2 Material und Methoden

↓11

2.1  Versuchstiere

Sechs bis acht Wochen alte DBA/2J-Männchen und CBA/J-Weibchen wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) und alternativ auch vom Jackson Laboratory (Maine, USA) bezogen. Die Tiere wurden in der Tierhaltung des Virchow-Klinikums (Berlin, Deutschland) beziehungsweise der Tierhaltung des Toronto Hospitals (Toronto, Kanada) bei einem Licht-/Dunkelheitszyklus von zwölf Stunden gehalten. Die Tiere erhielten Futter und Wasser ad lib i tum. Zwei Monate alte CBA/J-Weibchen und drei Monate alte DBA/2J-Männchen wurden im Verhältnis 2:1 für die Verpaarung zusammengesetzt. Die Trächtigkeit wurde jeden Tag zur gleichen Zeit durch die Untersuchung auf einen vaginalen Pfropfen kontrolliert. Dieser Tag wurde als Tag 0,5 der Trächtigkeit dokumentiert. Die Genehmigung zur Vornahme der Versuche dieser Arbeit an lebenden Wirbeltieren wurde vom Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit unter Reg 0401/98 erteilt.

2.2 Patientinnenkollektiv

↓12

Die aus dem ersten Trimenon stammenden Gewebeproben bestanden aus paraformaldehyd-fixierten und in Paraffin eingebetteten Deziduaproben von 14 Patientinnen, die einen Abort erlitten hatten und von sechs Patientinnen mit einer elektiven Terminierung einer normalen Schwangerschaft aus sozialer Indikation. Die Proben wurden routinemäßig von der Pathologie des Virchow-Klinikums (Berlin, Deutschland) gesammelt und freundlicherweise zur Untersuchung auf fgl2, TNF-α und Apoptose zur Verfügung gestellt.

Die aus dem dritten Trimenon stammenden Gewebeproben bestanden aus paraformaldehyd-fixierten und in Paraffin eingebetteten Plazentaproben von zwölf normalen Schwangerschaften und zwölf Plazenten von Patientinnen mit einer Präeklampsie. Im Folgenden werden diese als „Präeklampsie-Plazenten“ bezeichnet. Die Plazentaproben wurden routinemäßig von der Pathologie des Virchow-Klinikums gesammelt und freundlicherweise zur Untersuchung auf fgl2, TNF-α und Apoptose zur Verfügung gestellt. Die Kontrollproben wurden dem Gestationsalter der Präeklampsieproben, 27- 41 Schwangerschaftswochen (SSW), entsprechend ausgewählt. Die Präeklampsieproben wurden nach den Kriterien der Internationalen Gesellschaft zur Untersuchung von Bluthochdruck in der Schwangerschaft (ISSHP) ausgesucht, wobei der diastolische Blutdruck mindestens dreimal 100mmHg und mehr betragen haben und mindestens einmal eine Proteinurie mit 1g/dl Protein im Urin oder einem +++ Signal auf dem Urinstreifen gemessen worden sein musste.

2.3 Versuchsaufbau der Tierversuche

↓13

Es wurden zwei unhabhängige Tierversuche durchgeführt. In dem ersten Versuchsaufbau (I) wurden zehn trächtige Weibchen der Kontrollgruppe zugeordnet und elf der trächtigen Weibchen wurde am Tag 5,5 der Trächtigkeit für 24 h einer Lärmquelle (300 Hz, 70 dB, 4 Mal pro Minute in unregelmäßigen Abständen) ausgesetzt. Lärm ist eine anerkannte Methode zur Stress-Applikation bei Nagetieren, insbesondere die CBA/J-Weibchen zeigen sich empfänglich für diese Art des Stresses (Arck et al., 1995; Arck et al., 1997; Arck et al., 1997). Am Tag 13,5 wurden die Weibchen getötet und die Uteri entnommen. In einem weiteren Versuchsaufbau (II) wurden fünf der trächtigen Weibchen einer Kontrollgruppe zugeordnet und sieben der trächtigen Weibchen erhielten am Tag 5,5; 6,5; 7,5 und 8,5 der Trächtigkeit anstatt Stress eine Injektion von rekombinanten, murinen IL-12 p70 Protein ( R&D System, Deutschland). Die Injektion erfolgte intraperitoneal mit 100ng des IL-12 für vier Tage zwischen 8:00 und 10:00 Uhr (Fantuzzi et al., 1999; Zenclussen et al., 2002). Alle Kontrollgruppen erhielten keinerlei Behandlung; auch auf die Injektion von PBS Puffer wurde verzichtet, da in vorangegangenen Arbeiten bereits gezeigt werden konnte, dass die i.p. Injektion von PBS-Puffer keine Auswirkung auf die Abortrate im Vergleich zu nicht behandelten Tieren hatte (Arck et al., 1995).

