Aus der Klinik für Geburtsmedizin
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Th₁-Zytokine und die Prothrombinase fgl2 in normaler und pathologischer Schwangerschaft

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Maike Knackstedt
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen

Dekan: Prof. Dr. med. Matin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen
2. Prof. Dr. med. habil. H. Donat
3. Prof. Dr. med. G. Schönfelder

Datum der Promotion: 24. September 2004

Inhaltsverzeichnis

• Zielsetzung
• 1  Einleitung
  • 1.1  Grundlagen der Implantation eines Embryos – Der Beginn einer Schwangerschaft
    • 1.1.1  Das Transplantationsmodell
    • 1.1.2 Die pathologische Implantation
  • 1.2 Immunologische Grundlagen einer Schwangerschaft
    • 1.2.1  Das Th ₁ /Th ₂ -Paradigma
    • 1.2.2 Die Rolle der Th ₁ -Zytokine in der Schwangerschaft
  • 1.3 Folgen der immunologischen Dysbalance in der Schwangerschaft
    • 1.3.1  Die Aktivierung des Gerinnungssystems
    • 1.3.2 Die Rolle der Apoptose in der Schwangerschaft
  • 1.4 Aspekte des Spontanabortes
    • 1.4.1  Immunologische Grundlagen des Spontanabortes
    • 1.4.2 Zwei Abortmodelle in CBA/J Mäusen: Stress versus IL-12
  • 1.5 Immunologische Aspekte der Präeklampsie
  • 1.6 Fragestellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Versuchstiere
  • 2.2 Patientinnenkollektiv
  • 2.3 Versuchsaufbau der Tierversuche
  • 2.4 Abortrate in Prozent
  • 2.5 Gewebepräparation
  • 2.6 Total-RNA-Extraktion
  • 2.7 DNAse-Behandlung der RNA-Proben
  • 2.8 Reverse Transkription
  • 2.9 Qualitative PCR
  • 2.10 Die Agaroseelektrophorese
  • 2.11 Quantitative PCR
  • 2.12 Analyse der Taq-Man-Daten
  • 2.13 Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab (Minipräparation)
  • 2.14 Linearisierung der Plasmid-cDNA
  • 2.15 Synthese der ³⁵S-markierten RNA-Sonde
  • 2.16 In-situ-Hybridisierung
  • 2.17 Immunhistochemie
  • 2.18 TUNEL-Färbung
  • 2.19 Giemsa-Färbung
  • 2.20  Statistische Analyse der Daten
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Die Erhöhung der Abortrate durch Stress und durch die Injektion von IL-12 p70
  • 3.2  Der Einfluss von Stress auf die mRNA-Expression von abortogenen Zytokinen
    • 3.2.1  Der Anstieg von TNF-α mRNA nach Stressexposition
    • 3.2.2 Die IFN-γ-Expression nach Stressapplikation
    • 3.2.3 Die Beeinflussung der mRNA-Expression von IL-12 durch Stress
    • 3.2.4 Das Verhältnis der Abortrate zu der quantitativen Menge an Zytokinen
  • 3.3 Das Zytokinprofil nach der Injektion von IL-12
  • 3.4 Der Vergleich der Expression von fgl2 mRNA bei Stress und  nach Injektion von IL-12
  • 3.5 Die Induktion von Apoptose durch Stress und IL-12 im Mausmodell
  • 3.6 Die Expression von TNF-α im ersten Trimenon und dritten Trimenon
  • 3.7 Die Expression von fgl2 mRNA und fgl2 Protein in humanem Plazentagewebe
    • 3.7.1  Das erste Trimenon
    • 3.7.2 Das dritte Trimenon
  • 3.8 Apoptose in Präeklampsie und Spontanabort
• 4 Diskussion
• 5 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• 6. Schriftenverzeichnis
• 7. Anhang
• Danksagung
• Erklärung an Eides statt

Tabellen

• Tabelle 1: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf und von Pr ä eklampsie-PatientinnenVermehrte Expression von TNF-α Protein in Endothelzellen und Trophoblasten bei Präeklampsie (PE) im Vergleich zu einem normalen Schwangerschaftsverlauf. Kein Unterschied in der Expression von TNF-α Protein in Trophoblastzellen und plazentaren Makrophagen.
• Tabelle 2: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf und bei Pr ä eklampsie-PatientinnenVermehrte Expression von fgl2 Protein in Endothelzellen, Trophoblasten und Makrophagen bei Präeklampsie-Patientinnen (PE) im Vergleich zu einem normalen Schwangerschaftsverlauf.
• Tabelle 3: Überblick über das Zytokinprofil im Mausmodell nach Stress und IL-12-Injektion
  Stress bewirkte einen Anstieg der Resorptionsrate und von TNF-α mRNA, wobei fgl2 mRNA vermindert exprimiert wurde. Stress zeigte keinen Einfluss auf die Expression von IFN-γ mRNA und IL-12 mRNA. Die Injektion von IL-12 bewirkte einen Anstieg von TNF-α und IFN-γ mRNA sowie einen Anstieg von fgl2 mRNA.

