Studien zur DNA-Vakzinierung von Hühnern mit Eimeria tenella-Antigenen

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologe Christian Klotz

geboren am 24. Juni 1970 in Grünstadt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
3. PD Dr. Frank Seeber

Tag der Einreichung: 29.11.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 21.02.2005

Zusammenfassung

Der Einzeller Eimeria tenella zählt zu den hochpathogenen Parasiten des Haushuhns und ist Verursacher der Blinddarm-Kokzidiose. Zur Zeit existiert noch kein Impfstoff, der auf Basis von einzelnen Antigenen wirksam ist. Insbesondere die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, welche an der Parasit-Wirtszell-Interaktion beteiligt sind, könnte einen Beitrag zur Entwicklung einer Immunprophylaxe darstellen.

Über eine bioinformatische Methode wurden aus 12187 E. tenella-expressed sequence tag (EST) 2881 Contig-Sequenzen gebildet. Daraus konnten mittels blastx-Suche und SignalP-Analyse 84 Sequenzen extrahiert werden, die signifikante Homologien zu Proteinen mit einer N-terminalen Konsensussequenz besaßen. Aufgrund der beschriebenen Funktion und Lokalisierung dieser Proteine, wurde für 54 E. tenella-Sequenzen eine Beteiligung an der Wirts-Parasit-Interaktion abgeleitet.

Eine experimentelle Identifizierung von sekretorischen Proteinen aus einer Sporozoiten-cDNA-Bank mittels funktioneller Komplementierung in Hefen ergab insgesamt 25 unabhängige Sequenzen, die am N-Terminus eine Signalsequenz besaßen. Elf der 25 Sequenzen zeigten Homologien zu anderen, schon bekannten Proteinen, wovon lediglich drei schon beschriebene E. tenella-Proteine darstellten.

In den Analysen wurden 15 unterschiedliche Sequenzen identifiziert, die signifikante Homologien zum Hauptoberflächenprotein TA4 aufwiesen. Diese TA4-ähnlichen Proteine, deren Funktion unbekannt ist, werden vermutlich stadienspezifisch auf der Oberfläche von Sporozoiten oder Merozoiten exponiert.

Um ein DNA-Immunisierungsprotokoll für Hühner zu erarbeiten wurden die drei E. tenella-Antigene SO7, TA4 und EtMIC1 eingesetzt und der Einfluss von zwei unterschiedlichen DNA-Immunisierungsvektoren (pCDNA3, pVR1012) und des stabilisierenden Fusionspartners enhanced green flurescence protein (EGFP) überprüft. Es konnten spezifische SO7-Antikörperreaktionen induziert werden, wobei keine auffälligen Unterschiede durch den Einsatz der beiden Vektoren oder durch EGFP-Fusion zu beobachten waren. Des Weiteren wurden 13 neu identifizierte Sequenzen in den DNA-Immunisierungsvektor pCDNA3 kloniert. Zur Überprüfung des Immunschutzes wurden nach DNA-Immunisierung Belastungsinfektionen durchgeführt. Jedoch konnten in keinem Fall reproduzierbare Reduktionen der Parasitenlast erzielt werden.

