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2  Ergebnisse

2.1 Identifizierung sekretorischer Proteine von E. tenella

Das Fehlschlagen bisheriger Impfstoffprojekte gegen E. tenella könnte neben weiteren Ursachen dadurch bedingt sein, dass nicht die richtigen Antigene identifiziert wurden. Deshalb sollten in der vorliegenden Arbeit neue Antigene identifiziert werden, die möglicherweise einen ausreichenden Schutz induzieren können. Von immunologischen Interesse sind dabei vor allem Parasitenmoleküle, die an einer direkten Wirts-Parasit-Interaktion beteiligt sind und dadurch mit dem Wirtsimmunsystem interagieren. Hierzu zählen insbesondere Oberflächenproteine oder Moleküle die sekretiert werden. Diese können dann in die parasitophore Vakuole gelangen und letztendlich über MHC-I auf der Oberfläche der Wirtszellen präsentiert werden. Aus diesem Grund wurde die Suche nach neuen E. tenella-Antigenen in der vorliegenden Arbeit auf diese Molekülgruppe fokussiert und es wurden zwei verschiedene Methoden zur Identifizierung durchgeführt: (1) Die Identifizierung durch in silico-Analysen von EST-Datenbanken von E. tenella. (2) Die Identifizierung von Proteinen mit N-terminalem Signalpeptid aus einer E. tenella-cDNA-Bank durch funktionelle Komplementierung in transfizierten Hefezellen.

2.1.1 Identifizierung sekretierter Proteine mittels bioinformatischer Methoden

Die EST-Datenbanken von E. tenella enthielten zum Zeitpunkt der Analysen (März 2003) 12187 Einträge und umfassten cDNA-Sequenzen, die sowohl aus Sporozoiten als auch aus Merozoiten stammten. Wie in Abbildung 2 schematisch dargestellt, erfolgte die Computeranalyse ("DNASignalP") in drei Schritten: (1) Die E. tenella-EST-Sequenzen wurden mit dem Computerprogramm SeqMan® (DNASTAR, USA) zu sogenannten Contigs zusammengefasst. Aus 12187 EST-Sequenzen ergaben sich 2881 Contigs. Mit diesem Verfahren werden redundante EST eines mRNA-Transkriptes identifiziert und zu einer Sequenz zusammengefasst, die als Contig bezeichnet wird. (2) Diese Transkripte (Contigs) wurden mit Hilfe des blastx-Algorithmus (Altschul et al., 97) mit einer Proteindatenbank verglichen. (3) Die Sequenzen mit der größten Übereinstimmung wurden jeweils auf den Besitz einer [Seite 20↓]Signalsequenz hin überprüft. Dazu wurde der N-Terminus mit dem SignalP-Algorithmus (Nielsen et al., 97) analysiert. Um sicher zu stellen, dass die anschließenden Resultate auf die Eimeriensequenzen übertragbar waren, wurden nur die homologen Sequenzen zur Analyse herangezogen, die einen blastx E-value kleiner 10-4 besaßen. Dieser Wert stellt einen Grad der Homologie zwischen zwei Proteinsequenzen dar, wobei die Wahrscheinlichkeit mit abnehmenden E-value zunimmt (Selzer et al., 04). Insgesamt wurden mit dieser Methode 84 Proteinsequenzen identifiziert, die eine Vorhersage für eine Signalsequenz zeigten. Die bioinformatischen Arbeiten wurden von R. Marhöfer und P. Selzer (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) durchgeführt.

Abb. 2: Die DNASignalP-Analyse zur Identifizierung sekretorischer Proteine aus EST-Datenbanken (Selzer et al., 04).

Eine erste Analyse zeigte, dass 51 Contigs Homologien zu bekannten Proteinen verwandter Apikomplexa-Parasiten besaßen. Die verbleibenden Contigs umfassten Proteinhomologe von phylogenetisch weiter entfernten Organismen. Abgeleitete Proteine von 54 Contigs sind aufgrund ihrer beschriebenen Funktion oder Lokalisierung (sekretiert oder an der Oberfläche) möglicherweise an der Wirts-[Seite 21↓]Parasit-Interaktion beteiligt und werden deshalb im nachfolgenden näher beschrieben. Die übrigen abgeleiteten Proteinsequenzen, die Homologien zu 17 Mitochondrienproteinen und zu acht ER/Golgi-Proteinen zeigten, sowie fünf Proteine ohne funktionelle Zuordnung, wurden in den weiteren Analysen nicht berücksichtigt.

1 Apikomplexaspezifische, sekretorische Proteine

Eukaryotische Proteine, die zur Sekretion bestimmt sind, werden zunächst in das Endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert. Der weitere Transport in die verschiedenen Kompartimente oder an die Zelloberfläche erfolgt über Vesikel. Neben den für eukaryotische Zellen typischen Kompartimenten besitzen Apikomplexa-Parasiten zusätzlich sekretorische Organellen, die ebenfalls Ziele des Vesikeltransportes sind (Joiner und Roos, 02). Diese Organellen sind Teile des sogenannten Apikalkomplex und bestehen aus Mikronemen, Rhoptrien und "Dichten Granula". Proteine dieser Organellen ermöglichen essentielle Prozesse wie Zellinvasion und die für Apikomplexa einzigartige Bewegungsart der gliding motility (Opitz und Soldati, 02).

Durch die EST-Analyse konnten homologe Sequenzen zu AMA1 (Hehl et al., 00; Kocken et al., 00) und SPATR (Kappe et al., 01) identifiziert werden (Tab. 1). Es handelt sich hierbei um Moleküle, die an der initialen Parasit-Wirtszell-Bindung, dem ersten Schritt der Zellinvasion, beteiligt sind. Neben der Zellerkennung stellt die spezifische gliding motility einen weiteren essentiellen Schritt invadierender Apikomplexa dar. An diesem komplexen Prozess sind unter anderem Mikronemenproteine beteiligt (Opitz und Soldati, 02). Diese werden in Form eines Vorläuferproteins in den Mikronemen gespeichert und signalvermittelt als prozessiertes Protein sezerniert. Es konnten die Eimerienproteine EtMIC1,-2,-4 (Tomley et al., 91; Tomley et al., 96; Tomley et al., 01) und EtMIC-5 (Brown et al., 00) identifiziert werden, sowie zwei Contigs, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen Homologien zu den T. gondii-Proteinen TgMIC8 und -10 (Hoff et al., 01; Meissner et al., 02) zeigten.

Das Protein Ea3-1E von E. acervulina und ein nicht näher charakterisiertes Oberflächenmolekül von P. falciparum sind ebenfalls auf der Oberfläche lokalisiert (Lillehoj et al., 00). Daneben wurden in der Analyse die Eimerienproteine SO7 und [Seite 22↓]EtA1 (Kramer et al., 93; Profous-Juchelka et al., 88) identifiziert; diese sind in den refraktilen Körperchen lokalisiert, welche eimerienspezifische Organellen darstellen.

Tab 1: Eimeria tenella-Sequenzen mit Homologien zu apikomplexaspezifischen, sekretorischen Proteinen.

Protein

Funktion

Accession number (EMBL)

Contig-Nummer

Plasmodium ssp., T. gondii "AMA 1"

(Hehl et al., 00; Kocken et al., 00)

Adhäsion,

Mikronemen und Oberfläche

Q9N9E4, O15681

90, 158;

1016

P. yoelii "SPATR"

(Kappe et al., 01)

Thrombospondin-ähnlich, Adhäsionsligand, Oberfläche

Q963C1

2007

E. tenella "EtMIC1"

(Tomley et al., 91)

Adhäsion und Bewegung,

Mikronemen und Oberfläche

O43981

81; 88

E. tenella "EtMIC2"

(Tomley et al., 96)

Adhäsion und Bewegung,

Mikronemen und Oberfläche

Q24936

35; 1776

E. tenella "EtMIC4"

(Tomley et al., 01)

Adhäsion und Bewegung,

Mikronemen und Oberfläche

Q9BI05

2223

E. tenella "EtMIC5"

(Brown et al., 00)

Adhäsion,

Mikronemen und Oberfläche

Q9U966

124, 564

T. gondii "TgMIC8"

(Meissner et al., 02)

Transmembran-Protein,

Mikronemen und Oberfläche

Q9BIM7

1674

T. gondii "TgMIC10"

(Hoff et al., 01)

Transmembran-Protein,

Mikronemen und Oberfläche

Q9GSV5

2078

E. tenella "SO7"

(Profous-Juchelka et al., 88)

Refraktile Körperchen,

Sporozoiten

P15744

33

E. tenella "EtA1"

(Kramer et al., 93)

Nucleotid-Transhydrogenase, Refraktile Körperchen

Q07600

2547

E. acervulina "Ea3-1E"

( Lillehoj et al., 00 )

Oberfläche

Q9UA42

616

P. falciparum Oberflächenprotein

Membranprotein

Q9U0J9

2992

2 Transporter-, Rezeptor- und Signalproteine

Verschiedene Kanäle und Transporter vermitteln die Nährstoffaufnahme und Ionen-Regulation über Membranen. Hierzu zählen die identifizierten Adenosin- und Biopterin-Transporter sowie der H+/Ca2+-Transporter (Tab. 2).

Proteinkinasen und Phosphatasen sind Schlüsselenzyme in vielen biochemischen Prozessen und spielen eine wesentliche Rolle in der zellulären Kommunikation und Regulation (Kappe et al., 99). Zu dieser Molekülgruppe gehören die gefundenen Histidin- und Tyrosin-Kinasen. Die gefundenen Proteine Lag1, Notch-like-Rezeptor [Seite 23↓]und das Synaptobrevin-ähnliche Molekül spielen ebenfalls eine Rolle in der transmembranen Signalvermittlung. Eine homologe Serin/Threonin-Phosphatase Typ1 von T. gondii ist bei der Regulation der Zellinvasion beteiligt (Delorme et al., 02), so dass auch dem homologen E. tenella-Protein eine ähnliche Funktion zukommen könnte. In der vorliegenden Analyse wurden ebenfalls drei unterschiedliche Phosphatidat-Phosphatasen (PAP) identifiziert, die vermutlich am Phosphoglycerid-Stoffwechsel beteiligt sind (Tab. 2).

Tab. 2: Eimeria tenella-Sequenzen mit Homologien zu Transportern und signalvermittelnden Proteinen.

Protein

Funktion

Accession number (EMBL)

Contig-Nummer

T. gondii "TGAT"

(Chiang et al., 99)

Adenosin-Transporter, Membranprotein

Q9TVQ1

1763

Synechocystis ssp. "SLR0642"

Biopterin-Transporter-ähnlich, integrales Membranprotein

Q55721

1795

Mus musculus "PDE7A"

(Bloom und Beavo, 96)

cAMP-Phosphodiesterase, Signaltransduktion

P70453

2934

Homo sapiens "ABCA2"

(Kaminski et al., 01)

ATP-binding cassette, Transporter, integrales Membranprotein

Q9BZC7

461

Anabaena ssp."All0626"

(Kaneko et al., 01)

H+/Ca2+-Transporter,

Regulation der Ca2+-Konzentration

Q8YZ61

2324

Dicttyostelium discoideum "Synaptobrevin"

(Glockner et al., 02)

Hypothetisches Synaptobrevin-ähnliches Transmembranprotein, Signalvermittlung

Q8T1W2

566

Homo sapiens "LAG1"

(Lee, 91)

Longevity assurance homolog 1; integrales Membran-Signalprotein

P27544

2450

D. melanogaster "NOTCH"

(Wharton et al., 85)

NOTCH-Rezeptor, Typ 1-Membranprotein, Signalprotein

P07207

2232

D. melanogaster "WUN"

(Zhang et al., 97)

H. sapiens "PPAP2B"

(Kai et al., 96)

M. musculus "PPAP2A"

(Kai et al., 97)

Phosphadidat-Phosphatasen

Typ2, Typ2a und Typ 2b

Transmembranprotein

Q9V576

O14495

Q61469

77

127

2531

Arabidobsis thaliana "BSU1"

(Mora-Garcia et al., 04)

Bri1 Suppressionsprotein 1, Serin/Threonin-Phosphatase

Q9LR78

507

Caulobacter crescentus "DIVJ"

(Ohta et al., 92)

Histidin-Proteinkinase,

Transmembranprotein, Signalvermittlung

Q03228

1161

A. thaliana "F14G6.1"

Zink-Finger-Protein ("RING"), Protein-Protein-Interaktion

Q9S783

2900


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3  Sekretierte, enzymatisch aktive Moleküle und Matrixproteine

Proteolytische Prozessierungen von sekretierten Molekülen finden auch bei Apikomplexa während der Passage durch ER und Golgi oder an der Oberfläche statt (Ngo et al., 00). In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, dass zwei Contigs Übereinstimmungen zu Proteasen zeigten (Tab. 3). Es wurden ein Pepsin-Homolog und eine Subtilisin-ähnliche Protease gefunden. Des Weiteren wurde eine homologe Sequenz zu Glutaredoxin von Theileria parva identifiziert, die als einziger Vertreter dieser Proteinfamilie eine Signalsequenz besitzt und sekretiert wird (Ebel et al., 97).

Eine Sequenz zeigte Homologien zum Enzym Trehalase. Das Molekül spaltet den Zucker Trehalose und ist im Kohlenstoffwechsel involviert. Vermutlich spielt das Enzym auch eine Rolle in der Entgiftung von Radikalen.

Zusätzlich wurde eine F-Spondin1-ähnliche Sequenz und ein Protein mit Homologien zu einem Prolin-reichen Zellwandmolekül identifiziert.

Tab. 3: Sekretorische Enzyme und Matrixbestandteile mit Homologien zu Eimeria tenella-Sequenzen.