Bilder

• Abbildung 1: Trophoblasteninvasion während der Frühschwangerschaft Cytotrophoblasten invadieren in mütterliches Gewebe, insbesondere in mütterliche Gefäße. Dort kleiden sie die Gefäßwand luminal aus, wobei sie das Integrinmuster der mütterlichen Endothelzellen imitieren.  (modifiziert nach Zhou et al. 1997)
• Abbildung 2: Uteroplazentare Zirkulation Dargestellt ist die Umwandlung der maternalen Spiralarterien von Hochwiderstandsgefäßen in Gefäße mit niedrigem Widerstand bei weitem Gefäßdurchmesser. Diese Umwandlung wird durch die eingewanderten Trophoblasten, die das Integrinprofil der mütterlichen Endothelzellen imitieren, gesteuert (siehe auch Abbildung 1). (modifiziert nach Zhou, 1997)
• Abbildung 3: Darstellung eines der Seitenhörner des V-förmigen Mausuterus
• Abbildung 4: Prinzip der quantitativen PCR 1. Die Sonde ist linear an die cDNA gebunden und das Quencher-Molekül inhibiert die Fluoreszenz des Reporters. 2. Bei der Synthese der cDNA wird die Sonde von der cDNA abgespalten. Der Quencher inhibiert nicht länger den Reporter.
• Abbildung 5: Die Resorptionsraten und Implantationen bei Stress und IL-12-Injektion A: Die Resorptionsrate in Prozent lag bei den stressbehandelten und den IL-12-behandelten Tieren zweifach höher als bei den nicht behandelten Tieren (kein Stress, keine Injektionen). B: Die durchschnittliche Anzahl an Implantationen pro Tier ist hier angezeigt, wobei Stress und IL-12-Injektion die Anzahl der Implantationen geringfügig reduzierten.
• Abbildung 6: TNF- α mRNA in Stress und Kontro l le Ein 5facher Anstieg der Menge an TNF- α nach Stress im Vergleich zu den nichtbehandelten Tieren.
• Abbildung 7: IFN- γ mRNA in Stress und KontrolleKeine Veränderung in der Menge an IFN- mRNA nach Stressexposition.
• Abbildung 8: IL-12 p40 und Il-12 p35 in Stress und Kontrolle A: Die Stressexposition der trächtigen Mäuse reguliert die Expression von IL-12 p40 um das 1,2fache herunter. B: Die Stressexposition der trächtigen Mäuse reguliert die Expression von IL-12 p35 um das 2,8fache herauf.
• Abbildung 9: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter TNF- α mRNA Es zeigt sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an TNF- α mRNA und dem Prozentsatz an Resorptionen bei einem Korrelationskoeffizienten von r = 0.611.
• Abbildung 10: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter IFN- γ RNA Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IFN-γ und dem Prozentsatz an Resorptionen.
• Abbildung 11: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an expr i mierter IL-12 p40 mRNA Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IL-12 p40 und dem Prozentsatz an Resorptionen.
• Abbildung 12: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter IL-12 p35 mRNA Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IL-12 p35 und dem Prozentsatz an Resorptionen.
• Abbildung 13: Zytokinregulation nach der Injektion von IL-12 p70Deutlicher Anstieg von TNF-α und IFN-γ nach der Injektion von rekombinanten IL-12 p70.
• Abbildung 14: In-situ-Hybridisierung für fgl2 mRNA im Uterus eines CBA/J-Weibchen am Tag 13,5 der Trächti g keit (A) zeigt die Sense-Probe und (B) zeigt die fgl2 mRNA positive Antisense-Probe.
• Abbildung 15: Fgl2 mRNA-Expression bei stress-induziertem und inflammatorisch-induziertem Abort A: Fgl2 mRNA nach Stress und nach Injektion von IL-12: Fgl2 mRNA ist nach der Applikation von Stress (Tag 5,5) am Tag 13,5 der Trächtigkeit um das 3fache niedriger, wohingegen die Stimulation mit IL-12 p70 fgl2 mRNA auf das Dreifache erhöht. B: Zusammenhang zwischen fgl2 und der Anzahl an Aborten: Es ist kein Zusammenhang zwischen der Menge an fgl2 mRNA und der Höhe der Resorptionen erkennbar.