2.4 Abortrate in Prozent

Am Tag 13 der Trächtigkeit wurden die Weibchen mittels Genickbruch getötet und die Uteri präpariert. Es wurde die Anzahl an erfolgreichen Implantationen im Verhältnis zur Anzahl an Resorptionen (=Aborte) protokolliert. Resorption wurde anhand der Größe sowie der hämorrhagischen und nekrotischen Zersetzung diagnostiziert. Der Prozentsatz an Resorptionen wurde durch das Verhältnis von Resorptionen zu erfolgreichen Implantationen ermittelt. Abbildung 3 zeigt ein Horn des V-förmigen Mausuterus mit Resorptionen und Implantationen.

↓14

Abbildung 3: Darstellung eines der Seitenhörner des V-förmigen Mausuterus

Dargestellt sind zwei Implantationen () und zwei Resorptionen () in einem Mausuterus am Tag 13,5 der Trächtigkeit, daher liegt in dem oben dargestellten Seitenhorn des Uterus eine Abortrate von 50% vor.

2.5 Gewebepräparation

Für die molekularbiologischen Untersuchungen wurden 100mg des Uterusgewebes von Stellen erfolgreicher Implantationen präpariert und vorsichtig mit sterilem PBS (pH=7.4) gewaschen und darauf unverzüglich mittels flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C bis zur RNA-Isolation aufbewahrt. Es wurden keine Gewebeproben von der Resorptionsseite entnommen, da das Gewebe bereits hämorrhagisch und nekrotisch zersetzt war und Probeversuche gezeigt hatten, dass sich dieses Gewebe zur Zytokindiagnostik nicht eignet.

2.6 Total-RNA-Extraktion

↓15

Material:

Trizol

Gibco BRL, Karlsruhe,D

Chloroform

Merck, Darmstadt, D

Ethanol (100%, 75%)

Merck, Darmstadt, D

Agarosegel 1,5%

Biozym, Oldendorf, D

Ethiduim-Bromid (10mg/ml)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

Despergierstation

T 8.10, IKA Labortechnik

Zentrifuge (5415C)

Eppendorf, Hamburg, D

100mg des Mausuterus wurden mit ca. 1ml Trizol behandelt und mit dem Dispergiergerät homogenisiert. Danach wurden 200µl, auf –20°C abgekühltes, Chloroform hinzugegeben und das Ganze vermischt. Durch Zentrifugation (13.000g, 15min, 4°C) wurde das Gemisch in zwei Phasen aufgetrennt: Die obere Phase, wässrig-klar enthielt die RNA, die untere Phase (zäh-bläulich) die DNA und die Proteine. Zur Präzipitation wurde die obere klare Phase mit der RNA in einem neuen Eppendorfgefäß mit der gleichen Menge an –20°C kaltem, absolutem Ethanol über Nacht bei –20°C gefällt und anschließend zentrifugiert (18.000g, 15min, 4°C). Die ausgefallene RNA wurde dann mit 500µl 75%-Ethanol gewaschen und danach erneut zentrifugiert (5000g, 8min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen, die RNA für 20min getrocknet, um dann in 20µl DEPC-gereinigtem Wasser gelöst zu werden. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt auf der Grundlage, dass 1OD bei 260nm 40µg RNA entspricht. Die Qualität der extrahierten RNA wurde mittels Elektrophorese in Ethidium-Bromid gefärbtem 1,5% Agarosegel geprüft.

2.7 DNAse-Behandlung der RNA-Proben

↓16

Material:

DNAse I 100 U (1U/µl)

Roche, Mannheim, D

EDTA

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Nach der RNA-Isolation wurde die Total-RNA mit DNAse I mit 1U/l pro µg-RNA für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die DNAse durch die Zugabe von EDTA inaktiviert. Nach der DNAse Behandlung konnte keine genomische DNA mehr durch PCR nachgewiesen werden.