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Biologie von Eimeria tenella
  • 1.2  Bedeutung und Pathologie der Eimeriosen
  • 1.3 Schützende Immunantwort während Eimerieninfektionen
    • 1.3.1 Immunantwort nach Primärinfektionen
    • 1.3.2 Immunantwort nach Reinfektionen
  • 1.4 Kontrolle der Kokzidiose
    • 1.4.1 Therapeutika
    • 1.4.2  Impfstoffe und Impfstoffentwicklung gegen Eimerieninfektionen
  • 1.5 Ziele der Arbeit
• 2  Ergebnisse
  • 2.1 Identifizierung sekretorischer Proteine von E. tenella
    • 2.1.1 Identifizierung sekretierter Proteine mittels bioinformatischer Methoden
      • 1 Apikomplexaspezifische, sekretorische Proteine
      • 2 Transporter-, Rezeptor- und Signalproteine
      • 3  Sekretierte, enzymatisch aktive Moleküle und Matrixproteine
      • 4  Analyse und Charakterisierung von TA4-ähnlichen Sequenzen
    • 2.1.2  Identifizierung sekretierter Proteine durch experimentelle Methoden
      • 1  Konstruktion einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten
      • 2  Identifizierung sekretorischer E. tenella-Sequenzen aus Hefetransfektanten durch funktionelle Komplementierung
      • 3 Analyse der identifizierten cDNA-Sequenzen
  • 2.2  DNA-Immunisierungsstudien mit den E. tenella-Antigenen SO7, TA4 und EtMIC1 bei Hühnern
    • 2.2.1  Konstruktion der DNA-Immunisierungsvektoren und Überprüfung der Plasmide in der Zellkultur
      • 1 Konstruktion und Überprüfung von Plasmiden mit den Genen für die sekretorischen E. tenella-Proteine SO7, TA4 und EtMIC1
      • 2 Konstruktion und Überprüfung von Vektoren mit den Hühnergenen der proinflammatorischen Zytokine chIFN-γ und chIL-18.
    • 2.2.2  Immunisierung von Hühnern mit Eimerien-DNA-Konstrukten und rekombinantem SO7- und TA4-Protein
    • 2.2.3 Einfluss des Vektortypes, des Fusionspartners EGFP und koexprimierter Zytokine auf den Immunisierungserfolg mit SO7-DNA-Vakzinen
  • 2.3 DNA-Immunisierungsstudien mit neu-identifizierten, sekretorischen E. tenella-Antigenen bei Hühnern
  • 2.4 
    • 2.4.1 
      • 1 Klonierung und Überprüfung der ausgewählten sekretorischen Eimeriensequenzen im eukaryotischen Expressionsvektor pCDNA3
      • 2  DNA Immunisierung von Hühnern mit den generierten Eimeria-cDNA-Konstrukten
• 3  Diskussion
  • 3.1 Sekretorische Eimerienproteine als Impfstoffkandidaten
    • 3.1.1 Charakterisierung der TA4-ähnlichen Proteinsequenzen
    • 3.1.2 Identifizierte E. tenella-Proteine als Impfstoffkandidaten
  • 3.2 Immunreaktion von Hühnern nach DNA-Immunisierung
    • 3.2.1 Proteinexpression in vitro
    • 3.2.2 Analyse der Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung zur Bestätigung des Immunisierungserfolges
    • 3.2.3 Protektive zelluläre Immunantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung
    • 3.2.4 Ausblick für alternative DNA-Applikationen und neue Immunisierungs-Strategien bei Hühnern
  • 3.3 Resumé
• 4  Methoden
  • 4.1 Gewinnung von Parasitenmaterial
    • 4.1.1 Passagierung von E. tenella in Hühnern und Gewinnung von Oozysten
    • 4.1.2 Gewinnung reiner E. tenella-Sporozoiten
