Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

• 1  Einleitung

  • 1.1 Biologie von Eimeria tenella

  • 1.2  Bedeutung und Pathologie der Eimeriosen

  • 1.3 Schützende Immunantwort während Eimerieninfektionen

    • 1.3.1 Immunantwort nach Primärinfektionen

    • 1.3.2 Immunantwort nach Reinfektionen

  • 1.4 Kontrolle der Kokzidiose

    • 1.4.1 Therapeutika

    • 1.4.2  Impfstoffe und Impfstoffentwicklung gegen Eimerieninfektionen

  • 1.5 Ziele der Arbeit

• 2  Ergebnisse

  • 2.1 Identifizierung sekretorischer Proteine von E. tenella

    • 2.1.1 Identifizierung sekretierter Proteine mittels bioinformatischer Methoden

      • 1 Apikomplexaspezifische, sekretorische Proteine

      • 2 Transporter-, Rezeptor- und Signalproteine

      • 3  Sekretierte, enzymatisch aktive Moleküle und Matrixproteine

      • 4  Analyse und Charakterisierung von TA4-ähnlichen Sequenzen

    • 2.1.2  Identifizierung sekretierter Proteine durch experimentelle Methoden

      • 1  Konstruktion einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten

      • 2  Identifizierung sekretorischer E. tenella-Sequenzen aus Hefetransfektanten durch funktionelle Komplementierung

      • 3 Analyse der identifizierten cDNA-Sequenzen

  • 2.2  DNA-Immunisierungsstudien mit den E. tenella-Antigenen SO7, TA4 und EtMIC1 bei Hühnern

    • 2.2.1  Konstruktion der DNA-Immunisierungsvektoren und Überprüfung der Plasmide in der Zellkultur

      • 1 Konstruktion und Überprüfung von Plasmiden mit den Genen für die sekretorischen E. tenella-Proteine SO7, TA4 und EtMIC1

      • 2 Konstruktion und Überprüfung von Vektoren mit den Hühnergenen der proinflammatorischen Zytokine chIFN-γ und chIL-18.

    • 2.2.2  Immunisierung von Hühnern mit Eimerien-DNA-Konstrukten und rekombinantem SO7- und TA4-Protein

    • 2.2.3 Einfluss des Vektortypes, des Fusionspartners EGFP und koexprimierter Zytokine auf den Immunisierungserfolg mit SO7-DNA-Vakzinen

  • 2.3 DNA-Immunisierungsstudien mit neu-identifizierten, sekretorischen E. tenella-Antigenen bei Hühnern

  • 2.4 

    • 2.4.1 

      • 1 Klonierung und Überprüfung der ausgewählten sekretorischen Eimeriensequenzen im eukaryotischen Expressionsvektor pCDNA3

      • 2  DNA Immunisierung von Hühnern mit den generierten Eimeria-cDNA-Konstrukten

• 3  Diskussion

  • 3.1 Sekretorische Eimerienproteine als Impfstoffkandidaten

    • 3.1.1 Charakterisierung der TA4-ähnlichen Proteinsequenzen

    • 3.1.2 Identifizierte E. tenella-Proteine als Impfstoffkandidaten

  • 3.2 Immunreaktion von Hühnern nach DNA-Immunisierung

    • 3.2.1 Proteinexpression in vitro

    • 3.2.2 Analyse der Antikörperantwort nach DNA-Immunisierung zur Bestätigung des Immunisierungserfolges

    • 3.2.3 Protektive zelluläre Immunantwort von Hühnern nach DNA-Immunisierung

    • 3.2.4 Ausblick für alternative DNA-Applikationen und neue Immunisierungs-Strategien bei Hühnern

