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3  Diskussion

Da Eimerieninfektionen eine adäquate Immunprotektion gegen Reinfektionen induzieren, erscheint die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes erfolgversprechend (Jenkins, 98). Bisher durchgeführte Untersuchungen auf diesem Gebiet führten zwar zur Identifizierung einiger Eimerienantigene, mit denen jedoch in Immunisierungsstudien lediglich Teilerfolge erzielt werden konnten (Vermeulen, 98). Vermutlich sind hierfür nicht nur die eingesetzten Antigene verantwortlich, sondern auch die Art der Antigenapplikationen. Die Entwicklung eines erfolgreichen Impfstoffes erfordert daher die Identifizierung neuer Antigene und die Anwendung von möglicherweise effizienteren Applikationsrouten.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, neue sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren, und diese mittels DNA-Immunisierung zu testen. Zunächst wurden die drei bekannten E. tenella-Antigene SO7 (Profous-Juchelka et al., 88), TA4 (Brothers et al., 88) und EtMIC1 (Tomley et al., 91) eingesetzt, um ein DNA-Immunisierungsprotokoll zu erstellen. Dabei wurde außerdem der Einfluss von zwei unterschiedlichen Vektoren und eines stabilisierenden Fusionspartners EGFP auf die Immunantwort nach DNA-Immunisierung überprüft. Zusätzlich wurden die zwei proinflammatorischen Zytokine chIL-18 und chIFN-γ zur Koimmunisierung eingesetzt. Die Identifizierung von sekretierten Molekülen von E. tenella erfolgte zum einen über einen bioinformatischen Ansatz und zum anderen über ein experimentelles Verfahren in Hefen.

3.1 Sekretorische Eimerienproteine als Impfstoffkandidaten

Die Identifizierung von Parasitenantigenen, die eine protektive Immunantwort gegen natürliche Infektionen vermitteln, ist ein entscheidender Punkt in der Impfstoffentwicklung (Jenkins, 98; Lillehoj und Trout, 96; Vermeulen et al., 01). Verschiedene Impfstoffe gegen komplexe Krankheitserreger wie Plasmodien (Bojang et al., 01; Kester et al., 01) oder Leishmanien (Campos-Neto et al., 02; Coler et al., 02; Skeiky et al., 02) enthalten Oberflächenantigene und werden zur Zeit in klinischen Studien getestet. Bei diesen fortgeschrittenen Impfstoffansätzen werden zahlreiche potentiell protektive Antigene eingesetzt. Es wird weiterhin versucht, die Wirksamkeit vor allem durch eine geeignete Applikationsform zu erhöhen. Jedoch [Seite 69↓]bleibt festzustellen, dass trotz intensiver Bemühungen durchschlagende Erfolge noch ausstehen. Die bisherigen Impfstoffkandidaten von Eimerien sind auch auf der Oberfläche lokalisiert oder werden sekretiert, konnten aber ebenfalls in Immunisierungsstudien nicht überzeugen (Jenkins, 98).

Die Suche nach protektiven Antigenen von Eimerien konzentrierte sich bisher vor allem auf die Immunanalyse mit Infektionsseren und auf die Identifizierung invasionsblockierender Antikörper (Crane et al., 88; Miller et al., 89; Profous-Juchelka et al., 88; Refega et al., 03). Da die Immunprotektion gegen Eimerien über den zellulären Arm der Immunantwort vermittelt wird (Rose, 96), könnten diese konventionellen Screening-Verfahren fehlschlagen.

Aufgrund dieser Erkenntnisse sollten in der vorliegenden Arbeit sekretierte Moleküle und Oberflächenantigene der frühen invasiven Stadien (Sporozoiten und Merozoiten) identifiziert werden. Darunter sollten sich, so die Hypothese, potentiell protektive Antigene befinden. Hintergrund dieser Überlegungen ist, dass diese Moleküle direkt mit den Wirtszellen interagieren und daher vermutlich bevorzugt dem Wirtsimmunsystem präsentiert werden.

Die Identifizierung sekretorischer Proteine wurde über eine experimentelle Analyse in Hefen und über eine in silico-Analyse von E. tenella-EST-Datenbanken durchgeführt. Beide Methoden machen sich zu Nutze, dass sekretierte Proteine, bis auf wenige Ausnahmen, eine N-terminale Konsensussequenz tragen, die ihre Translokation in das ER vermittelt. Da dieser Prozess in eukaryotischen Zellen hochkonserviert ist, sind die Signalpeptide von Proteinen funktionell austauschbar. Des Weiteren können Signalsequenzen aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften sehr gut identifiziert werden (Klein et al., 96; Nielsen und Krogh, 98).

Die in der vorliegenden Arbeit angewandte Signalpeptidselektion in Hefen erlaubt es, mit einer hohen Erfolgsquote Gene zu isolieren, die für sekretierte Proteine kodieren (Klein et al., 96). Hierzu war es zunächst notwendig, eine cDNA-Bank von E. tenella-Sporozoiten herzustellen, die dann zur Selektion in die Hefemutanten transfiziert wurde. Die cDNA-Bank resultierte in 5 x 105 cfu, was einer niedrigen Ausbeute entsprach (Jacobs et al., 99). Einerseits kann dafür das limitierte Ausgangsmaterial verantwortlich gewesen sein, andererseits verursachte der relativ große Klonierungsvektor pSUC2 eine Verringerung der Transformationseffizienz (Inoue et al., 90). Vermutlich könnte durch größere Mengen von Ausgangsmaterial und durch die Anwendung alternativer Transformationsmethoden (z. B. Elektroporation) die Ausbeute erhöht werden (Miller, 94).

Die Hefeselektion führte zur Identifizierung von 191 positiven Klonen, welches in Bezug auf die getesteten Klone einem Selektionsfaktor von etwa 1000 entsprach. In früheren Arbeiten wurden Selektionsfaktoren zwischen 5000 bis 50000 beschrieben, wobei die 10- bis 100-fach höhere Anzahl positiver Hefetransfektanten getestet wurde (Jacobs et al., 97; Klein et al., 96). Demnach scheint die Selektionsrate in einer gewissen Abhängigkeit zu der Zahl der Ausgangsklone zu stehen, was vermutlich an der unterschiedlichen technischen Umsetzung des Screening-Verfahrens liegt. Die Anzahl der hier gefundenen falsch-positiven Klone liegt mit 15 % im Rahmen der dokumentierten Fehlerquote von 10 - 20 % (Jacobs et al., 97; Klein et al., 96). Die Identifizierung der falsch-positiven Klone beruht vermutlich auf zufälligen DNA-Sequenzen, die einer Signalsequenz ähnlich sind und damit eine Sekretion zulassen (Kaiser et al., 87). Verstärkt wird dieser Effekt dadurch, dass schon eine schwache Invertasesekretion von nur 3 % des Levels der Wildtyp-Hefe ausreicht, um das Hefewachstum auf Selektionsmedium zu ermöglichen (Kaiser und Botstein, 86).

Generell schwierig zu bestimmen ist die Anzahl falsch-negativer Sequenzen. Es besteht die Möglichkeit, dass die Sequenz aufgrund ungleichmäßiger oder unvollständiger Amplifikation nicht in der cDNA-Bibliothek vorhanden ist oder die Bibliothek nicht umfassend genug ist, um alle Transkripte abzudecken. Zum anderen wird das Signalpeptid möglicherweise von der Hefezelle nicht erkannt. Obwohl in vielfältigen Studien gezeigt werden konnte, dass Signalsequenzen verschiedener Organismen funktionell austauschbar sind, trifft dieses nicht immer zu (Galliciotti et al., 01). Schließlich können biologische Eigenschaften, wie zum Beispiel Toxizität des exprimierten Gens dazu führen, das Zellwachstum zu inhibieren oder Zellschädigungen hervorzurufen.

Die Hefemethode erlaubt es, im Vergleich zur zufälligen Sequenzierung von EST-Sequenzen Gene, die für sekretorische Proteine kodieren, mit einer fünffachen Effizienz anzureichern und zu isolieren (Klein et al., 96; Taft et al., 02). Des Weiteren kann sie bei jedem höheren und niederen eukaryotischen Organismus angewendet [Seite 71↓]werden (Goo et al., 99; Jacobs et al., 97; Musembi et al., 00). Im Vergleich zu anderen Systemen ist die Selektion in Hefen weit entwickelt (Chen und Leder, 99; Tashiro et al., 99) und erlaubt die gleichzeitige Testung von bis zu 108 Transfektanten (Jacobs et al., 99).

