Dobrava and Tula hantaviruses from Central Europe: molecular evolution and pathogenic relevance

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologe Boris Klempa
geboren am 5. Dezember 1976 in Malacky, Slowakei

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Detlev H. Krüger
2. Prof. Dr. Gholamreza Darai
3. Dr. habil. Milan Labuda, DSc.

Tag der mündlichen Prüfung: 09. Dezember 2004

SUMMARY

Hantaviruses are rodent-borne bunyaviruses that cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Eurasia and hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS) in the Americas. The viruses form a genus Hantavirus within the Bunyaviridae family. They are negative-strand RNA viruses with a genome consisting of three different segments, S, M, and L. Hantaviruses belong to the group of “emerging viruses” exhibiting an increasing significance as human pathogens. To cause human disease, the viruses have to be transmitted from their respective hosts to men.

There is an urgent need to acquire substantial knowledge about the epidemiology, molecular evolution and clinical relevance of hantaviruses circulating in Central Europe. This thesis presents novel data about two European hantaviruses, Dobrava virus (DOBV) and Tula virus (TULV).

DOBV is an important etiologic agent of HFRS in Europe. DOBV strains were found to be hosted by at least two different rodent species, yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and striped field mouse (A. agrarius). According to their natural hosts they form the distinct genetic lineages DOBV-Af and DOBV-Aa, respectively. We have determined and analysed the complete S and M, and partial L segment nucleotide sequences of sympatrically occurring DOBV-Af and DOBV-Aa strains from Central Europe. Molecular phylogenetic analyses gave evidence for genetic reassortment in the evolution of the virus species. It will be important to see whether such reassortment processes (similar to the situation in influenza viruses which carry segmented genomes, too) can change the virulence of hantaviruses towards humans.

Whereas for virus strains of the DOBV-Af lineage their pathogenic potential towards humans was known from studies on the Balkans, such evidence was still missing for the newly discovered DOBV-Aa lineage in Central Europe. We were able to amplify a DOBV-Aa nucleotide sequence from a DOBV-seropositive HFRS patient in Central Europe. This is the first molecular identification of human infection by DOBV in Central Europe and the first direct proof that a virus strain related to the DOBV-Aa lineage, carried by A. agrarius rodents, is able to cause HFRS.

For future studies on the virus-host interactions of DOBV-Aa, it was important to isolate a viable virus strain. This urgency was underlined by the fact that the Central European DOBV-Aa strains were shown to be only distantly related to the existing DOBV cell culture isolates from Estonia, Slovenia and Greece. Therefore, under biosafety level 3 conditions, we have established a DOBV isolate named Slovakia (SK/Aa) from an A . agrarius animal captured in Slovakia. SK/Aa, as the only isolate clearly belonging to the DOBV-Aa lineage, can be taken as the representative of this virus lineage. The new virus isolate, in comparison to a DOBV-Af strain, was used for serotyping neutralising antibodies of HFRS patients in Central Europe by the use of a focus reduction neutralisation assay. Most patients' sera exhibited a higher end-point titer towards SK/Aa suggesting that DOBV-Aa strains are responsible for most of the DOBV HFRS cases in this region.

TULV is carried by European common voles (Microtus sp.). Its pathogenic potential for humans was rather unknown. We have described the first case of HFRS which can be associated with TULV infection. Moreover, TULV strains detected in M. arvalis near the home village of the patient in North-East Germany clustered with strains from Poland and represent a new, well-supported genetic lineage within the TULV species. In addition to DOBV and longer known Puumala virus, TULV is most likely an additional causative agent of HFRS in Central Europe.

ZUSAMMENFASSUNG

Hantaviren sind Erreger, die von Nagetieren auf den Menschen übertragen werden. In Europa und Asien vorkommende Hantaviren lösen Hämorrhagische Fieber mit Renalem Syndrom (HFRS) aus, in den Amerikas zirkulierende Viren das Hantavirus Cardiopulmonale Syndrom. Die Viren bilden ein eigenes Genus Hantavirus innerhalb der Familie Bunyaviridae. Sie sind Negativstrang-RNA Viren, deren Genom aus drei Segmenten (S, M, L) besteht. Hantaviren gehören zur Gruppe der „emerging viruses“, die durch eine zunehmende Bedeutung als allgemeingefährliche Humanpathogene gekennzeichnet sind. Die einzelnen Virusspecies sind mit unterschiedlichen Nager-Wirtsspecies assoziiert und werden von diesen auf den Menschen übertragen, der einen Fehlwirt darstellt.

