Klassen, Irena: Thema: „METASTASEN BEI UNBEKANNTEM PRIMÄRTUMOR - VORSCHLAG EINES STATISTISCHEN VERFAHRENS ZUR IMMUNHISTOCHEMISCHEN DIFFERENZIERUNG HÄUFIGER ADENOKARZINOME “

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Immunhistochemie

3.1.1 Histologisches Untersuchungsmaterial

Aus dem Routineuntersuchungsmaterial des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik Charité der Jahre 1992-1998 gingen insgesamt 313 Paraffinblöcke von häufigen metastatischen nicht-muzinösen Adenokarzinomen in die vorliegende Arbeit ein. Die Primärtumoren waren bezüglich ihrer Lokalisation und der histologischen Klassifikation eindeutig bestimmt. Die Gruppe der untersuchten Präparate umfaßte die metastatischen Absiedlungen von 73 Mammakarzinomen, 37 Ovarialkarzinomen, 45 Lungenkarzinomen, 44 Nierenzellkarzinomen, 31 Pankreaskarzinomen, 42 Kolonkarzinomen, 41 Magenkarzinomen. Ganz überwiegend handelte es sich dabei um mäßig bis schlecht differenzierte Tumoren (166 G2-Tumoren, 143 G2-Tumoren) bis auf 4 gut differenzierte Tumoren. Die Geschlechtsverteilung war abgesehen von den häufig vertretenen Tumoren der weiblichen Geschlechtsorgane relativ ausgewogen für Kolon, Pankreas und Magen. Überwiegend männliche Patienten waren mit Nieren- und vor allem mit Lungenkarzinomen vertreten (Tab. 1). Die Patienten waren zwischen 26 und 95 Jahre alt. Ausgeschlossen wurden Tumoren, die mit immunhistochemischen Methoden im allgemeinen problemlos differenziert werden können, wie Prostata- oder Schilddrüsenkarzinome. Darüberhinaus beschränkten wir uns bei der Auswahl der Primärlokalisationen auf diejenigen, die am häufigsten als Tumoren unbekannten Ursprungs auftreten. So blieben beispielsweise Primärtumoren der Leber, Gallenwege oder Hoden- und Corpuskarzinome unberücksichtigt, die kaum im Rahmen eines CUP-Syndroms vorkommen. Feinnadel- bzw. sehr kleine Biopsien wurden ebenfalls nicht in die Untersuchung eingeschlossen.

Die Differenzierung von muzinösen und nicht-muzinösen Adenokarzinomen war vor allem deshalb notwendig, weil sich das immunhistochemische Verhalten von nicht-muzinösen und muzinösen (d.h. von serösen und endometrioiden) Ovarialkarzinomen grundsätzlich unterscheidet. Im vorliegenden Material durfte also keine prominente intrazytoplasmatische Schleimbildung in Form von Schleimvakuolen nachweisbar sein. Die Quantität der intraluminalen Schleimbildung (d.h. in größeren inter- oder intrazellulären Lumina) war dabei unerheblich. Darüberhinaus wurden auch alle Adenokarzinome ausgeschlossen mit einer interstitiellen Schleimablagerung von über 50% der gesamten Tumormasse.


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Tab. 1:Untersuchte Fälle

Sitz des

Anzahl

Differenzierungsgrad

Geschlecht

Primärtumors

 

G1

G2

G3

weiblich

männlich

Mamma

73

3

37

33

73

 

Ovar

37

 

13

24

37

 

Lunge

45

 

18

27

11

34

Niere

44

 

34

10

13

31

Pankreas

31

1

21

9

18

13

Kolon

42

 

36

6

24

18

Magen

41

 

7

34

23

18

Gesamtzahl

313

 

170

143

199

114

3.1.2 Allgemeine methodische Aspekte

3.1.2.1 Vorbehandlungen

Es wurden ausschließlich Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Präparate verwendet. Obwohl für die Erhaltung der Gewebsstrukturen eine Fixierung erforderlich ist, kann sie selbst für die Maskierung von Gewebsantigenen verantwortlich sein und zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Das heißt, es kommt zu Brückenbildungen zwischen reaktiven Endgruppen desselben Proteins oder benachbarter Proteine und damit zur Maskierung von Epitopen, den Angriffspunkten der Antikörper. Das Ausmaß der Maskierung wird unter anderem beeinflußt von der Fixierdauer, der Temperatur, der Konzentration der Fixierlösung und dem Vorhandensein benachbarter Proteine. Für den Nachweis zahlreicher Antigene ist daher eine Vorbehandlung erforderlich. Mit Hilfe von enzymatischen oder nichtenzymatischen Demaskierungsverfahren kann erreicht werden, dass die spezifische Antigenmarkierung verstärkt und die unspezifische Hintergrundanfärbung vermindert wird. Zu den enzymatischen Verfahren zum Aufbrechen der störenden Proteinbrücken zählen proteolytische Enzyme wie Trypsin, Pronase, Ficin etc.. Als nicht-enzymatische oder physikochemische Verfahren kommen die Schnellkochtopfmethode oder die Mikrowellenbehandlung zur Anwendung. Die Art des angewendeten Demaskierungsverfahrens (enzymatisch oder nicht-enzymatisch) hängt zum Teil vom Antigen ab. Es gibt Antikörper, die mit einem bestimmten Antigen nur nach Vorbehandlung reagieren und ausschließlich nach einer Methode, unabhängig von der Antigendichte im Gewebe. Nach CATTORETTI et al. (1993) können drei verschiedene Gruppen von Antigenen unterschieden werden:

Im vorliegenden Datenmaterial sind sowohl enzymatische als auch nicht-enzymatische Vorbehandlungen verwendet worden:

Tab. 2: Vorbehandlungen

Verwendete Tumormarker

Vorbehandlungen

GCDFP ( gross cystic disease fluid protein)

Pronase

CEA (carcinoembryonic antigen)

Schnellkochtopf

CK 20 (Zytokeratin 20)

Pronase

CK 7 (Zytokeratin 7)

Pronase

ER (Estrogenrezeptor)

Schnellkochtopf

Vimentin

Schnellkochtopf

Surfactant A

Schnellkochtopf

3.1.2.2 Immunhistochemische Detektionsverfahren

Die ursprünglich angewendete direkte Methode basiert auf der direkten Reaktion eines enzym-markierten Primär-Antikörpers mit einem Gewebsantigen und wurde später von der weit sensitiveren indirekten Methode abgelöst. Dabei wird ein unkonjugierter Primär-Antikörper an das Gewebsantigen gebunden, der wiederum mit einem enzymmarkierten Sekundär-Antikörper reagiert. Im Anschluß erfolgt an dieser Stelle die Umwandlung eines Substrats in ein Chromogen, das lichtmikroskopisch sichtbar wird.

Die für das vorliegende Datenmaterial angewendete LSAB-Methode (Labelled-Streptavidin-Biotin-Methode) beruht auf der starken Affinität des Streptavidins zum Vitamin Biotin. Streptavidin ist ein Glycoprotein, das aus dem Bacterium Streptomyces avidinii extrahiert wird. Es besteht aus vier identischen Untereinheiten, die jeweils über eine Biotin-Bindungsstelle verfügen. Nachdem die Bindung eines unkonjugierten Primär-Antikörpers an das Gewebsantigen erfolgt ist, wird eine Inkubation mit einem biotinylierten Sekundär-Antikörper vorgenommen. An diesen kann nun als 3. Schritt ein enzymmarkierter Streptavidinkomplex anbinden. Als Enzyme kommen Peroxidase oder die hier verwendete alkalische Phosphatase in Frage, die für die Farbreaktion bei der


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Umwandlung eines Substrates verantwortlich sind. Die alkalische Phosphatase zeichnet sich im Vergleich zur Peroxidase durch eine höhere Sensitivität aufgrund einer höheren Substrat-Umsatzrate aus. Bei der Anwendung muß allerdings das Problem der möglichen endogenen alkalischen Phosphatase-Aktivität berücksichtigt werden, die zuvor blockiert werden kann.

Abb. 1: LSAB- Methode ( Abb. nach Boenisch, 1983)

3.1.3 Untersuchte Tumormarker

3.1.3.1 Intermediärfilamente

Als Bestandteil des Cytoskeletts kommen Intermediärfilamente in nahezu allen Zellen von Wirbeltieren vor. Ihre Bezeichnung leitet sich von der Tatsache ab, dass sie mit ihrer Größe zwischen 7 und 11 nm zwischen den Mikrofilamenten (6nm) und den Microtubuli (25nm) oder, wenn vorhanden, den Myosinfilamenten (15 nm) liegen [OSBORN et al., 1983].

Es lassen sich 5 verschiedene Klassen von Intermediärfilamenten unterscheiden, die für bestimmte Gewebe typisch sind:

  1. Zytokeratine (epitheliale Zellen),
  2. Vimentin (mesenchymale Zellen),
  3. Desmin (Muskelzellen)
  4. Neurofilament (Neurone)
  5. Gliafilament (Gliazellen).

Da auch bei Malignomen entsprechend ihres Ursprungsgewebes Intermediärfilamente nachgewiesen werden können, besteht somit eine Möglichkeit zur Differenzierung. Allerdings können Tumorzellen auch gleichzeitig verschiedene Klassen von Intermediärfilamenten exprimieren.


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In der Regel findet man bei epithelialen Tumoren nur Zytokeratine vor, die komplexer aufgebaut sind als die übrigen Intermediärfilamente. Man unterscheidet 2 Gruppen von sauer und basisch reagierenden Zytokeratinen. Die Epithelzellen exprimieren eine bestimmte Auswahl von Keratinen, und zwar immer paarweise eine saure und eine basische Untereinheit, spezifisch für einen epithelialen Phänotyp. Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Komplexität eines Epithels und der Größe der Untereinheiten, die gebildet werden. Niedrigmolekulare Zytokeratine (40-54 kd) charakterisieren Zylinderepithel-typische, höhermolekulare (48-67 kd) dagegen Plattenepithel-typische Epithelien. Davon abgeleitete Neoplasmen verhalten sich meist entsprechend. Komplexe Epithelien wie im Respirationstrakt enthalten auch ein komplexes Muster von Zytokeratinen mit hohem und geringem Molekulargewicht. In den oberen Schichten von mehrschichtigen Plattenepithelien finden sich die Zytokeratine mit dem höchsten Molekulargewicht. In Abhängigkeit vom Profil der exprimierten Keratine besteht die Möglichkeit der weiteren Differenzierung epithelialer Tumoren, die auch bei wenig differenzierten Karzinomen oft erhalten bleibt. Die Expressionsmuster der Zytokeratine in normalen Epithelien, Tumoren und Zellkulturen sind von MOLL et al. (1982) katalogisiert worden.

In einigen bestimmten Tumorgruppen kommt bei der überwiegenden Zahl der Fälle eine Koexpression von Cytokeratin und Vimentin vor. Die fast regelmäßige Vimentinexpression bei solchen zytokeratin-positiven Tumoren könnte mit ihrer histogenetischen Nähe zum mesenchymalen Zellsystem zusammenhängen. Da dieses Phänomen nur bei einigen Tumortypen beobachtet wurde, kann es differentialdiagnostische Bedeutung erlangen [MOLL, 1986].

