Studien zur DNA-Vakzinierung von Hühnern mit Eimeria tenella-Antigenen

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologe Christian Klotz

geboren am 24. Juni 1970 in Grünstadt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
3. PD Dr. Frank Seeber

Tag der Einreichung: 29.11.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 21.02.2005

Zusammenfassung

Der Einzeller Eimeria tenella zählt zu den hochpathogenen Parasiten des Haushuhns und ist Verursacher der Blinddarm-Kokzidiose. Zur Zeit existiert noch kein Impfstoff, der auf Basis von einzelnen Antigenen wirksam ist. Insbesondere die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, welche an der Parasit-Wirtszell-Interaktion beteiligt sind, könnte einen Beitrag zur Entwicklung einer Immunprophylaxe darstellen.

Über eine bioinformatische Methode wurden aus 12187 E. tenella-expressed sequence tag (EST) 2881 Contig-Sequenzen gebildet. Daraus konnten mittels blastx-Suche und SignalP-Analyse 84 Sequenzen extrahiert werden, die signifikante Homologien zu Proteinen mit einer N-terminalen Konsensussequenz besaßen. Aufgrund der beschriebenen Funktion und Lokalisierung dieser Proteine, wurde für 54 E. tenella-Sequenzen eine Beteiligung an der Wirts-Parasit-Interaktion abgeleitet.

Eine experimentelle Identifizierung von sekretorischen Proteinen aus einer Sporozoiten-cDNA-Bank mittels funktioneller Komplementierung in Hefen ergab insgesamt 25 unabhängige Sequenzen, die am N-Terminus eine Signalsequenz besaßen. Elf der 25 Sequenzen zeigten Homologien zu anderen, schon bekannten Proteinen, wovon lediglich drei schon beschriebene E. tenella-Proteine darstellten.

In den Analysen wurden 15 unterschiedliche Sequenzen identifiziert, die signifikante Homologien zum Hauptoberflächenprotein TA4 aufwiesen. Diese TA4-ähnlichen Proteine, deren Funktion unbekannt ist, werden vermutlich stadienspezifisch auf der Oberfläche von Sporozoiten oder Merozoiten exponiert.

Um ein DNA-Immunisierungsprotokoll für Hühner zu erarbeiten wurden die drei E. tenella-Antigene SO7, TA4 und EtMIC1 eingesetzt und der Einfluss von zwei unterschiedlichen DNA-Immunisierungsvektoren (pCDNA3, pVR1012) und des stabilisierenden Fusionspartners enhanced green flurescence protein (EGFP) überprüft. Es konnten spezifische SO7-Antikörperreaktionen induziert werden, wobei keine auffälligen Unterschiede durch den Einsatz der beiden Vektoren oder durch EGFP-Fusion zu beobachten waren. Des Weiteren wurden 13 neu identifizierte Sequenzen in den DNA-Immunisierungsvektor pCDNA3 kloniert. Zur Überprüfung des Immunschutzes wurden nach DNA-Immunisierung Belastungsinfektionen durchgeführt. Jedoch konnten in keinem Fall reproduzierbare Reduktionen der Parasitenlast erzielt werden.

Inhaltsverzeichnis

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18.05.2005