Insgesamt wurden mit Hilfe der Hefeselektionsmethode 25 unabhängige Sequenzen identifiziert. Um zusätzliche Informationen über die Sequenzen zu erhalten, wurden diese mit E. tenella-EST-Datenbanken verglichen. Dieser Schritt war notwendig, da das Hefesystem nur für den Einsatz kurzer DNA-Fragmente optimiert ist (Jacobs et al., 99). Die Analyse der EST-Sequenzen zeigte eine eindeutige stadienspezifische Verteilung der gefundenen Eimeriensequenzen. Da die Isolierung aus Sporozoiten vorgenommen wurde, stammten die meisten EST-Sequenzen wie erwartet aus Sporozoiten. Über die stadienspezifische Expression von sekretorischen Proteinen bei Apikomplexa ist zur Zeit noch wenig bekannt, so dass die Daten erste Hinweise auf das Expressionsprofil und die Lokalisierung der identifizierten Sequenzen geben können. Für die Entwicklung einer Vakzine ist das Wissen um die stadienspezifische Expression der Zielproteine wichtig. Bei Malaria gibt es verschiedene Ansätze, welche die Bekämpfung von Sporozoiten oder von Merozoiten des Blutstadiums zum Ziel haben und dementsprechend Antigene verschiedener Entwicklungsstadien beinhalten (Moorthy et al., 04). Auch frühere EST-Studien konnten zeigen, dass bei E. tenella und anderen Apikomplexa eine stadienspezifische Transkription unterschiedlicher Gene stattfindet (Li et al., 03; Ng et al., 02). Neben der reinen Analyse von EST-Datenbanken zeigten auch microarray-Analysen große Unterschiede in der Expression von Genen aus verschiedenen Lebensstadien von P. falciparum und T. gondii(Bozdech et al., 03; Cleary et al., 02). Diese Daten stimmen allgemein sehr gut mit experimentellen Daten überein und können für die Vorauswahl von Impfstoffkandidaten von großem Nutzen sein.

Mit der bioinformatischen Methode konnten 84 E. tenella -Sequenzen identifiziert werden, die signifikante Homologien zu Proteinen mit N-terminaler Konsensussequenz zeigten. Diese Arbeiten wurden von R. Marhöfer und P. Selzer (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) durchgeführt. Die weitere Analyse zeigte, dass 17 Sequenzen Homologien zu Mitochondrienproteinen aufwiesen. In zukünftigen Studien könnte die Anzahl dieser Proteine durch die Anwendung eines verbesserten Algorithmus ausgeschlossen werden (Bendtsen et al., 04). Für die [Seite 72↓]Entwicklung eines Impfstoffes sind diese Proteine von geringer Bedeutung, da die Moleküle in der Regel nicht dem Immunsystem zugänglich sind. Mitochondrienproteine könnten jedoch als Ziele für einen chemotherapeutischen Ansatz dienen. Beispielsweise greifen einige Malaria-Medikamente wirksam in den Stoffwechsel von Mitochondrien ein (Krungkrai et al., 97; Vaidya, 04).

Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die in silico-Strategie eine hocheffiziente Methode darstellt, durch die sekretorische Sequenzen aus EST-Datenbanken extrahiert werden können. Dabei kann aus großen Datenmengen eine überschaubare Anzahl von Sequenzen identifiziert werden. Der Ansatz basiert auf der Analyse von signifikanten Sequenzhomologien zu schon bekannten Proteinen, die eine Signalsequenz tragen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass aufgrund der Analogien eine direkte Vorhersage über die Lokalisierung und Funktion der identifizierten Sequenzen ermöglicht wird. Hieraus können dann direkt potentielle Antigene oder Zielmoleküle für therapeutische Ansätze ausgewählt werden.

Andere bioinformatische Analysen zur Identifizierung von Signalsequenzen arbeiten beispielsweise mit virtuellen ORF aus Genom-Datenbanken (Foth et al., 03). Der Nachteil dieser Methoden besteht darin, dass Sequenzen identifiziert werden, deren Stadienspezifität und Funktion nachträglich weiter analysiert werden müsste.

Das Hefesystem bietet die Möglichkeit, die bioinformatischen Daten in kurzer Zeit zu verifizieren. Das zeigten die sechs überlappenden Sequenzen, die sowohl mit der bioinformatischen Methode als auch mit dem Hefeansatz identifiziert werden konnten. Zusätzlich besitzt die Hefemethode den Vorteil, dass neue, bis dahin unbekannte Proteine identifiziert werden können. In der vorliegenden Arbeit konnten potentielle N-terminale Signalsequenzen von 22 neu identifizierten sekretorischen E. tenella-Proteinen präsentiert werden. Lediglich drei der insgesamt 25 positiven Sequenzen, die mit dem Hefesystem identifiziert wurden, waren identisch zu den schon bekannten E. tenella-Proteinen EtMIC5 (Brown et al., 00), TA4 (Brothers et al., 88) und SAG10 (Tabares et al., 04).

Mit der bioinformatischen Analyse wurden in der vorliegenden Arbeit etwa dreimal mehr sekretorische Sequenzen identifiziert als mit der Hefemethode. Obwohl dieser rein quantitative Unterschied durch weiteres Durchmustern mit der Hefemutante [Seite 73↓]reduziert werden könnte, sind für die gefundenen Unterschiede vermutlich noch weitere Faktoren verantwortlich. Ein Faktor kann die bereits im Vorfeld eingeschränkte Auswahl der cDNA-Sequenzen sein. Während für die bioinformatische Analyse sowohl Sporozoiten- als auch Merozoiten-cDNA-Datenbanken genutzt wurden, kam in der Hefeselektionsanalyse lediglich Sporozoiten-cDNA zum Einsatz. Auch technische Gründe, wie etwa die Komplexität der cDNA-Bank, können zur geringen Anzahl unabhängiger Sequenzen beigetragen haben (Jacobs et al., 99). Des Weiteren wurde eine hohe Redundanz der cDNA-Sequenzen festgestellt, die mit der Hefemethode identifiziert wurden. Dabei fiel eine ungleichmäßige Verteilung der Sequenzen auf. Die fünf am häufigsten identifizierten Moleküle deckten ca. 60 % der gesamten untersuchten Sequenzen ab. Es handelte sich hierbei nicht um die natürliche Sequenzverteilung innerhalb der sekretorischen Sequenzen von Sporozoiten. Die Über- oder Unterrepräsentierung von Sequenzen, die sich durch die Analyse in der Hefe ergab, beruht vermutlich auf der Herstellung oder Expression der cDNA-Fragmente, nicht jedoch auf den spezifischen Eigenschaften der heterologen Proteinfragmente (Jacobs et al., 97; Klein et al., 96; Taft et al., 02). Zukünftig könnte eine negative Selektion der cDNA-Bank von E. tenella-Sporozoiten gegen die fünf redundanten Sequenzen die Suche nach neuen sekretorischen Proteinen effizienter gestalten.

Beide Methoden beruhen ausschließlich auf der Identifizierung der N-terminalen Signalpeptide, die jedoch noch keinen Beweis für die letztendliche Lokalisierung der Moleküle darstellen. Hinweise auf die endgültige Lokalisierung der Proteine können durch die Überprüfung der publizierten Daten der homologen Proteine gewonnen werden. Da die Lokalisierung von Proteinen über zusätzliche Signale in der Aminosäuresequenz festgelegt wird, kann auch eine weitere Analyse der Sequenzen nach solchen sekundären Signalen zur Aufklärung der zellulären Lokalisierung beitragen (Joiner und Roos, 02). In Frage kommen beispielsweise verschiedenen C-terminal gelegene Retentionssignale, die zum Verbleib der Proteine im ER (HDEL am C-Terminus) oder Golgi-Apparat (Motif mit sauren und hydrophoben Aminosäuren) führen. Auch die Signale der Proteine, die für die Apikomplexa-spezifischen Organellen (Mikronemen, Rhoptrien, dichte Granula und Apikoplast) bestimmt sind, können überprüft werden (Joiner und Roos, 02). Einschränkend ist jedoch hinzuzufügen, dass für solche Analysen vollständige cDNA Sequenzen [Seite 74↓]vorliegen sollten, was nur für eine begrenzte Anzahl von Sequenzen zutrifft. Die tatsächliche Lokalisierung der gefundenen Sequenzen muss letztendlich durch experimentelle Analysen überprüft werden.

Zur Zeit befindet sich das Projekt zur Sequenzierung des E. tenella-Genoms kurz vor dem Abschluss (Shirley et al., 04). Mit diesen umfassenden Sequenzinformationen können in zukünftigen Studien weitere potentielle Impfstoffkandidaten identifiziert werden. Hierbei könnte der automatisierte Prozess, der in der vorliegenden Arbeit vorgestellt wurde, zur Identifizierung von sekretorischen Proteinen einen wichtigen Beitrag leisten.

3.1.1 Charakterisierung der TA4-ähnlichen Proteinsequenzen

Es konnten sowohl durch die in silico-Analyse als auch im experimentellen Ansatz zahlreiche TA4-ähnliche Sequenzen identifiziert werden. TA4 ist das Hauptoberflächenantigen von E. tenella-Sporozoiten (Brothers et al., 88; Files et al., 87). Aufgrund der vorliegenden Daten könnte es sich hierbei um verwandte Oberflächenproteine handeln, die stadienspezifisch exprimiert werden. Diese Vermutung wird durch eine publizierte Studie unterstützt, in der anhand von 23 unterschiedlichen TA4-ähnlichen Sequenzen gezeigt werden konnte, dass nur wenige in Sporozoiten und die Mehrzahl in Merozoiten transkribiert werden (Tabares et al., 04). Die Autoren gehen von ca. 250 TA4-ähnlichen Sequenzen im E. tenella-Genom aus. Aufgrund ihrer Oberflächenlokalisierung wurden die zur Zeit bekannten Proteine von den Autoren in surface antigen 1-23 (SAG 1-23) umbenannt.

