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4  Methoden

4.1 Gewinnung von Parasitenmaterial

4.1.1 Passagierung von E. tenella in Hühnern und Gewinnung von Oozysten

Die Passagierung von E. tenella in Hühnern dient der Produktion von Parasitenmaterial. Um gleichbleibend infektiöse Oozysten zu erhalten, sollten Passagierungen alle 3 bis 9 Monate durchgeführt werden (Shirley, 95).

Hühner im Alter von 3 Wochen wurden je mit 30000 E. tenella Oozysten oral über eine Schlundsonde infiziert. Die Sektion der Versuchstiere und die Entnahme der Blinddärme erfolgte 7 Tage nach der Infektion. Zur Isolierung der Oozysten wurde das Blinddarmgewebe kräftig in H2O ausgeschüttelt und der Darminhalt mit Mörser und Pistill homogenisiert. Zur Reinigung der Oozysten erfolgten drei Sedimentationen in H2O. Anschließend konnte das Sediment in 2% Kaliumbichromat aufgenommen werden. Die Oozystensporulation erfolgte für 3 Tage bei Raumtemperatur (RT) und leichtem Schütteln. Mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer wurde die Sporulationsrate und Oozystenkonzentration ermittelt. Die Lagerung der Suspension erfolgte bei 4°C.

4.1.2 Gewinnung reiner E. tenella-Sporozoiten

Je Sporozoitenaufreinigung sollten nicht mehr als 3 x 107 sporulierte Oozysten eingesetzt werden. Die Sterilisation der Oozysten erfolgte mit 200 ml NaOCl (13 %) für 15 Minuten (min) unter Rühren. Anschließend konnten die Oozysten in 50 ml-Portionen für 8 min flotiert (1100 g) werden. Die Oozysten die sich in der obersten Schicht des Überstand (ÜS) befanden, wurden abgenommen und dreimal mit 50 ml sterilem H2O für 8 min gewaschen (1600 g).

Das sterilisierte Oozystenpellet wurde in 10 ml vorgewärmten Hank's-Puffer aufgenommen und mit 30 g sterilen Glasperlen versetzt. Durch kräftiges Schütteln für 15 Sekunden (sec) konnten die Oozystenhüllen mechanisch zerstört werden. Der ÜS wurde entnommen und die Sporozysten für 5 min pelletiert (800 g). Das Pellet wurde anschließend in 7,5 ml Hank's-Puffer aufgenommen.


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Um die Sporozoiten freizusetzen, wurden der Sporozystensuspension 12,5 ml vorgewärmtes Exzystierungsmedium zugesetzt und der Ansatz im Wasserbad für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Sporozoiten für 10 Minuten zentrifugiert (1600 g) und das Sporozoitenpellet in Phosphatpuffer/Glukose-Lösung aufgenommen.

Die Reinigung der Sporozoiten erfolgte über eine vorbereitete DE52-Anionenaustauschchromatographie-Säule (Schmatz et al., 84). Zur Herstellung der Säule wurden in einer 30 ml-Einmalspritze Glaswolle (0,5 cm), Nylonwolle (3-5 cm) und DE52-Zellulose (5 cm) übereinander geschichtet. Die DE52-Zellulose wurde einen Tag zuvor zweimal in Phosphatpuffer für 1 h gewaschen und anschließend der pH-Wert auf 8,0 eingestellt. Die Lagerung der Suspension erfolgte bei 4°C. Die Sporozoiten konnten mit 300 ml Phosphatpuffer/Glukose-Lösung aus der Säule ausgewaschen werden. Der Durchfluss enthielt ultrareine Sporozoiten, die anschließend für 10 min pelletiert (1600 g) werden konnten. Die Ermittlung der Zellzahl erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer.

4.1.3 Bestimmung der Oozystenzahl im Fäzes infizierter Tiere

Zur Bestimmung der Gesamt-Oozystenausscheidung wurde der Fäzes infizierter Tiere von Tag 5 bis 10 nach der Infektion täglich eingesammelt, gewogen und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Aufgrund haltungstechnischer Bedingungen wurde der Kot von Tiergruppen als Fäzes-Pool gesammelt.

Der gesammelte Fäzes wurde entweder komplett in 5 Liter (l) H2O homogenisiert oder drei repräsentative Aliquots (5 g) in 50 ml-Plastikröhrchen überführt und mit 50 ml H2O resuspendiert. Die Suspension wurde mit gesättigter NaCl-Lösung vermischt (1:10 oder 1:20) und die Oozystenzahl in einer MacMaster-Flotations-Zählkammer ermittelt. Jede Probe wurde mindestens dreimal ausgezählt und aus dem Mittelwert unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors die Gesamt-Oozystenzahl berechnet.

4.2 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen

Die Herstellung kompetenter E. coli-Zellen wurde nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990) durchgeführt.


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250 ml SOB-Medium wurden mit einer Bakterienkolonie angeimpft und auf dem Schüttelinkubator bis zu einer OD600 von 0,6 bei 18°C kultiviert. Die Kultur wurde für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend für 10 min bei 4°C pelletiert (2500 g). Die Bakterien wurden in 80 ml eiskaltem Transformationspuffer resuspendiert und für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 20 ml Transformationspuffer aufgenommen und mit 7% Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurden Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.

Je nach Transformationsansatz wurden 200 µl kompetente E. coli-Zellen mit 10-50 ng Plasmid-DNA oder 1- 10 µl Ligationsansatz gemischt und in einem Polypropylen-Röhrchen für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 30 sec bei 42°C und anschließender 1-minütiger Inkubation auf Eis, erfolgte die Zugabe von 800 µl SOC-Medium. Die Ansätze wurden für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend 50 - 200 µl auf Selektionsagarplatten mit entsprechenden Antibiotikumzusatz ausplattiert.