Protein

Funktion

Accession

number (EMBL)

Contig-Nummer

Macaca fuscata "Pepsin A2/A3"

(Kageyama et al., 91)

Sekretierte-Protease

P27677

2051

P. berghei "SUB2"

Sekretierte Subtilisin-ähnliche Serinprotease

Q9NG20

376

Theileria parva "Glutaredoxin"

(Ebel et al., 97)

Sekretiertes Glutaredoxin-ähnliches Protein

Q9BH70

2186

Bombyx mori "Trehalase"

(Su et al., 93)

Sekretiert, Degradierung von Trehalose

P32358

414

Brachydanio rerio "SPON1A" (Higashijima et al., 97)

F-spondin1, extrazelluläres Matrixprotein

O42113

1740

Sorgum vulgare "Extensin"

(Raz et al., 91)

Prolin-reiches Glycoprotein, Struktur von Zellwänden

Q9S436

2589


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4  Analyse und Charakterisierung von TA4-ähnlichen Sequenzen

Nach der Datenanalyse zeigten insgesamt 17 Contigs Übereinstimmungen zum TA4-Protein, dem Hauptoberflächenantigen von E. tenella-Sporozoiten (Brothers et al., 88; Files et al., 87). Eine detaillierte Analyse ergab, dass es sich insgesamt um 14 unterschiedliche Sequenzen handelte, die 30 % bis 60 % Sequenzhomologien aufwiesen. Hiervon entsprach eine Sequenz exakt dem TA4-Protein.

Mit Ausnahme von zwei Contigs, denen die Sequenzinformationen für die N-terminalen Bereiche fehlten, besaßen alle TA4-ähnlichen Moleküle nach dem SignalP-Algorithmus (Nielsen et al., 97) ein Signalpeptid. Aufgrund der Zusammensetzung der E. tenella-EST-Datenbank, die etwa zu gleichen Teilen aus Merozoiten- und Sporozoiten-cDNA besteht, konnte untersucht werden, ob die TA4-Moleküle stadienspezifische Unterschiede zeigten.

Tab. 4: Stadienspezifische EST-Verteilung der TA4-ähnlichen Contigs.

TA4-Contig

EST

blastx E-value

zur TA4-Sequenz

E. tenella-SAG

(Tabares et al., 04)

Sporozoiten

Merozoiten

Contig 145/538/2925

48

-

-

TA4/SAG1

Contig 2051/151

-

54

10-6/10-59

-

Contig 2219

-

10

10-47

SAG4

Contig 1938

-

127

10-39

SAG2

Contig 1244

-

30

10-28

SAG3

Contig 2218

11

-

10-26

-

Contig 2220

-

9

10-23

-

Contig 1716

-

79

10-17

SAG7

Contig 1829

-

37

10-11

SAG5

Contig 331

-

21

10-10

SAG11

Contig 180

-

39

10-9

-

Contig 67

55

5

10-9

-

Contig 1957

-

119

10-9

-

Contig 142

15

3

10-4

SAG10


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Wie in Tabelle 4 dargestellt, wurden tatsächlich erhebliche Unterschiede in der Verteilung ihrer zugrunde liegenden EST-Sequenzen gefunden. So stammten beispielsweise EST-Sequenzen der originalen TA4-Sequenz ausschließlich aus Sporozoiten und Contig 1938 war nur aus Merozoiten-EST zusammengesetzt. Hiernach transkribieren Sporozoiten nur wenige und Merozoiten sehr viele TA4-Varianten.

Diese Resultate werden durch eine kürzlich publizierte Studie unterstützt (Tabares et al., 04). Dabei wurden 23 TA4-ähnliche Sequenzen näher untersucht und es konnte gezeigt werden, dass die Proteine auf der Oberfläche lokalisiert und mit einem GPI-Anker in der Membran befestigt sind. Aufgrund ihrer Lokalisierung wurden die Proteine in surface antigens (SAG1-23) umbenannt. Das Expressionsmuster der 23 SAG-Sequenzen ergab, entsprechend der bioinformatischen Analyse, dass nur wenige Sequenzen in Sporozoiten transkribiert werden (Tabares et al., 04). Bis auf das SAG1(=originales TA4-Protein) werden alle untersuchten SAG-Sequenzen in Merozoiten exprimiert (Tabares et al., 04). Von den 23 beschriebenen SAG (TA4)-Proteinen waren acht in der vorliegenden Studie wiederzufinden. In Tabelle 4 ist die entsprechende Zuordnung der Sequenzen dargestellt. Die Autoren gehen von etwa 250 unterschiedlichen SAG-Genen im E. tenella-Genom aus.

Ein multipler Abgleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigte als wichtigstes Merkmal sechs konservierte Cysteine, die an der Bildung von Disulfidbrücken beteiligt sein können (Abb. 3). Neben den Cysteinen sind weitere Aminosäuren konserviert, welche über die gesamte Sequenz verteilt sind. Insbesondere die Aminösäureabfolge AVSFVALYNP (Bereich 170, Abb. 3) ist hoch konserviert, stellt aber wie die übrigen konservierten Bereiche kein bekanntes Proteinmotiv dar. Das originale TA4-Protein wird proteolytisch prozessiert, wobei ein Tripeptid (RRL) aus der Primärsequenz entfernt wird. Die beiden verbleibenden Peptide von 17 und 8 kDa werden über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden (Brothers et al., 88). Neben dem TA4-Protein zeigten noch weitere drei Sequenzen (contig 151, 1938, 1244) ein RRL-Motiv. Möglicherweise unterliegen auch diese Proteine proteolytischer Prozessierung und werden in ähnlicher Form modifiziert. Die übrigen Sequenzen besitzen kein konserviertes RRL-Motiv.


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Abb. 3: Aminosäurevergleich der homologen TA4-ähnlichen Sequenzen.


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2.1.2  Identifizierung sekretierter Proteine durch experimentelle Methoden

Die Identifizierung von E. tenella-Proteinen mit N-terminalem Signalpeptid aus den Sporozoitenstadien wurde mit der sogenannten signal sequence trap-Methode in Saccharomyces cerevisiae durchgeführt (Jacobs et al., 97; Klein et al., 96). Das Verfahren nutzt die Tatsache aus, dass sekretierte Proteine von eukaryotischen Organismen eine N-terminale Konsensussequenz benötigen. Diese Signalsequenzen führen zur Translokation der Proteine in das ER. Sie sind funktionsspezifisch und erfüllen ihre Aufgabe auch über Organismusgrenzen hinweg. Dies kann dazu genutzt werden, die Sekretion eines Proteins ohne N-terminale Konsensussequenz über eine fremde Signalsequenz zu vermitteln (Kaiser et al., 87). Für die Methode werden zwei Komponenten benötigt:

Die erste Komponente ist der Hefevektor pSUC2 (Abb. 4), der die genetische Information für das Enzym Invertase trägt, dem die Signalsequenz und das Start-ATG fehlt. Die Invertase steht unter Kontrolle des Alkoholdehydrogenase (ADH)-Promotors. Des Weiteren besitzt der Vektor einen Replikationsursprung und Selektionsmarker für Hefen und E. coli, so dass das Plasmid in beiden Systemen vermehrt werden kann und positive Transformanden selektiert werden können.

Abb. 4: Hefeplasmid pSUC2 (Jacobs et al., 97).


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Die zweite Komponente ist die Invertase-defiziente Hefemutante YTK12 (suc2 -). Die Sekretion von Invertase dient in Wildtyp-Hefen dazu, bei Abwesenheit von Glukose alternative Kohlenstoffquellen wie Saccharose oder Raffinose zu erschließen. Die Invertase-defiziente Hefemutante ist demnach im Gegensatz zu Wildtyp-Hefen nicht in der Lage, Saccharose als Kohlenstoffquelle zu nutzen und zeigt daher auf Minimalmedium mit Saccharose, aber ohne Glukose, kein Wachstum. Diese Defizienz kann über ein eingebrachtes Plasmid, das die vollständige Information für das Invertasegen besitzt, komplementiert werden (Abb. 5). Um fremde cDNA-Sequenzen zu analysieren, werden diese am 5'-Ende vor das modifizierte Invertasegen des pSUC2-Vektors, das keine Signalsequenz trägt, kloniert und anschließend in die Hefemutante YTK12 eingebracht. Dies führt zur Wiederherstellung des Wachstums auf den Minimalplatten, sofern der heterologe cDNA-Anteil für eine Signalsequenz kodiert, ein Start-ATG besitzt und im open reading frame (ORF) zum Invertasegen vorliegt (Abb. 4 und 5).

Methodisch lassen sich die durchgeführten Arbeiten demnach in drei Teile gliedern: (1) Die Konstruktion einer E. tenella-Sporozoiten-cDNA-Plasmid-Bank in E. coli, (2) die Transfektion von Hefemutanten und (3) die Selektion der positiven Transfektanten auf Selektionsagarplatten.

Abb. 5: Identifizierung von Proteinen mit N-terminalen Signalpeptiden durch funktionelle Komplementierung in Saccharomyces cerevisiae.

pSUC2: Die Expression der vollständigen Invertase über ein Hefeplasmid führt zur Sekretion des Proteins. Das Wachstum der Hefemutante YTK12 (Invertase-defizient) auf Saccharose-Minimalmedium zeigt dadurch Wildtypcharakter. pSUC2 Δ MSP: Dem Invertasegen fehlt die Signalsequenz und es wird nicht sekretiert. Es findet deshalb kein Wachstum statt. cDNA-pSUC2 Δ MSP: Nur Rekombinante mit heterologen Signalsequenzen zeigen Invertasesekretion. Positive Klone zeigen Wachstum auf Saccharose-Minimalmedium.


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1  Konstruktion einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten

Um mittels der Hefeselektionsmethode sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren, wurde zunächst eine cDNA-Plasmid-Bibliothek von E. tenella-Sporozoiten hergestellt. Hierzu war es notwendig, aus Oozysten hochreine Sporozoiten zu gewinnen, was durch die Anwendung eines Aufreinigungsverfahrens über eine DE-52 Anionen-Austauschchromatochraphie-Säule gewährleistet werden konnte (Schmatz et al., 84). Die Ausbeuten an Sporozoiten lagen dabei etwa im Verhältnis 1:1 zu den eingesetzten Oozysten. Da jede Oozyste acht Sporozoiten enthält, bedeutete dies einen Verlust an Sporozoitenmaterial.

Die Isolierung der mRNA durch Dynabeads® Oligo (dT)25 (Dynal, Norwegen) hatte den Vorteil mRNA direkt aus Zelllysat oder Gesamt-RNA gewinnen zu können. Dementsprechend wurde die mRNA sowohl aus ca. 109 E. tenella-Sporozoiten direkt extrahiert, als auch aus ca. 100 µg Sporozoiten-Gesamt-RNA gewonnen. Die Bindungskapazität der pro Aufreinigung eingesetzten Matrix betrug ca. 2 µg mRNA, so dass theoretisch insgesamt 4 µg mRNA zu Verfügung standen. Da die Parasitengewinnung sehr aufwändig ist, wurden die mRNA-Fraktionen zusammengeführt und ohne weitere Analyse für die Erststrang cDNA-Synthese eingesetzt.

Abb. 6: Agarose-Gelelektrophorese der Eimeria tenella-Sporozoiten-cDNA.

E. tenella-Sporozoiten-cDNA nach EcoRI-Adapter-Ligation und XhoI-Restriktionsverdau im 0,8 %-igen Agarosegel aufgetrennt.


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Der für die cDNA-Synthese verwendete Zufallsprimer erhöht im Gegensatz zum Polyadenosin (PolyA)-Primer die Wahrscheinlichkeit, mRNA im 5'-Bereich zu amplifizieren. Zusätzlich sollte durch die Einführung einer XhoI-Schnittstelle, ein gerichtetes Klonieren ermöglicht werden. Nach erfolgter Zweitstrangsynthese wurden EcoRI-Adaptoren an die cDNA-Enden ligiert. Im Anschluss fand ein XhoI-Restriktionsverdau statt und die cDNA konnte durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt werden (Abb. 6). Das Agarosegel zeigte einen konsistenten cDNA-Schmier zwischen 200 - 4000 Basenpaaren (bp) und zusätzlich ein sehr starkes Signal unter 200 bp. Vermutlich handelte es sich dabei um nicht-ligierte Adaptoren bzw. Adaptoren, die durch den XhoI-Verdau abgespalten wurden (Abb. 6).

Die Hefeselektionsmethode ist optimiert für kürzere DNA-Fragmente, welche vor das Invertasegen kloniert werden können. Somit wurden Fragmente von 200-800 bp aus dem präparativen Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt. Nachfolgend konnte die gewonnene cDNA in den vorbereiteten Klonierungsvektor pSUC2 ligiert werden. Die Transformation der cDNA-Bank in E. coli-XL1-blue Zellen resultierte in 5 x 105 colony forming units (cfu) mit 92% rekombinanten Plasmiden. Eine Restriktionsanalyse mit EcoRI und XhoI von 38 zufällig ausgewählten Transformanden führte zur Freisetztung der Inserts die eine durchschnittliche Größe von 580 bp hatten (Abb. 7).

Abb. 7: Insertgröße zufällig ausgewählter Klone der Eimeria tenella-Sporozoiten-cDNA-Bank.