Der verwandte Organismus T. gondii ist ebenfalls mit varianten Oberflächenproteinen bedeckt, die als SAG1-related sequences (SRS) bezeichnet werden (Lekutis et al., 01). Von diesen wurden bisher mehr als 20 kloniert und bioinformatische Anlaysen zeigten, dass mindestens 161 unterschiedliche SRS-Sequenzen existieren (Jung et al., 04; Lekutis et al., 01). Ähnlich wie bei E. tenella lassen sich die abgeleiteten Proteinsequenzen in zwei Gruppen einteilen, sie werden stadienspezifisch exprimiert und sind über GPI-Anker in der Zelloberfläche verankert (Lekutis et al., 01; Manger et al., 98). Es gibt Koexpressionen von definierten SRS-Genen innerhalb von verschiedenen Parasitenstadien, es wird jedoch keine Variation auf den Zellen beobachtet (Lekutis et al., 01). Aufgrund der aufgezeigten Parallelen zwischen E. [Seite 75↓] tenella-SAG- oder T. gondii-SRS-Proteinen wird auch für die E. tenella-SAG-Proteinfamilie ein ähnliches Verteilungsmuster vermutet.

Variante Oberflächenproteine sind bei parasitischen Protozoen relativ weit verbreitet und dienen häufig der Immunevasion vor der Antikörperantwort des Wirtes (McCulloch, 04). Im Gegensatz zu T. gondii findet bei Trypanosoma brucei und Giardia lamblia ein zufälliger periodischer Wechsel des Oberflächenmantels statt, der es einigen Parasiten erlaubt den Attacken der Antikörperantwort des Wirtes zu entgehen (Lekutis et al., 01; McCulloch, 04; Nash, 02). Dabei wird auf jeder individuellen Zelle nur ein Vertreter einer varianten Multi-Genfamilie zur gleichen Zeit exprimiert. Im Gegensatz hierzu verfolgt T. gondii eine andere Strategie. Obwohl auch T. gondii lange im Wirt persistiert, entkommt der Parasit dem Immunsystem, indem er Gewebezysten bildet, in denen ein wenig stoffwechselaktives Ruhestadium überlebt. Die Rolle der SRS-Proteine in diesem Zusammenhang ist ungeklärt, sie scheinen aber am Invasionsprozess und/oder an der Immunevasion beteiligt zu sein (Dzierszinski et al., 00; He et al., 02; Lekutis et al., 01). Es wird beispielsweise angenommen, dass TgSAG1 eine Doppelfunktion als Adhäsionsmolekül und Immuntarget ausführt. TgSAG1 ist immundominant und wird ausschließlich von den sich schnell teilenden Tachyzoiten exprimiert. Persistierende Bradyzoiten besitzen einen anderen SAG-Oberflächenmantel und sind dadurch nicht der TgSAG1-spezifischen Immunantwort ausgesetzt (He et al., 02; Lekutis et al., 01).

Vergleicht man die oben genannten Organismen und ihre bekannte Antigenvariationen mit E. tenella, so fällt auf, dass diese im Gegensatz zu Eimerien sehr lange in ihren Wirten persitieren. E. tenella besitzt ein festes Entwicklungsprogramm mit einer sehr kurzen Entwicklungszeit und persistiert nur etwa sieben Tage im Wirt (Rose, 96). Dennoch könnten die E. tenella-SAG-Oberflächenproteine, ähnlich wie die varianten Oberflächenproteine anderer Parasiten, an der Immunevasion beteiligt sein. Da möglicherweise nur wenige immundominante SAG-Antigene auf der Sporozoitenoberfläche exponiert werden, bildet das Immunsystem lediglich gegen diese Moleküle spezifische Antworten aus. Die Merozoiten der zweiten Generation entwickeln sich etwa fünf Tage nach der Infektion und sind wahrscheinlich mit einer neuen varianten SAG-Oberfläche ausgestattet (Tabares et al., 04). Die gerade reifende spezifische Antwort gegen die frühen SAG-Proteine der Sporozoiten kann gegen diesen neuen Oberflächenmantel nicht wirken. Da die vermutete Immunevasion noch nicht die große Anzahl [Seite 76↓]unterschiedlicher SAG-Proteine erklärt, ist anzunehmen, dass von ihnen noch andere Funktionen ausgeführt werden. Analog zu den SRS-Proteinen von T. gondii wären beispielsweise Aufgaben bei der Zelladhäsion vorstellbar.

Es ist noch nicht abschließend geklärt, ob auf jeder Zelle eines Stadiums die gleichen E. tenella-SAG-Proteine exprimiert werden. Des Weiteren muss noch geklärt werden, ob auch die verschiedenen Merozoitenstadien unterschiedliche SAG-Proteine exprimieren. Interessanterweise liegen bisher keine Daten über TA4 (SAG)-ähnliche Proteine von anderen Eimerien vor. Genauere Studien müssten hier klären, ob ähnliche variable Oberflächenmoleküle existieren und welche Funktion sie übernehmen.

Zahlreiche T. gondii-SRS-Gene wurden in DNA-Immunisierungsstudien eingesetzt und führten teilweise zu einem Immunschutz gegen Belastungsinfektionen (Angus et al., 00; Nielsen et al., 99). Aufgrund der Analogien sind auch die TA4-ähnlichen-Moleküle von E. tenella vielversprechende Impfstoffkandidaten, die in zukünftigen Immunisierungsstudien bevorzugt eingesetzt werden sollten.

3.1.2 Identifizierte E. tenella-Proteine als Impfstoffkandidaten

Ein Großteil der in der vorliegenden Arbeit identifizierten Moleküle ist an der Zellerkennung, am Invasionsprozess sowie an der Etablierung der Parasiten in der Wirtszelle beteiligt. Hierzu zählen die Homologen zu AMA von Plasmodium ssp. und T. gondii (Hehl et al., 97; Kocken et al., 00) und andere Proteine des Apikalkomplexes. Zahlreiche erfolgreiche Immunisierungsstudien mit Plasmodium ssp.-AMA1 in Nagern (Anders et al., 98; Crewther et al., 96) und Affen (Stowers et al., 02) verdeutlichen das protektive Potential von AMA1. Wenn auch bei anderen Eimerienarten des Huhns AMA1-analoge Moleküle identifiziert werden sollten, so wäre das Protein ein Kandidat, der möglicherweise einen artübergreifenden Schutz gegen die Eimerienarten des Huhns induzieren könnte. Unter natürlichen Bedingungen wird eine solche Kreuzimmunität zwischen Eimerienarten, die das Huhn besiedeln, nicht beobachtet (Prowse, 91). Jedoch ergab eine Studien von Crane et al. (1991), dass durch eine rekombinante Vakzine ein solcher artübergreifender Schutz gegen mehrere Eimerieninfektionen hervorgerufen werden kann.

Mikronemen sind Organellen zur Speicherung und geregelten Sekretion von [Seite 77↓]Molekülen, die an der speziellen Bewegung (gliding motility) und der Zellinvasion beteiligt sind (Sibley, 04). Die Proteine sind nicht nur strukturell, sondern auch funktionell innerhalb der Apikomplexa konserviert (Soldati et al., 01). Verschiedene Mikronemenproteine von Plasmodien, wie das thrombospondin-related anonymous Protein (TRAP), das TRAP-analoge circum sporozoite TRAP related-Protein (CTRP) oder das Circumsporozoiten-Antigen (CS) nehmen in der Impfstoffentwicklung gegen Malaria eine zentrale Rolle ein (Moorthy et al., 04).

Die in der vorliegenden Arbeit gefundene EtMIC1-Sequenz (Tomley et al., 91) von E. tenella besitzt Analogien zum TRAP-Protein von Plasmodium ssp. (Robson et al., 88). Die identifizierte EtMIC4-Sequenz gehört ebenfalls zur TRAP-Familie und zeigt große Übereinstimmungen zu EtMIC1. Im Gegensatz zu EtMIC1 wird EtMIC4 konstitutiv auf der Oberfläche von Zoiten exponiert (Tomley et al., 01). Kürzlich wurde ein EtMIC4-homologes Protein in E. maxima identifiziert (TmTFP250) (Witcombe et al., 03). Beide Proteine induzieren starke Antikörperantworten (Tomley et al., 01; Witcombe et al., 03). Ob es sich dabei auch um kreuzreaktive Antikörper handelt, muss jedoch noch geklärt werden.

Da die Funktion der Mikronemenproteine mit dem Invasionsprozess assoziiert ist, kommt vermutlich auch den Proteinen EtMIC2, EtMIC5 und TgMIC10 eine Rolle in diesen Prozessen zu.

Neben den zahlreichen Mikronemenproteinen wurden auch zwei Proteine identifiziert, die in den refraktilen Körperchen lokalisiert sind. Die Funktion dieser eimerienspezifischen Organellen ist noch unbekannt. Das SO7-Protein von E. tenella zeigte in früheren Immunisierungsstudien gute Resultate und wurde auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt (Crane et al., 91; Profous-Juchelka et al., 88). Ein weiteres Protein der refraktilen Körperchen von E. tenella ist EtA1. Das Protein besitzt Nukleotid-Transferase-Funktion und ist somit ein interessantes Zielmolekül für therapeutische Ansätze (Kramer et al., 93).

Das Oberflächenprotein Ea3-1Evon E. acervulina erbrachte in mehreren Immunisierungsstudien sehr vielversprechende Resultate (Lillehoj et al., 00; Min et al., 01; Song et al., 00), so dass das E. tenella-homologe Protein ebenfalls als aussichtsreicher Impfstoffkandidat angesehen werden kann.