Im vorliegenden Datenmaterial sind die Zytokeratine CK 20, CK 7 sowie Vimentin verwendet worden, die im folgenden näher beschrieben werden.

CK 20 und CK

CK-20, ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 46 kd, kommt in einfachen Epithelien vor. Innerhalb der Gruppe der sauren Zytokeratine reagiert es am schwächsten sauer. CK-20 wird vor allem in den Epithelien des Darms, des Magens, im Urothel und in Merkel-Zellen vorgefunden. Es bildet eine Ausnahme in bezug auf die fehlende immunologische Kreuzreaktivität mit anderen sauer reagierenden oder Typ-I-Zytokeratinen. Auch monoklonale Antikörper gegen ein breites Spektrum von Zytokeratinen reagieren nicht mit CK-20. Daher wurde es möglich, verschiedene spezifische monoklonale Antikörper gegen dieses Protein zu entwickeln.

MOLL et al. haben 1992 in einer Studie gezeigt, dass CK-20 von einer klar definierten Anzahl von Primärtumoren und ihren Metastasen exprimiert wird. Die hohe Stabilität der Expression während der malignen Transformation läßt eine Nutzung als Malignitätsmarker nicht zu. Die Bedeutung liegt insbesondere in der Differenzierung von Metastasen mit unklarem Primärtumor. Ein positiver Nachweis von CK-20 innerhalb einer Adenokarzinommetastase läßt den Primärtumor im Kolon, Magen, biliären System oder Pankreas vermuten oder spricht für ein muzinöses Ovarialkarzinom. Gleichzeitig werden ein Adenokarzinom des Endometriums, der


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Niere, der Schilddrüse, der Speicheldrüsen und ein nichtmuzinöses Ovarialkarzinom ausgeschlossen. Die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen eines Mamma- oder Lungenkarzinoms ist dann sehr gering. Andererseits ist bei CK-20-negativem Adenokarzinom der Ursprung von Magen, Gallengängen oder Pankreas weniger wahrscheinlich, ein primäres Kolonkarzinom sehr unwahrscheinlich.

Der Nachweis von CK 7 läßt ebenfalls eine Differenzierung verschiedener Typen von Adenokarzinomen zu. Charakteristisch ist beispielsweise die fehlende Expression bei kolorekatalen- oder Leberzellkarzinomen. Nierenzellkarzinome, Prostatakarzinome und Karzinoide sind ebenfalls überwiegend CK7-negativ. Im Gegensatz dazu findet man ein positives Färbeergebnis normalerweise bei Adenokarzinomen der Lunge, des Pankreas, der Mamma, des weiblichen Genitaltrakts ebenso wie bei Urothelkarzinomen und Mesotheliomen [RAMAEKERS et al., 1990].

Vimentin

Vimentin ist ein singuläres Peptid mit einem Molekulargewicht von 57 kd. Es ist das wesentliche und gewöhnlich auch das einzige Intermediärfilament mesenchymaler Zellen, wie Fibroblasten, Endothelien, Makrophagen, und kommt auch in Melanocyten und Lymphocyten vor. Davon abgeleitet findet man Vimentin also in den meisten Sarkomen, Lymphomen und Melanomen vor.

Kennzeichnend ist die allgemein geringe Spezifität des Vimentins. Bei zahlreichen epithelialen Läsionen findet sich eine Co-Expression von Vimentin und Keratin (z.B. in Nierenzellkarzinomen, Schilddrüsen-, Endometrium-, Ovarial-, Lungen- oder Mammakarzinomen). Aus diesem Grund ist eine Anwendung monoklonaler Antikörper gegen Vimentin nur in Kombination mit anderen Markern sinnvoll [TRUE, 1990].

3.1.3.2 Weitere verwendete Tumormarker

CEA

CEA (carcinoembryonic antigen) ist das erste oncofetale Antigen, das 1965 von Gold und Freeman identifiziert und benannt wurde. Es handelt sich hierbei um ein vielfach glykosyliertes, hochmolekulares Glycoprotein. Es gewann seine größte Bedeutung in der klinischen Medizin als serologischer Indikator für das Wachstum des Kolonkarzinoms. Allerdings wurden später auch erhöhte CEA-Spiegel bei verschiedenen benignen entzündlichen Erkrankungen, bei Rauchern oder auch bei anderen Krebsleiden gefunden, so dass seine Rolle als Tumormarker im wesentlichen beschränkt bleibt auf die Verlaufskontrolle nach Tumorresektion, als möglicher Hinweis für ein Rezidiv bzw. metastatisches Wachstum [TRUE, 1990].

Das CEA verschiedener Karzinome erweist sich als heterogen bezüglich seiner physikochemischen und immunologischen Eigenschaften, so dass man nach Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern von einer CEA-Familie mit mindestens


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22 verschiedenen Molekülvarianten sprechen muß. Hinzu kommen CEA-ähnliche Substanzen, die in verschiedenen anderen Geweben exprimiert werden und zu Kreuzreaktionen führen können. Der Nachweis mittels polyklonaler Antikörper zeichnete sich daher durch eine mangelnde Spezifität aus. Die Identifizierung der relativ gewebsspezifischen CEA-Subtypen mit monoklonalen Antikörpern gegen 5 bekannte Epitope läßt eine bessere Differenzierung zu.