    • 4.1.3 Bestimmung der Oozystenzahl im Fäzes infizierter Tiere
  • 4.2 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen
    • 4.2.1 Identifizierung rekombinanter Bakterienklone
    • 4.2.2 Langzeitlagerung von E. coli-Zellen
  • 4.3  Transformation von S. cerevicae-Zellen mit Plasmid-DNA
    • 4.3.1 Langzeitlagerung von Hefezellen
  • 4.4  Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren
    • 4.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
    • 4.4.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen
    • 4.4.3 Isolierung von Ribonukleinsäuren
    • 4.4.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
    • 4.4.5 Reinigung von Nukleinsäurelösung mittels Phenol/Chlorophorm-Extraktion
    • 4.4.6 Konzentrieren von Nukleinsäuren (Ethanolpräzipitation)
    • 4.4.7  Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
  • 4.5 Analyse und enzymatische Veränderungen von Nukleinsäuren
    • 4.5.1 Agarose-Gelelektophorese
    • 4.5.2 Restriktionsverdau von DNA
    • 4.5.3 Ligation von DNA-Fragmenten
    • 4.5.4 Phosphorylierung von Nukleinsäuren
    • 4.5.5 Sequenzierung von DNA
    • 4.5.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
    • 4.5.7 Reverse Transkription (RT)
    • 4.5.8 Zweitstrang-cDNA-Synthese
  • 4.6 Herstellung einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten
  • 4.7 Identifizierung von sekretorischen Proteinen mittels Hefemutanten (suc2 ^- , trp ^-) und Invertaseaktivitätstest
  • 4.8 Expression und Aufreinigung rekombinanter E. coli-Proteine
  • 4.9  Proteinanalytik
    • 4.9.1 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)
    • 4.9.2 Elektrotransfer von gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf Nitrocellulose (NC)-Membranen
    • 4.9.3  Konzentrationsbestimmung von Proteinen mittels Bicinchroninsäure (BCA)-Test
    • 4.9.4 Kopplung von myc-Peptid an BSA
  • 4.10 Immunologische und zellbiologische Methoden
    • 4.10.1 Immunchemischer Nachweis von Proteinen auf NC-Membran
    • 4.10.2 ELISA
    • 4.10.3 Isolierung und Aufreinigung von PBL und Milzzellen von Hühnern
    • 4.10.4 IFN-γ-Biotest mit Hilfe einer Hühnermonozytenzelllinie (HD11)
    • 4.10.5  Kultivierung von Zelllinien
    • 4.10.6 Transformationstest mit PBL von Hühnern
    • 4.10.7 Immunisierung von Hühnern
    • 4.10.8 Gewinnung von Seren
    • 4.10.9 Transfektion von eukaryotischen Zellen mit Plasmid-DNA
  • 4.11 Computeranalysen und statistische Methoden
    • 4.11.1 Sequenzanalyse nach der SignalP-Strategie
    • 4.11.2 Sequenz- und Datenbankanalysen
    • 4.11.3 Statistische Methoden
• 5  Material
  • 5.1 Laborgeräte
  • 5.2 Verbrauchsmaterialien
  • 5.3 Chemikalien, Sonstiges
  • 5.4 Kommerzielle Kits und Enzyme
  • 5.5 Antikörperkonjugate, Immunchemikalien
  • 5.6 Tiermaterial und permanente Zelllinien
  • 5.7 Bakterienstämme, Hefestämme und Plasmide
  • 5.8 Oligonukleotide, Adaptoren
  • 5.9  Puffer, Medien und Stammlösungen
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung
• 6. Abkürzungsverzeichnis
• 7. Literatur
• 8. Publikationen und Tagungsbeiträge