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Die gefundenen homologen Sequenzen zu Proteinkinasen, Phosphatasen und Transportermolekülen dürften eine wesentliche Rolle in der zellulären Kommunikation, Regulation und Nährstoffaufnahme spielen (Delorme et al., 02; Kieschnick et al., 01; Kirk, 04). Die homologen Proteine Lag1, Notch-like-Rezeptor und das Synaptobrevin-ähnliche Moleküle sind vermutlich an der Signaltransduktion beteiligt (Nam et al., 02; Petcherski und Kimble, 00).

Generell stellen solche Proteine aussichtsreiche Zielmoleküle für therapeutische Ansätze dar (Delorme et al., 02; Doerig et al., 02; Kirk, 04), können aber aufgrund ihrer exponierten Lage auch für immunologische Interventionen von Interesse sein.

3.2 Immunreaktion von Hühnern nach DNA-Immunisierung

DNA-Vakzine kommen vor allem als Impfstoffe gegen intrazelluläre Krankheitserreger in Frage (Doolan und Hoffman, 01; Seder und Hill, 00). Obwohl zur Zeit noch kein wirksamer DNA-Impfstoff zugelassen ist, wurden in den vergangenen Jahren einige Fortschritte auf diesem Gebiet erzielt. Neben Forschungen zur Bekämpfung viraler und bakterieller Krankheitserreger, wird auch versucht, die DNA-Immunisierung gegen parasitische Protozoen einzusetzen (Gurunathan et al., 00). So induzieren beispielsweise DNA-Impfstoffe gegen Malaria eine protektive CD8+-T-Zellantwort und werden momentan in Phase I-Studien getestet (Doolan und Hoffman, 01; Keitel et al., 99; Moorthy et al., 04; Sedegah et al., 00). Auch zahlreiche DNA-Vakzinen gegen T. gondii induzieren zelluläre Immunantworten und vermitteln Immunschutz (Scorza et al., 03; Vercammen et al., 00). Viele intrazelluläre Krankheitserreger induzieren breite Immunreaktionen, wobei der zelluläre Arm wesentlich zur Induktion des Immunschutzes beiträgt (Seder und Hill, 00). Unter diesem Gesichtspunkt sind DNA-Impfstoffe besonders geeignet, denn sie induzieren ebenfalls ein breites Spektrum zellulärer und humoraler Immunantworten (Fynan et al., 93; Tang et al., 92; Ulmer et al., 93). Die qualitativen und quantitativen Aspekte der induzierten Immunantwort sind dabei abhängig von der applizierten DNA-Menge, wobei hohe DNA-Dosen vorzugsweise TH1-Typ-Antworten generieren (Barry und Johnston, 97). Darüber hinaus ist im Wesentlichen die zelluläre Lokalisierung des Antigens für die eingeschlagene Richtung der induzierten Immunantwort verantwortlich (Haddad et al., 98; Morel et al., 04; Torres et al., 99).

Ein weiterer Vorteil der DNA-Immunisierung besteht darin, dass die Herstellung des [Seite 79↓]Impfstoffes relativ einfach ist und auch eine größere Anzahl verschiedener Antigene getestet werden kann. Dies ist bei Eimerieninfektionen besonders vorteilhaft, denn durch die bisherigen Forschungen hat sich, wie oben dargestellt, noch kein schützendes Antigen herauskristallisieren können (Jenkins, 98).

In der vorliegenden Arbeit wurde ein DNA-Immunisierungsschema in Hühnern erarbeitet, wozu drei bekannte E. tenella-Antigene zum Einsatz kamen. Dabei wurden unterschiedliche Aspekte berücksichtigt, wie der Einfluss verschiedener Vektoren bzw. des stabilisierenden Fusionspartners EGFP. Des Weiteren wurden die inflammatorischen Zytokine chIL-18 und chIFN-γ als Kostimulanzien eingesetzt. Basierend auf dem etablierten DNA-Immunisierungsschema wurden 13 neu-identifizierte sekretorische E. tenella-Proteine getestet.

3.2.1 Proteinexpression in vitro

Die Überprüfung der Proteinexpression der Vektorkonstrukte erfolgte in der Zellkultur in transfizierten COS-7- und HD11-Zellen.

Die Eimerien-EGFP-Fusionsproteine wurden mit einem EGFP-Antiserum nachgewiesen. Das Ergebnis wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie in COS-7-Zellen und Hühnerzellen (HD11) bestätigt. Die Resultate mit den Hühnerzellen zeigten auch, dass die Konstrukte für die Immunisierung von Hühnern geeignet sind.

Ein unerwartetes Ergebnis war, dass die TA4-Fusionsproteine im Gegensatz zu den SO7- und EtMIC1-Fusionsproteinen nicht mit einem E. tenella-Antiserum nachweisbar waren. Eine zu geringere Verfügbarkeit von TA4-Antikörpern im Serum ist hierfür nicht verantwortlich, da das Serum bakteriell exprimiertes TA4-Protein in gleicher Weise erkennt wie rekombinantes SO7-Protein (Daten nicht gezeigt).

Eine mögliche Erklärung ist, dass die B-Zellepitope des TA4-Anteils durch den EGFP-Anteil verdeckt wurden und deshalb für die TA4-Antikörper nicht zugänglich waren. Für diese Hypothese spricht zum einen, dass die TA4-Fusionsproteine mit EGFP-Serum das erwartete Molekulargewicht zeigten. Zum anderen ist das EGFP-Protein sehr stabil gegen Proteaseabbau und liegt auch bei starken Detergenzien wie 1 % SDS sowie in breiten pH-Bereichen und bei verschiedenen Redoxpotentialen noch im gefalteten Zustand vor (Tsien, 98). Daraus resultierte vermutlich eine sterische Behinderung der Antikörperbindung. Insgesamt sprechen die Argumente dafür, dass eine TA4-Expression stattfand.


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Die Überprüfung der fusionsfreien Konstrukte im Immunblot ergab, dass lediglich die EtMIC1-Proteine nachweisbar waren, obwohl genspezifische Transkripte auch für die SO7- und TA4-Konstrukte gefunden wurden. Vermutlich wurden auch die SO7-und TA4-Konstrukte exprimiert, wobei die Proteinmenge unter der Nachweisgrenze des Immunblots lag.

Nach diesen Analysen führte EGFP aufgrund seiner stabilisierenden Eigenschaft zu einer verbesserten Proteinexpression. Inwieweit dies durch reine Proteinstabilisierung und durch den Schutz gegen Proteaseabbau bedingt ist, oder ob auch zusätzlich Faktoren auf der Transkriptions- oder Translationsebene eine Rolle spielen, müssen zukünftige Studien klären. Die stabilisierende Eigenschaft von Fusionspartnern bei der Proteinexpression wurde schon häufig beobachtet und wird u.a. zur Optimierung von Proteinausbeuten in heterologen Expressionssystemen genutzt (Stahl et al., 04).

Die Analyse der chIFN-γ-Konstrukte in COS-7-Zellen zeigte die erfolgreiche Expression und Sekretion von chIFN-γ in das Kulturmedium, so dass die chIFN-γ-Freisetzung auch nach DNA-Immunisierung von Hühnern erwartet werden konnte. Diese Resultate stimmen mit Studien überein, die im gleichen System ähnliche Ergebnisse erzielen konnten (Heriveau et al., 00).

Weniger eindeutig waren die Resultate des chIL-18-Konstruktes. Mit Zellkulturüberständen von transfizierten COS-7-Zellen konnten Milzzellen eines Spendertieres zur chIFN-γ-Produktion stimuliert werden, hingegen wurde bei den Zellen des zweiten Spendertieres keine Reaktion induziert. Wodurch dieser Unterschied auftrat ist ungeklärt. Es könnten technische Gründe, wie eine zu geringe Transfektionseffizienz als Ursache in Frage kommen. Auch das Fehlen von kostimulatorischen Faktoren/Rezeptoren, wie beispielsweise eine geringe Anzahl von IL-18-Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen, könnte für die Unterschiede verantwortlich sein. Beispiele aus dem Mausmodell zeigen jedoch, dass IL-18-Plasmide, die das Protein mit der natürlichen Signalsequenz exprimieren, in vivo zur Induktion von IFN- γ führen ( Kremer et al., 99 ). Daraus kann abgeleitet werden, dass auch in Hühnern die chIL-18-Expression über das chIL-18-Plasmid zur Freisetzung von chIL-18 führt.

Da aus Kapazitätsgründen nicht alle identifizierten Proteine in Immunisierungsstudien eingesetzt werden konnten, wurden 13 Sequenzen ausgewählt. Die Sequenzen [Seite 81↓]wurden in einen pCDNA3myc Vektor kloniert und die Proteinexpression in COS-7-Zellen überprüft. In der Immunblotanalyse konnten bei sieben Konstrukten entsprechende Signale detektiert werden. Der fehlende Proteinnachweis der übrigen Konstrukte könnte auf unzureichende Proteinexpression zurückzuführen sein. Die Ergebnisse der Sequenzanalysen zeigten, dass die Vektorkonstrukte die erwarteten cDNA-Sequenzen beinhalteten.