  • 3.3 Resumé

• 4  Methoden

  • 4.1 Gewinnung von Parasitenmaterial

    • 4.1.1 Passagierung von E. tenella in Hühnern und Gewinnung von Oozysten

    • 4.1.2 Gewinnung reiner E. tenella-Sporozoiten

    • 4.1.3 Bestimmung der Oozystenzahl im Fäzes infizierter Tiere

  • 4.2 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli-Zellen

    • 4.2.1 Identifizierung rekombinanter Bakterienklone

    • 4.2.2 Langzeitlagerung von E. coli-Zellen

  • 4.3  Transformation von S. cerevicae-Zellen mit Plasmid-DNA

    • 4.3.1 Langzeitlagerung von Hefezellen

  • 4.4  Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

    • 4.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien

    • 4.4.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen

    • 4.4.3 Isolierung von Ribonukleinsäuren

    • 4.4.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

    • 4.4.5 Reinigung von Nukleinsäurelösung mittels Phenol/Chlorophorm-Extraktion

    • 4.4.6 Konzentrieren von Nukleinsäuren (Ethanolpräzipitation)

    • 4.4.7  Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

  • 4.5 Analyse und enzymatische Veränderungen von Nukleinsäuren

    • 4.5.1 Agarose-Gelelektophorese

    • 4.5.2 Restriktionsverdau von DNA

    • 4.5.3 Ligation von DNA-Fragmenten

    • 4.5.4 Phosphorylierung von Nukleinsäuren

    • 4.5.5 Sequenzierung von DNA

    • 4.5.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)

    • 4.5.7 Reverse Transkription (RT)

    • 4.5.8 Zweitstrang-cDNA-Synthese

  • 4.6 Herstellung einer cDNA-Bank aus E. tenella-Sporozoiten

  • 4.7 Identifizierung von sekretorischen Proteinen mittels Hefemutanten (suc2 ^- , trp ^-) und Invertaseaktivitätstest

  • 4.8 Expression und Aufreinigung rekombinanter E. coli-Proteine

  • 4.9  Proteinanalytik

    • 4.9.1 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

    • 4.9.2 Elektrotransfer von gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf Nitrocellulose (NC)-Membranen

    • 4.9.3  Konzentrationsbestimmung von Proteinen mittels Bicinchroninsäure (BCA)-Test

    • 4.9.4 Kopplung von myc-Peptid an BSA

  • 4.10 Immunologische und zellbiologische Methoden

    • 4.10.1 Immunchemischer Nachweis von Proteinen auf NC-Membran

    • 4.10.2 ELISA

    • 4.10.3 Isolierung und Aufreinigung von PBL und Milzzellen von Hühnern

    • 4.10.4 IFN-γ-Biotest mit Hilfe einer Hühnermonozytenzelllinie (HD11)

    • 4.10.5  Kultivierung von Zelllinien

    • 4.10.6 Transformationstest mit PBL von Hühnern

    • 4.10.7 Immunisierung von Hühnern

    • 4.10.8 Gewinnung von Seren

    • 4.10.9 Transfektion von eukaryotischen Zellen mit Plasmid-DNA

  • 4.11 Computeranalysen und statistische Methoden

    • 4.11.1 Sequenzanalyse nach der SignalP-Strategie

    • 4.11.2 Sequenz- und Datenbankanalysen

    • 4.11.3 Statistische Methoden

• 5  Material

  • 5.1 Laborgeräte

  • 5.2 Verbrauchsmaterialien

  • 5.3 Chemikalien, Sonstiges

  • 5.4 Kommerzielle Kits und Enzyme

  • 5.5 Antikörperkonjugate, Immunchemikalien

  • 5.6 Tiermaterial und permanente Zelllinien

  • 5.7 Bakterienstämme, Hefestämme und Plasmide

  • 5.8 Oligonukleotide, Adaptoren

  • 5.9  Puffer, Medien und Stammlösungen

• Eidesstattliche Erklärung

• Danksagung

• 6. Abkürzungsverzeichnis

• 7. Literatur

• 8. Publikationen und Tagungsbeiträge