4.2.1 Identifizierung rekombinanter Bakterienklone

Blau/Weiß-Screening: Systeme die zur α-Komplementierung geeignet sind, wurden nach der Transformation auf LB-Platten mit XGal (40 µg/ml) und Isopropyl-thio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) (40 µg/ml) aufgebracht. Nach Kultivierung erschienen Transformanden mit gewünschtem Insert als weiße Kolonien, während negative Klone als blaue Kolonien detektiert werden konnten.

Restriktionsanalyse: Von einzelnen Kolonien wurden über-Nacht (ÜN)-Kulturen angeimpft, die Plasmid-DNA aufgereinigt und anschließend mit Restriktionsenzymen analysiert.

Kolonie-PCR: Einzelne Klone wurden mit einem sterilen Zahnstocher aufgenommen und in 20 µl H2O resuspendiert. Davon wurden 1 µl in die PCR eingesetzt.

4.2.2 Langzeitlagerung von E. coli-Zellen

Aus einer ÜN-Kultur wurde die Bakteriensuspension mit Hogness-Einfriermedium versetzt (1:10), in einem Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff eingefrohren und bei -80 °C gelagert.


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4.3  Transformation von S. cerevicae-Zellen mit Plasmid-DNA

Die Herstellung kompetenter Hefezellen und deren Transfektion wurde nach der Lithiumacetat-Methode durchgeführt ( Ausubel et al., 95 ).

300 ml YPD-Medium wurden mit 5 µl einer Hefe-Vorkultur angeimpft und bei 30°C inkubiert, bis der Ansatz eine OD600 von 0,5 erreicht hatte. Anschließend erfolgte für 5 min eine Zentrifugation (4000 g). Das Pellet wurde in 10 ml reinstem MilliQ-H2O resuspendiert und nochmals für 5 min pelletiert (5000 g). Die Zellen wurden in 1,5 ml frisch angesetzter Lithiumacetatlösung resuspendiert. Derart hergestellte Hefezellen bleiben einige Tage kompetent und können bei 4°C gelagert werden.

Pro Transformation wurden 200 µg carrier-DNA mit 1 ng - 5µg Plasmid-DNA vermischt. Der Ansatz wurde anschließend mit 200 µl kompetenten Hefezellen versetzt. Nach Zugabe von 1,2 ml frisch angesetzter Polyethylenglycol (PEG)-Lösung wurden die Zellen für 30 min bei 30°C inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 15 min bei 42°C erfolgte die Aufnahme der pelletierten Zellen in 200 µl frisch angesetzten TE-Puffer. Bis zu 200 µl Transfektionsansatz wurden auf entsprechenden complete minimal (CM)-drop out-Platten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.

Zur Herstellung der carrier-DNA wurde Lachshoden-DNA in TE-Puffer (10 mg/ml) bei 4°C gelöst. Der Ansatz wurde im Sonikator (75 % Leistung) aufgeschlossen, bis die Viskosität der Lösung leicht abnahm. Die DNA sollte zwischen 2 und 15 kb fraktioniert sein. Anschließend wurde der Ansatz mittels Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt, mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer (10 mg/ml) gelöst. Aliquots wurden bei -20°C gelagert.

4.3.1 Langzeitlagerung von Hefezellen

Aus einer ÜN-Kultur wurden Hefezellen mit 2 x Einfriermedium (1:1) gemischt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.


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4.4  Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

4.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien

Isolierung mittels Cetytrimethylammoniumbromid (CTAB)-Präparation (Del Sal et al., 88)

Von einer E. coli-Kultur wurden 1 bis 5 ml abzentrifugiert und die Zellen in 200µl STET-Puffer resuspendiert. Nach der Zugabe von frisch angesetzter Lysozymlösung (1 mg/ml) wurde der Ansatz für 5 min inkubiert, anschließend für 45 sec aufgekocht und dann für 10 min abzentrifugiert (15000 g). Das Pellet aus aggregierter chromosomaler DNA und Proteinen konnte mit einem Zahnstocher entfernt werden. Die RNA wurde durch Zugabe von RNase (250 µg/ml) und Inkubation für 10 min bei 65°C entfernt. Die Plasmid-DNA konnte anschließend durch Zugabe von 10 µl CTAB-Lösung und 5-minütiger Zentrifugation (15000 g) präzipitiert werden. Das Präzipitat wurde in 1,2 M NaCl gelöst und die Plasmid-DNA selektiv mit Ethanol ausgefällt und die DNA in H2O oder TE aufgenommen.

Minipräparation und Maxipräparation von Plasmid-DNA mittels Anionenaustauschchromatographie-Säulen (Fa. Clontech)

Die Methode dieser kommerziellen Kits basiert auf der alkalischen Lyse der Bakterien (Birnboim und Doly, 79) und der Aufreinigung von Plasmid-DNA über Anionenaustauschchromatographie-Säulen. Nach Pelletierung der ÜN-Bakterienkultur wurde die Lyse und Aufreinigung nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Für Miniprep-Säulchen wurden in der Regel 5 bis 8 ml Bakterien-Kultur verwendet und für Maxipräparationen 500 ml Bakterienkultur.

4.4.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen

Zur Gewinnung von Plasmid-DNA als PCR-Vorlage wurde eine Schnelllyse durchgeführt. Hierzu wurden 5 µl Hefekultur mit 20 µl Lysepuffer I versetzt und für 10 min bei 100°C inkubiert. Für die PCR-Reaktion wurden 3 µl Hefelysat eingesetzt.

Die Aufreinigung größerer Mengen Plasmid-DNA aus bis zu 5 ml ÜN-Kultur erfolgte [Seite 100↓]durch die Zugabe von 200 µl Lysepuffer II und 200 µl Glasperlen zum Hefepellet. Der Ansatz wurde 1 min kräftig gevortext und mit 200 µl Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und anschließend in H2O aufgenommen.