Doppelverdau mit EcoRI/XhoI. Plasmid-DNA von 38 zufällig ausgewählten Bakterienklonen im 0,6 %-igen Agarosegel. Vektorgröße (pSUC2) ca. 9200 bp. M: DNA-Marker


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2  Identifizierung sekretorischer E. tenella-Sequenzen aus Hefetransfektanten durch funktionelle Komplementierung

Zur Identifizierung von Signalsequenzen war es zunächst notwendig, Hefezellen mit der E. tenella-cDNA-Bank zu transfizieren. Die eingesetzte Hefemutante (Hefestamm YTK12, Genetics Institute, USA) zeichnet sich durch die schon beschriebene Deletion im Invertasegen (suc2 -) aus. Zusätzlich ist sie nicht in der Lage, die Aminosäure Tryptophan zu synthetisieren (trp1 -), so dass mit einem entsprechenden supplementierenden Plasmid positive Transfektanten selektioniert werden können. Die Transfektion mit der cDNA-Bank ergab 2 x 105 TRP+-Hefezellen. Zur Identifizierung der Signalpeptide wurden die Hefen auf Replikaplatten mit Raffinose-Selektionsmedium übertragen. Um den Anteil an falsch-positiven Klonen zu minimieren, wurden die positiven Kolonien nochmals auf Raffinose-Selektionsagarplatten vereinzelt, wodurch schließlich 191 positive Hefeklone identifiziert werden konnten. Der Selektionsfaktor betrug demnach ca. 1000. In Abbildung 8 sind beispielhaft sechs rekombinante Hefeklone gezeigt, die, im Gegensatz zu den Kontrollen auf Selektionsagarplatten wachsen. Zusätzlich wurde die extrazelluläre Invertaseaktivität mit einer Farbreaktion nachgewiesen und somit die Sekretion des Enzyms bestätigt.

Abb. 8: Überprüfung der extrazellulären Invertaseaktivität rekombinanter Hefeklone.

1-6: Hefemutante YTK12 mit pSUC2-Plasmiden, die unterschiedliche Eimeria tenella-cDNA-Sequenzen tragen. p: Hefemutante mit Plasmid, jedoch ohne Insert. Negativkontrolle (-): Hefezellen ohne Plasmid. CMD-W: Minimalmedium ohne Tryptophan. YPRAA: Medium mit Raffinose, jedoch ohne Glukose. Enzymaktivität: Dunkler Farbumschlag zeigt extrazelluläre Invertaseaktivität.


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Die cDNA-Sequenzen der 191 Klone wurden mittels DNA-Sequenzierung bestimmt und geeignete ORF mit Start-ATG ausgewählt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden dann mit dem Programm SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) analysiert, das in der Lage ist, mit einer hohen Genauigkeit Signalpeptide und deren Schnittstelle vorauszusagen (Nielsen et al. 1997). Die Analyse prognostizierte für 162 Sequenzen (85 %) das Vorhandensein eines Signalpeptids. Ein anschließender Sequenzvergleich mit der Computersoftware MacVector (Pharmacopeia, USA) ergab, dass es sich dabei um insgesamt 25 unabhängige Sequenzen handelte (Tab. 5 und Tab. 6).

Tab. 5: Identifizierte Signalpeptide der Eimeria tenella-Sporozoiten cDNA's.

Klon

n

%

Signalsequenz

p

H2

29

15,2

M VRLSRQLKFVVCGVLLTHAYCAATAAAAE...

0,997

H3

27

14,1

MKSARAPVLAAALVAFLHTPAFG↓VK...

1,000

H16

25

13,1

M ARLNSRLALALCCSVLLLAALGGGVAAAA...

0,999

H6

16

8,4

MRKVAYLLFASLAVSHAFI...

0,999

H4

13

7,8

MRSSQRRRLALLGALMVALFELVVA↓ DV...

0,999

H7

7

3,7

M APLTLLTLFSAFSASFLFLSRA↓ QE...

0,999

H1

6

3,1

MKVTAASLAATATAVAFATSAAVG↓ SP...

0,999

H8

6

3,1

M ARLSFVSLLSLYLLFGQQAVRA↓ QN...

1,000

H9

6

3,1

M ILSWKLSVIMALSGLPLVRPAA...

0,985

H11

5

2,6

M LQRKLPPILRISFLMLSATTLG↓ NS...

0,972

H32

4

2,1

M VSLRLLLLGLACCAAVAAAAA...

1,000

H27

3

1,6

M AGFWFLALASTLLLPKVSSS↓ SE...

1,000

H13

2

1,1

M ALLSKLKGVYLAAFAIAGFPFTSMTSAME...

0,969

H36

2

1,1

M LSSAFIGFLMRHGADALS...

0,578

H10

1

0,5

MTYVGLLACFAGLLASAAAPHFSSAIS...

1,000

H14

1

0,5

MQLPFLTFRKDSLLVRCCVAACFWFIPQDVAALT...

0,947

H15

1

0,5

MKFFASRSLGAAAIALAVNCTG↓IW...

0,986

H24

1

0,5

MHVLSLLAGMFSGCKLA↓ HR...

0,961

H25

1

0,5

MGRIRRAAAVAGGLGITLLPRDGTEA↓ WL...

0,943

H28

1

0,5

MGQMAPFKRLPVFGASLLLAATENA↓ GQ...

0,993

H29

1

0,5

MTVPRLLRHAATAALIALGTFQGQS↓ DP...

0,984

H34

1

0,5

MRRVAAPVLVLIATLVGGTIEVQG↓ KK...

0,984

H35

1

0,5

MKGLFFTVALGAAVAVNA↓ SD...

0,999

H39

1

0,5

MKVLVSSVAMAGAVALCAA↓ SS...

0,997

H48

1

0,5

M APMLLKGLLCALAAVAAISSSAAAP...

1,000

Die Tabelle ist nach der Anzahl (n) bzw. Prozent (%) der gefundenen Sequenzen sortiert. Pfeil (↓): vorausgesagte Signalpeptidase-Schnittstellen, p: Wahrscheinlichkeit der Voraussage mit SignalP-HMM (Nielsen und Krogh, 98). Startmethionin in fett, hydrophobe Aminosäuren unterstrichen.


[Seite 34↓]

In Tabelle 5 sind die N-terminalen Signalsequenzen und die prognostizierten Peptidaseschnittstellen der 25 Klone dargestellt. Wie es für Signalsequenzen zu erwarten war, enthielten die Peptide zahlreiche hydrophobe Aminosäuren. Das Auffällige bei der Betrachtung der Häufigkeitsverteilung der einzelnen Sequenzen war, dass die fünf häufigsten cDNA-Sequenzen (H3, H3, H16, H6, H4) ca. 58 % der gesamten identifizierten Sequenzen umfassten (Tab. 5). Der Vergleich der 25 identifizierten Sequenzen mit einer Liste der 25 häufigsten E. tenella-EST-Sequenzen (http://www.cbil.upenn.edu/apidots/pub/SupTable1Top25.html) ergab, dass acht Sequenzen (H2/H4/H13/H24/H25/H29/H35/H36) übereinstimmten. Die Reihenfolge der Häufigkeitsverteilung war jedoch unterschiedlich. Beispielsweise wurden die Sequenzen H2 und H4, die in der vorliegenden Arbeit zu den fünf häufigsten Sequenzen zählten, in der Datenbank lediglich auf Rang 10 und 19 aufgelistet. Die drei übrigen Sequenzen, die in der vorliegenden Arbeit zu den fünf häufigsten zählten, waren nicht in der Datenbank enthalten.

3 Analyse der identifizierten cDNA-Sequenzen

Zur Identifizierung der E. tenella-Sequenzen wurden cDNA-Fragmente mit der Größe von 200-800 bp eingesetzt, so dass nicht erwartet werden konnte, vollständige Transkripte zu erhalten. Im vorliegenden Fall umfassten die 191 Sequenzen durchschnittlich ca. 431 bp. Um dennoch mehr Sequenzinformationen zu erhalten, wurden die 25 identifizierten Nukleinsäuresequenzen mit einer EST-Datenbank von E. tenella (http://www.tigr.org/tigr-scripts/tgi/T_index.cgi?species=e_tenella) mittels blastn-Algorithmus (Altschul et al., 97) abgeglichen.

In dieser Datenbank sind E. tenella-EST eingetragen, die jeweils etwa zur Hälfte aus Sporozoiten- oder Merozoiten-cDNA stammen und zu sogenannten Contigs zusammengefasst sind. Mit einer Ausnahme (H39) konnte jeder Sequenz ein E. tenella-EST-Contig (TC) oder eine einzelne EST-Sequenz zugeordnet werden (Tab. 6). Die korrespondierenden Contig-Sequenzen wurden auf die Stadienherkunft ihrer zugrunde liegenden EST hin analysiert (d.h. Sporozoiten- oder Merozoiten-cDNA). Dabei wurde festgestellt, dass 18 Contigs überwiegend aus Sporozoiten-EST zusammengesetzt waren und nur drei Contigs mehrheitlich aus Merozoiten-EST. Für fünf Sequenzen war die Anzahl der EST < 5, was als zu gering angesehen wurde, um eine Aussage zu treffen. Um die Aussage noch deutlicher zu gestallten, wurde [Seite 35↓]überprüft, wie viele Sequenzen einen fünffachen Unterschied in ihrer EST-Verteilung zwischen Sporozoiten und Merozoiten zeigten. Die Analyse ergab, dass zwölf Contigs aus einer fünffach höheren Anzahl von Sporozoiten-EST und lediglich ein Contig aus einer fünffach höheren Anzahl von Merozoiten-EST zusammengesetzt war.

Tab. 6: Datenbankabgleich der 25 experimentell identifizierten sekretorischen Eimeria tenella-Sequenzen.

Klon

Contig/EST

Stadium

   

Homologie

E-value

 

(blastn)

Sp

Me

bp

ORF

AS

(Accession number, EMBL)

(blastx)

         

H2

TC2829

50

0

737

112-737

208

-

> e-3

H3

TC2128

38

0

1120

131-788

219

-

> e-3

H16

TC2153

31

0

926

100-740

213

-

> e-3

H6

TC2921

15

0

1225

349-1235

266

-

> e-3

H4

TC2853

33

0

1843

94-1317

407

-

> e-3

H7

TC2827

70

5

1691

237-1000

254

E.t. TA4 (M21088)

7 e-10

H1

TC3237

5

0

679

61-661

200

P.f. Ca2+-Protein (M77834)

2 e-16

H8

TC2164

22

0

1415

92-852

253

E.t. TA4 (M21088) = EtSAG1

identisch

H9

BG929984

1

0

593

66-282

72

N.c. Serpin (Q8MZJ9)

4 e-6

H11

TC2915

11

5

937

129-913

261

E.t. TA4/EtSAG10 (Q70CC2)

2 e-10/identisch

H32

TC2380

1

4

345

31-345

105

-

> e-3

H27

TC2144

29

5

873

396-873

158

E.t. TA4 (M21088)

e-9

H13

TC2101

123

39

1281

353-1280

308

Serpin (O08797)

2 e-32

H36

TC2836

55

0

2219

226-1748

507

-

> e-3

H10

TC2807

0

16

772

107-627

173

-

> e-3

H14

TC2460

1

2

884

55-314

86

-

> e-3

H15

TC3177

2

1

809

200-654

151

E.t. MIC3 (Q6R5NO)

2 e-13

H24

TC2125

37

22

1878

547-1387

281

Phosphatase 2b (O14495)

2 e-26

H25

TC2115

18

53

3460

397-3195

932

E.t. MIC5 (Q9U966)

identisch

H28

TC2170

27

0

1270

49-848

266

E.t. TA4 (M21088)

e-4

H29

TC2188

18

4

657

405-656

83

-

> e-3

H34

TC2796

2

0

410

58-410

117

-

> e-3

H35

TC2817

108

147

1075

94-593

166

-

> e-3

H39

-

0

0

195

64-195

45

-

> e-3

H48

TC2876

25

0

789

104-789

228

-

> e-3

Contig/EST-Nr. aus einer E. tenella-EST-Datenbank (http://www.tigr.org/tigr-scripts/tgi/T_index.cgi? species=e_tenella) und die Stadienverteilung der EST. Sp: Sporozoiten; Me: Merozoiten; bp: Basenpaare; ORF: open reading frame; AS: Anzahl der Aminosäuren des ORF.

Daneben wurde die Sequenzinformation für eine blastx-basierte Homologiesuche in Proteindatenbanken genutzt. Die Analyse ergab, dass lediglich elf der 25 Sequenzen [Seite 36↓]signifikante Übereinstimmungen zu bekannten Proteinen in öffentlichen Datenbanken zeigten (Tab. 6). Die Sequenz H1 wies Homologien zu einem Ca2+-bindenden Protein von P. falciparum auf. Bei den Proteinen H9 und H13 handelte es sich um unabhängige Sequenzen, die beide Homologien mit Sequenzen von Serin-Protease-Inhibitoren (Serpin) aufwiesen. Demnach existieren bei E. tenella vermutlich mindestens zwei unterschiedliche, sekretierte Serpine. Der Klon H24 zeigte Homologien zu einer Phosphadidat-Phosphatase (PAP), die eine Schlüsselfunktion in der Synthese anderer Phosphoglyceride einnimmt. H15 zeigte Ähnlichkeiten zum E. tenella-Protein EtMIC3, so dass auch H15 in den Mikronemen lokalisiert sein könnte. Es konnte ebenfalls das EtMIC5-Protein identifiziert werden (H25), ein Mikronemenprotein von E. tenella mit bisher unbekannter Funktion (Ryan et al., 00). Des Weiteren wurde die cDNA-Sequenz (H8) von TA4 gefunden. Hierbei handelt es sich um das Hauptoberflächenprotein von E. tenella-Sporozoiten, das bei Sporozoiten etwa 1% der membranassoziierten Proteine umfasst (Files et al., 87). Interessanterweise wurden noch weitere vier cDNA-Sequenzen (H7, H11, H27, H28) gefunden, die in der blastx-Analyse Ähnlichkeiten mit dem TA4-Protein aufwiesen. Insgesamt stellten 22 der 162 (ca. 13 %) identifizierten Sequenzen TA4 oder TA4-ähnliche Moleküle dar, die nach der EST-Analyse vermutlich stadienspezifisch (oder dominant) in Sporozoiten exprimiert werden (Tab. 6) (siehe auch Abschnitt 2.1.1.4). Ein Sequenzvergleich mit 23 kürzlich beschriebenen TA4-ähnlichen Proteinen (EtSAG1-23) (Tabares et al., 04) mittels clustelW-Programm in der Computersoftware MacVector (Pharmacopeia, USA) ergab, dass H11 der SAG10-Sequenz entsprach. In der Publikation (Tabares et al., 04) ist TA4 in SAG1 umbenannt worden und somit identisch mit H8. Die weiteren TA4-ähnlichen Sequenzen H7, H27 und H28 zeigten keine Übereinstimmung zu einer der 23 beschriebenen SAG-Sequenzen.