2.8 Reverse Transkription

↓17

Material:

Random Hexamer

Gibco BRL, Karlsruhe, D

dNTP-Mix (2 mM)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

Erststrangpuffer

Invitrogen, Groningen, NL

DTT (100mM)

Invitrogen, Groningen, NL

Superscript II (200U/µl)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

Thermocycler (MasterCycler 5530)

Eppendorf, Hamburg, D

Zur Gewinnung von cDNA für die PCR wurde die gereinigte mRNA durch eine reverse Transkription mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase umgeschrieben. An das Poly-A-Ende der RNA-Moleküle wurde ein Thymin-Oligonukleotid anhybridisiert und diente als Matrize für die weitere Kettenverlängerung. Die Ribonuklease aus der reversen Transkriptase hydrolysierte den RNA-Teil des entstehenden RNA/DNA-Hybridstranges, so dass in einem zweiten Durchgang der komplette DNA-Doppelstrang durch die reverse Transkriptase synthetisiert werden konnte.

↓18

2µg der extrahierten RNA wurden mit 2µl Random Hexamer versetzt, für 10min bei 70°C inkubiert und durch anschließendes Abschrecken auf Eis (1 min) denaturiert. Dann wurden pro Ansatz 5µl dNTP Mix, 4µl Erststrangpuffer, 2µl DTT und 1µl Superscript II hinzugegeben. Der 20µl Ansatz wurde im Thermocycler für 10min auf 25°C gebracht, danach für 60min bei 42°C und 10min bei 70°C inkubiert. Die cDNA wurde entweder unverzüglich weiterverarbeitet oder bei –20°C aufbewahrt. Kontrollproben enthielten das Reaktionsgemisch ohne RNA, wobei keine cDNA synthetisiert wurde.

2.9 Qualitative PCR

Material:

dNTP-Mix (2mM)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

10 x Gold-Taq-PCR-Reaktionspuffer

Applied Biosystems, CA, USA

Forward-Primer (20µM)

Tib-Molbiol, Berlin, D

Reverse-Primer (20µM)

Tib-Molbiol, Berlin, D

AmpliTaq-Gold DNA-Polymerase (1U/µl)

Applied Biosystems, CA, USA

Thermocycler (MasterCycler 5330)

Eppendorf, Hamburg, D

↓19

Durch Bindung der Primer werden bestimmte Sequenzen der durch die Reverse-Transkription gewonnenen cDNA durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert: Der cDNA-Doppelstrang wird durch eine Erhöhung der Temperatur auf 94°C denaturiert (hot start), anschließend werden zwei aus 15 bis 25 Basenpaaren bestehende Oligonukleotide (Primer) zugesetzt, die am Anfang und Ende der zu amplifizierenden Sequenz an die cDNA binden. Die DNA-Polymerase synthetisiert eine neuen DNA-Strang, der jeweils zu dem als Matritze dienenden Einzelstrang komplementär ist. Dadurch entstehen während jedes Reaktionzykluses 2x doppelsträngige Kopien der cDNA-Sequenz.

2µl des RT-Produktes wurde mit 31µl Aqua dest., 7,5µl dNTP-Mix, 5µl 10 x Gold-Taq-PCR-Reaktionspuffer, jeweils 2µl forward- bzw. reverse-Primer und 0,5µl Gold-Taq-DNA-Polymerase versetzt. Als Negativkontrolle diente ein Ansatz ohne RT-Produkt, um eine Kontamination auszuschließen. Der 50µl Ansatz wurde im Thermocycler amplifiziert. 1 Zyklus 10min bei 94°C (hot start), darauf folgten 40 Zyklen jeweils 30s 94°C, 45s 60/63°C und 1min 72°C, danach wieder 1 Zyklus 10min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch dargestellt.