4.4.3 Isolierung von Ribonukleinsäuren

Die Isolierung von Gesamt-RNA wurde mit der gebrauchsfertigen Extraktionslösung peqGOLD RNAPure (peqLab, Erlangen) nach Herstellerangaben durchgeführt. 5 x 108 E. tenella Sporozoiten oder 1 x 106 COS-7-Zellen wurden 1 ml RNAPure-Lösung zugesetzt und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde der Ansatz kräftig geschüttelt und für 10 min bei 4°C zentrifugiert (12000 g). Die RNA in der oberen wässrigen Phase wurde mit Isopropanol präzipitiert und in RNase-freien H2O gelöst. Um DNA-Kontaminationen zu vermeiden, wurde für RT-PCR- Reaktionen die RNA vor Zugabe mit DNase verdaut.

Die Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA oder E. tenella-Sporozoiten wurde mittels Dynabeads® Oligo (dT)25 und mRNA-DIRECT-Kit (Dynal, Norwegen) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Der überwiegende Anteil der mRNA ist mit einem Polyadenosin (PolyA)-Schwanz ausgestattet. Diese PolyA-Sequenzen binden an Oligothymidinmoleküle, die an eine Trägersubstanz gekoppelt sind. Da die Trägersubstanz mit Magnetfeldern in Wechselwirkung tritt, kann die mRNA leicht aus der Suspension isoliert werden. Durch Temperaturerhöhung ist die Bindung wieder auflösbar. Je Extraktionsschritt wurden entweder 100 µg Gesamt-RNA oder 1 x 10 9 E. tenella-Sporozoiten eingesetzt. Die RNA wurde mit RNase-freien H2O eluiert und bis zur weiteren Verwendung in 75%-igem Ethanol bei -80 °C gelagert.

4.4.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

Elektroelution mittels Biotrap-Kammer

Die Biotrap-Kammer (Schleicher und Schüll, Dassel) wurde entsprechend der Herstellerangaben mit Membranen versehen und in eine mit TBE-Puffer gefüllten Elektrophoresekammer gestellt. Die ausgeschnittenen Gelstücke wurden in die dafür vorgesehene Kammer eingebracht und die DNA für 4 h bei 200 V extrahiert. Nach der Elektroelution wurde der Strom für etwa 20 sec umgepolt und die DNA-[Seite 101↓]Fragmente aus der entsprechenden Kammer entnommen. Die DNA wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol präzipitiert.

Absorption von DNA an Glasperlen (NucleoTrap®-Methode)

Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde der kommerzielle Kit NucleoTrap® (BD Bioscience Clontech, Heidelberg) nach Herstellerangaben verwendet.

Die entsprechenden DNA-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Natriumjodid-haltigem Puffer und Glasmilchmatrix versetzt. Durch Inkubation für 15 min bei 50°C, wurde die DNA in Lösung gebracht. Die Matrix mit der gebundenen DNA wurde jeweils zweimal mit ethanolhaltigen Waschpuffern gewaschen und anschließend getrocknet. Die DNA wurde mit H2O von den Glaspartikeln gelöst.

4.4.5 Reinigung von Nukleinsäurelösung mittels Phenol/Chlorophorm-Extraktion

Die Entfernung von Proteinen aus Nukleinsäurelösungen erfolgte mit äquilibrierten Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/C/I) (25:24:1) bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5.

Die zu reinigende Nukleinsäurelösung wurde mit gleichem Volumen einer P/C/I-Lösung versetzt und gemischt. Die Phasentrennung erfolgte während einer 3-minütigen Zentrifugation (12000 g). Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen und bei Bedarf durch Zugabe des gleichen Volumens Chloroform erneut extrahiert und anschließend mit Ethanol präzipitiert.

4.4.6 Konzentrieren von Nukleinsäuren (Ethanolpräzipitation)

Als Standardmethode zur Fällung von Nukleinsäuren wurde die Ethanolpräzipitation mit Natriumacetat oder Ammoniumacetat eingesetzt.

Hierzu wurden zur Nukleinsäurelösung Natriumacetat (0,3 M) oder Ammoniumacetat (1 M) zugesetzt und mit 2 Volumen eiskaltem Ethanol gemischt. Zur Fällung von geringen RNA-Mengen erfolgte die Zugabe von 1µg Glykogen. Nach 2 h Inkubation (-20°C) konnte das Präzipitat für 30 min bei 4°C pelletiert werden (12000 g). Nach einem weiteren Waschschritt mit 70 % Ethanol wurde das Pellet getrocknet. Die Resuspendierung der DNA oder RNA erfolgte in TE oder H2O.


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4.4.7  Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren erfolgte mittels photometrischer Messung bei OD260. Einem OD260 -Wert von 1 entsprechen ca. 50 µg/ml Doppelstrang-DNA und etwa 35 µg/ml RNA. Zusätzlich wurde die Reinheit der Lösung durch die Ermittlung des OD280 -Wertes bestimmt, wobei der QuotientOD260/OD280 zwischen 1,8 und 1,9 liegen sollte. Niedrigere Werte weisen auf Proteinverunreinigungen hin.

4.5 Analyse und enzymatische Veränderungen von Nukleinsäuren

4.5.1 Agarose-Gelelektophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese ermöglicht es, DNA aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekülmassen und der dadurch bedingten Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld aufzutrennen. Durch den Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid, der in die DNA interkaliert, kann die aufgetrennte DNA sichtbar gemacht werden (Anregung bei 250 - 300 nm). Die DNA-Lösung wurde mit Probenpuffer (1:10) versetzt und in einem 0,5 bis 1,5 % Agarosegel mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid im elektrischen Feld (80 V) aufgetrennt.

4.5.2 Restriktionsverdau von DNA

Mittels Restriktionsendonukleasen kann DNA spezifisch gespalten werden, was der Klonierung und Analyse von DNA dient. Die Reaktionsbedingungen, wie eingesetzte Enzymmengen und Pufferbedingungen, entsprachen den Herstellerangaben.