Des Weiteren wurde in einem blastn-basierten Vergleich festgestellt, dass sechs von 25 Sequenzen auch mit der bioinformatischen Methode identifiziert wurden. Hierzu zählen H1 (= Contig 2122), H8 (= Contig 145), H11 (= Contig 142), H24 (= Contig 127), H25 (= Contig 124) und H27 (= Contg 67). Für diese bioinformatisch identifizierten Sequenzen konnte somit die Funktion der N-terminalen Signalsequenz durch die Hefemethode direkt bestätigt werden.


[Seite 37↓]

2.2  DNA-Immunisierungsstudien mit den E. tenella-Antigenen SO7, TA4 und EtMIC1 bei Hühnern

In der vorliegenden Arbeit sollte ein DNA-Immunisierungsprotokoll erstellt werden, anhand dessen neue E. tenella-Antigene in Form von DNA-Vakzinen getestet werden sollten. Die Applikation von Antigenen durch Plasmid-DNA bietet einige Vorteile gegenüber anderen rekombinanten Vakzinen. Sie aktiviert beispielsweise im Gegensatz zur Immunisierung mit rekombinanten Proteinen auch eine starke CD8+-T-Zellantwort (Gurunathan et al., 00). Damit ist ein besserer Immunisierungserfolg bei Eimerieninfektionen zu erwarten. Zusätzlich bietet die DNA-Immunisierung den Vorteil der relativ einfachen Herstellung großer Mengen Ausgangsmaterials.

Die Etablierung des DNA-Immunisierungsprotokolls beinhaltete neben der Verwendung von zwei unterschiedlichen Vektoren (pCDNA3 und pVR1012) auch den Einsatz des stabilisierenden, heterologen Fusionspartners enhanced green fluorescent protein (EGFP). Des Weiteren wurden Koimmunisierungen mit Vektoren durchgeführt, welche die genetische Information für die inflammatorischen Hühnerzytokine IFN-γ (chIFN-γ) und IL-18 (chIL-18) tragen. Für die Klonierung der DNA-Vektoren wurden die drei in unserer Analyse identifizierten und schon bekannten sekretorischen E. tenella-Proteine TA4 (Brothers et al., 88), SO7 (Miller et al., 89) und EtMIC1 (Tomley et al., 91) eingesetzt.

Aufgrund der Erkenntnisse aus früheren Arbeiten wurden einige Standardparameter der DNA-Immunisierung festgesetzt und in den Versuchen nicht mehr variiert. Zum einen wurde die DNA intramuskulär mit einer Dosis von 100 µg/Tier (in 0,9% NaCl) appliziert. Um zu gewährleisten, dass die Hühner während der ersten Immunisierung ein voll entwickeltes Immunsystem besaßen wurde zum anderen jeweils mit drei Wochen alten Tieren gearbeitet.

In einem vergleichenden Experiment wurden Hühner mit den bakteriell exprimierten Antigenen SO7 und TA4 parenteral immunisiert.

Der Immunisierungserfolg sollte durch die zeitliche Analyse der spezifischen Serokonversion mittels ELISA überprüft werden. Die zelluläre Immunreaktion sollte anhand der T-Zellproliferation und durch Oozystenverminderung nach einer Belastungsinfektion analysiert werden.


[Seite 38↓]

2.2.1  Konstruktion der DNA-Immunisierungsvektoren und Überprüfung der Plasmide in der Zellkultur

1 Konstruktion und Überprüfung von Plasmiden mit den Genen für die sekretorischen E. tenella-Proteine SO7, TA4 und EtMIC1

Die Zielvektoren für die DNA-Immunisierung pCDNA3 (Invitrogen, USA) und pVR1012 (Vical, USA) werden häufig in Immunisierungsstudien eingesetzt. Sie unterscheiden sich in einer Cytomegalivirus (CMV)-5'-Intronsequenz, die sich an die Promotorsequenz von pVR1012 anschließt. Diese soll zu einer verbesserten Expressionsrate beitragen (Hartikka et al., 96). Beide Vektoren sind mit dem CMV-Promotor/Enhancer und einer bovine growth hormone (BGH)-Terminationsstelle ausgestattet, wodurch die Proteinexpression in eukaryotischen Zellen ermöglicht wird.

Die cDNA-Sequenzen von SO7, TA4 und EtMIC1 wurden alleine bzw. in Fusion mit EGFP in beide Plasmide kloniert. Aufgrund der hohen Proteinstabilität und Widerstandsfähigkeit gegen Proteaseabbau ist EGFP als Fusionspartner besonders geeignet (Cubitt et al., 95). Es sollte untersucht werden, ob durch die erhöhte Proteinstabilität eine Verstärkung der Antikörperantwort gegen das Eimerienprotein erreicht werden kann. Als Nebeneffekt konnte das EGFP auch als Reporter für die Proteinexpression eingesetzt werden.

Zunächst war es notwendig die cDNA-Sequenzen mittels PCR zu amplifizieren, wobei der für die N-terminale Signalsequenz kodierende Bereich nicht berücksichtigt wurde. Da in den DNA-Immunisierungsvektoren unterschiedliche multiple Klonierungsstellen (MCS) vorlagen, mussten die PCR-Produkte mit entsprechenden flankierenden Restriktionsschnittstellen versehen werden (Klonierungsschema siehe Abb. 9). Die Klonierung in pCDNA3 wurde über HindIII/XbaI durchgeführt und für pVR1012 kamen die Enzyme BamHI/XbaI zum Einsatz. Die Herstellung der EGFP-Fusionskonstrukte fand über einen zusätzlichen Klonierungsschritt statt. Dazu wurde der Vektor pN1 (BD Clontech, Heidelberg) eingesetzt. Er besitzt vor dem 5'-Ende der EGFP-Sequenz eine Klonierungsstelle, wodurch die resultierenden Fusionsproteine den heterologen Sequenzanteil am N-Terminus tragen. Mit den Enzymkombinationen HindIII/XbaI und Eco47III/XbaI konnten dann die Fusionskonstrukte erfolgreich in die [Seite 39↓]Vektoren pCDNA3 und pVR1012 umkloniert werden.

Abb. 9: Klonierungsschema der DNA-Immunisierungsvektoren mit cDNA-Sequenzen von SO7, TA4 und EtMIC1.

Zur Bestätigung der Klonierung wurden die Konstrukte mittels Restriktionsverdau überprüft und die pCDNA3-Vektoren mit den Enzymen HindIII/XbaI geschnitten. Durch die Klonierung der pVR1012-Konstrukte wurden die Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende zerstört, so dass die Restriktionsanalysen mit dem im flankierenden Bereich schneidenden Enzym PstI und XbaI vorgenommen wurden. Zu berücksichtigen war auch, dass SO7 und EtMIC1 zwei bzw. drei Erkennungssequenzen für PstI besitzen. In der Tat ließen sich die einzelnen DNA-Fragmente in den jeweiligen Restriktionsansätzen wiederfinden, sowie auch die linearisierten Plasmide, die eine Größe von ca. 5,4 kb (pCDNA3) bzw. 4,9 kb (pVR1012) besitzen (Daten nicht gezeigt). Zur zusätzlichen Überprüfung wurden die generierten Konstrukte sequenziert und die korrekte Klonierung bestätigt.

Die Proteinexpression der konstruierten Vektoren wurde in transfizierten eukaryotischen Zellen mittels Immunblotanalysen, RT-PCR-Experimenten und Fluoreszenzmikroskopie analysiert.


[Seite 40↓]

Die Überprüfung der fusionsfreien (ohne EGFP) Eimerienkonstrukte im Immunblot mit einem anti-E. tenella-Serum zeigte für die EtMIC1-Konstrukte (in beiden Vektoren) ein Signal auf der Höhe des erwarteten Molekulargewichtes von ca. 100 kDa. Wie in Abbildung 10 (Spur 1 und Spur 2) zu erkennen ist, wurde im pVR1012-Ansatz eine einzelne Proteinbande erkannt, hingegen im pCDNA3-Ansatz zwei dicht nebeneinanderliegende Proteinbanden detektiert (Abb. 10). Im Gegensatz dazu konnten für die Konstrukte von SO7 und TA4 keine spezifischen Proteinsignale detektiert werden, dies galt sowohl für pCDNA3 als auch für pVR1012 (Abb. 10). Um etwa gleiche Transfektionsbedingungen zu gewährleisten, wurden COS-7-Zellen des gleichen Ansatzes verwendet und die Konstrukte unter gleichen Bedingungen transfiziert. Üblicherweise wurden Transfektionseffizienzen von ca. 20-40% erreicht.

Abb. 10: Immunblotanalyse der fusionsfreien Konstrukte in COS-7-Zellen mit anti-Eimeria tenella-Serum.

Transfektion von COS-7-Zellen mit fusionsfreien SO7-, TA4- oder EtMIC1-Konstrukten. Pro Spur wurden äquivalente Mengen von ca. 5 x 104 Zellen aufgetragen. pV: pVR1012, pC: pCDNA3.

Um aufzuklären, ob die Transfektion der Zellen tatsächlich zur Transkription spezifischer mRNA führte, wurde die RNA von COS-7-Zellen mittels RT-PCR untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass mit beiden Vektoren die unterschiedlichen Eimeriensequenzen transkribiert werden konnten (Abb. 11). Im Agarosegel ist zu erkennen, dass in jedem Ansatz die spezifischen cDNA-Fragmente erwarteter Größe detektiert wurden. Die stärksten Signale wurden bei den EtMIC1-Konstrukten und TA4-pVR1012 detektiert. Schwächere Signale zeigten die SO7-Konstrukte und TA4-[Seite 41↓]pCDNA3. Daraus kann geschlossen werden, dass die Transfektion erfolgreich verlief und eine Transkription stattfand. Wie zudem die Restriktionsanalyse und die Sequenzierung zeigte, waren die Plasmide erfolgreich und ohne Verschiebung des Leserahmens kloniert worden. Aufgrund dieser Resultate kann vermutet werden, dass die Proteinexpression von SO7 und TA4 unter der Nachweisgrenze des Immunblots lag.

Abb. 11: RT-PCR-Analyse der Transkription von Eimeriengenen in COS-7-Zellen.

Transfektion von COS-7-Zellen mit SO7-, TA4- oder EtMIC1-Konstrukten. Nach 18 h wurde eine genspezifische RT-PCR aus Gesamt-RNA durchgeführt und im Agarosegel (0,8%) aufgetrennt. pCDNA3-Konstrukte: 1, 5, 9; pVR1012-Konstrukte: 3, 7, 11; Positivkontrolle (PCR mit Vektor): 2, 6, 10; Negativkontrollen (PCR ohne cDNA): 4, 8, 12; Negativkontrollen (PCR mit COS-7-cDNA aus Zellen, die mit leeren Vektoren transfiziert wurden): 13, 14, 15. Weiße Pfeile zeigen das erwartete Signal. M: DNA-Marker in bp.

Die Fusionskonstrukte (mit EGFP) wurden im Immunblot mit einem Maus-anti-EGFP-Serum und einem Kaninchen-anti-E. tenella-Serum getestet (Abb. 12). Mit dem anti-EGFP-Serum konnten die erwarteten, spezifischen Signale der Fusionsproteine von ca. 49 kDa (SO7-EGFP), 52 kDa (TA4-EGFP) bzw. 127 kDa (EtMIC1-EGFP) nachgewiesen werden (Abb. 12A). Die Zelllysate von SO7-EGFP in pCDNA3 (Abb. 12A, Spur 4) zeigten zwei weitere Banden, die ober- und unterhalb der dominanten Bande erkannt wurden. Im Ansatz TA4-EGFP in pCDNA3 (Abb. 12A, Spur 5) wurde ein zusätzliches Signal unterhalb des erwarteten Signals detektiert. Auch in der EGFP-Positivkontrolle im Vektor pCDNA3 (Abb. 12A, Spur 7) wurden zwei dicht nebeneinander liegende Proteinbanden erkannt. Der Ansatz mit EtMIC1-EGFP in pCDNA3 und die verschiedenen pVR1012-Ansätze zeigten neben sehr schwachen, [Seite 42↓]unspezifischen Reaktionen distinkte singuläre Proteinsignale. Wie die Intensität der Signale zeigt, wurden vermutlich unterschiedliche Proteinmengen in den einzelnen Ansätzen exprimiert, obwohl die Transfektionseffizienz für alle Ansätze bei etwa 20-30 % lag.

Abb. 12: Immunblotanalyse der EGFP-Fusionskonstrukte in COS-7-Zellen.

A: Anti-EGFP-Serum. B: Anti-Eimeria tenella-Serum.
Transfektion von COS-7-Zellen mit EGFP-Fusionskonstrukten. Aufgetragen wurden pro Spur äquivalente Mengen von etwa 1 x 105 Zellen. SDS-PAGE mit 5%-20% Gradientengel. SO7-EGFP-pVR1012 (A1, B1), SO7-EGFP-pCDNA3 (A4, B5). TA4-EGFP-pVR1012 (A2, B2). TA4-EGFP-pCDNA3 (A5, B6). EtMIC1-EGFP-pVR1012 (A3, B3). EtMIC1-EGFP-pCDNA3 (A6, B4). Kontrollen: EGFP-pCDNA3 (A7, B7). Vektorkontrolle mit einer Mischung aus pCDNA3 und pVR1012 (A8, B8).