3.2.2 Analyse der Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung zur Bestätigung des Immunisierungserfolges

Eine Immunisierung mit Plasmid-DNA erzeugt neben der zellulären Immunantwort auch eine Antikörperreaktion ( Gurunathan et al., 00 ). Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Erfolg der DNA-Immunisierung über die Induktion einer spezifischen Antikörperantwort zu verfolgen. Darauf aufbauend wurde ein Immunisierungsprotokoll erstellt, mit dem neu identifizierte Antigene getestet werden sollten.

Antikörperreaktionen korrelieren nicht mit dem Immunschutz gegen Eimerieninfektionen. Deshalb kann deren Analyse lediglich einen allgemeinen Hinweis auf die Proteinexpression und darauf folgende Immunreaktion in vivo geben. In mehreren unabhängigen Versuchen konnte gezeigt werden, dass Hühner eine spezifische SO7-Antikörperantwort nach einer entsprechenden DNA-Immunisierung entwickelten. Der Fusionspartner EGFP hatte dabei keinen Einfluss auf die SO7-Antikörperkonzentration im Serum immunisierter Hühner. Eine vergleichbare Studie, in der ein Gen von Mycoplasma als EGFP-Fusionskonstrukt in Mäusen eingesetzt wurde, ergab ähnliche Resultate (Quinn et al., 02). Interessanterweise beschreiben die Autoren eine Verschiebung der Antikörper-Subklassen von IgG1 zu IgG2a durch den Einsatz des Fusionskonstruktes. IgG2a-Antikörper sind assoziiert mit einer TH1-Antwort. Ob sich dadurch auch eine höhere Protektion gegen Mycoplasmen ergibt, muss in dem Modell jedoch noch aufgeklärt werden. Bei Hühnern sind keine unterschiedlichen IgG-Subklassen bekannt, die mit einer bestimmten zellulären Reaktion assoziiert sind (Higgins, 96). Deshalb kann im vorliegenden Fall keine Aussage über die genaue Richtung der Immunreaktionen gemacht werden. Ob die von Quinn et al. (2002) beschriebene Verschiebung in Richtung TH1-Antwort auf das gesamte spezifische Fusionsprotein zurückzuführen ist oder eine generelle [Seite 82↓]Eigenschaft von EGFP darstellt, sind noch zu klärende Fragen.

Bei Tieren, die mit TA4- oder EtMIC1-Fusionskonstrukt (mit EGFP) immunisiert wurden, konnten keine TA4- bzw. EtMIC1-spezifischen Antikörper nach DNA-Immunisierung nachgewiesen werden, obwohl es sich um immundominante Antigene handelt (Profous-Juchelka et al., 88; Tomley et al., 91). Im Gegensatz zum EtMIC1-Fusionskonstrukt induzierte das TA4-Fusionskonstrukt spezifische EGFP-Antikörper. Es ist deshalb davon auszugehen, dass hier eine Proteinexpression stattfand, wobei EGFP vermutlich wesentliche B-Zellepitope des TA4-Proteins verdeckte. Dies stimmt auch mit den Daten der in vitro-Expression überein (siehe 3.2.1). Dagegen führte das EtMIC1-Fusionskonstrukt vermutlich zu keiner oder lediglich zu einer schwachen Proteinexpression in vivo.

Im Vergleich zur Immunisierung mit den rekombinanten Antigenen waren die Antikörperreaktionen der DNA-immunisierten Tiere in der vorliegenden Arbeit deutlich niedriger, oder konnten zum Teil nicht nachgewiesen werden. Tatsächlich findet man häufig niedrigere Antikörpertiter nach DNA-Immunisierung im Vergleich zur Immunisierung mit rekombinanten Antigenen oder nach natürlicher Infektion (Boyle et al., 96; Kang et al., 98). Obwohl durch DNA-Vakzinierung auch die humorale Antwort stimuliert wird, ist nicht generell mit einem hohen Antikörpertiter zu rechnen (Gurunathan et al., 00). Dies gilt insbesondere bei intramuskulärer DNA-Applikation und bei Verwendung von Konstrukten, die nicht zur Sekretion der exprimierten Proteine führen. Des Weiteren ist bekannt, dass bei DNA-Immunisierungen nur Proteinmengen im Nanogrammbereich exprimiert werden (Gurunathan et al., 00). Ein zusätzliches Problem ist die mögliche toxische Eigenschaft des exprimierten Antigens. Die verschiedenen Aspekte können insgesamt zu einer relativ niedrigen Antikörperreaktion führen, die unter Umständen nur unzureichend detektiert werden kann.

Studien, in denen verschiedene Promotoren und Polyadenylierungsstellen für die Hühnerimmunisierung untersucht wurden, zeigten die besten Resultate mit dem CMV-Promotor und der BGH-Polyadenylierungsstelle (Kodihalli et al., 97; Oshop et al., 02). Diese beiden Eigenschaften besitzen auch pCDNA3- und pVR1012-Vektoren, die in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurden. Der für die DNA-Immunisierung von Mäusen optimierte pVR1012-Vektor (Hartikka et al., 96), [Seite 83↓]generierte dabei im Vergleich zum pCDNA3-Vektor ähnliche Antikörperkonzentrationen. Beide Vektoren sind demnach in gleicher Weise für DNA-Immunisierungen von Hühnern geeignet. Da der pCDNA3-Vektor in zahlreichen Studien mit Hühnern schon erfolgreich eingesetzt wurde, kann auch in Zukunft auf diesen Vektor zurückgriffen werden (Min et al., 01; Song et al., 00; Wang et al., 03). Zudem ist pCDNA3 für die Proteinexpression in COS-7-Zellen optimiert, wodurch ein besserer Proteinnachweis in vitro zu erwarten ist (Harvey et al., 97).

Die Art der Immunantwort hängt stark von der zellulären Lokalisierung des exprimierten Proteins ab. Cytosolische Proteine generieren im Gegensatz zu sekretierten Proteinen eine stärkere CD8+-T-Zellantwort (Forns et al., 99; Lewis et al., 99; Rush et al., 02). Da der Immunschutz gegen Eimerieninfektionen vermutlich vorrangig durch CD8+-T-Zellen vermittelt wird (Rose, 96), wurden in der vorliegenden Arbeit die Plasmide bewusst so konstruiert, dass die Proteine nicht sekretiert werden. Der Einsatz von Plasmiden, deren heterologe Eimeriengene eine Signalsequenz tragen, würde vermutlich höhere Antikörpertiter induzieren, aber auch eine verminderte CD8+-T-Zellantwort zur Folge haben. Dies müsste jedoch in vergleichenden Studien bestätigt werden.

3.2.3 Protektive zelluläre Immunantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung

Die Analyse der Antikörperantwort wurde zur Überprüfung des Immunisierungserfolges und zur Erstellung einer geeigneten DNA-Immunisierungsstrategie durchgeführt. Sie korreliert jedoch nicht mit einem Immunschutz gegen Eimerieninfektionen. Zur Evaluierung einer protektiven Immunantwort wurden deshalb bei immunisierten Hühnern Belastungsinfektionen durchgeführt und die Oozystenausscheidung bestimmt. Um des Weiteren die zelluläre Immunreaktion zu ermitteln, bieten sich prinzipiell verschiedene Möglichkeiten an, die jedoch im Huhn aufgrund fehlender Immunreagenzien nur eingeschränkt durchführbar sind. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht die zelluläre Immunreaktion über T-Zellproliferationsassays zu erfassen.

Die Überprüfung der T-Zellproliferation ergab, dass die PBL von Tieren nach [Seite 84↓]Immunisierung mit rekombinantem TA4-Protein eine TA4-spezifische T-Zellproliferation zeigten. Vermutlich wurde diese Reaktion durch die natürliche E. tenella-Infektion verstärkt. Arbeiten mit trunkierten Proteinen oder Peptid-mapping könnten dazu beitragen entsprechende T-Zellepitope zu identifizieren (Hoffmeister et al., 03). Nach DNA-Immunisierung und nach Immunisierung mit rekombinantem SO7-Protein konnten keine spezifischen T-Zellproliferationen erfasst werden, obwohl reaktive T-Zellen vorlagen, wie die Analyse mit ConA zeigte.

Die Ergebnisse der Lymphozytenproliferation sind insgesamt zurückhaltend zu bewerten, denn es bestehen große experimentelle Hürden, welche die Qualität der Lymphozytenproliferation von Hühnerzellen beeinflussen (Barta et al., 92; Schaefer et al., 85). Im Gegensatz zum Mausmodell sind in Bezug auf Hühner wenig eindeutige Daten bekannt. Unter anderem konnte bei Hühnern gezeigt werden, dass Makrophagen/Monozyten einen supprimierenden Effekt auf mitogenstimulierte Lymphozyten aufweisen (Vainio und Ratcliffe, 84). Die Ursache dieses Effektes ist nicht bekannt. Es wird diskutiert, dass möglicherweise ein sezernierter Faktor mit einem T-Zell-Oberflächenrezeptor interagiert und so eine Modulation der Lymphozyten-Aktivierung zur Folge hat (Varaldo et al., 89). Die besten Resultate werden mit der, auch in dieser Arbeit durchgeführten, langsamen Zentrifugation erreicht (Smith et al., 95). Obwohl die Daten der mitogenstimulierten T-Zellen zeigten, dass reaktive T-Zellen aufgereinigt wurden, können supprimierende Effekte, die zu einer verminderten Lymphozytenproliferation führten, nicht ausgeschlossen werden. Es besteht auch die Möglichkeit, dass keine oder nur sehr schwache T-Zellantworten durch die Immunisierungen induziert wurden, die in den untersuchten PBL nicht nachweisbar waren. Hierfür sprechen auch die sehr geringen Antikörpertiter nach DNA-Immunisierung. Bei Säugern und Hühnern wird eine B-Zellantwort durch Hilfe von CD4+-T-Zellen verstärkt (Rose, 96), so dass eine geringe B-Zellantwort vermutlich auch eine schwache T-Zellantwort als Ursache hat. Über eine induzierte CD8+-T-Zellantwort lässt sich im vorliegenden Fall keine Aussage machen. Diese müsste zum Beispiel anhand eines zytolytischen Assays charakterisiert werden.