4.5.3 Ligation von DNA-Fragmenten

Die DNA-Ligase katalysiert die kovalente Verknüpfung einer freien 5'-Phosphatgruppe und einer freien 3'-Hydroxylgruppe. Sollten DNA-Fragmente in einen geschnittenen Vektor eingesetzt werden, wurde ein Vektor:Insert-Verhältnis von 3:1 gewählt.


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Standardreaktion für die Ligation:

Vektor-DNA

50-100 ng

Fragment-DNA

variabel 5-100 ng

10 x Ligasepuffer

2 µl

T4-DNA-Ligase

3 U

H2O

ad 20 µl

Die Ligation erfolgte ÜN bei 16°C. Für die Transformation von Bakterien wurden 1-10 µl Ligationsansatz eingesetzt.

4.5.4 Phosphorylierung von Nukleinsäuren

Die Phosphorylierung von nicht-phosphorylierten 5'-DNA-Enden ist erforderlich, um eine Ligation zu ermöglichen.

Standardreaktion für die Phosphorylierung:

DNA

1 - 5 µg

5 x Polynukleotidkinase-Puffer

4 µl

T4- Polynukleotidkinase

10 - 30 U

H2O

ad 20 µl

Die Phosphorylierung erfolgte für 30 min bei 37°C.

4.5.5 Sequenzierung von DNA

Die Sequenzanalyse wurde auf der Grundlage der Didesoxymethode durchgeführt (Sanger et al., 77). Das Verfahren beruht darauf, dass ein Oligonukleotid an einer Matrix-DNA enzymatisch verlängert wird, wobei durch die Zugabe von Didesoxynukleotiden gleichmäßig verteilte Kettenabbrüche erzeugt werden. Die einsträngigen DNA-Fragmente können anschließend mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt werden. Für die Sequenzierungen wurde der Sequenase-Kit (Pharmacia, Freiburg) in Verbindung mit Cy5-markierten Primern verwendet, der eine nicht-radioaktive Sequenzierung ermöglicht.

Je Sequenzieransatz wurden Plasmid-DNA (1 - 5 µg) oder unaufgereinigtes PCR-Produkt (200 ng/1kb) mit Cy5 markierten Primer (2 µM) und 1 µl Sequenziermix versetzt. Das Endvolumen pro Ansatz betrug 8 µl. Im Thermocycler (MJ Research, [Seite 104↓]USA) erfolgte die Sequenzierreaktion unter folgenden Bedingungen:

97°C

4:30 min

96°C

0:30 min

55-60°C

0:30 min

72°C

0:30 min; insgesamt 24 Zyklen.

Nach Zugabe von 6 µl Ladepuffer wurden die Ansätze auf das Sequenziergel aufgetragen und die PCR-Fragmente entsprechend den Herstellerangaben im ALFexpress-Sequenziergerät (Pharmacia, Freiburg) aufgetrennt. Die automatisierte Sequenzanalyse erfolgte mit der ALF-Computersoftware (Phamacia, Freiburg). Nicht erkannte Signale wurden manuell editiert.

4.5.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die PCR ist eine Methode zur Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen, bei der die DNA-Replikation nachgeahmt wird. Die PCR wird meist in drei Schritten durchgeführt, die sich in genau definierten Zyklen wiederholen. Nach der Denaturierung der Doppelstrang-DNA mit Hilfe von Hitze, folgt die Anlagerung der zwei Oligonukleotide (Primer) an definierte Sequenzabschnitten, die den zu amplifizierten Bereich einschließen. Im dritten Schritt erfolgt die Kettenverlängerung der Nukleinsäuresequenz.

Standardreaktion der PCR:

DNA-Matrize

1-5 µl (variierende Konzentrationen)

5'Primer

1-2 µl (10-20 pmol)

3'Primer

1-2 µl (10-20 pmol)

MgCl2

3 µl (50 mM)

10 x PCR-Puffer

5 µl

Taq-Polymerase

1 µl (5 U/µl)

H 2 O

ad 50 µl

Die Standardbedingungen der PCR-Reaktion umfassten einen ersten Denaturierungsschritt für 3 min bei 94°C gefolgt von 30 - 35 Reaktionszyklen. Jeder Zyklus bestand aus 1 min Denaturierung bei 94°C, 1 min Primer-Anlagerung bei 55 - 65°C und der Primer-Verlängerung für 0:30 - 1:30 min bei 72°C. Anschließend [Seite 105↓]erlaubt eine 7-minütige Inkubation bei 72°C die vollständige Verlängerung aller DNA-Kopien. Die Bedingungen variieren nach erwarteter Länge des DNA-Produktes und der spezifischen Primerbindungstemperatur.

4.5.7 Reverse Transkription (RT)

Mittels RT kann RNA in DNA umgeschrieben werden, wobei einzelne cDNA-Stränge entstehen. Diese können entweder direkt in eine nachfolgende PCR eingesetzt werden, oder zur Herstellung von Doppelstrang-cDNA genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde auf eine M-MLV-Reverse Transkriptase zurückgegriffen.

Standardreaktion der RT:

Gesamt-RNA oder mRNA

1 - 10 µg

Primer

200 ng - 1 µg

5 x Puffer

5 µl

dNTP

5 mM

M-MLV-RT

200 - 1000 U

H2O

ad 25 µl

In den ersten 10 min erfolgte die Inkubation mit PolyA-Primern bei 40°C und mit Zufallsprimern bei RT, danach wurde der Ansatz für 50 min bei 40°C weiter inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen für 15 min bei 70°C beendet.

4.5.8 Zweitstrang-cDNA-Synthese

Die Erzeugung von Doppelstrang-DNA nach einer RT kann mit der E. coli-DNA-Polymerase I durchgeführt werden. Die Reaktion wurde dabei durch Zugabe von E. coli- DNA-Ligase und E. coli-RNase H optimiert.