Im Immunblot mit dem Kaninchen-anti-E.tenella-Serum wurden in den gleichen Zellextrakten, entsprechend dem vorangegangenem Experiment (mit EGFP-Antiserum), die SO7 und EtMIC1-Fusionsproteine detektiert (Abb. 12B). Unerwartet jedoch war, dass die TA4-Fusionsproteine bei gleicher Proteinmenge des gleichen Transfektionsansatzes im Gegensatz zum EGFP-Antiserum keine Reaktion zeigten (Abb. 12B, Spur 2 und 6). Dies trat zudem unabhängig vom eingesetzten Vektor auf. Wie in den übrigen Ansätzen wurden die Zellextrakte von ca. 1 x 105 COS-7-Zellen getestet. Der Vergleich mit dem EGFP-Antiserum ergab, dass die TA4-Proteinbande des pVR1012-Vektors (Abb. 12A, Spur 2) nur ein schwaches Signal zeigte und demnach die Proteinmenge für die Detektion durch das anti-E. tenella-Serum möglicherweise nicht genügte. Jedoch wurde auch das Fusionsprotein von TA4-[Seite 43↓]EGFP in pCDNA3 nicht erkannt, obwohl die Reaktion mit dem anti-EGFP-Serum deutlich nachweisbar war (Abb. 12A Spur 5). Hinzuzufügen ist, dass es sich bei den eingesetzten Seren um nicht-aufgereinigte Blutseren aus der Maus bzw. dem Kaninchen handelte und somit vergleichbare Bedingungen vorherrschten. Des Weiteren spricht die Tatsache, dass die TA4-Fusionsproteine vom EGFP-Serum auf der Höhe des erwarteten Molekulargewichtes detektiert wurden, gegen eine Verschiebung des Leserasters und gegen eine vorzeitige Translationsunterbrechung. Vermutlich waren wesentliche Epitope im Fusionsprotein nicht zugänglich, so dass die Antikörperbindung verhindert wurde.

Ein Vergleich der Immunblotexperimente zeigte, dass die Eimerienproteine durch die Fusion mit EGFP an Stabilität gewonnen haben. Vermutlich sind für die negativen Immunblotergebnisse der fusionsfreien SO7- und TA4-Konstrukte eine Kombination aus geringer Proteinstabilität und limitierter Expressionsmenge verantwortlich.

Der Einsatz des EGFP ergab auch die Möglichkeit, die Genexpression der Fusionsproteine über Fluoreszenzmikroskopie zu ermitteln. Neben COS-7-Zellen wurden für diese Arbeiten auch Zellen der Hühnerzelllinie HD11 (Beug et al., 79) mit den unterschiedlichen Fusionskonstrukten transfiziert (Abb. 13, Abb. 14).

Abb. 13: Expression von EGFP-Fusionsproteinen in COS-7-Zellen.

Transfektion von COS-7-Zellen mit EGFP-Fusionskonstrukten: EtMIC1 (A, D), TA4 (B, E) und SO7 (C, F). pCDNA3: A, B, C; pVR1012: D, E, F. Nach 48 h wurde die spezifische EGFP-Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop (1:400) überprüft.

Es zeigte sich, dass sämtliche Fusionskonstrukte in beiden Zelllinien zur EGFP-Expression führten. Da es sich bei der HD11-Zelllinie um eine Hühnermonozyten-[Seite 44↓]Zelllinie handelt, für die keine optimierten Transfektionssysteme und Protokolle vorlagen, war die Proteinexpression und Transfektionsrate hier etwas niedriger. Wichtig war die qualitative Beurteilung der Proteinexpression in HD11-Zellen, die zeigte, dass die getesteten Vektoren zur Immunisierung von Hühnern geeignet waren und in vivo die Proteinexpression der Fremdproteine erwartet werden durfte.

Abb. 14: Expression von EGFP-Fusionsproteinen in HD11-Zellen.

Transfektion von HD11-Zellen mit den EGFP-Fusionskonstrukten: EtMIC1 (A, D), TA4 (B, E) und SO7 (C, F). pCDNA3: A, B, C; pVR1012: D, E, F. Nach 48 h wurde die spezifische EGFP-Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop (1:400) überprüft.

2 Konstruktion und Überprüfung von Vektoren mit den Hühnergenen der proinflammatorischen Zytokine chIFN-γ und chIL-18.

Da Zytokine eine essentielle Rolle bei der Differenzierung von Effektor-T-Zellen spielen, kann Plasmid-DNA, die kostimulierende Moleküle exprimiert, zur Verstärkung der Immunreaktion eingesetzt werden (Gurunathan et al., 00). Um bei zukünftigen DNA-Immunisierungen solche Vektoren einsetzten zu können, wurden die zwei für Eimerieninfektionen interessanten Hühnerzytokine chIFN-γ und chIL-18 kloniert bzw. in der Zellkultur überprüft.

Die cDNA von chIFN-γ wurde aus stimulierten Hühnermilzzellen (48 h mit Concanvalin A (ConA), 25 µg/ml) mittels RT-PCR isoliert. Hierzu wurde die Gesamt-RNA von stimulierten Zellen aufgereinigt und in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde der kodierende Bereich der chIFN-γ-Sequenz mittels PCR amplifiziert. Zur [Seite 45↓]gezielten Klonierung in den Zielvektor pCDNA3 wurden die Restriktionsenzyme EcoRI/XbaI genutzt. Für den Vektor pVR1012 kamen die Enzyme SalI/XbaI zum Einsatz. Zur Überprüfung der chIFN-γ-Expression wurden dann COS-7-Zellen mit den generierten Plasmiden transfiziert und chIFN-γ im Überstand nachgewiesen (Abb. 15). Hierzu wurde ein Biotest mit einer Hühnermonozytenzelllinie (HD11) angewendet, deren Stimulation durch chIFN-γ die Produktion von Stickoxid-Verbindungen anregt, welche schließlich als Nitrit im Zellüberstand nachweisbar sind. Mit der sogenannten Griess-Reaktion kann das freigesetzte Nitrit quantitativ bestimmt werden.

Abb. 15: Nachweis von chIFN-γ in COS-7-Zellkulturüberständen.

Mit den Zellkulturüberstände (24h) transfizierter COS-7-Zellen wurden HD11-Zellen stimuliert und das freigesetzte Nitrit mit der Griess-Reaktion quantifiziert.

Der Versuch zeigte, dass der Überstand der mit den chIFN-γ-Konstrukten transfizierten COS-7-Zellen große Mengen chIFN-γ enthielt (Abb. 15). Im Gegensatz zu den Kontrollen, in denen nur ca. 1-2 µM Nitrit nachweisbar waren, lagen die Nitritkonzentrationen beider chIFN-γ-Konstrukte bei ca. 30 µM.

Die chIL-18-Sequenz lag bereits im Vektor pCDNA3 vor (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von K. Schneider, Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg). Um das Konstrukt in der Zellkultur testen zu können, wurden COS-7-Zellen mit chIL-18-pCDNA3 transfiziert und nach 24 h der Zellkulturüberstand zur Stimulierung von Hühnermilzzellen (isoliert aus 3 Wochen alten Hühnern) eingesetzt. Da chIL18 bei CD4+-T-Zellen unter anderem zur Sekretion von chIFN-γ führt (Gobel et al., 03), kann die Aktivität von chIL-18 indirekt über den Nachweis von [Seite 46↓]chIFN-γ im Überstand von aktivierten T-Zellen erfolgen. Nach einer Inkubation von 24 h erfolgte die Überprüfung der Milzzellüberstände auf chIFN-γ-Freisetzung im Biotest mit HD11-Zellen. Das Ergebnis zeigte, dass die Milzzellen eines Spendertieres zur chIFN-γ-Sekretion stimuliert wurden, was sich im Vergleich zur Kontrolle in einem dreifach höheren Nitritwert niederschlug (Abb. 16). Die Zellen des zweiten Tieres hingegen zeigten keine chIFN-γ-Freisetzung. Zur Kontrolle der allgemeinen T-Zellreaktivität wurden die isolierten Milzzellen in separaten Näpfen mit ConA stimuliert, was bei den Zellen beider Tiere zur chIFN-γ-Produktion führte (Abb. 16). Ebenso wurde eine Transfektionskontrolle in COS-7-Zellen mit dem Konstrukt chIFN-γ-pCDNA3 durchgeführt. Hierbei konnte chIFN-γ im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden und bestätigte die erfolgreichen Transformationbedingungen. Möglicherweise ist die fehlende Reaktion der Zellen eines Spendertieres auf geringe kostimulatorische Faktoren in der Milzzellpopulation zurückzuführen. Aufgrund des begrenzten Tiermaterials und aufgrund der positiven Sequenzieranalyse des chIL18-Vektors, die zeigte, dass die vollständige chIL18 Sequenz vorlag, wurden in der vorliegenden Arbeit keine zusätzlichen Milzzellpopulationen getestet.

Abb. 16: Aktivitätstest von chIL-18.

Hühnermilzzellen von zwei Tieren (Spender 1 und 2) wurden entweder mit den Zellkulturüberständen (24h) von mit chIL-18-pCDNA3 transfizierten COS-7-Zellen oder mit ConA (25µg/ml) für 24h stimuliert und das freigesetzte chIFN-γ mit dem HD11-Biotest quantifiziert. Als Transfektionskontrolle wurden COS-7-Zellen mit chIFN-γ-pCDNA3 transfiziert und der Überstand im Biotest überprüft. K: pCDNA3, ConA: Concanavalin A.


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2.2.2  Immunisierung von Hühnern mit Eimerien-DNA-Konstrukten und rekombinantem SO7- und TA4-Protein

Zur DNA-Immunisierung von Hühnern wurden die unterschiedlichen Eimeriensequenzen SO7, TA4 und EtMIC1 als EGFP-Fusionskonstrukte im Vektor pCDNA3 eingesetzt. Wie die in vitro-Daten zeigten, wirkte EGFP stabilisierend bzw. führte zu einer verbesserten Genexpression der Eimeriensequenzen, so dass auch in vivo eine erhöhte Proteinstabilität und somit eine verbesserte Immunreaktion zu erwarten war. In einem vergleichenden Experiment wurden Hühner parenteral mit den rekombinanten Antigenen SO7 und TA4 immunisiert.

Die Überprüfung des Immunisierungserfolges im zeitlichen Verlauf erfolgte über die Analyse der spezifischen Serokonversion mittels ELISA. Zusätzlich wurde versucht die zelluläre Immunreaktion mit einem T-Zelltransformationstest und anhand der Oozystenverminderung nach einer Belastungsinfektion zu ermitteln.

Im Rahmen der Immunisierung von Hühnern mit den drei Eimerien-EGFP-Fusionskonstrukten (pCDNA3) erfolgten zwei intramuskuläre Immunisierungen (100µg/Tier) im Abstand von 30 Tagen. Die Belastungsinfektion mit 30000 E. tenella Oozysten wurde eine Woche nach der zweiten Immunisierung appliziert (Abb. 17).

Abb. 17: Schema zur DNA-Immunisierung von Hühnern.

Um den Ablauf der Immunisierung zu verfolgen, wurde die spezifische Serokonversion mittels ELISA bestimmt. Als Antigene wurden hierzu E. coli-exprimierte Proteine eingesetzt. Die mit dem SO7-Konstrukt immunisierten Tiere zeigten signifikante Antikörperreaktionen (p ≤ 0,05) nach der ersten Immunisierung im Vergleich zu den EGFP-Kontrolltieren (Abb. 18). Der Antikörpertiter blieb auch [Seite 48↓]nach der zweiten Immunisierung und bis zehn Tage nach der Infektion konstant. Die mit TA4- oder EtMIC1-Fusionskonstrukt immunisierten Tiere zeigten keine signifikanten Antikörperreaktionen nach der zweiten Immunisierung. Innerhalb der ersten zehn Tage nach der Infektion erfolgte ein Anstieg des TA4- bzw. EtMIC1-Antikörpertiters (Abb. 18). Hierbei konnte jedoch kein Unterschied zwischen den immunisierten Tieren und Kontrolltieren festgestellt werden.

Abb. 18: Antikörperantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0 und 30.

Immunisierung mit 100µg Plasmid-DNA/Tier (pCDNA3-Konstrukte). Belastungsinfektion am Tag 37 mit 30000 Oozysten/Tier. TA4-EGFP (n=5), SO7-EGFP (n=5), EtMIC1-EGFP (n=6), EGFP-Kontrolle (n=4). ELISA (IgG) gegen rekombinantes SO7-, TA4- bzw. EtMIC1-Protein. Serumverdünnung 1:125. Signifikanzniveau zur EGFP-Kontrolle p ≤ 0,05 (*).

Die Überprüfung der Antikörperreaktion gegen den Fusionspartner EGFP ergab einen stetigen Anstieg der Antikörperkonzentration in den Gruppen, die mit SO7-EGFP, TA4-EGFP und EGFP-Konstrukten immunisiert worden waren (Abb. 19). Die Versuchstiere, die mit EtMIC1-EGFP immunisiert wurden, zeigten keine Antikörperreaktion gegen EGFP. Erst nach der Infektion konnten auch bei diesen Tieren EGFP-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Das deutet darauf hin, dass eine Grundimmunisierung vorlag, die durch die immunologischen Reaktionen der Tiere auf die Belastungsinfektion verstärkt wurde.


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Abb. 19: EGFP-spezifische Antikörperantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung mit EGFP-Fusionskonstrukten am Tag 0 und 30.