Die Überprüfung der Lymphozytenproliferation wurde auf die im Blut zirkulierenden PBL fokusiert, da hierüber aktivierte T-Zellen des gesamten Organismus analysiert werden können. Dadurch sollte sichergestellt werden, dass auch die über die intramuskuläre Immunisierung aktivierten T-Zellen erfasst werden. Da es sich bei [Seite 85↓]Eimerieninfektionen um eine intestinale Erkrankung handelt, sind vermutlich die lokalen Immunzellen von entscheidender Bedeutung. Möglicherweise könnte daher die zusätzliche Überprüfung der IEL in zukünftigen Studien verbesserte Resultate liefern.

Einen weitereren Aspekt stellt der Zeitpunkt der Analysen dar. Die Überprüfung der T-Zellproliferation wurde auf das Versuchsende, d.h. zehn Tage nach der Belastungsinfektion, beschränkt. Dieser Zeitpunkt erschien sinnvoll, da in Versuchen mit Sporozoitenantigen gezeigt werden konnte, dass acht, zehn und 14 Tage nach einer E. tenella-Infektion die eimerienspezifischen Proliferationsraten von T-Zellen (PBL) am höchsten waren (Breed et al., 96; Breed et al., 97). Um bessere Hinweise auf die induzierte Immunantwort nach DNA-Immunisierung zu erhalten, wäre es jedoch zukünftig sinnvoll, die zelluläre Immunantwort direkt nach Immunisierung zu analysieren. Vermutlich könnte damit die spezifische Immunantwort gegen das applizierte Antigen besser erfasst werden, da keine "störenden" Immunantworten der Eimerieninfektion interferieren würden. Wie schon diskutiert, bietet sich dazu der Proliferationstest nur bedingt an. Aufschlußreich wäre die Detektion von chIFN-γ, welches von aktivierten T-Lymphozyten sezerniert wird und mit der Kontrolle von Primärinfektionen in Zusammenhang steht (Lowenthal et al., 97; Ovington et al., 95). Die Analyse könnte über RT-PCR aus Zellen der Darmmukosa erfolgen und so einen Hinweis über die lokale Immunreaktion geben (Chai und Lillehoj, 88; Choi et al., 99). Des Weiteren wäre es sinnvoll, die Subpopulationen von T-Zellen in der Darmmukosa zu bestimmen. So wird in einer Studie mit dem 3-1E-Antigen von E. acervulina beschrieben, dass nach intramuskulärer DNA-Immunisierung in der Dünndarm-IEL-Population eine höhere Anzahl von CD4+- und γδ+ -T-Zellen und eine verminderte Anzahl von CD8+ -T-Zellen vorlag (Song et al., 00). Die Autoren diskutieren, dass dies möglicherweise mit dem beobachteten Immunschutz korreliert. Es wäre interessant zu sehen, ob die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten Antigene nach DNA-Immunisierung ebenso eine Veränderung der T-Zellsubpopulationen und/oder chIFN-γ-Freisetzung induzieren. Zur Charakterisierung der spezifischen CD8+-T-Zellantwort könnten des Weiteren zytolytische Assays durchgeführt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden 13 neu identifizierte E. tenella-Sequenzen zur DNA-Vakzinierung eingesetzt. Hierbei konnte in einem ersten orientierenden Versuch [Seite 86↓]eine Reduktion der Oozystenausscheidung durch H15 und durch das TA4-Homolog H7 erreicht werden. Diese Resultate waren jedoch in einem weiteren Immunisierungsversuch, der im Rahmen einer Diplomarbeit durchgeführt wurde, nicht reproduzierbar (Gehre, 04). Auch die Studien mit den schon bekannten E. tenella-Antigenen SO7, TA4 und EtMIC1 ergaben keinen Immunschutz gegen Belastungsinfektionen.

Hierfür können vielfältige Gründe verantwortlich sein. Zum einen könnten die eingesetzten Proteine nicht oder nur unzureichend geeignet sein einen adäquaten Immunschutz zu induzieren. Das gilt insbesondere für die neu identifizierten Sequenzen, für die es bisher keine Hinweise bezüglich ihrer Immunogenität gab. Jedoch wurde zumindest mit dem Modellantigen SO7 die Induktion einer protektiven Immunantwort erwartet, denn das Protein wurde schon in mehreren Immunisierungsstudien eingesetzt, in denen Oozystenreduktionen nach Belastungsinfektionen erzielt werden konnten (Crane et al., 91; Liberator et al., 89; Miller et al., 89; Profous-Juchelka et al., 88).

Das TA4-Protein scheint ebenfalls ein vielversprechender Impfstoffkandidat zu sein und zeigte in einem in vitro-Assay und in Immunisierungsstudien protektives Potential (Files et al., 87). Wie an anderer Stelle bereits diskutiert, sind möglicherweise auch andere Mitglieder der TA4-Proteinfamilie bzw. das EtMIC1-Protein als Impftoffkandidaten geeignet (siehe 3.1.1 bzw. 3.1.2).

Aus den Resultaten der vorliegenden Arbeit kann nicht geschlossen werden, dass die eingesetzten Antigene für die Impfstoffentwicklung ungeeignet sind. Beispielsweise zeigte eine kürzlich publizierte Studie, dass die DNA-Immunisierungen mit TA4- und EtA1-Sequenzen von E. tenella zu einer Veringerung der Blinddarmlässionen nach einer Belastungsinfektion führten (Wu et al., 04). Da in dieser Studie lediglich ein Versuch durchgeführt wurde, müssten die Resultate durch größer angelegte Immunisierungsstudien belegt werden. Ähnliche Resultate wurden für eine DNA-Vakzine mit der SO7-Sequenz publiziert (Kopko et al., 00).

Insgesamt sprechen aber die publizierten Daten und die Resultate der vorliegenden Arbeit dafür, dass die eingesetzten Immunisierungsstrategien in Kombination mit den verwendeten Proteinen zu ineffizient sind, um den gewünschten protektiven Effekt zu generieren. Daher sind vermutlich, neben der weiteren Identifizierung neuer Kandidatenantigene, grundlegend neue Immunisierungsstrategien notwendig.


[Seite 87↓]

Eine relativ einfach durchzuführende Modifikation besteht darin, kostimulatorische Moleküle einzusetzen. In Frage kommen Zytokine die eine essentielle Rolle bei der Aktivierung von Effektor-T-Zellen spielen und zur Verstärkung der Immunreaktion beitragen können (Gurunathan et al., 00). In der vorliegenden Arbeit wurden erste Ansätze in diese Richtung durchgeführt und die Hühnerzytokine chIFN-γ und chIL-18 als Kostimulanzien für die DNA-Immunisierung eingesetzt. Die Resultate ergaben jedoch keine auffälligen Unterschiede bezüglich der Serokonversion oder Oozystenausscheidung. Im Gegensatz dazu konnte in DNA-Immunisierungstudien mit dem E. acervulina 3-1E-Antigen die protektive Wirkung durch Koapplikation mit chIFN-γ-Plasmid verstärkt werden (Lillehoj et al., 00). Eine andere Studie mit E. acervulina 3-1E-Antigen zeigte, dass die Wirkung einer suboptimalen DNA-Vakzindosis durch gleichzeitige Applikation von chIFN-γ-Plasmid verstärkt werden kann (Min et al., 01). In der gleichen Studie wurden noch weitere Hühnerzytokine und Chemokine als DNA-Kostimulanzien getestet. Insbesondere die Koapplikation von chIL-8, Lymphotaktin, chIL-15, chTGF-β4 und chIL-1β führte zu einer Oozystenverminderung im Vergleich zur Plasmidkontrolle. In einer anderen Studie mit Hühnern zeigte die Koapplikation mit einem IL-2-Plasmid einen verbesserten Immunschutz gegen das infectious bursal disease virus (IBSV) (Hulse und Romero, 04). Zur Zeit sind nur wenige Daten zur DNA-Koapplikation von Hühnerzytokinen veröffentlicht worden, so dass noch großer Klärungsbedarf hinsichtlich ihrer Wirkung besteht. Mehr Informationen liegen aus zahlreichen Studien im Maussystem vor, die zeigen, dass die Koimmunisierung mit DNA-Plasmiden, die Informationen für Zytokingene tragen, zu einer modifizierten Immunantwort führen können (Gurunathan et al., 00).

Im Zusammenhang mit Eimerieninfektionen sind besonders die Zytokine IL12 und IL-18 interessant, die nach DNA-Immunisierung zu einer höheren zellulären Proliferation führen und die CD8+-T-Zellantwort stimulieren (Kim et al., 98). Jedoch ist zu bemerken, dass zur Zeit noch kein IL12-äquivalentes Hühnerzytokin identifiziert wurde.