Standardreaktion der Zweitstrang-cDNA-Synthese:

RT-Ansatz

20 µl

5 x Zweitstrang-Puffer

30 µl

dNTP

1 mM

E. coli-DNA-Polymerase I

40 U

E. coli- DNA-Ligase

10 U

E. coli-RNase H

2 U

H2O

ad 150 µl


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Die Inkubation des Ansatzes erfolgte für 2 h bei 16°C. Um stumpfe DNA-Enden zu erzeugen, wurden anschließend dem Ansatz 10 U T4-DNA-Polymerase zugesetzt und die Reaktion für weitere 5 min bei 16°C fortgesetzt.

4.6 Herstellung einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten

Zur Herstellung der cDNA-Bank wurde ein cDNA-Synthese-Kit (GibcoBRL, Karlsruhe) vewendet und die von Jacobs et al. (1999) beschriebenen Veränderungen vorgenommen.

Die Sporozoiten-mRNA wurde mit einem Zufallsprimer, der um eine XhoI-Schnittstelle verlängert war, in einer RT-Reaktion eingesetzt. Anschließend folgte die Zweitstrangsynthese. Nach den beiden Reaktionen wurden die Proteine durch Phenol/Chloroform-Extraktion aus dem Reaktionsansatz entfernt und die cDNA mit Ammoniumacetat und Ethanol präzipitiert. Anschließend erfolgte die Adapterligation und Phosphorylierung der cDNA-Enden. Um die gerichtete Klonierung in den Zielvektor pSUC2 zu ermöglichen, wurde die cDNA mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten und danach mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ammoniumacetat und Ethanol präzipitiert. Die Analyse erfolgte im Agarosegel.

4.7 Identifizierung von sekretorischen Proteinen mittels Hefemutanten (suc2 - , trp -) und Invertaseaktivitätstest

Nach der Hefetransfektion der E. tenella-cDNA-Bank (im Vektor pSUC2) in den Hefestamm YTK12 (suc2 - , trp -) erfolgte zunächst die Identifizierung positiver Hefetransfektanten auf complete minimal dextrose medium without tryptophane (CMD-W)-Agarplatten. Aufgrund der Defizienz in der Aminosäuresynthese von Tryptophan, teilen sich lediglich Transfektanten, die über das eingebrachte Plasmid die Tryptophansynthese komplementieren. Die Inkubation erfolgte bei 30°C. Nachdem sichtbare Kolonien gewachsen waren, erfolgte die Überführung der Kolonien mit einem Stempel auf YPRAA-Agarplatten und eine weitere Inkubation für 7 Tage bei 30°C. Antimycin A im Medium führte zu anaeroben Bedingungen und inhibierte das Wachstum von Hefezellen, die keine Invertase sekretieren. Um die Rate an falsch-positiven Resultaten zu minimieren, wurden die positiven Klone erneut auf YPRAA-Agarplatten ausgestrichen.


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Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis der Invertasesekretion besteht darin, die extrazelluläre Aktivität des Enzyms über die Spaltprodukte Glukose und Fruktose zu ermitteln (Vitolo und Borzani, 83). Das Enzym spaltet nicht-reduzierende Oligosaccharide wie Saccharose in reduzierende Monosaccharide, die im ÜS nachweisbar sind. Für den Test wurden die Hefezellen bis zu einer OD600 von 1 kultiviert. 2,5 ml Hefekultur wurden pelletiert und in 1 ml H2O aufgenommen. 750 µl Zellsuspension wurden mit 750 µl gepufferte Saccharoselösung gemischt und der Ansatz für 15 min bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und 100 µl ÜS mit 900 µl Entwicklungslösung versetzt. Ein Farbumschlag zeigt den Nachweis von reduzierenden Zuckern im ÜS an.

4.8 Expression und Aufreinigung rekombinanter E. coli-Proteine

Die cDNA der E. tenella-Proteine SO7, TA4 und EtMIC1 wurden in den Vektor pQE-30 kloniert und in E. coli-XL1-Blue transformiert. Die Konstrukte lagen zu Beginn der Arbeiten bereits vor. Die pQE-30-Plasmide (Stüber et al., 90) besitzen einen IPTG-induzierbaren Promotor (lac-Operon), wodurch die Genexpression der rekombinanten Proteine ausgelöst wird.

Eine ÜN-Kultur wurde in LB-Medium 1:20 verdünnt und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert. Nach Zugabe von 2 mM IPTG erfolgte eine weitere Inkubation für 3 h. Die Bakteriensuspension wurde für 10 min bei 4°C pelletiert (4000 g) und die Bakterien in Lysepuffer A (5 ml/g Pellet) für 1 h auf Eis inkubiert. Nach einer 20-minütigen Zentrifugation bei 4°C (12000 g) wurde der ÜS mit 1 ml Nickel-Chelat-Matrix (Qiagen, Hilden) versetzt und der Ansatz ÜN bei 4°C inkubiert. Die Matrix mit den gebundenen Proteinen wurde auf eine Säule gegeben. Die Waschschritte erfolgten mit 20 ml Puffer B und 20 ml Puffer C. Die Proteinelution erfolgte mit 15 ml Puffer E. Die Proteinlösungen wurden stufenweise über absteigende Harnstoffkonzentrationen gegen PBS dialysiert und die Proteinkonzentration mit dem BCA-Test bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Aliquots bei -20°C aufbewahrt.


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4.9  Proteinanalytik

4.9.1 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE erlaubt eine reproduzierbare biochemische Charakterisierung und Analyse von Proteinen durch Auftrennung im elektrischen Feld (Laemmli, 70). Die Proteinauftrennung erfolgt nahezu auf Basis der Proteingröße. Die einzelnen aufgetrennten Proteine können unspezifisch (z.B. mit Coomassie-Blau) angefärbt werden, womit einzelne Proteinbanden bis zu einer Menge von 100 ng nachweisbar sind (Sambrook et al., 89).

Das Elektrophorese-System (Pharmacia, Freiburg) wurde laut Herstellerangaben zusammengebaut. Je nach erwarteten Molekulargewichten wurden Trenngele zwischen 8 bis 15 % Acrylamid benutzt.