CEA kommt in verschiedenen normalen Geweben wie Kolonschleimhaut, Milz, Knochenmark und Lunge sowie vor allem in schleimbildenden Adenokarzinomen vor, aber auch bei Plattenepithel- und kleinzelligen Lungenkarzinomen sowie C-Zellkarzinomen der Schilddrüse. Zu den nicht-neoplastischen gastrointestinalen Epithelien, die gelegentlich oder konstant CEA-positiv sind, gehören besonders Magenschleimhautmetaplasien. Ebenso können auch die Epithelien der Pankreas- und Gallengänge CEA exprimieren, insbesondere bei papillären Ganghyperplasien [KLÖPPEL, 1986].

In der vorliegenden Arbeit wurden monoklonale Antikörper gegen den Subtyp CEA-1 verwendet. Diese zeigten in einer vorangegangenen Studie die besseren Ergebnisse im Vergleich zu den gleichfalls verwendeten monoklonalen Antikörpern gegen die Epitope 2 und 3, insbesondere eine höhere Sensitivität bezüglich gastrointestinaler Tumoren [KAUFMANN et al, 1996].

GCDFP

Das GCDF-Protein besteht aus verschiedenen Monomeren, die nach ihrem Molekulargewicht bezeichnet werden als GCDFP-15 (15 kd), GCDFP-24 (24 kd), GCDFP-44 und GCDFP-70 [HAAGENSEN et al., 1979]. Es wird exprimiert von Zellen mit apokrinen Eigenschaften wie z. B. von denen der Brustdrüse. Insbesondere monoklonale Antikörper gegen GCDFP-15 haben sich als hochspezifisch und sensitiv bei der Differenzierung von Mammakarzinomen und deren Metastasen erwiesen [WICK et al., 1989; MONTEAGUDO et al., 1990]. Auch bei wenig differenzierten Malignomen blieben die Markereigenschaften von GCDFP-15 weitgehend erhalten [MAZOUJIAN et al., 1983]. Nur in wenigen anderen Geweben konnte GCDFP bisher zum Teil auch nachgewiesen werden, in Speichel- und Tränendrüsen sowie in serösen Drüsen der Bronchialschleimhaut [MAZOUJIAN et al, 1983].

ER

Der Estrogenrezeptor (ER) gewinnt bei positivem Nachweis an malignen Tumoren besondere Bedeutung durch die mögliche Konsequenz einer Hormontherapie.

Bei dem Rezeptorprotein handelt es sich um ein Dimer bestehend aus zwei Untereinheiten mit jeweils 65 kd Molekulargewicht mit Lokalisation im Zellkern. Die darauf befindlichen Bindungsstellen für Estradiol und DNA sind ausreichend weit entfernt vom Epitop für den Antikörper, so dass die Antigenität nicht von der Bindung eines Liganden oder von Chromatin beeinflußt wird.


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Estrogenrezeptoren werden in der Brustdrüse sowie im Bereich des weiblichen Genitaltraktes exprimiert. Sie steuern hier auch die Expression der Progesteronrezeptoren. Während die Rezeptoraktivität der Mamma unabhängig von Zyklus oder Menopause ist, bestehen im Endometrium bei überwiegender Progesteronrezeptoraktivität deutliche zyklusabhängige Schwankungen. Im Ovar gibt es normalerweise nur wenige Estrogenrezeptoren, dagegen findet man in malignen Ovarialtumoren oft eine stark erhöhte Rezeptoraktivität [TRUE, 1990].

Da der Progesteronrezeptor aufgrund seiner Estrogenabhängigkeit und der relativ inkonstanten Expression nur von untergeordneter Bedeutung bei der Differenzierung von metastasierenden Mamma- oder Ovarialkarzinomen ist, wurde hier auf dessen Nachweis verzichtet.

Surfactant A

Surfactant oder auch Antiatelektasefaktor wird ausschließlich in der Lunge von den kubischen Alveolarepithelzellen (Pneumocyten Typ II) produziert und dient hier zur Verminderung der Oberflächenspannung der Alveolen, um deren expiratorischen Kollaps zu verhindern. Es handelt sich um ein Stoffgemisch, das neben Lipiden und Kohlenhydraten auch eine Gruppe heterogener Proteine im Bereich von 5-70 kd beinhaltet. Gegen eine Reihe dieser Apoproteine wurden monoklonale Antikörper entwickelt zur Differenzierung primärer und sekundärer Lungentumoren bzw. zur Abgrenzung von pulmonalen gegenüber anderen Metastasen. Der relativ neue monoklonale Antikörper PE-10 gegen humane Surfactant-Apoproteine erwies sich als hochspezifisch bei der Differenzierung von primären Adenokarzinomen der Lunge. Plattenepithelkarzinome sind dagegen Surfactant-negativ [MIZUTANI et al., 1988; SHIMOSATO et al., 1992].

3.1.3.3 Begriffe: Markerkombination, Markerspektrum, Markerprofil

Der Begriff Markerkombination wird in der vorliegenden Arbeit im Sinne einer bewußten Auswahl von Tumormarkern zum Zwecke einer immunhistochemischen Untersuchung verwendet. Die Gesamtheit der Färbeergebnisse dieser Untersuchung ergibt das Markerspektrum. Unter Markerprofil wird hier das charakteristische Markerspektrum einer Tumorart verstanden.


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3.1.4 Verwendete primäre Antikörper

In der nachfolgenden Tabelle (Tab. 3) sind alle verwendeten primären Antikörper mit Angabe der entsprechenden Klone, der Hersteller sowie der verwendeten Verdünnung zusammengefaßt.