Es besteht die dringende Notwendigkeit, neue, grundsätzliche Erkenntnisse zur Epidemiologie, molekularen Evolution und klinischen Relevanz der in Mitteleuropa zirkulierenden Hantaviren zu gewinnen. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet derartige Ergebnisse zu zwei europäischen Hantaviren, dem Dobravavirus (DOBV) und dem Tulavirus (TULV).

DOBV ist ein wichtiger HFRS-Erreger in Europa. DOBV Stämme kommen in mindestens zwei verschiedenen Nagerspecies, der Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis) und der Brandmaus (Apodemus agrarius) vor. In Übereinstimmung mit diesen unterschiedlichen natürlichen Wirten konnten wir zeigen, dass die Virusstämme zwei genetische Linien innerhalb der DOBV Species bilden: DOBV-Af und DOBV-Aa. Es wurden die vollständigen Nukleotidsequenzen der S- und M-Segmente sowie partielle Sequenzen der L-Segmente von sympatrisch vorkommenden DOBV-Af und DOBV-Aa Stämmen aus Mitteleuropa bestimmt und für molekularphylogenetische Analysen genutzt. Die Analysen zeigten das Vorkommen von Reassortmentprozessen der Genomsegmente während der Evolution der Virusspecies. Für Influenzaviren (die ebenfalls segmentierte Genome besitzen) ist bekannt, dass Reassortment die wichtigste genetische Grundlage für Veränderungen der Pathogenität der Viren ist. Unsere Ergebnisse schaffen nun die Voraussetzung, diese Prozesse ebenfalls für die Hantaviren zu untersuchen.

Während für Infektionen mit Virusstämmen der DOBV-Af Linie in Südosteuropa das Auftreten von mittelschwerem und schwerem HFRS beschrieben wurde, gab es bisher keinen Beweis für die Humanpathogenität der neu entdeckten DOBV-Aa Stämme. Es konnte nun die virale Nukleotidsequenz aus einem DOBV-seropositiven HFRS-Patienten in Mitteleuropa amplifiziert und analysiert werden. Damit wurde erstmalig der molekulare Beweis erbracht, dass DOBV in Mitteleuropa HFRS auslöst und dass die DOBV-Aa Linie aus Apodemus agrarius humanpathogen ist.

Für weitere Forschungen zu den Virus-Wirt-Interaktionen von DOBV-Aa ist das Vorhandensein eines vermehrungsfähigen DOBV-Aa Virusisolates die entscheidende Voraussetzung. Diese Notwendigkeit wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die mitteleuropäischen DOBV-Aa Stämme mit den existierenden DOBV Isolaten aus Slowenien, Griechenland und Estland nur relativ entfernt verwandt sind. Unter Laborbedingungen der Sicherheitsstufe 3 wurde aus einer in der Slowakei gefangenen Apodemus agrarius Maus ein neues Virusisolat gewonnen, welches „Slovakia (SK/Aa)“ genannt wurde. SK/Aa ist das bisher einzige Virusisolat, das die DOBV-Aa Linie repräsentiert. Es wurde gemeinsam mit einem Isolat der DOBV-Af Linie zur vergleichenden Typisierung der Antikörper von mitteleuropäischen HFRS-Patienten mittels Fokusreduktionsneutralisationstest eingesetzt. Die Seren der meisten Patienten zeigten die höchsten neutralisierenden Antikörpertiter gegenüber SK/Aa, was die Schlussfolgerung zulässt, dass DOBV-Aa Stämme für die meisten DOBV-Infektionen in Mitteleuropa verantwortlich sind.

TULV wird durch die Feldmaus (Microtus arvalis) beherbergt. Die Übertragbarkeit auf den Menschen bzw. die Fähigkeit zur Auslösung von HFRS waren bisher wenig bzw. nicht bekannt. Wir haben den ersten Fall von HFRS gefunden, der mit einer TULV Infektion assoziiert ist. Aus demselben geographischen Gebiet in Nordostdeutschland, in dem dieser Patient lebt, konnten aus Feldmäusen TULV Nukleotidsequenzen amplifiziert werden. In phylogenetischen Analysen clustern sie mit Stämmen aus Polen und bilden mit diesen gemeinsam eine eigene, neue genetische Linie innerhalb der TULV Species. Ausser dem hier untersuchten DOBV und dem länger bekannten Puumalavirus ist TULV offenbar das dritte Hantavirus, das in Mitteleuropa HFRS hervorruft.

Contents

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20.10.2005