Welche Funktion das chIL-18 bei Eimerieninfektionen einnimmt, ist bisher unklar. Allerdings konnte gezeigt werden, dass die Stimulation von Hühner-Milzzellen mit chIL-18 zum einen zur chIFN-γ-Sekretion und Milzzellproliferation führt und zum anderen eine verstärkte MHC-II-Präsentation bewirkt (Gobel et al., 03). Des Weiteren ergab ein Vergleich der Effekte von chIL-2 und chIL-18, dass chIL-2 hauptsächlich [Seite 88↓]eine CD8+-T-Zellproliferation und chIL-18 überwiegend eine CD4+-T-Zellproliferation induziert. Interessanterweise war die Wirkung von chIL-18 bei PBL von einer zusätzlichen TZR-Stimulation abhängig, was vermutlich an einer verminderten IL-18-Rezeptor-Expression liegt (Gobel et al., 03). IL-18 von Säugern, dem eine analoge Funktion zukommt, wird von vielen Zelltypen und Geweben sekretiert, unter anderem auch von intestinalen Epithelzellen (Sugawara, 00). Daher könnte IL-18 in Verbindung mit Eimerieninfektionen von großen immunologischen Interesse sein. Unterstützend kommen Daten aus dem Maussystem hinzu, die zeigen, dass bei Plasmodium- und anderen intrazellulären Infektionen IL-18 eine essentielle Rolle zukommt (Sugawara, 00). Ob chIL-18 jedoch tatsächlich eine kritische Rolle bei Eimerieninfektionen einnimmt, müssen weitere experimentelle Daten zeigen.

3.2.4 Ausblick für alternative DNA-Applikationen und neue Immunisierungs-Strategien bei Hühnern

Die Ergebnisse der Immunisierungsstudien dieser Arbeit erbrachten keine reproduzierbaren Erfolge. Auch andere Immunisierungsstudien gegen Eimerieninfektionen, die mit intramuskulärer DNA-Applikation (Kopko et al., 00; Lillehoj et al., 00) oder anderen Verfahren (Bhogal et al., 92; Binger et al., 93; Crane et al., 91; Crane et al., 88; Danforth et al., 89; Kim et al., 89; Wallach et al., 95) durchgeführt wurden, zeigten keine durchschlagenden Erfolge. Daher sollten in zukünftigen Studien grundlegend neue Ansätze der DNA-Applikation und die Kombination mit anderen Immunisierungsmethoden im Vordergrund stehen.

Eimerieninfektionen induzieren eine komplexe Immunantwort, die eine starke humorale und zelluläre Reaktion einschließt. Sowohl für die Kontrolle von Erstinfektionen als auch für die Induktion der Immunität ist hauptsächlich der zelluläre Arm der Immunantwort verantwortlich (Lillehoj, 98; Long, 93; Rose et al., 88; Rose et al., 92). Jüngste Untersuchungen mit transgenen Mäusen legen zudem den Schluss nahe, dass nicht ein bestimmter Effektormechanismus den Immunschutz vermittelt. Vermutlich tragen hierzu verschiedene, noch nicht bekannte zelluläre Immunreaktionen bei (Roberts et al., 96; Smith und Hayday, 98; Smith und Hayday, 00). Anschaulich wird dies anhand einer Studie, die zeigte, dass sowohl MHCI- als auch MHCII-defiziente Mäuse einen adäquaten Immunschutz gegen Reinfektionen [Seite 89↓]mit E. vermiformis aufbauen konnten (Smith und Hayday, 00). Im Zentrum dieser Reaktionen stehen hauptsächlich αβ+-T-Zellen, die sich als essentiell für eine effektive Immunprotektion herausstellten (Smith und Hayday, 98). Zur Zeit wird allgemein davon ausgegangen, dass vorwiegend CD8+-T-Zellen den Immunschutz gegen Eimerieninfektionen vermitteln (Rose et al., 92; Trout und Lillehoj, 96). Jedoch fehlen in diesem Zusammenhang noch weitere Daten, um ein genaueres Bild zu zeichnen. Interessanterweise scheint für die Ausbildung der Immunität keine bestimmte primäre Effektorantwort notwendig zu sein. Beispielsweise zeigten Studien mit IFN-γ-knockout Mäusen, dass IFN-γ zwar für die effektive Kontrolle einer primären Eimerieninfektion essentiell ist, jedoch keinen Einfluss auf die Induktion eines adäquaten Immunschutz hat (Smith und Hayday, 98). Da es sich bei Eimerieninfektionen ausschließlich um eine intestinale Erkrankung handelt, spielen vermutlich die lokalen T-Zellen eine bedeutende Rolle (Yun et al., 00).

Als Konsequenz für die Impfstoffentwicklung ergibt sich hieraus, dass eine möglichst komplexe und lokale zelluläre Immunantwort generiert werden sollte. Von den zur Zeit bekannten rekombinanten Impfstoffansätzen kommt die DNA-Immunisierung diesem Anforderungsprofil sehr nahe (Gurunathan et al., 00).

In den letzten Jahren wurden vielversprechende DNA-Impfstoffe für den Einsatz gegen parasitische Protozoen getestet. Beispielsweise werden durch ein Plasmid, welches die genetische Information für das P. yoelii-CS-Protein enthält, spezifische zytolytische CD8+-T-Zellantworten hervorgerufen, die mit einer massiven Reduktion der Parasitenlast nach einer Reinfektion mit P. yoelii einhergehen (Sedegah et al., 94). Ähnlichen Immunschutz über CD8+-T-Zellantworten generiert auch ein DNA-Impfstoff für T. gondii, welcher die genetische Information für das "Dichte Granula"-Protein 1 (GRA1) enthält (Scorza et al., 03). Auch gegen Protozoen, die weniger nahe verwandt sind, wurden DNA-Vakzine erfolgreich getestet. Beispielsweise konnte durch die DNA-Immunisierung von Mäusen mit dem immundominanten LACK-Gen eine Protektion gegen Leishmania major-Infektionen erzielt werden (Gurunathan et al., 97). Auch andere DNA-Immunisierungsstudien mit Virusantigenen ergaben Teilprotektionen gegen Belastungsinfektionen (Chang et al., 01; Fynan et al., 93; Kodihalli et al., 97; Robinson et al., 93). Es bleibt trotz der erzielten Erfolge festzustellen, dass die Immunisierungsstrategien weiter verbessert werden müssen. Beispielsweise ist anzunehmen, dass durch eine DNA-[Seite 90↓]Vakzinierung, die mit anderen Applikationsformen kombiniert wird, die sogenannte heterologe prime-boost-Methode, bessere Immunisierungserfolge erzielt werdenkönnten. Diese neueren Ansätze zeigten in Tiermodellen mit Malariavakzinen (Fynan et al., 93; Kodihalli et al., 97; Moorthy et al., 04; Robinson et al., 93; Schneider et al., 98; Sedegah et al., 00) und anderen Impfstoffen (Hanke et al., 99; Robinson et al., 99), dass die Immunisierungen so viel effektiver gestaltet werden können. Beispielsweise konnte die T-Zellimmunogenität einer DNA-Vakzine mit dem TRAP-Gen von P. falciparum durch einen boost mit einem modifizierten vaccinia virus Ankara (MVA) erhöht werden (McConkey et al., 03).

Anstelle einer intramuskulären DNA-Injektion kommt auch die Nutzung einer gene-gun in Frage. Mit ihrer Hilfe kann die DNA-Menge um das 100-fache reduziert werden, um äquivalente Immunreaktionen hervorzurufen (Fynan et al., 93). Dabei ist jedoch zu beachten, dass sich die Immunantworten qualitativ unterscheiden können und nach einer gene-gun-Immunisierung eine verstärkte Th2-Antwort zu erwarten wäre (Feltquate et al., 97; Pertmer et al., 96). Neben diesen Th2-Antworten wurden mit der gene-gun-Immunisierung aber auch starke cytotoxische T-Zellantworten registriert (Barry und Johnston, 97; Pertmer et al., 95). Da die Methode gut reproduzierbare Resultate erzeugt und nur geringe DNA-Mengen benötigt werden, sollten in zukünftigen Studien auch die Verabreichung von Eimerien-DNA-Vakzinen mittels gene-gun-Methoden überprüft werden.

Wie schon dargestellt, handelt es sich bei Eimerieninfektionen um intestinale Erkrankungen, bei denen vermutlich die lokale mukosale Immunreaktion von entscheidender Bedeutung ist (Lillehoj, 98; Yun et al., 00). Es ist anzunehmen, dass die intramuskuläre Verabreichung von DNA oder Antigen nur einen suboptimalen Immunisierungserfolg im intestinalen Gewebe induziert. Obwohl intramuskuläre Immunisierungen mit DNA auch zu Veränderungen der T-Zellsubpopulation im Darm führen (Song et al., 00), sollte in zukünftigen Studien ein Hauptaugenmerk auf alternative DNA-Applikationsformen gelegt werden. Diese sollten zielgerichtet die Immunantwort des GALT ansprechen.