Tabellen

• Tab 1: Eimeria tenella-Sequenzen mit Homologien zu apikomplexaspezifischen, sekretorischen Proteinen.
• Tab. 2: Eimeria tenella-Sequenzen mit Homologien zu Transportern und signalvermittelnden Proteinen.
• Tab. 3: Sekretorische Enzyme und Matrixbestandteile mit Homologien zu Eimeria tenella-Sequenzen.
• Tab. 4: Stadienspezifische EST-Verteilung der TA4-ähnlichen Contigs.
• Tab. 5: Identifizierte Signalpeptide der Eimeria tenella-Sporozoiten cDNA's.
• Tab. 6: Datenbankabgleich der 25 experimentell identifizierten sekretorischen Eimeria tenella-Sequenzen.
• Tab. 7: Oozystenausscheidung von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.
• Tab. 8: Gewichtsanalyse von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.
• Tab. 9: Erwartete PCR-Produkte und theoretisches Molekulargewicht der abgeleiteten Eimeria tenella-Proteine.

Bilder

• Abb. 1: Lebenszyklus von Eimeria tenella.
• Abb. 2: Die DNASignalP-Analyse zur Identifizierung sekretorischer Proteine aus EST-Datenbanken (Selzer et al., 04).
• Abb. 3: Aminosäurevergleich der homologen TA4-ähnlichen Sequenzen.
• Abb. 4: Hefeplasmid pSUC2 (Jacobs et al., 97).
• Abb. 5: Identifizierung von Proteinen mit N-terminalen Signalpeptiden durch funktionelle Komplementierung in Saccharomyces cerevisiae.
• Abb. 6: Agarose-Gelelektrophorese der Eimeria tenella-Sporozoiten-cDNA.
• Abb. 7: Insertgröße zufällig ausgewählter Klone der Eimeria tenella-Sporozoiten-cDNA-Bank.
• Abb. 8: Überprüfung der extrazellulären Invertaseaktivität rekombinanter Hefeklone.
• Abb. 9: Klonierungsschema der DNA-Immunisierungsvektoren mit cDNA-Sequenzen von SO7, TA4 und EtMIC1.
• Abb. 10: Immunblotanalyse der fusionsfreien Konstrukte in COS-7-Zellen mit anti-Eimeria tenella-Serum.
• Abb. 11: RT-PCR-Analyse der Transkription von Eimeriengenen in COS-7-Zellen.
• Abb. 12: Immunblotanalyse der EGFP-Fusionskonstrukte in COS-7-Zellen.
• Abb. 13: Expression von EGFP-Fusionsproteinen in COS-7-Zellen.
• Abb. 14: Expression von EGFP-Fusionsproteinen in HD11-Zellen.
• Abb. 15: Nachweis von chIFN-γ in COS-7-Zellkulturüberständen.
• Abb. 16: Aktivitätstest von chIL-18.
• Abb. 17: Schema zur DNA-Immunisierung von Hühnern.
• Abb. 18: Antikörperantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0 und 30.
• Abb. 19: EGFP-spezifische Antikörperantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung mit EGFP-Fusionskonstrukten am Tag 0 und 30.
• Abb. 20: Proliferation der PBL von DNA-immunisierten Hühnern nach einer Eimeria tenella-Belastungsinfektion und nach ConA-Stimulation.
• Abb. 21: Oozystenausscheidung und Gewichtsdifferenz von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.
• Abb. 22: Antikörperantwort von Hühnern nach parenteraler Immunisierung mit TA4- und SO7-Protein am Tag 0 und 14.
• Abb. 23: Proliferation der PBL von parenteral immunisierten Hühnern nach Eimeria tenella-Belastungsinfektion und nach Restimulation mit SO7- bzw. TA4-Antigen.
• Abb. 24: Oozystenausscheidung und Gewichtsdifferenz von parenteral immunisierten Hühnern während einer Eimeria tenella-Belastungsinfektion.
• Abb. 25: EGFP-spezifische Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung von Hühnern mit dem Modellplasmid EGFP-pCDNA3.
• Abb. 26: SO7-spezifischer Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28.
• Abb. 27: SO7-Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28 mit SO7-Fusionskonstrukt und chIFN-γ-Plasmid.
• Abb. 28: SO7-Antikörpertiter von Hühnern nach DNA-Immunisierung am Tag 0, 14 und 28 mit SO7-pCDNA3-Konstrukten und chIL-18-pCDNA3.
• Abb. 29: Agarose-Gelelektrophorese der mittels RT-PCR isolierten Eimeria tenella-cDNA's.
• Abb. 30: Immunblotanalyse der pCDNA3myc-Konstrukte in COS-7-Zellen mit anti-myc-Antikörper.
• Abb. 31: Schema zur DNA-Immunisierung von Hühnern.
• Abb. 32: Oozystenausscheidung von DNA-immunisierten Hühnern während der Eimeria tenella-Belastungsinfektion.
• Abb. 33: Gewichtsdifferenz von DNA-immunisierten Hühnern während der E. tenella-Belastungsinfektion.