontrolle der Proteasom-Assemblierung, der Bindung an andere Strukturen und der Lokalisation innerhalb der Zelle bietet. Die Stützung dieser Hypothese durch strukturelle Daten wird aber weiterhin schwierig sein, da die zur Verfügung stehenden Methoden begrenzt und oft für die sehr geringen Mengen an Kohlenhydraten nicht empfindlich genug sind. Außerdem sind die Bindungen der Zuckerreste oder die Zuckerreste selbst teilweise sehr instabil. In den Versuchen, in denen gereinigtes 20S Proteasom mit Neurminidase verdaut und danach an MiniQ in die Subtypen aufgetrennt wurde, war zu erkennen, dass es sich nur um minimale Veränderungen der Ladung handelt (Abb.27). Die Subtypen eluierten im selben Konzentrationsbereich des Salzgradienten, ihre Zahl blieb unverändert, lediglich die Mengenverteilung verschob sich etwas in Richtung der positiveren Oberflächenladung. Dem gegenüber steht die relativ starke Reaktion mit dem NANA-erkennenden Lectin TML, die in der 2D-PAGE fast das komplette Muster der 20S Proteasom-Untereinheiten zeigte (Abb.26). Ein Grund für diese Diskrepanz ist eventuell, dass für die Neuraminidase bei dem nativen Komplex nicht alle Neuraminsäure-Reste für die Abspaltung zugänglich waren. Die in der 2D-PAGE denaturierten Untereinheiten konnten dagegen mit dem Enzym komplett desialyliert werden, eine nachfolgende Inkubation mit dem Lectin ergab keine Reaktion mehr. Mit den anderen verwendeten deglykosylierenden Enzymen konnte weder eine Veränderung des Elutionsprofils, noch eine Entfernung der Lectinfärbung erreicht werden. Der Grund dafür können die Spezifitäten der Enzyme sein, die andere als die vorhandenen Bindungen und Sequenzen erkennen.
Tritrichomonas mobilensis ist ein Protozoon aus dem Darm von Totenkopfäffchen (Squirrel monkey). Das Tritrichomonas mobilensis Lectin formt multimere Komplexe mit dem Molekulargewicht 556 und 491 kDa. Es benötigt anders als die Pflanzenlectine keine bivalenten Kationen für die Reaktion mit Kohlenhydraten. TML ist hochglykosyliert mit ca. 20% Kohlenhydratanteil (Babal et al., 1994). Nach Inkubation mit Papain wurde eine Zunahme der Agglutinationsaktivität von TML beobachtet (Pindak et al., 1988). Es wird in der Literatur als hochspezifisch beschrieben (Babal et al., 1996 und 1999). Die sehr starke Reaktion mit den proteasomalen Untereinheiten in den 2D-PAGE-Analysen könnte der Tatsache geschuldet sein, dass das große multimere TML-Molekül eine starke Biotinylierung aufweist und somit auch stärker angefärbt wird.
Über die Funktion der Glykosylierung des Proteasoms kann bisher noch nicht viel gesagt werden. Erste Hinweise auf eine Auswirkung auf die Aktivität bei 26S Proteasom gibt es bereits. Zhang et al. (2003) fanden eine Hemmung der chymotryptischen Aktivität gegenüber Suc-LLVY-MCA von 26S Proteasom durch die OGT-vermittelte Glykosylierung mit GlcNAc, allerdings nicht bei 20S Proteasom.
Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. P.-M. Kloetzel für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Biochemie der Charite’ anzufertigen.
Bei Herrn Prof. Dr. B. Dahlmann möchte ich mich für die freundliche Aufnahme in der Arbeitsgruppe und für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit bedanken.
Ein herzliches Dankeschön an die Mitarbeiter der AG Kloetzel für die hilfreiche Unterstützung bei der Lösung zahlreicher Fragen und Probleme und für die sehr nette Arbeitsatmosphäre, besonders danke ich Annette Zoeger, Sybille Standera, Ilse Drung, Ulrike Kuckelkorn, Ulrike Seiffert, Michael Seeger.
Bei Burkhardt Dahlmann, Annette Zoeger und Astrid Borchert bedanke ich mich für das Korrekturlesen der Arbeit.
Für die Glykananalytik möchte ich mich bei Detlef Grunow und Martin Zimmermann-Kordmann vom Institut für Molekularbiologie und Biochemie, Charite’ Campus Benjamin Franklin, bedanken.
Der KKGS-Stiftung Berlin danke ich für die Gewährung des Promotionsstipendiums.
Ein besonderer Dank gilt meiner Familie und meinem Freund Andreas für den wichtigen seelisch-moralischen Rückhalt und die große Unterstützung bei der „Brutpflege“ meiner Töchter.
Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unerlaubte Hilfsmittel angefertigt habe.
Berlin, 19. Oktober 2004