• Abbildung 16: Zusammenhang zwischen der Menge an TNF- α und der Menge an fgl2 mRNA Es zeigt sich keine signifikante Korrelation zwischen der Menge an TNF-αund der Menge an fgl2 mRNA, als Tendenz lässt sich ein negativer Zusammenhang zwischen den beiden Parametern erkennen.
• Abbildung 17: Zusammenhang zwischen der Menge an IFN- γ mRNA und der exprimierten Menge an fgl2 mRNA Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IFN-γ und der Menge an fgl2 mRNA.
• Abbildung 18: Apoptose nach Stress und nach IL-12-Injektion Stressstimulation und IL-12-Stimulation erhöhen das Auftreten von Apoptose im Uterus von CBA/J Weibchen.
• Abbildung 19: TNF- α Expression in den Gefäßen bei PräeklampsieSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für TNF-α Protein an den Gefäßen in Präeklampsie und Kontrollen.
• Abbildung 20: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für TNF-α Protein.
• Abbildung 21: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta von Präeklampsie-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für TNF-α Protein.
• Abbildung 22: In-situ-Hybridisierung für fgl2 mRNA 1.-Trimester-Zotte(A) zeigt die Sense-Kontrolle und (B) zeigt die Antisense-Färbung für fgl2 mRNA.
• Abbildung 23: Immunhistochemie für fgl2 in 1.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein sowie einen repräsentativen Gefäßanschnitt.
• Abbildung 24: fgl2 Protein-Expression in Endothelzellen von Gefäßen im ersten Tr i menonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Gefäßen in der Dezidua basalis von Kontrolle und Spontanabort.
• Abbildung 25: fgl2 Protein-Expression in Trophoblasten des ersten TrimenonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Trophoblastzellen der Dezidua basalis in Kontrolle und Spontanabort
• Abbildung 26: Immunhistochemie für fgl2 in 1.-Trimester-Plazenta von Abort-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein sowie einen repräsentativen Gefäßanschnitt.
• Abbildung 27: Expression von fgl2 Protein in Endothelzellen im dritten TrimenonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Gefäßen in Präeklampsie und Kontrollen.
• Abbildung 28: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein.
• Abbildung 29: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta von Präeklampsie-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein.
• Abbildung 30: Apoptose im ersten und dritten Trimenon A: Semi-quantitative Analyse der apoptotischen Signale im Spontanabort. B: Semi-quantitative Analyse der apoptotischen Signale bei Präeklampsie.
• Abbildung 31: Apoptose im dritten TrimenonDie Zellkerne sind blau angefärbt, wobei die apoptotischen Fragmente grünfluoreszieren.
• Abbildung 32: HypotheseDurch simultane Applikation von TNF-α und IFN-γ am Tag 7,5 der Trächtigkeit werden immunkompetente Zellen, wie Mastzellen, spezifische T-Zellsubpopulationen und Makrophagen, aktiviert, wodurch ein inflammatorisches Milieu mit Produktion von Th_1-Zytokinen entsteht. Die Anwesenheit von TNF-α und IFN-γ sowie Interleukin-1 im Uterus stimuliert maternale Endothelzellen zur Produktion und Sekretion von fgl2. Wenn fgl2 von den maternalen Endothelzellen exprimiert wird, fungiert es als direkte Prothrombinase und wandelt Prothrombin in Thrombin um. Dieser Vorgang führt zum einem zur Gerinnung und erhöhter Bildung von Fibrin, zum anderen zur Aktivierung der Endothelzellen und zur erhöhten Produktion von IL-8 (in der Maus MIP-2). Die Anwesenheit von IL-8 wirkt chemotaktisch auf polymorphonukleare Leukozyten, die dann zu Zelluntergang und nekrotischem Gewebezerfall führen. „Klinisch“ zeigt sich das Bild einer gesteigerten Abortrate. Appliziert man gleichzeitig mit den Zytokinen gerinnungshemmende Medikamente wie Hirudin oder Heparin bleibt der deutliche Anstieg der Abortrate aus.