Tab. 3: Überblick über die verwendeten Antikörper

Antikörper

Klon

Hersteller

Verdünnung

CEA-1

II-7

DAKO, Hamburg

1:50

CK 7

OV-TL 12/30

DAKO

1:50

CK 20

Ks 20.8

DAKO

1:20

GCDFP-15

D6

Signet

1:40

Estrogenrezeptor

6F11

Novocastra, Newcastle u. Tyne

1:50

Surfactant A

PE10

DAKO, Japan

1:50

Vimentin

V 9

DAKO, Hamburg

1:50

3.1.5 Ablauf der immunhistochemischen Detektion

Die gründlich entparaffinierten und rehydrierten 3-5µm dicken Schnitte wurden entsprechend der zu untersuchenden Marker vorbehandelt (Schnellkochtopf, Pronase). Die Vorbehandlung mit Pronase erfolgte in Form von 0,1%iger Pronase E (Merck, Darmstadt) für 10 min (CK7) bzw. für 20min. (CK20) bei Raumtemperatur in PBS. Bei der Schnellkochtopf-Methode wurden die Schnitte in Citratpufferlösung bei einem pH-Wert von 6,0 über 5 min gekocht mit anschließender Kühlung im Wasserbad. Nach ausgiebiger Spülung mit TBS-Puffer wurden die Schnitte mit 10%igem normalem Ziegenserum blockiert und anschließend mit den primären Antikörpern (verdünnt in TBS mit 1%igem Bovinem Serumalbumin) in der feuchten Kammer für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Spülung mit TBS erfolgte die Inkubation mit den sekundären biotinylierten Antikörpern und anschließend mit dem Streptavidin-alkalische-Phophatase-Komplex.. Die Farbreaktion wurde erreicht durch die Immersion der Schnitte für 10 min in einer Lösung von Fast Red TR/Naphthol AS-MX Phosphat mit 0,15 mg/ml Levamisol aus gebrauchsfertigen Tabletten. Nach der Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer wurden die Schnitte mit Glycerolgelatine eingedeckt [KAUFMANN et al., 1996].


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3.1.6 Interpretation der Gewebsreaktion

Bei der Auswertung der Färbeergebnisse (Leitz Labor Lux S-Mikroskop der Firma Leica) wurden zunächst die in der folgenden Tabelle dargestellten 4 Differenzierungsstufen festgelegt:

Tab. 4: Interpretation der Gewebsreaktion

Stufe

Anteil der angefärbten Tumorzellen

Ergebnis

0

keine Anfärbung

Negativ

1

0-10%

Schwach positiv

2

10-50%

Positiv

3

>50%

stark positiv

Unterschieden wurde weiterhin zwischen diffuser und heterogener Anfärbung. Dokumentiert wurde dieser Befund in Form einer zweiten, zusätzlichen Ziffer, 1= heterogen und 2= diffus. Ein positiver Nachweis von Östrogenrezeptoren bezog sich dabei auf eine positive Kernreaktion.

Zur Vereinfachung des statistischen Verfahrens mußte diese Differenzierung weiterhin auf die Entscheidung „positiv“ oder „negativ“ ohne die zuvor genannten Abstufungen reduziert werden. Grundsätzlich wurde eine Anfärbung von mehr als 10% der Tumorzellen (Schätzwert) als sicher positives Ergebnis gewertet (Stufe 2 und 3 in Tab.4), unter 10% entsprechend als (eher) negatives Ergebnis (Stufe 0 und 1 in Tab.4).


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3.2 Verfahren zur Klassifikation von Tumormarkerspektren

3.2.1 Einordnung des Klassifikationsverfahrens

Bei der statistischen Klassifikation geht es um Verfahren, die auf der Grundlage von Merkmalen Objekten Klassen zuordnen. Prinzipiell unterscheidet man zwischen

Verfahren.

Bei den überwachten Verfahren liegt die Klassendefinition fest. Das bedeutet, dass man einerseits weiß, wieviele Klassen existieren und andererseits prinzipiell eine Möglichkeit hat, für ein Objekt zu entscheiden, welcher Klasse es zuzuordnen ist. Man hat die Möglichkeit, eine Lernstichprobe aufzunehmen, bei der für jedes Objekt die Ausprägung seiner Merkmale und die Klassenzugehörigkeit bekannt sind. Es gilt nun einen Klassifikationsalgorithmus (Klassifikator genannt) abzuleiten, der für weitere Objekte diese Zuordnung mit möglichst hoher Sicherheit vornimmt. Mit einer von der Lernstichprobe unabhängigen Teststichprobe kann dann die Wahrscheinlichkeit der Richtigkeit einer Zuordnung mit einem Klassifikator geschätzt werden. Diese Zuordnungswahrscheinlichkeit nennt man Klassifikationsgüte. Beispiele für die überwachte Klassifikation sind Schriftzeichenerkennung, Texturerkennung, Malignitätsgrading auf der Grundlage histologischer Merkmale.

Bei der unüberwachten Klassifikation weiß man vorher nicht, wieviele Klassen existieren und wodurch sie charakterisiert sind. Bei der unüberwachten nummerischen Klassifikation (Merkmale liegen in Zahlenform vor) geht man von der Hypothese aus, dass Objekte ein und derselben Klasse im Merkmalsraum enger zusammen liegen (geringere euklidische Abstände voneinander haben) als Objekte unterschiedlicher Klassen. Deshalb sucht man nach Punktclustern im Merkmalsraum und versucht diesen eine Bedeutung zuzuordnen. Beispiele dafür sind die Zuordnung von Texturen in Satellitenbildern zu Feldern und deren Reifegrad oder die Bestimmung des Motilitätsgrades von Zellen auf der Grundlage von morphometrischer Bewegungsanalyse.