Immunisierung mit 100µg Plasmid-DNA/Tier. Eingesetzt wurden pCDNA3-Konstrukte. Belastungsinfektion am Tag 37 mit 30000 Oozysten/Tier. TA4-EGFP (n=5), SO7-EGFP (n=5), EtMIC1-EGFP (n=6) und EGFP-Kontrolle (n=4). ELISA (IgG) gegen EGFP. Serumverdünnung 1:250.

Neben der humoralen Antwort wurde versucht die spezifische T-Zellantwort der peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) über einen Lymphozytentransformationstest zu analysieren. Der Test wurde lediglich am Ende des Versuchs (10 Tage p.i.) durchgeführt, da bei jungen Hühnern nur geringe Mengen Blut entnommen werden können und in der vorliegenden Arbeit aus Kapazitätsgründen keine weiteren Versuchsgruppen mitgeführt wurden. Die PBL wurden mit den rekombinanten Eimerienantigenen und ConA stimuliert. Dabei wurde als Schwellenwert für eine positive Stimulation ein Stimulationsindex (SI) größer drei definiert.

Abb. 20: Proliferation der PBL von DNA-immunisierten Hühnern nach einer Eimeria tenella-Belastungsinfektion und nach ConA-Stimulation.

DNA-Immunisierung am Tag 0 und 30, Belastungsinfektion mit 30000 E. tenella-Oozysten am Tag 37. Zellisolation am Tag 10 p.i.. Stimulation mit ConA (25 µg/ml). SI: Stimulationsindex (logarithmisch). Querstrich: Median. TA4-EGFP (n=5), SO7-EGFP (n=5), EtMIC1-EGFP (n=6), EGFP (n=4). Mediumwert (n=20): 469 ± 767 counts per minute (cpm).


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Die Inkubation der Zellen mit ConA ergab eine allgemeine T-Zellreaktivität zwischen 10 und 100 SI, die zeigte, dass reaktive T-Zellen vorlagen (Abb. 20). Eine eimerienspezifische T-Zellproliferation nach Restimulation mit den rekombinanten Antigenen konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Eine verminderte Ausscheidung von Oozysten nach einer Belastungsinfektion ist ein Hinweis auf die Induktion einer schützenden Immunantwort. Wie sich jedoch aus Abbildung 21A ergibt, wurden keine Unterschiede in der Parasitenreplikation zwischen immunisierten Tieren und den Kontrolltieren gefunden.

Ein weiteres häufig genutztes Kriterium zur Feststellung des Immunschutzes, ist die Gewichtszunahme, die ein Maß für die Schwere der Pathologie und Futterverwertung nach einer Belastungsinfektion darstellt. Sie ergibt sich aus der Gewichtsdifferenz der Versuchstiere zum Zeitpunkt der Infektion und sieben Tage p.i.. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den immunisierten Tieren und den Kontrollen festgestellt werden (Abb. 21B).

Abb. 21: Oozystenausscheidung und Gewichtsdifferenz von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.

A: Gesamt-Oozystenausscheidung (Tag 5-10 p.i.). B: Gewichtsdifferenz individueller Tiere (Differenz von Tag 7 und Tag 0 p.i.). Infektionsdosis: 30000 E. tenella-Oozysten. Eingesetzt wurden pCDNA3-EGFP-Fusionskonstrukte: TA4 (n=5), SO7 (n=5), EtMIC1 (n=6), K = EGFP-Kontrolle (n=4).

Auffällig waren große Unterschiede innerhalb der Versuchsgruppen. Die Werte der Gewichtsdifferenz schwankten insgesamt zwischen -100g und +150g und dokumentierten die große Belastung durch die sehr hohe Infektionsdosis (30000 Oozysten). Da es sich bei der Rasse "weiße Leghorn" nicht um genetisch definierte Tiere handelt, kann davon ausgegangen werden, dass die unterschiedlichen [Seite 51↓]Gewichtszunahmen auch auf den unterschiedlichen genetischen Hintergrund der Tiere zurückzuführen sind.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die DNA-Immunisierung mit dem SO7-EGFP-Fusionskonstrukt eine SO7-spezifische Antikörperantwort nach der ersten und zweiten Immunisierung generierte. Im Gegensatz hierzu induzierte das TA4- und EtMIC1-EGFP-Fusionskonstrukt keine nachweisbaren Antikörper-konzentrationen. Mit Ausnahme des EtMIC1-Plasmides induzierten alle Konstrukte nach zwei DNA-Applikationen EGFP-spezifische Antikörperantworten. Nach der Belastungsinfektion mit E. tenella konnten bei den Tieren spezifische Antikörper gegen die Eimerienzielantigene detektiert werden. Des Weiteren war unter den genannten Bedingungen keine spezifische T-Zellproliferation nachweisbar. Auch hinsichtlich der Oozystenausscheidung nach Belastungsinfektion, die einen Parameter für den Immunschutz darstellen kann, wurden keine Unterschiede zwischen den immunisierten Tieren und Kontrolltieren festgestellt.

Die parenterale Immunisierung von Hühnern wurde mit bakteriell exprimiertem SO7-und TA4-Antigen durchgeführt. Die Proteinexpression in Bakterien und deren Aufreinigung mittels Ni-Chelat-Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen wurde nach einem etablierten Protokoll durchgeführt (Pogonka et al., 03).

Es erfolgten zwei subkutane Immunisierungen im Abstand von zwei Wochen mit jeweils 50 µg Protein. Für die erste Applikation wurde Freund’s complete adjuvans (FCA) eingesetzt und für die zweite Applikation Freund's incomplete adjuvans (FIA). Eine Negativkontrollgruppe bekam nur Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) mit FCA bzw. FIA verabreicht.Um möglicherweise auch kleine Effekte zu erfassen, erfolgte nach zwei Wochen die Belastungsinfektion mit einer niedrigen Infektionsdosis von 500 E. tenella-Oozysten.

Die humorale Immunantwort gegen die Eimerienantigene SO7 und TA4 im Serum immunisierter Tiere wurde mit Hilfe des ELISA untersucht. Als Zielantigen wurden die rekombinanten SO7- und TA4-Proteine eingesetzt. Immunisierte Tiere zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach einmaliger Immunisierung eine hohe [Seite 52↓]IgG-Antikörperkonzentration gegen das jeweilige Protein (Abb. 22). Dieser Antikörpertiter blieb über die zweite Immunisierung und die Infektion hinweg beständig. Zusätzlich konnten spezifische IgA-Antikörper im Serum immunisierter Tiere festgestellt werden, die aber deutlich niedriger konzentriert waren. Dies wird anhand der eingesetzten Serumverdünnungen (1:5000 bei IgG, 1:100 bei IgA) deutlich. Auch hier zeigten die immunisierten Tiere bereits nach der ersten Immunisierung eine spezifische Reaktion, die über die zweite Immunisierung und Infektion hinweg unverändert blieb.

Abb. 22: Antikörperantwort von Hühnern nach parenteraler Immunisierung mit TA4- und SO7-Protein am Tag 0 und 14.

Immunisierung mit 50 µg/Tier am Tag 0 (mit FCA) und Tag 14 (mit FIA). Die Kontrollgruppe erhielt lediglich PBS und Adjuvans. Belastungsinfektion mit 500 Eimeria tenella Oozysten am Tag 28. ELISA gegen rekombinantes TA4- bzw. SO7-Protein. Serumverdünnung: für IgG 1:5000, für IgA 1:100. Signifikanzniveau zur PBS-Kontrolle p ≤ 0,05 (*). Versuchsgruppen (n=5).

Wie an anderer Stelle bereits erläutert, wurde die Überprüfung der T-Zellproliferation immunisierter Hühner auf die Analyse der PBL nach Versuchsende beschränkt. Die PBL wurden zehn Tage nach der Belastungsinfektion entnommen und mit [Seite 53↓]rekombinantem Antigen, dem Mitogen ConA oder Sporozoitenantigen stimuliert.

Die PBL der mit TA4-Protein immunisierten Tiere zeigten im Gegensatz zur Kontrollgruppe signifikant erhöhte Proliferationswerte (p ≤ 0,05) nach Stimulation mit rekombinantem TA4-Antigen (Abb. 24). Als spezifische Proliferation wurde ein SI > 3 definiert. Dagegen zeigten die mit SO7-Protein immunisierten Tiere keine Erhöhung der Proliferation nach spezifischer Antigenstimulation (Abb. 22). Das Ergebnis deutet darauf hin, dass das TA4-Protein eine spezifische T-Zellreaktivität induzierte.

Abb. 23: Proliferation der PBL von parenteral immunisierten Hühnern nach Eimeria tenella-Belastungsinfektion und nach Restimulation mit SO7- bzw. TA4-Antigen.

Immunisierung mit 50 µg Protein/Tier am Tag 0 (mit FCA) und Tag 14 (mit FIA). Die Kontrollgruppe erhielt lediglich PBS und Adjuvans. Belastungsinfektion mit 500 E. tenella Oozysten am Tag 28.
PBL-Isolation am Tag 10 p.i.. Im: Immunisierung, Re: Restimulation mit rekombinantem SO7- oder TA4-Protein (0,5 µg/Napf). Querstrich: Median. Signifikanzniveau p ≤ 0,05 (*).

Die Überprüfung der allgemeinen T-Zellreaktivität der PBL durch das Mitogen ConA (15 µg/ml) zeigte, dass reaktive T-Zellen vorhanden waren. Die Werte zeigten durchschnittlich für die mit SO7-Protein immunisierte Gruppe 30215 ± 13325 cpm (Mediumkontrolle: 87 ± 30 cpm), für die mit TA4-Protein immunisierte Gruppe 30276 ± 13056 cpm (Mediumkontrolle: 130 ± 78) und für die mit PBS behandelte Kontrolle 46992 ± 15146 cpm (Mediumkontrolle: 72 ± 40). Die durchschnittlichen Proliferationswerte der mit SO7-Protein oder mit TA4-Protein immunisierten Tiere lagen ca. 33% niedriger als die Werte der PBS behandelten Kontrollen. Eine statistische Signifikanz konnte allerdings nicht festgestellt werden.


[Seite 54↓]

Die Überprüfung der T-Zellproliferation nach Stimulation durch Sporozoitenantigen sollte einen Hinweis auf den zellulären Immunstatus der Tiere nach der Belastungsinfektion geben. Die Mehrheit der infizierten Tiere zeigte (10 von 15 Tieren) erhöhte Proliferationswerte nach Antigenstimulation im Vergleich zum Kontrollansatz (Daten nicht gezeigt). Die SI-Werte lagen zwischen vier und 13 und somit über dem Schwellenwert drei, der als spezifische Proliferation definiert worden war. Diese Tiere zeigten keine Besonderheiten bezüglich der Infektion. Bei fünf Tieren konnte keine eimerienspezifische T-Zellproliferation nachgewiesen werden, obwohl reaktive T-Zellen vorlagen, wie die Proliferationswerte mit ConA gezeigt hatten. Die Ergebnisse zeigten, dass Eimerieninfektionen spezifische reaktive T-Zellen generierten, wobei die ermittelten Proliferationswerte mit früher publizierten Daten vergleichbar waren (Breed et al., 97).

Abb. 24: Oozystenausscheidung und Gewichtsdifferenz von parenteral immunisierten Hühnern während einer Eimeria tenella-Belastungsinfektion.

A: Gesamt-Oozystenausscheidung (Tag 5-10 p.i.). B: Gewichtsdifferenz individueller Tiere (Differenz von Tag 7 und Tag 0 p.i.). Immunisierung mit 50 µg Protein/Huhn am Tag 0 (mit FCA) und 14 (mit FIA). Infektion mit 500 E. tenella-Oozysten am Tag 28. TA4 (n=5). SO7 (n=5). PBS (n=5).

Als Maßstab für eine schützende Immunreaktion kann die Oozystenausscheidung dienen. Diese ergab jedoch im vorliegenden Experiment keine Unterschiede zwischen den immunisierten Tieren und der Kontrolle (Abb. 24A). Die Anzahl der ausgeschiedenen Oozysten waren bei den immunisierten Tieren mit 10,1 ± 1 x 106 (TA4) bzw. 10,2 ± 1,1 x 106 (SO7) etwas höher als die der Kontrollgruppe (7,9 ±1,9 x 106), wobei es sich jedoch vermutlich nur um einen zufälligen Unterschied handelte. Aus haltungstechnischen Gründen wurden die Hühner gruppenweise in einem Käfig [Seite 55↓]gehalten, so dass die Oozystenzahl von zusammengeführtem Fäzes ermittelt wurde. Die hieraus gewonnenen Ergebnisse können daher lediglich als Orientierung dienen.

Die Analyse der Gewichtszunahme nach Belastungsinfektion ergab keine deutlichen Unterschiede zwischen immunisierten Tieren und den Kontrolltieren. Im Durchschnitt zeigten die mit TA4- oder SO7-Protein immunisierten Tiere eine Gewichtszunahme um 93 ± 18 g bzw. 101 ± 24 g und die Kontrollgruppe um 114 ± 13 g (Abb. 24B).

Abschließend kann festgestellt werden, dass die parenterale Immunisierung mit den rekombinanten Antigenen SO7 und TA4 mit Freund's Adjuvans schon nach der ersten Immunisierung einen hohen Antikörpertiter generierte, der über die zweite Immunisierung und Belastungsinfektion hinweg beständig blieb. Die Analyse der T-Zellproliferation führte zu dem Ergebnis, dass die PBL von Tieren, die mit TA4-Protein immunisiert wurden, mit dem rekombinanten TA4-Antigen zur Proliferation angeregt werden konnten. Im Gegensatz dazu konnte bei den mit SO7-Protein immunisierten Tieren und den mit PBS behandelten Kontrolltieren keine T-Zellproliferation nach Stimulation mit rekombinanten Antigenen detektiert werden. Die Immunisierung hatte jedoch keinen Einfluss auf die Oozystenauscheidung und Gewichtsdifferenz nach der E. tenella-Belastungsinfektion.