Die Proteinproben wurden mit 2 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95°C denaturiert und nach dem Auftragen bei einer Stromstärke von 15 mA elektrophoretisch aufgetrennt.

Zur Färbung der Proteine wurde das Trenngel für 1 h im Coomassie-Blau-Färbebad inkubiert und das Gel anschließend entfärbt. Zur weiteren Dokumentation erfolgte die Trocknung des Gels zwischen zwei Folien in einem Spannrahmen (Promega, Mannheim).

4.9.2 Elektrotransfer von gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf Nitrocellulose (NC)-Membranen

Für die immunologische Charakterisierung von Proteinen mit spezifischen Antikörpern wurden die durch die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine im elektrischen Feld auf ein festes Trägermaterial (NC) übertragen (Towbin et al., 92). Der Transfer wurde mit einer Semidry-Blot-Apparatur (LMS, Dossenheim) nach Herstellerangaben durchgeführt.

Zur Kontrolle des Transfers, konnten die übertragenen Proteine reversibel mit Ponceau-Färbelösung (10% Gebrauchslösung) für 10 min bei RT gefärbt werden. Die Proteinbanden wurden durch Waschen in PBS wieder entfärbt.


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4.9.3  Konzentrationsbestimmung von Proteinen mittels Bicinchroninsäure (BCA)-Test

Der BCA-Test (Smith et al., 85) zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität (bis 5 µg/ml Protein) und Kompatibilität mit vielen Pufferkomponenten aus. Im alkalischen Milieu bindet BCA an Protein-Kupfer-Komplexe und bildet dabei einen violetten Farbkomplex, der photometrisch erfasst werden kann.

Zur Ermittlung der Proteinkonzentration wurde eine Standardreihe von 50 bis 1200 µg/ml BSA hergestellt. In einer Mikrotiterplatte wurden 20 µl Proteinlösung mit 200 µl gebrauchsfertiger BCA-Lösung (Pierce, USA) gemischt. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei 37°C. Im Plattenphotometer erfolgte die Ermittlung der Extinktion bei 550 nm (Referenzwellenlänge 630 nm).

4.9.4 Kopplung von myc-Peptid an BSA

Die kovalente Kopplung von Peptiden an Trägerproteine kann über freie Aminogruppen (z.B. Lysin) erfolgen.

Der Ansatz mit BSA, myc-Peptid und Glutaraldehyd (siehe Material) wurde für 90 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit 125µl 0,1 M NaBH 4 versetzt. Nach einer weiteren Inkubation für 15 min bei RT konnte das gekoppelte Peptid bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert werden.

4.10 Immunologische und zellbiologische Methoden

4.10.1 Immunchemischer Nachweis von Proteinen auf NC-Membran

Das immunchemische Nachweissystem für Proteine, die auf NC übertragen wurden, beinhaltet das spezifische Erkennen des Proteins durch Antikörper und die Detektion des gebundenen Antikörper durch einen zweiten Antikörper, der mit einem Enzym konjugiert ist. Nach Zugabe eines Enzymsubstrates erfolgt die Detektion der Spaltungsprodukte.

Zur Absättigung der nach der Proteinübertragung verbleibenden [Seite 110↓]Proteinbindungsstellen wurde die NC-Membran in Blockierungspuffer für 30 min bei RT inkubiert. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte für 3 h. Nach drei Wasschschritten für 5 min erfolgte die Inkubation mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat für 1 h. Die NC-Membran wurde erneut dreimal mit Waschpuffer für 5 min gewaschen. Schließlich wurde die Farbreaktion mit dem Enzymsubstrat durchgeführt, bis die gewünschte Farbintensität eintrat. Als Substrat für die alkalische Phosphatase (AP) wurde 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-tetrazoliumchlorid (NBT) in AP-Puffer verwendet.

4.10.2 ELISA

Der ELISA bietet die Möglichkeit, antigenspezifische Antikörper quantitativ nachzuweisen. Hierzu wird das Antigen unspezifisch an die Festphase einer Mikrotiterplatte gebunden und anschließend mit dem Testserum inkubiert. Über ein Antikörper-Enzym-Konjugat, das den spezifisch gebundenen Antikörper erkennt, wird dann der Nachweis erbracht.

Das Antigen wurde in ELISA-Puffer I mit 5 µg/ml verdünnt und je 100 µl in die Reaktionskammern einer Mikrotiterplatte zugesetzt. Die Inkubation erfolgte ÜN bei 4°C. Nach dieser und jeder weiteren Inkubation folgten drei Waschschritte mit Waschpuffer. Von den Testseren wurden Verdünnungsreihen in ELISA-Puffer II hergestellt und je 100 µl in die Reaktionsgefäße zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 90 min bei 37°C. Danach wurden 100 µl des zweiten Antkörpers oder des Enzym-Konjugates, verdünnt in ELISA-Puffer II, zugegeben und die Ansätze jeweils für 90 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 100 µl Substratlösung zugegeben und der Ansatz für 15-30 min bei 37°C inkubiert. Die Detektion der Farbreaktion erfolgte im Plattenphotometer bei einer Absorption von 405 nm (Referenz 450 nm). Die Resultate wurden entweder als reine Absorptionswerte angegeben oder die Antikörperkonzentration wurde als Endpunkttiter dargestellt (Venkatesan und Wakelin, 93).

4.10.3 Isolierung und Aufreinigung von PBL und Milzzellen von Hühnern

In der vorliegenden Arbeit wurden zur Überprüfung der zellulären Immunantwort PBL in T-Lymphozyten-Transformationstests eingesetzt (Smith et al., 95). Milzzellen [Seite 111↓]wurden zur Überprüfung von IFN-γ in Zellkultur-ÜS präpariert.

Die Hühner wurden mit CO2 getötet, in einer Desinfektionslösung (Mucocit, 1%) gebadet und der Bauchraum und Brustbereich eröffnet. Das Blut wurde mit einer Herzpunktion (Heparin,1000 U in Spritze vorgegeben) entnommen.