Bei der Klassifikation von Markerspektren handelt es sich um eine überwachte Klassifikation. Als Besonderheit ist festzuhalten, dass jedes Merkmal nur drei Ausprägungen haben kann (0 - negativ, 1- positiv, 2- unbekannt).

Damit ergibt sich bei einer endlichen Anzahl n von Merkmalen auch ein endliches Spektrum von möglichen Merkmalsausprägungen, nämlich . Die Probleme bei der


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Zuordnung eines realen Falles anhand seines Markerspektrums bestehen insbesondere darin, dass

Aufgrund dieser Randbedingungen wurde ein spezielles Klassifikationsprinzip entwickelt, das im folgenden Abschnitt vorgestellt wird.

3.2.2 Klassifikationsprinzip

3.2.2.1 Allgemeiner Ablauf der Klassifikation

Im n-dimensionalen Merkmalsraum gibt es exakt mögliche Merkmalsausprägungen, im folgenden Knoten genannt. Bei zwei Merkmalen sind dies die Kombinationen: 0-0, 0-1, 0-2, 1-0, 1-1, 1-2, 2-0, 2-1 und 2-2. Aufgrund der Lernstichprobe kennen wir in jedem Knoten j (0 le j le -1) die genaue Anzahl der Fälle einer Klasse k. Wenn nun ein unbekannter Fall x klassifiziert werden soll, so sehen wir uns den Knoten an, der seiner Merkmalsausprägung entspricht. Anhand der Klassenverteilung in diesem Knoten wird eine Zuordnungsentscheidung getroffen. Eine Zuordnungsentscheidung wird nur dann getroffen, wenn die Zuordnungswahrscheinlichkeit in diesem Knoten über 50% liegt. Ist dies nicht der Fall oder sind für den betrachteten Knoten gar keine Fälle in der Lernstichprobe enthalten, so wird das Merkmal mit der geringsten Diskriminationsfähigkeit ermittelt, weggelassen und die Zuordnung erneut versucht. Als Merkmal mit der geringsten Diskriminationsfähigkeit wird dasjenige bestimmt, bei dessen Weglassen sich die Gesamtgüte des Klassifikators auf Basis der Lernstichprobe am wenigsten verringert.

Praktisch führt das Weglassen eines Merkmals zu einer Abbildung der Knoten eines m-dimensionalen Merkmalsraumes auf die eines m-1-dimensionalen Merkmalsraumes. Im oben angegebenen Beispiel führt etwa das Weglassen des zweiten Merkmals zu folgender Addition der Werte (Fallanzahlen) in den Knoten: 0-0 + 0-1 + 0-2 =0, 1-0 + 1-1 + 1-2 = 1, 2-0 + 2-1 + 2-2 = 2. Damit werden die ursprünglich 9 Knoten auf 3 abgebildet. In den verbleibenden 3 Knoten ist dann die Gesamtzahl der Objekte der Lernstichprobe enthalten. Durch die Verdichtung kann die Wahrscheinlichkeit, eine Zuordnung treffen zu können, ansteigen.

Das Verfahren des Weglassens wird so lange sukzessiv angewendet, bis eine Zuordnungsentscheidung getroffen werden kann, bzw. kein Merkmal mehr weggelasen werden kann. Die Zuordnungswahrscheinlichkeit ergibt sich dann aus dem Verhältnis der Objekte der betrachteten Klassen im Knoten. Die Zuordnungswahrscheinlichkeit ist jedoch nicht der nummerische Anteilswert der Klasse, sondern der Erwartungswert der a-posteriori-Verteilung, die unter Annahme der Gleichwahrscheinlichkeit als a-priori-


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Verteilung bestimmt wurde [Formel (2), siehe HUFNAGL, VOSS 1985]. Durch diese direkte Güteschätzung entfällt die Unterteilung in Lernstichprobe und Teststichprobe.

3.2.2.2 Bezeichnungen

n

Anzahl der Merkmale.

Menge der möglichen Merkmalskombinationen, Knotengenannt

m

Anzahl der Klassen

Menge der möglichen Klassen


Zuordnungsmatrix, Repräsentation der Lernstichprobe mit

Anzahl der Fälle der Klasse k (0 le k le m-1), die die Merkmalskombinationen „j“ besitzen

Merkmalskombination des Falls x, wobei .

Hierbei bedeutet dass der Marker negativ ist, dass der Marker positiv ist und dass der Marker nicht bestimmt worden oder das Ergebnis nicht eindeutig ist

Jeder Merkmalsausprägung (Markerspektrum) x entspricht ein Knoten j aus dem Merkmalsraum N aller Knoten, der sich nach der folgenden Formel (1) bestimmen läßt:

mit

(1)


31

Ist ein neuer Fall mit der Merkmalsausprägung x1 zu klassifizieren, so wird der dem Markerspektrum des Falles entsprechende Knoten j(x1) = b<U>x</U><sub>1</sub> betrachtet. Die Zuordnungswahrscheinlichkeit pkj des Knotens j zu einer Klasse k läßt sich mit der folgenden Formel bestimmen:

(2)

Dies ist der Erwartungswert der a-posteriori-Verteilung für die Klasse k unter der Voraussetzung, dass als a-priori-Verteilung die Gleichverteilung aller Klassen angenommen wird [HUFNAGL, VOSS 1985]. Ein Fall wird genau der Klasse k zugeordnet, für die dieser Erwartungswert maximal wird:

(3)