2.2.3 Einfluss des Vektortypes, des Fusionspartners EGFP und koexprimierter Zytokine auf den Immunisierungserfolg mit SO7-DNA-Vakzinen

In dem vorliegenden Experiment sollten weitere Parameter des DNA-Immunisierungsschemas analysiert werden. Dies umfasste sowohl den Einsatz der beiden Vektoren pCDNA3 und pVR1012, als auch die Konstrukte mit und ohne EGFP-Fusion. Im Rahmen dieser Arbeit konnten nicht alle generierten Eimerienkonstrukte eingesetzt werden, so dass die Versuche auf die SO7-Plasmide beschränkt wurden. Für das SO7-Konstrukt sprachen die Resultate des vorangegangenen DNA-Immunisierungsexperimentes, in dem nur das SO7-Plasmid eine stabile antigenspezifische Immunreaktion induzierte. Der Immunisierungserfolg wurde anhand der SO7-spezifischen Serokonversion ermittelt. Obwohl die Antikörperantwort nicht mit dem Immunschutz gegen Eimerieninfektionen korreliert, kann darüber ermittelt werden, ob eine spezifische Immunreaktion nach DNA-[Seite 56↓]Immunisierung erfolgte und gibt somit indirekt Aufschluss über die Proteinexpression in vivo. Zusätzlich ist bei dem Nachweis einer Antikörperantwort davon auszugehen, dass auch zelluläre Immunreaktionen induziert wurden (Gurunathan et al., 00).

Des Weiteren wurde als Parameter für die schützende Immunantwort die Oozystenausscheidung nach Belastungsinfektion mit 500 E. tenella-Oozysten überprüft.

In zusätzlichen Versuchsgruppen wurden die inflammatorischen Zytokinplasmide chIFN-γ-pCDNA3 oder chIL-18-pVR1012 eingesetzt, womit der Einfluss der Koimmunisierung auf die immunologischen Parameter analysiert werden sollte.

Im vorherigen Versuch wurden zwei DNA-Applikationen mit EGFP-Fusionsplasmiden durchgeführt. Dabei ergab die Messung der Antikörperkonzentrationen gegen den Fusionspartner EGFP, dass der Antikörpertiter anstieg (siehe 2.2.2). Um zu testen, ob sich durch eine weitere Immunisierung der Antikörpertiter nochmals steigern lässt, wurden Hühner in einem Vorversuch dreimal mit 100 µg EGFP-pCDNA3 im Abstand von zwei Wochen immunisiert und die Antikörperreaktionen verfolgt. Das EGFP-Plasmid diente dabei als Modell für die DNA-Immunisierung.

Abb. 25: EGFP-spezifische Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung von Hühnern mit dem Modellplasmid EGFP-pCDNA3.

Im: Immunisierung (100µg DNA) am Tag 0, 14 und 28. ELISA gegen EGFP. Serumverdünnung 1:250.

Wie in Abbildung 25 zu erkennen ist, konnte tatsächlich ein weiterer Anstieg der Antikörperkonzentration nach der dritten Immunisierung erzielt werden. Zwei Tiere zeigten nach der dritten Immunisierung im ELISA einen klaren Anstieg der EGFP-spezifischen Antikörper. Bei einem immunisierten Huhn konnten keine EGFP- [Seite 57↓] Antikörper detektiert werden.

Für die nachfolgenden Experimente mit SO7-Konstrukten wurde dieses Immunisierungschema übernommen und Hühner im Alter von drei Wochen drei Mal im Abstand von zwei Wochen mit 100µg Plasmid-DNA intramuskulär immunisiert. In zwei Versuchen wurden die pCDNA3- bzw. pVR1012-Konstrukte mit dem fusionslosen SO7 und dem SO7-EGFP-Fusionskonstrukt eingesetzt. Zur Ermittlung der SO7-spezifischen Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung wurden ELISA durchgeführt und die Antikörpertiter ermittelt (Abb. 26).

Abb. 26: SO7-spezifischer Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28.

Dargestellt sind die Antikörpertiter von Tag 14 (14 d nach 1. Immunisierung), Tag 28 (14 d nach 2. Immunisierung) und Tag 35 (7 d nach 3. Immunisierung). DNA-Immunisierung/Tier mit 100 µg Plasmid. V1: Versuch 1, V2: Versuch 2. Signifikanzniveau zur Vektorkontrolle p ≤ 0,05 (*). ELISA (IgG) gegen rekombinantes SO7-Protein. Versuchsgruppen (n=5).


[Seite 58↓]

In jedem Experiment konnten spezifische SO7-Antikörper nachgewiesen werden, es ergaben sich aber zum Teil Unterschiede in der Intensität und dem Zeitpunkt der Antikörperreaktion. So zeigte z.B. die mit dem SO7-EGFP-Konstrukt immunisierte Gruppe im ersten pCDNA3-Versuch bereits nach der ersten Immunisierung eine signifikante Antikörperreaktion (Titer 220 ± 85). Im zweiten Versuch hingegen konnten erst nach der zweiten Immunisierung Antikörper (Titer 150 ± 35) detektiert werden. Dabei handelte es sich um einen deutlichen, nicht aber signifikanten Unterschied. Anders die mit SO7-Konstrukt immunisierten Gruppen beider pCDNA3-Versuche; sie zeigten die ersten deutlichen Antikörperreaktion nach der zweiten Immunisierung (Titer 220 ± 135 und 170 ± 85). Betrachtet man die pVR1012-Versuche, so kann festgestellt werden, dass im ersten Experiment nach der zweiten Immunisierung Antikörper im Serum der mit dem SO7- bzw. dem SO7-EGFP-Konstrukt immunisierten Tiere (Titer 200 ± 69 und 130 ± 47) vorhanden waren. Im zweiten Experiment ergab sich jedoch erst nach der dritten Immunisierung ein Antikörpertiter für beide Gruppen von 260 ± 77 (SO7) und 210 ± 87 (SO7-EGFP) (Abb. 27). Ein Vergleich der Experimente hinsichtlich der eingesetzten Vektoren pCDNA3 und pVR1012 ergab keine auffälligen Unterschiede bezüglich der Induktion der Antikörperantworten.

Einer Versuchstiergruppe wurde zusätzlich zum SO7-Fusionsplasmid das Konstrukt chIFN-γ-pVR1012 als Kostimulans appliziert. Dabei zeigte die Antikörperantwort keine wesentlichen Unterschiede in der Serumkonzentration nach der dritten Immunisierung (Abb. 27).

Abb. 27: SO7-Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28 mit SO7-Fusionskonstrukt und chIFN-γ-Plasmid.

100 µg SO7-EGFP-pVR1012 ± 50 µg chIFN-γ-pVR1012 (n=5). Ant­ikörpertiter von Tag 14 (14 d nach 1. Immunisierung), Tag 28 (14 d nach 2. Immunisierung) und Tag 35 (7 d nach 3. Immunisierung).


[Seite 59↓]

Neben chIFN-γ wurde auch chIL-18 auf seine kostimulierende Wirkung überprüft. Es wurden je Immunisierung zusätzlich 50 µg chIL-18-pCDNA3 eingesetzt. Jedoch konnten auch hier keine signifikanten Unterschiede in der Antikörperkonzentration festgestellt werden (Abb. 28). In dem vorliegenden Experiment konnten 14 Tage nach der ersten Immunisierung keine SO7-Antikörper detektiert werden. Nach der zweiten und dritten Behandlung zeigten die mit SO7-Konstrukten immunisierten Tiere deutliche Antikörpertiter von 150 bis 250.

Abb. 28: SO7-Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28 mit SO7-pCDNA3-Konstrukten und chIL-18-pCDNA3.

Immunisierung: Am Tag 0, 14 und 28 (100 µg DNA/Tier ± 50 µg chIL-18-pCDNA3). Dargestellt sind die Antikörpertiter von Tag 14 (14 d nach 1. Immunisierung), Tag 28 (14 d nach 2. Immunisierung) und Tag 35 (7 d nach 3. Immunisierung). Signifikanzniveau zur Vektorkontrolle p ≤ 0,05 (*). Gruppen (n=5).

Die Wirkung der beiden Zytokine chIFN-γ und chIL-18 besteht hauptsächlich in der Aktivierung von Makrophagen bzw. T-Zellen und führt letztendlich zur Ausbildung einer TH1-Immunreaktion (Gobel et al., 03; Sugawara, 00). Daher wurde vermutet, dass die Koimmunisierung mit diesen Zytokinen zu einer reduzierten Antikörperkonzentration führen könnte. Die Experimente zeigten jedoch, dass unter den gegebenen Bedingungen die zusätzliche Gabe von chIL-18 oder chIFN-γ keinen Einfluss auf die Ausbildung SO7-spezifischer Antikörper hatte.

Um beurteilen zu können, ob die SO7-DNA-Immunisierung mit den unterschiedlichen Vektoren bzw. mit oder ohne EGFP-Fusion einen veränderten Immunschutz hervorrufen kann, wurden die Versuchstiere einer Belastungsinfektion unterzogen. Als Schutzparameter wurde die Oozystenauscheidung und die Gewichtsdifferenz nach einer moderaten Belastungsinfektion mit 500 E. tenella-Oozysten analysiert. [Seite 60↓]Hinsichtlich der Oozystenauscheidung konnten keine Unterschiede zwischen den mit SO7-Konstrukten immunisierten Hühnern und den entsprechenden Kontrollen festgestellt werden (Tab. 7). Jedoch wurden in den ersten Versuchen große Unterschiede zwischen den mit EGFP-Plasmiden behandelten Gruppen, d.h. SO7-EGFP- und EGFP-Konstrukte, zu den Tieren die lediglich SO7-Konstrukt oder Vektor ohne Insert erhielten, festgestellt. Hierbei betrug die Oozystenausscheidung der mit EGFP-Plasmiden immunisierten Tiere das Drei- bis Fünffache der Gruppen, die mit Plasmiden ohne EGFP immunisiert wurden. Diese Resultate konnten jedoch in den nachfolgenden Experimenten nicht bestätigt werden (Tab. 7). Die Resultate der Oozystenausscheidungen können lediglich als Orientierung dienen, da sie aus dem Gesamt-Fäzes der Versuchsgruppen bestimmt wurden. Aus diesem Grund konnte keine statistische Auswertung vorgenommen werden.

Bakterielle CpG-Sequenzen, wie sie in Plasmid-DNA zu finden sind, besitzen immunstimulierende Eigenschaften und können die Immunreaktion verändern. Deshalb wurde zusätzlich eine Versuchstiergruppe, die lediglich mit PBS behandelt wurde, mitgeführt und der Einfluss der eingesetzten Vektoren auf die E. tenella-Infektion überprüft. Wie in Tabelle 7 ersichtlich, zeigte sich bei den verschiedenen pVR1012-Konstrukten eine Reduktion der Oozystenausscheidung zwischen 26% und 52 % im Vergleich zu PBS-behandelten Tieren. Hingegen wurden solche Unterschiede bei den pCDNA3-Plasmiden nicht beobachtet. Ob es sich bei den aufgezeigten Unterschieden tatsächlich um Vektor-bedingte Einflüsse handelte, müsste jedoch in zusätzlichen Studien überprüft werden.

Tab. 7: Oozystenausscheidung von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.

Oozysten x 10 6 /Tier

SO7-GFP

GFP-Kontrolle

SO7

Vektorkontrolle

PBS-Kontrolle

pVR1012 Versuch 1

16,5 ± 4,86

23 ± 3,2

6,1 ± 1,6

5,1 ± 0,8

-

pVR1012 Versuch 2

(+ 50 µg IFN- γ -pVR1012)

10,5 ± 1,9

(14,0 ± 2,5)

9,6 ± 2,0

-

14,6 ± 2,0

-

12,6 ± 2,4

-

19,9 ± 3,7

-

pCDNA3 Versuch 1

6,2 ± 1,3

7,1 ± 0,8

2,1 ± 1,2

1,5 ± 0,4

-

pCDNA3 Versuch 2

(+50 µg IL-18-pCDNA3)

5,3 ± 0,8

(4,2 ± 0,4)

4,1 ± 0,5

-

3,7 ± 0,5

(3,6 ± 0,7)

3,9 ± 0,5

-

3,2 ± 0,8

(4,2 ± 0,7)

Oozystenausscheidung von Tag 5 - Tag 10 p.i. (n=5). Belastungsinfektion mit 500 E. tenella-Oozysten


[Seite 61↓]

Die Analyse der Gewichtsdifferenz der immunisierten Tiere im Vergleich zu den PBS- oder Vektorkontrollen ergab keine auffälligen Unterschiede (Tab. 8). Die prozentuale Gewichtszunahme der einzelnen Gruppen betrug sieben Tage nach der Infektion zwischen 13 % bis 18 % des Gewichtes der Tiere am Infektionstag.

Tab. 8: Gewichtsanalyse von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.