Um die PBL zu gewinnen, wurde das Blut für 10 min bei ausgeschalteter Bremse zentrifugiert (40 g). Das Serum mit der weißen Zellschicht (buffy coat layer) wurde entnommen. Es folgten drei Waschschritte mit RPMI-1640-Medium für 10 min (200 g). Die Zellen wurden schließlich in 3 ml RPMI-1640-Medium resuspendiert.

Die Milzzellen wurden durch Siebpassage vereinzelt und die Gewebspartikel 3 min sedimentiert. Der ÜS mit Einzelzellen wurde für 10 min pelletiert (290 g) und nach drei Waschschritten in 5 ml RPMI-1640-Medium resuspendiert.

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer und die Bestimmung der Vitalität der Zellen mit Trypan-Blau. Nur Zellfraktionen mit einer Vitalität von >95% wurden weiter verarbeitet. Die Zellzahl wurde mit RPMI-1640 auf 107 Zellen/ml eingestellt.

4.10.4 IFN-γ-Biotest mit Hilfe einer Hühnermonozytenzelllinie (HD11)

Makrophagen/Monozyten sezernieren Stickoxid, wenn sie mit IFN-γ stimuliert werden (Sung et al., 94). Im Biotest wird eine Hühnermonozytenzelllinie (HD11) (Beug et al., 79) genutzt, um IFN-γ im Zellkultur-ÜS zu quantifizieren. Das durch die HD11-Zellen freigesetzte Stickoxid wandelt sich in stabiles Nitrit um, das durch eine Farbreaktion (Griess-Reaktion) nachgewiesen werden kann (Prowse and Pallister 1989).

100 µl einer HD11-Zellsuspension (106 Zellen/ml) wurden mit 100 µl des zu testenden Zellkultur-ÜS (von transfizierten COS-7-Zellen oder Milzzellen) versetzt und für 24 h inkubiert (40,5°C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit). Von diesem Zellkultur-ÜS wurden 50 µl entnommen und mit 100 µl Griess-Reagenz versetzt. Als Standard wurde eine 1 bis 100 µM NaNO2-Verdünnungsreihe mitgeführt. Die Detektion des Farbumschlags erfolgte im Plattenphotometer bei 540 nm.


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4.10.5  Kultivierung von Zelllinien

Zur Passagierung wurden HD11-Zellen und COS-7-Zellen für 2 min mit Trypsin-EDTA-Lösung behandelt. Nach einem Waschschritt für 10 min (290 g) wurden die Zellen in frischem Medium verdünnt und weiter inkubiert (37°C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchte). HD11-Zellen wurden in Iscoves-Vollmedium und COS-7-Zellen in Dulbeccos-MEM (DMEM) kultiviert.

Um Zellen für die Langzeitlagerung einzufrieren, wurde die Zellzahl in Einfriermedium auf 5 bis 10 x 106 Zellen/ml eingestellt und in Kryoröhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden in einem Einfrierbehälter für mindestens 24 h bei -80°C aufbewahrt und für die Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.

Um gelagerte Zellen in Kultur zu nehmen, wurden diese im 37°C Wasserbad aufgetaut und in Vollmedium für 8 min gewaschen (290 g). Die Zellen konnten anschließend in Vollmedium kultiviert werden.

4.10.6 Transformationstest mit PBL von Hühnern

Der Transformationstest ist eine Möglichkeit, die zelluläre Immunantwort in vitro zu überprüfen. Lymphozyten werden durch verschiede Substanzen (z.B. Mitogene) stimuliert und zur Proliferation angeregt, welche mit DNA-Neusynthese einhergeht. Der Vorgang kann in vitro durch den Einbau von radioaktiv markierten DNA-Vorstufen (3H-Thymidin) in die neu synthetisierte DNA nachvollzogen werden. Bei kurzen Kultivierungszeiten reflektiert die Lymphozyten-Transformation die Proliferation von T-Zellen.

Je 100 µl der PBL-Suspension wurden in die Reaktionskammern einer Flachboden-Mikrotiterplatte pipettiert und die Außennäpfe mit 200 µl sterilem PBS befüllt, um Verdunstungseffekten entgegenzuwirken. Pro Ansatz wurden 100 µl rekombinantes Antigen (5 µg/ml), inaktivierte Sporozoiten (3 x 105/Napf) oder Mitogenverdünnungen (15 µg/ml) zu den Zellen geben. Mitogenproben wurden 2 Tage und Antigenproben 4 Tage inkubiert.

Die Quantifizierung der DNA-Synthese proliferierender Lymphozyten erfolgte durch [Seite 113↓]die Ermittlung des Einbaus von radioaktiv markierten 3H-Thymidin, das 16 h vor Beendigung der Inkubationszeit zu den Zellen gegeben wurde (1 µCi/Reaktion). Die Zellernte erfolgte mit einem Zellernter (Wallac, Finnland) entsprechend den Angaben des Herstellers. Nach Trocknung der Filter bei 50°C wurde das Szintillationswachs eingeschmolzen. Die Analyse erfolgte in cpm in einem Szintillations-Spektrometer (Wallac, Finnland).

4.10.7 Immunisierung von Hühnern

Zur Immunisierung von Hühnern mit rekombinanten Antigen wurde das Adjuvans FCA eingesetzt, das eine starke humorale und zelluläre Immunreaktion (Lillehoj et al., 93) auslöst. FCA besteht aus einer Öl-Wasser-Emulsion mit inaktivierten Mycobacterium tuberculosis-Bakterien. Da FCA eine starke Granulombildung verursacht, wurde es lediglich für die primäre Injektion verwendet. Bei weiteren Injektionen wurden die Antigene mit FIA appliziert, welches nur aus einer Öl-Wasser-Emulsion besteht (Harlow und Lane, 88).