Eine Klassifikationsentscheidung wird jedoch nur dann getroffen, wenn dieser Erwartungswert

ist. Diese Wahrscheinlichkeiten können direkt aus der Zuordnungstabelle der Lernstichprobe bestimmt werden. Im Verlauf des Klassifikationsprozesses wird versucht, diese Zuordnungwahrscheinlichkeit zu erhöhen. Das hier verwendete Verfahren nutzt dazu die Merkmalsselektion im Kontext der in Frage kommenden Klassen. Aus medizinischen Gründen kommt oft nur eine Teilmenge Ms aller Primärtumoren M in Frage:

(4)

Um den Klassifikator schrittweise zu verbessern wird jeweils das schlechteste Merkmal weggelassen. Als schlechtestes Merkmal bezeichnen wir das Merkmal, welches bei Wegfall zum geringsten Gesamtgüteverlust des Klassifikators bezüglich der relevanten Klassen Ms führt. Wir müssen deshalb die Formeln (2) und (3) auf Ms einschränken:

mit

(5)

(6)


32

Die Gesamtgüte G berechnet sich dann wie folgt

(7)

Läßt man nun ein Merkmal l der n Merkmale weg, so reduziert sich die Anzahl der Knoten auf 1/3 und die Güteberechnung erfolgt nur noch über diese Knoten. Wir nennen diese Güte . Die „1“ steht dabei für das Weglassen des ersten Merkmals. Das für die Auftrennung der Klassen am wenigsten beitragende Merkmal lmin ergibt sich als

(8)

Mit dieser Art der Merkmalsselektion wird solange fortgefahren, bis nur noch ein Merkmal vorhanden ist. Unter den so gewonnenen Entscheidungen wird die mit der höchsten Wahrscheinlichkeit ausgewählt.

Für diesen Erwartungswert läßt sich auch ein Konfidenzintervall angeben. Es wird dadurch berechnet, dass man die a-posteriori-Verteilung über die Zuordnungswahrscheinlichkeit

(9)

über die Intervalle [0,t1] und [t2,1] so integriert, dass sich jeweils alpha/2 ergibt. Das Intervall [t1,t2] ist dann das Konfidenzintervall zur Irrtumswahrscheinlichkeit alpha.

Programm zur Klassifikation von TumormarkerspektrennDas Programm TMB (Tumor Marker Berater) dient der systematischen Analyse von Tumormarkerkombinationen und besteht in der vorliegenden Form aus zwei Teilen. Im ersten Teil werden die vorhandenen Färbeergebnisse als Lernstichprobe eingelesen. Im zweiten Teil wird für ein konkretes Tumormarkerspektrum eine Zuordnungsentscheidung für das jeweilige Primärorgan getroffen. Die hier verwendete Lernstichprobe ist aufgrund laborspezifischer Besonderheiten nur bedingt übertragbar. Entspechend der Zielsetzung und der bereits vorhandenen immunhistologischen Untersuchungsergebnisse können jedoch laboreigene Lernstichproben eingelesen werden, die dann die Grundlage für die zu ermittelnden Zuordnungswahrscheinlichkeiten bilden.


33

3.2.2.3 Einlesen der Daten

Die gesamten zu verwendenden Ergebnisse eines Labors sollen in Form einer Datei vorliegen. Das Programm TMB kann die Daten in Tabellenform importieren. Es werden die Formate von DBase und MS-Excel unterstützt. Die Tumormarkerbezeichnungen werden aus dem Tabellenkopf entnommen. Per Dialog können unerwünschte Spalten ausgeblendet werden. Über einen weiteren Dialog wird die Primärorgan-Spalte ausgewählt. Die gewählten Spalten werden nun eingelesen. Jede in diesen Spalten enthaltene Merkmalsausprägung wird in die Liste der möglichen Tumormarker-Werte aufgenommen.

Die eingelesenen Bezeichnungen sowohl für die Tumormarker selbst (Tabellenkopf), als auch für die Marker-Zustände können noch bearbeitet werden. Möglich ist sowohl ein einfaches Umbenennen einzelner Spalten/Zustände als auch das Zusammenlegen mehrerer Spalten/Zustände. So kann etwa "Spalte1: 00" umbenannt werden in "Marker X" und die Zustände "00","10" und "11" können dem Zustand "negativ" zugeordnet werden. Dies ist z.B. notwendig, wenn für die Marker nicht nur die Färbeergebnisse positiv, negativ und unbestimmt registriert wurden, sondern ein Score bestimmt wurde, der jetzt mit bestimmten Schwellen zugeordnet werden muß. Durch dieses spezifische Einlesen der Daten entsteht eine konkrete Lernstichprobe. (Diese weicht in der Regel von der Primärdatei ab und kann in eine Datei geschrieben und von dort auch wieder eingelesen werden. So kann man unterschiedliche Interpretationen der Tumormarkerkombinationen und Scores gegeneinander testen.)

3.2.2.4 Berechnung der Zuordnungswahrscheinlichkeiten für eine vorgegebene Tumormarkerkombination

Nach dem Einlesen der Daten sind im linken Teil des Programmfensters die bekannten Tumormarker mit ihren möglichen Zuständen tabellarisch aufgelistet. Pro Marker kann der jeweilige Zustand ausgewählt werden, die Voreinstellung ist "Marker undefiniert" für alle Marker.

Liegt weiteres Vorwissen zum untersuchten Fall vor, so kann über den Organauswahl-Dialog die Menge der in Frage kommenden Organe (Klassen) eingeschränkt werden.