Δ Gewicht (%)

( Gewicht am Infektionstag [g])

SO7-GFP

GFP-Kontrolle

SO7

Vektor-kontrolle

PBS-Kontrolle

pVR1012 Versuch 1

15,9 ± 1,2

(783 ± 97,9)

16,9 ± 2,3

(829 ± 95,4)

18,9 ± 2,3

(838 ± 135,2)

17,9 ± 4,1

(831,4 ± 63,7)

-

pVR1012 Versuch 2

14,1 ± 6,0

(737 ± 50,7)

14,0 ± 5,9

(825 ± 154,8)

15,2 ± 4,6

(832 ± 42)

17,5 ± 0,5

(795 ± 91,3)

18,4 ± 5,4

(899 ± 87,2)

(+ 50 µg IFN- γ -pVR1012)

20,4 ± 4,5

(826 ± 77,6)

-

-

-

-

pCDNA3 Versuch 1

16,6 ± 4,8

(831 ± 59,8)

15,0 ± 5,5

(834 ± 47,6)

16,5 ± 6,5

(847 ± 100,1)

15,3 ± 3,1

(810 ± 62,7)

-

pCDNA3 Versuch 2

(+50 µg IL-18-pCDNA3)

13,8 ± 4,6

(705 ± 67)

14,1 ± 1,8

(635 ± 87)

17,1 ± 4,8

(635 ± 84,4)

-

15,7 ± 1,7

(644 ± 44,6)

13,2 ± 1,5

(628,8 ± 77,8)

16,1 ± 4,9

(639 ± 90,6)

-

12,6 ± 2,6

(667 ± 42,5)

12,8 ± 2,9

(630 ± 36,1)

ΔGewicht (%): prozentuale Gewichtszunahme der Hühner am Tag 7 nach einer Belastungsinfektion mit 500 E. tenella-Oozysten. Versuchsgruppen (n=5).

Die Experimente konnten zeigen, dass durch die Immunisierung mit den unterschiedlichen SO7-Konstrukten spezifische SO7-Antikörperantworten generiert wurden. Hinsichtlich der eingesetzten Vektoren und des EGFP-Fusionsanteils konnten keine eindeutigen Unterschiede in der Induktion der humoralen Immunantwort beobachtet werden. Die Oozystenausscheidung oder Gewichtsdifferenz nach E. tenella-Belastungsinfektion zeigte keine Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen.

2.3 DNA-Immunisierungsstudien mit neu-identifizierten, sekretorischen E. tenella-Antigenen bei Hühnern

Um zu überprüfen, ob die hier identifizierten sekretorischen Eimerienproteine einen Immunschutz induzieren können, wurden sie in Immunisierungsexperimenten eingesetzt. Dabei konnte aus Kapazitätsgründen nur ein Teil der identifizierten [Seite 62↓]Sequenzen als DNA-Impfstoff getestet werden.

Die Sequenzinformationen der 25 experimentell im Hefesystem identifizierten Sequenzen umfassten trotz des Abgleichs mit der E. tenella-EST-Bank nicht immer einen kompletten ORF. Deshalb wurden zur Generierung der DNA-Immunisierungskonstrukte 13 Sequenzen ausgewählt, die einen ORF mit Start- und Stop-Kodon aufwiesen. Neben den Sequenzen H3, H4, H14, H15, H35 und H36, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen keine Homologie zu bekannten Proteinsequenzen zeigten, wurden die Sequenzen H1, H7, H9, H11, H13, H24 und H28 zur Klonierung ausgewählt. Diese Sequenzen zeigten Homologien zu schon bekannten Proteinen, sind aber bei E. tenella mit Ausnahme von H11 bisher nicht als Proteinsequenzen beschrieben worden (siehe Abschnitt 2.1.2.3). H11 wurde kürzlich in SAG10 (EMBL: Q70CC2) in der Proteindatenbank umbenannt (Tabares et al., 04). Es handelt sich um ein TA4-ähnliches Molekül, das mit anderen verwandten Proteinen auf der Parasitenoberfläche zu finden ist. TA4 wurde als Haupt-oberflächenprotein von E. tenella-Sporozoiten identifiziert (Brothers et al., 88).

Die DNA-Immunisierung fand nach dem Schema statt, das in den vorherigen Versuchen erarbeitet worden war. Im Gegensatz zu pVR1012 wurde pCDNA3 schon häufig zur DNA-Immunisierung bei Hühnern eingesetzt. Beispielsweise führte die Applikation der Sequenz Ea3-1E wiederholt zu einer Reduktion der Parasitenlast nach Belastungsinfektionen mit E. acervulina(Lillehoj et al., 00; Song et al., 00). Da in den vorliegenden Untersuchungen keine wesentliche Unterschiede bezüglich der Proteinexpression oder Immunreaktion festzustellen war, wurde zur Klonierung der ausgewählten Sequenzen auf pCDNA3 zurückgegriffen.

1 Klonierung und Überprüfung der ausgewählten sekretorischen Eimeriensequenzen im eukaryotischen Expressionsvektor pCDNA3

Zur Klonierung der oben genannten Sequenzen wurde eine RT-PCR mit Sporozoiten-Gesamt-RNA durchgeführt, wobei der Bereich der Signalsequenz nicht berücksichtigt wurde. Wie aus Abbildung 29 hervorgeht, konnten die spezifischen Transkripte mittels RT-PCR amplifiziert werden. Im Agarosegel wurden jedoch mitunter noch zusätzliche unspezifische Banden detektiert. Die Banden, die der erwarteten Größe (siehe Tab. 9) entsprachen, wurden aus dem Gel eluiert und in den T-Überhangsvektor pGEM-T (Promega, Heidelberg) kloniert.


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Abb. 29: Agarose-Gelelektrophorese der mittels RT-PCR isolierten Eimeria tenella-cDNA's.

RT-PCR-Ansätze (H1 bis H36) im 0,8-%igen Agarosegel aufgetrennt. M: DNA-Marker. Negativkontrolle (-).

Tab. 9: Erwartete PCR-Produkte und theoretisches Molekulargewicht der abgeleiteten Eimeria tenella-Proteine.

 

H1

H3

H4

H7

H9

H11

H13

H14

H15

H24

H28

H35

H36

NS

(bp)

550

607

1168

715

174

736

865

184

404

817

745

466

1264

MW (kDa)

19,6

21,7

43,2

24,5

5,6

25,3

31

6,3

14,6

30

26,9

16,4

44,9

NS: Nukleinsäuresequenz in Basenpaaren (bp) ohne Signalsequenz. MW: Molekulargewicht in kDa der abgeleiteten Proteine.

Um die Sequenzen zu verifizieren wurde eine DNA-Sequenzierung durchgeführt. Sie zeigte, dass alle klonierten Fragmente den erwarteten Sequenzen entsprachen.

Für die unbekannten Eimeriensequenzen liegen derzeit keine rekombinanten Proteine vor, so dass keine spezifische Antikörperantwort detektiert werden kann. Um dennoch den Immunisierungserfolg in Hühnern überprüfen zu können, wurde der Zielvektor pCDNA3 im 5'-Bereich der Klonierungsstelle durch Oligonukleotidinsertion mit einem myc-Epitop versehen. Es handelt sich dabei um ein kurzes, zehn Aminosäuren umfassendes, lineares B-Zellepitop für das kommerzielle monoklonale Antikörper verfügbar sind. Zusätzlich wurde damit eine spezifische Proteindetektion in Zellextrakten von COS-7-Zellen ermöglicht.

Zur Amplifikation der 13 Eimeriensequenzen wurden jeweils Primer verwendet, die mit zwei unterschiedlichen Restriktionsschnittstellen versehen waren, so dass die Fragmente zielgerichtet in pCDNA3myc umkloniert werden konnten. Aufgrund unterschiedlicher Restriktionsschnittstellen in den Eimeriensequenzen mussten [Seite 64↓]teilweise verschiedene Enzymkombinationen gewählt werden. Die Sequenzen H9, H11 und H13 wurden mit BamHI/XhoI, die Sequenz H15 mit HindIII/NotI und die restlichen Sequenzen (H1, H3, H4, H7, H14, H24, H28, H35, H36) mit HindIII/XhoI aus pGEM-T ausgeschnitten und in den entsprechend vorbereiteten pCDNA3myc-Vektor ligiert. Zur Überprüfung des Klonierungserfolges wurden Restriktionsanalysen durchgeführt, die zeigten, dass die erwarteten Fragmentgrößen kloniert wurden (Daten nicht gezeigt).

Um die Genexpression zu kontrollieren wurden COS-7-Zellen mit den DNA-Immunisierungsvektoren transfiziert und die Zellextrakte im Immunblot analysiert. Zur Detektion wurde ein kommerzieller anti-myc-Antikörper (Invitrogen, Karlsruhe) eingesetzt. Es zeigte sich, dass bei sieben Konstrukten entsprechende Banden im Immunblot detektiert werden konnten (Vergleiche Tab. 9 und Abb. 30). Bei sechs Konstrukten konnte keine Expression nachgewiesen werden. Vermutlich lag hier die Proteinexpression unter der Nachweisgrenze. Die genaue Analyse der Signale bei den Konstrukten H3, H7 und EGFP-Kontrolle zeigte zwei dicht nebeneinander liegende Signale, die sich etwa auf der Höhe der erwarteten Molekulargewichte befanden. H4 zeigte zwei Signale bei ca. 23 und 30 kDa, wobei hier ein Signal bei 43 kDa erwartet wurde. Es könnte sich um eine Fragmentierung des Proteins handeln. Bei den übrigen Sequenzen wurden einzelne Banden detektiert, wobei das apparente Molekulargewicht bei H7 und H11 etwa dem erwarteten von 24 kDa bzw. 25 kDa entsprach. Hingegen zeigten die Proteinbanden von H13 (27 statt 31 kDa), H28 (23 statt 27 kDa) und H36 (30 statt 45 kDa) niedrigere Molekulargewichte als erwartet (Vergleiche Abb. 30 und Tab. 11).

Abb. 30: Immunblotanalyse der pCDNA3myc-Konstrukte in COS-7-Zellen mit anti-myc-Antikörper.

COS-7-Zellen (Extrakt aus 5 x 104 Zellen/Spur) transfiziert mit Immunisierungsvektoren (H1 bis H36). Anti-myc-Antikörper (1:5000). Positivkontrolle: EGFP-pCDNA3myc (+). Pfeile: detektierte Signale


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2  DNA Immunisierung von Hühnern mit den generierten Eimeria-cDNA-Konstrukten

Die 13 generierten DNA-Konstrukte wurden in einem Immunisierungsexperiment eingesetzt. Es erfolgten nach dem etablierten Immunisierungsschema (Abb. 31) drei Immunisierungen im Abstand von zwei Wochen mit je 100 µg DNA/Tier. Die Belastungsinfektion mit 500 E. tenella-Oozysten erfolgte eine Woche nach der dritten Immunisierung.

Abb. 31: Schema zur DNA-Immunisierung von Hühnern.

Es wurden zwei Negativkontrollen (PBS- bzw. Vektorkontrolle), sowie eine Positivkontrolle mitgeführt. Die Tiere der Positivkontrolle wurden im Alter von drei Wochen mit jeweils 500 E. tenella-Oozysten infiziert, was schließlich zur natürlichen Immunität führte.

Um den Immunisierungserfolg zu überprüfen, wurden die Seren der Versuchstiere im ELISA analysiert. Da zum Zeitpunkt der Arbeiten noch keine aufgereinigten rekombinanten Proteine vorlagen, wurden die Seren auf anti-myc-Antikörper hin analysiert. Hierzu wurden synthetisch hergestellte myc-Peptide (Dr. Volkmer-Engert, Medizinische Immunologie, Charite Berlin) an bovines Serumalbumin (BSA) gekoppelt. Die ELISA-Analyse der zu unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnenen Seren (1:100 verdünnt) ergab, dass in keinem Fall spezifische anti-myc-Antikörper nachweisbar waren (Daten nicht gezeigt).

Die Analyse der Oozystenausscheidung ergab in dem Experiment eine deutliche Reduktion bei den Konstrukten H7 (- 48%) und H15 (- 29%) im Vergleich zu den Negativkontrollen (Abb. 32). Auch die Positivkontrolle zeigte eine drastische [Seite 66↓]Verringerung der Oozystenausscheidung um 93%. Bei vier Gruppen wurde eine Erhöhung der Oozystenausscheidung festgestellt. Wie schon ausgeführt, wurde der Fäzes einzelner Gruppen als Pool untersucht, so dass die Daten lediglich einen orientierenden Hinweis geben können. In einem weiteren Immunisierungsexperiment, das im Rahmen einer Diplomarbeit durchgeführt wurde (Gehre, 04), konnten die Resultate mit Ausnahme der Positivkontrolle nicht reproduziert werden. Es ist daher davon auszugehen, dass die gefundenen Unterschiede in der Oozysten-ausscheidung auf zufälligen Schwankungen beruhen.

Abb. 32: Oozystenausscheidung von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.

Gesamt-Oozystenausscheidung/Tier (Tag 5-10 p.i.). H1 bis H36: verschiedene pCDNA3myc-Konstrukte. pc: Vektorkontrolle (pCDNA3myc). PBS: Tiere, die lediglich PBS erhielten. PK: Positivkontrolle (Hühner nach überwundener E. tenella-Erstinfektion). Versuchsgruppen (n=5).

Hinsichtlich der Gewichtsdifferenz der Hühner konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen festgestellt werden (Abb. 33). Auch die Positivkontrolle, und damit Hühner, die eine natürliche Immunität nach Erstinfektion besaßen, zeigten keine effizientere Gewichtszunahme während der Belastungsinfektion im Vergleich zu den anderen Gruppen. Aufgrund dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die relativ geringe Infektionsdosis von 500 Oozysten nicht ausreichte, um Unterschiede in der Gewichtsentwicklung zwischen geschützten und nicht-geschützten Tieren beobachten zu können.


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Abb. 33: Gewichtsdifferenz von DNA-immunisierten Hühnern während der E. tenella-Belastungsinfektion.

Gewichtszunahme/Tier (Gewichtsdifferenz von Tag 7 und Tag 0 p.i.). H1 bis H36: verschiedene pCDNA3myc-Konstrukte. pCDNA3: Vektorkontrolle (pCDNA3myc). PBS: Tiere, die lediglich PBS erhielten. Pos-K: Positivkontrolle (Hühner nach überwundener E. tenella-Erstinfektion). Versuchsgruppen (n=5).


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18.05.2005