Gute Resultate konnten beispielsweise über die DNA-Applikation mit Chitosan-Nanopartikeln erreicht werden (Roy et al., 99). Dabei führten oral verabreichte DNA-Chitosan Partikel zur Genexpresssion von β-Galaktosidase in intestinalen Epithelzellen. Des Weiteren gelang mit dieser Methode die [Seite 91↓]Immunisierung/Sensibilisierung von Mäusen mit dem Gen für das Erdnuß-Hauptallergen Arah2 und führte zur massiven Reduktion der Krankheitssymptome (Roy et al., 99).

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Aufnahme nackter Plasmid-DNA über M-Zellen zu erhöhen, um so direkt mukosale Immunantworten hervorzurufen. Dies kann über DNA-Komplexe geschehen, welche spezifische M-Zell-Liganden beinhalten, wie das reovirus protein σ 1 (Wu et al., 01). M-Zellen sind für die professionelle Aufnahme von Antigenen in mukosalen Geweben verantwortlich. Sie transportieren die Antigene in Regionen weiter, in denen sie über APZ den T- und B-Zellen präsentiert werden. Über diese Methode kann direkt das mukosale Immunsystem angesprochen werden.

Auch virale Vektoren können für die mukosale Immunisierung eingesetzt werden (Morrow et al., 99). Es kommen verschiedene RNA- und DNA-Viren in Frage, die unterschiedliche Immunreaktionen induzieren. Erste erfolgreiche Versuche zur Vakzinierung von Hühnern wurden schon durchgeführt. Beispielsweise führt ein Kombinationsimpfstoff mit verschiedenen Eimerienantigenen, die in einem Tauben-Herpesvirus als Vakzine verabreicht wurden, zur verbesserten Gewichtsentwicklung nach Belastungsinfektion mit Eimerien (Vermeulen, 98; Vermeulen et al., 01).

Einen weiteren aussichtsreichen Ansatz bietet die genetische Immunisierung über bakterielle Vektoren. In Frage kommen verschiedene attenuierte Enterobakterien, wie beispielsweise unterschiedliche Listerien- oder Salmonellen-Stämme (Gentschev et al., 00). Diese attenuierten Bakterien können mit DNA-Vakzinen transformiert sein, die nach der Invasion der Wirtszelle durch Autolyse in das Zytoplasma abgegeben werden. Das heterologe Gen kann anschließend über den viralen (CMV) Promotor von der eukaryotischen Zelle exprimiert werden (Dietrich et al., 99; Medina und Guzman, 01). Ein Vorteil dieser Methode ist, dass beispielsweise Salmonellen und Listerien unter anderem APZ infizieren und aktivieren (Medina und Guzman, 01). Eine andere und schon häufiger angewandte Variante der bakteriellen Vakzinierung, ist die Applikation von attenuierten Bakterien, die das heterologe Antigen exprimieren. Durch Vakzinierung mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm, der das TB-Antigen ESAt-6 exprimiert und sekretiert, konnte so eine Reduktion der Bakterienlast erreicht werden (Mollenkopf et al., 01). Auch unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die Vakzinierung von Hühnern mit S. typhimurium, die das TA4- oder SO7-Protein exprimieren, zur Induktion einer eimerienspezifischen [Seite 92↓]Antikörperantwort führt (Pogonka et al., 03). Schutz konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Eine andere Arbeitsgruppe konnte durch Salmonellen-Vakzinierung eine Verbesserung der Gewichtszunahme nach Eimerieninfektionen erreichen (Vermeulen, 98; Vermeulen et al., 01).

Ein weiterer möglicher Ansatz wäre die Immunisierung mit attenuierten transgenen Parasiten, die Eimerienantigene exprimieren. Hierfür kommt vor allem der Modellorganismus T. gondii in Frage. Für diesen verwandten Apikomplexa-Parasiten stehen etablierte Transfektionssysteme zur Verfügung, die eine stabile genomische Integration von Fremd-DNA ermöglichen (Kim und Weiss, 04). Dass diese Methode erfolgversprechend angewendet werden kann, zeigt eine Studie mit attenuierten T. gondii-Parasiten (Stamm ts-4), die das Leishmania major-Antigen KPM-11 exprimieren (Ramirez et al., 01). Nach Immunisierung von Mäusen mit derart manipulierten T. gondii konnten KPM-11-spezifische T-Zellproliferationen detektiert werden. Des Weiteren wurde eine reduzierte Fußballen-Schwellung nach Belastungsinfektion mit L. major registriert. Ein weiterer Aspekt dieser Methode ist der Adjuvans-Effekt, der durch die T. gondii-Parasiten vermittelt wird. Ähnlich wie Eimerien induziert T. gondii eine breite zelluläre Immunreaktion, die sowohl CD8+- als auch CD4+-T-Zellantworten einschließt (Kasper et al., 04).

Um einen erfolgreichen Impfstoff gegen Eimerieninfektionen zu entwickeln, sollte neben der Suche nach möglicherweise effizienteren Impfstoffaplikationen auch die weitere Identifizierung von neuen protektiven Eimerienantigenen im Vordergrung stehen. Einige Aspekte hierzu wurden bereits in Kapitel 3.1 diskutiert. Da zur Zeit noch keine herausragende Antigene identifiziert werden konnten, sollten auch hier neue Wege eingeschlagen werden. Ein Ansatz könnte sein, genomische Eimerien-DNA- oder cDNA-Bibliotheken als DNA-Impfstoffe einzusetzen. Über aufeinanderfolgende Immunisierungen könnten so möglicherweise wenige protektive Antigene isoliert werden. Beispielsweise wurden solche Versuche mit Teilerfolgen schon bei Mycoplasma ssp., Leishmania donovani und Plasmodium chabaudi durchgeführt (Barry et al., 95; Melby et al., 00; Moore et al., 01; Rainczuk et al., 03; Smooker et al., 00).

Anstatt auf Sequenzen oder rekombinante Proteine zurückzugreifen und diese zu testen, wäre es auch erfolgversprechend in umgekehrter Reihenfolge vorzugehen. [Seite 93↓]Beispielsweise könnten protektive T-Zellklone von reinfizierten Tieren isoliert und damit das zugrunde liegende Antigen identifiziert werden. Beispielsweise konnten mit einem solchen Verfahren zwei rekombinante Antigene von Mycobacterium leprae identifiziert werden, die von einem Pool aus acht humanen T-Zellklonen erkannt wurden (Mustafa et al., 98).

Zur Zeit lässt sich keine Aussage darüber machen, welche Immunisierungsstrategie in Zukunft am schnellsten zum Erfolg führen könnte. Ein Grund hierfür ist, dass die dem Immunschutz gegen Eimerieninfektionen zugrunde liegenden Mechanismen noch ungeklärt sind. Zukünftige Studien mit dem Ziel eine rekombinanten Eimerienimpfstoff zu entwickeln, sollten deshalb auch verstärkt die Aufklärung dieser immunologischen Reaktionen im Blickfeld haben.

3.3 Resumé

Mit der Identifizierung sekretorischer Proteine von E. tenella stehen weitere potentielle Impfstoffkandidaten zur Verfügung, die in zukünftigen Immunisierungsstudien auf ihr protektives Potential hin überprüft werden sollten.

Insbesondere die Etablierung und Anwendung des experimentellen Ansatzes zur Identifizierung von Eimerienantigenen könnte in zukünftigen Studien dazu beitragen, dass weitere unbekannte sekretorische Moleküle identifiziert werden. Vorstellbar wäre die Testung von komplexen cDNA-Banken aus Sporozoiten oder anderen frühen Entwicklungsstadien. Auch könnten stadienspezifische sekretorische Moleküle durch die Anwendung von substrahierten cDNA-Banken identifiziert werden. Zusätzlich wäre die Analyse von cDNA-Banken anderer hochpathogener Eimerienarten von großem Nutzen, beispielsweise zur Identifizierung kreuzprotektiver Antigene.

Die zukünftige Anwendung der bioinformatischen Methode mit neuem Sequenzmaterial, wie etwa aus dem E. tenella-Genomprojekt, kann ebenso einen Beitrag zur schnellen Erkennung von sekretorischen Molekülen leisten. Die gefundenen Proteinhomologen von E. tenella-Sequenzen geben einen guten Hinweis auf deren wahrscheinliche Lokalisierung und Funktion. Genauere Analysen müssten dies jedoch noch für die einzelnen Moleküle bestätigen.

Obwohl hinsichtlich der Immunisierung von Hühnern mit unterschiedlichen [Seite 94↓]rekombinanten Eimerienimpfstoffen einige Erfolge zu verzeichnen sind, reichen die Resultate nicht an die der Lebendimpfstoffe heran. Vermutlich ist auch in Zukunft nicht zu erwarten, dass ein einziges Antigen einen kompletten Immunschutz gegen Eimerieninfektionen hervorrufen kann. Deshalb sollten weitere Studien auf die Nutzung komplexer Impfstoffe hinarbeiten, die mehrere teilprotektive Antigene enthalten. Auch die Erkenntnisse, die in dieser Arbeit gewonnen wurden zeigen, dass die Basis solcher Impfstoffe DNA-Vakzinen sein könnten. Jedoch sollte dabei die Induktion der lokalen intestinalen Immunantwort durch mukosale DNA-Applikation im Vordergrund stehen. Es sollten auch prime-boosting-Strategien in Betracht gezogen werden, bei denen zur Steigerung der Immunantwort verschiedene Impfstoff-Applikationenformen kombiniert werden.


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18.05.2005