Zur Immunisierung wurden pro Tier 50 µg rekombinantes Protein mit gleichem Volumen FCA oder FIA versetzt und gemischt. Die Applikation der Emulsion erfolgte subkutan in den Nacken der Tiere.

Zur DNA-Immunisierung wurde Plasmid-DNA in 0,9% NaCl (1 mg/ml) eingesetzt. Die Applikation von 100 µl DNA-Lösung pro Tier erfolgte in den Brustmuskel der Hühner, wobei je 50 µl auf die beiden Brustmuskel verteilt wurden.

4.10.8 Gewinnung von Seren

Den Versuchstieren wurde jeweils vor der Immunisierung 100 bis 1000 µl Blut aus den Flügelvenen entnommen. Das Volumen richtete sich nach der Größe der Tiere. Zur Koaggulation wurde das Blut bei 4°C ÜN gelagert und anschließend für 20 min bei 4°C zentrifugiert (8000 g). Der Serumüberstand wurde bei -20°C gelagert.

4.10.9 Transfektion von eukaryotischen Zellen mit Plasmid-DNA

Durch in vitro-Transfektion von eukaryotischen Zellen mit Plasmid-DNA kann die Proteinexpression heterologer Gene überprüft werden. Hierzu ist es notwendig, dass [Seite 114↓]der Vektor einen starken Promotor und eine geeignete Polyadenylierungsstelle besitzt.

Diethylaminoethyl (DEAE)-Dextranmethode

Einen Tag vor der Transfektion wurden konfluente COS-7-Zellen 1:5 verdünnt und in einer 25 cm2-Kulturflasche ÜN inkubiert, so dass die Zellen am nächsten Tag zu etwa 50 % konfluent waren. Kurz vor Gebrauch wurden 5 ml DMEM-Medium mit 5 µg Plasmid-DNA und 0,2 ml DEAE-Dextran-Transfektionsreagenz versetzt. Das Gemisch wurde auf die Zellen gegeben und für 4 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der ÜS durch 10 % DMSO ersetzt und der Ansatz für 2 min bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS konnten die Zellen in Vollmedium weiter kultiviert werden. Um die Fluoreszenz von EGFP-Konstrukten zu überprüfen oder RT-PCR-Reaktionen durchzuführen, wurden die Zellen für 24 h bei 37°C inkubiert. Für Proteinexpressionsstudien mittels Immunblot wurden die Zellen für 48 -72 h kultiviert, danach geerntet und direkt in 100 -500 µl 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen.

Transfektion mittels FuGENE®

Die Transfektion von Zellen mit FuGENE®-Reagenz (Roche, Mannheim) vermittelt eine hohe Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Zelltypen. Die Transfektionen wurden in 6-Napf-Zellkulturplatten durchgeführt. Dabei betrug die Konfluenz der Zellen 50 bis 80 %. Zu den Zellen wurde tropfenweise das DNA-Reagenz zugegeben und die Zellen bis zum weiteren Gebrauch bei 37°C kultiviert. Zur Herstellung des DNA-Gemischs wurden 97 µl serumfreies Medium mit 3µl FuGENE® gemischt und anschließend mit 2 µg DNA-Lösung versetzt.

4.11 Computeranalysen und statistische Methoden

4.11.1 Sequenzanalyse nach der SignalP-Strategie

Die SignalP-Strategie wurde angewandt, um sekretorische Proteine zu identifizieren. Diese Arbeiten wurden von R. Marhofer und P. Selzer (Intervet, Schwabenheim) durchgeführt. Zunächst wurden E. tenella-EST-Sequenzen mittels sequence retrieval system (SRS) der European Molecular Biological Laboratories (EMBL, http:// www.ebi.ac.uk ) auf einen Hausrechner geladen. In einem ersten Schritt wurden [Seite 115↓] die Sequenzen mit der Computersoftware Lasergene-Seqman (DNASTAR Inc., USA) zu sogenannten Contigs zusammengefasst (Selzer et al., 04) . Die Contig-Sequenzen sind unter folgender Internetadresse zu finden: http://www.biologie.hu-berlin.de/~molpara/kokzidien_en. Diese Contigs wurden anschließend mit den beiden Proteindatenbanken Swissprot und TrEMBL (Boeckmann et al., 03) mittels blastx (Gish und States, 93) verglichen. Das blastx-Computerprogramm erlaubt es Nukleinsäuresequenzen mit Proteinsequenzen zu vergleichen. Die Proteine mit den größten Übereinstimmungen wurden anschließend für eine Signalsequenzanalyse nach Nielsen et al. (1997) genutzt. Hierfür wurden nur Proteine mit einem E-value größer 10 -4 berücksichtigt.

Aufgrund der großen Datenmengen wurden die dargestellten Arbeitsschritte mit Hilfe der Analysesoftware "LION bioSCOUT DO_ALL" (LION bioscience AG, Heidelberg) durchgeführt.

4.11.2 Sequenz- und Datenbankanalysen

Die bioinformatische Analyse von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen erfolgte mit dem Programmpaket MacVektor (Pharmacopeia, USA) nach Anleitungen des Herstellers. Die Arbeiten umfassten hauptsächlich die Ermittlung von passenden Primerbindungsstellen, Identifizierung von ORF aus Nukleinsäuresequenzen, Übersetzung von Nukleinsäuresequenzen in Proteinsequenzen, Vergleich von Sequenzen und Datenbanken.

Die Sequenzvergleiche in den verschiedenen Datenbanken wurden mittels verschiedener blast-Programme durchgeführt (Altschul et al., 97; Gish und States, 93).

4.11.3 Statistische Methoden

Die statistische Auswertung der Versuche erfolgte mit dem U-Test für den Vergleich zweier unabhängige Stichproben (Sachs, 92), wobei Unterschiede zwischen den Gruppen mit p<0,05 als signifikant angesehen wurden.

Von mehrfach bestimmten Meßwerten wurde der arithmetische Mittelwert gebildet und die Standardabweichung errechnet.


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18.05.2005