Als weitere Option ist in der Menüleiste die Berechnung von Vertrauensintervallen vorgesehen. Standardmäßig berechnet das Programm die sogenannte Punktschätzung (Erwartungswert der a-posteriori-Verteilung) für die Klassenzugehörigkeiten (Primärorgan-Zuordnungswahrscheinlichkeit). Die a-posteriori-Verteilung ist eine Binomialverteilung. Neben der Punktschätzung, die den wahrscheinlichsten Wert liefert, ist es sinnvoll durch ein Konfidenzintervall die Zuverlässigkeit der Schätzung zu bestimmen. Das Konfidenzintervall (Vertrauensintervall [t1,t2]) kann zu einer vorgegebenen Irrtumswahrscheinlichkeit p berechnet werden. Wenn etwa p=0.05 angenommen wird, so liegt der wahre Wert mit 95%-iger Wahrscheinlichkeit innerhalb


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des Vertrauensintervalls. Das Vertrauensintervall wird um so schmaler, je mehr Fälle für die Berechnung zur Verfügung stehen. Anhand der Vertrauensintervalle kann die Sicherheit der statistischen Aussage abgeschätzt werden.

3.2.2.5 Einbeziehung von a-priori-Wahrscheinlichkeiten

Aus verschiedenen Gründen können die jeweiligen Anteile der verschiedenen Tumoren in der Stichprobe stark variieren. Allein aus dieser Häufigkeit heraus könnten dann Zuordnungen getroffen werden. Sind etwa 95% aller Fälle einer Tumorart zuzuordnen, so wird diese Tumorart mit 95% Wahrscheinlichkeit völlig unabhängig vom Marker-Spektrum ausgewählt. Um die Lernstichprobe bezüglich der Häufigkeit der Tumorarten annähernd homogen zu gestalten, besteht die Möglichkeit ausgleichende Gewichte einzuführen. Die in dieser Arbeit verwendete Stichprobe enthält beispielsweise überdurchschnittlich viele Fälle von Mammakarzinommetastasen (ca 43%), während z.B. die Primärlokalisation im Pankreas eher selten ist (ca 6%). Das führt zu der statistischen Aussage, dass bei einem vorliegenden unbekannten Fall bereits ohne Berücksichtigung der Färbeergebnissen ein primäres Mammakazinom siebenmal wahrscheinlicher als ein Pankreaskarzinom ist. Diese Aussage wäre durchaus sinnvoll, wenn die Stichprobe der tatsächlichen Inzidenz der Tumoren entsprechen würde, nicht jedoch, wenn die Häufigkeit aus einer bestimmten Spezialisierung des Untersuchers resultiert. Für diesen Fall ist es angemessener von gleichverteilten a-priori-Wahrscheinlichkeiten auszugehen, indem hier Pankreaskarzinom-Fälle höher gewichtet werden als Mammakarzinom-Fälle, so dass a priori alle Primärorgane annähernd gleich wahrscheinlich vorkämen. Wegen der zu Grunde gelegten Binomialverteilung sind nur ganzzahlige Gewichte sinnvoll, die vom Programm automatisch berechnet werden. Sie sind aktiv, wenn in der Menüleiste die Option "Gewichte" aktiviert ist. Per Dialog können die vom Programm berechneten Gewichte manuell korrigiert werden, so dass sie bei Vorliegen bekannter a-priori-Wahrscheinlichkeiten für die jeweiligen Primärorgane angepaßt werden können.

3.2.2.6 Ergebnisausgabe und Interpretation

Nach Eingabe der bekannten Markerzustände (positiv, negativ oder nicht definiert), wobei die Betrachtung des Färbeergebnisses eines einzelnen Tumormarkers als auch der kompletten Kombination möglich ist, und nach Aktivierung des Feldes Berechnen! erscheinen im Ergebnisfeld die ermittelten Wahrscheinlichkeitsreihen. Dabei wird die höchstmögliche Wahrscheinlichkeit in der ersten Reihe angezeigt unter Angabe des Primärorgans und der hierfür entscheidenden Tumormarkerzustände. Daneben kann nach entsprechender Aufforderung das oben beschriebene Konfidenzintervall berechnet werden. Von einer ausreichend hohen Zuordnungswahrscheinlichkeit wird bei erreichten Werten über 90% ausgegangen.


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In der folgenden Abbildung 2 wird beispielhaft die Zuordnungswahrscheinlichkeit für den hochspezifischen Marker GCDFP-15 berechnet.

Abb. 2: Tumormarkerberater , GCDFP positiv


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Im nächsten Beispiel wird ein komplexes Tumormarkerspektrum gezeigt, dass spezifisch ist für ein primäres Kolonkarzinom mit einer Zuordnungswahrscheinlichkeit von 96%.

Abb. 3: Tumormarkerberater, typisches Kolonkarzinommuster

3.3 Erfassung klinisch-epidemiologischer Daten zur Vorhersagewahrscheinlichkeit des Primärtumors
beim CUP-Syndrom

Es wurden aus Autopsiestudien der letzten 25 Jahre, die sich mit dem CUP-Syndrom befaßt haben, Daten über die Häufigkeit der letztlich im weiteren klinischen Verlauf oder autoptisch gesicherten Primärtumoren [NYSTROM et al. 1977; STEWART et al. 1979; DIDOLKAR et al. 1977; OSTEEN et al. 1977; JORDAN, SHILDT 1985; HAMILTON et al. 1986] sowie über die Häufigkeit der metastatischen Erstmanifestationen erfaßt und gegenübergestellt [LE CHEVALIER et al, 1988; HOLMES, FOUTS 1970; SNEE, VYRAMUTHU 1985, NYSTROM et al. 1977].

Zum Vergleich wurden die Angaben zum Inzidenzmuster der häufigsten Tumoren dem regionalen Krebsregister entnommen. Zusätzlich fanden Daten zum haematogenen Metastasierungsverhalten von Tumoren aus großen Autopsiestudien Verwendung [NOLTENIUS 1987; WILLIS 1973].


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