2.10 Die Agaroseelektrophorese

Material:

↓20

Ultra Pure Agarose

Biozym, Oldendorf, D

50 x TAE (Tris-Azetat-EDTA) ad 1l Aqua dest. (pH = 8,0):

- Tris Baze (40mM)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- Eisessigsäure (20mM)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- EDTA (2mM)

Sigma-Aldrich Steinheim, D

Ethidium-Bromid

Gibco BRL, Karlsruhe, D

10 x DNA-Probenpuffer

Gibco BRL, Karlsruhe, D

100bp-Leiter

Gibco BRL, Karlsruhe, D

Biometra Volt

Biometra, Göttingen, D

UV-Transluminator

Fröbel, Lindau, D

Sofortbildkamera

Polaroid, Offenbach, D

Die Gelelektrophorese nutzt das Verhalten von Proteinen bzw. RNA und DNA im elektrischen Feld. Die Wanderung wird durch Nettoladung, Größe und Gestalt bestimmt. Die negativ geladenen Basen der Nukleinsäuren wandern zur positiv geladenen Elektrode und werden durch die Struktur des Agarosegels nach Größe getrennt.

Die Agarose wurde in einer Konzentration zwischen 1% und 3% in 1 x TAE Lösung durch Erhitzen gelöst. Zu 100ml der Lösung wurden 1µl Ethidium-Bromid gegeben und durch Schwenken vermischt. Die flüssige Agaroselösung wurde in einen Gelschlitten gegossen und für mindestens 20min unbewegt zum Trocknen gelassen. Der Gelschlitten mit Gel wurde in eine Gelkammer gelegt, die mit 1 x TAE Puffer gefüllt war, so dass das Gel vollständig vom Puffer bedeckt war. Die Proben wurden mit 1µl bis 3µl DNA-Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Als Marker diente eine 100 Basenpaarleiter. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 90V bis 100V. Das Ethidium-Bromid interkaliert die DNA und dadurch wurde eine Visualisierung bei 312nm mit einem UV-Transluminator möglich. Die Dokumentation erfolgte mit einer Sofortbildkamera.

2.11 Quantitative PCR

↓21

Material:

Master Mix:

- 15,2µl H2O

Braun, Melsungen, D

- 2,5µl 10x Reaktionspuffer

Applied Biosystems, CA, USA

- 2µl dNTP’s (2,5mM)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

- 2,25µl MgCl2 (50mM)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,4µl TE (Tris-EDTA)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,25µl ROX

Tibmol-Biol, Berlin, D

Forward Primer (20µM)

Tibmol-Biol, Berlin, D

Reverse Primer (20µM)

Tibmol-Biol, Berlin, D

TaqMan-Sonde (10µM)

Tibmol-Biol, Berlin, D

AmpliTaq Platin

Applied Biosystems, CA, USA

ThermoFast, Plates

Rapidozym, Berlin, D

Flat Cap Stripes

Rapidozym, CA, USA

ABI PRISM 7700 Sequence Detector

Perkin Elmer, CA, USA

“Sequence Detections Systems“-Software

Perkin Elmer, CA, USA

Die TaqMan-PCR ist eine Methode zur quantitativen Detektion und Analyse von cDNA, die durch Reverse-Transkription aus RNA hergestellt wurde. Dabei werden der cDNA Probe zwei Primer-Moleküle und eine Sonde, die jeweils spezifisch für die zu messende Sequenz sind, hinzugefügt. Primer und Sonde binden an den für sie spezifischen Abschnitt der cDNA. Die Sonde ist an beiden Enden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Am 5’-Ende der Sonde befindet sich der Reporter mit dem Farbstoff FAM (6-Karboxifluoreszein) und am 3’-Ende der Quencher mit der Farbe TAMRA (6-Karboxi-N,N,N’,N’-Tetramethylrhodamin). Ist die Sonde an die cDNA gebunden, unterdrückt der Quencher an dem einen Ende der Sonde das Fluoreszenzsignal des Reporters am anderen Ende der Sonde. Diese Auslöschung des Fluoreszenzsignals des Reporters beruht auf dem Effekt des Resonanz-Energie-Transfers und ist an die linear räumliche Anordnung der beiden Moleküle gebunden. Startet nun die PCR und wird der komplementäre Strang zu dem Abschnitt, an dem die Sonde gebunden ist, durch die DNA-Polymerase synthetisiert, bedingt das eine Spaltung der Sonde von der cDNA. Durch diese Abspaltung der Sonde wird die strenge, lineare Anordnung der beiden Fluoreszenzmoleküle zueinander aufgehoben und der Resonanz-Energie-Transfer unterbrochen. Dadurch sendet das Reporter-Molekül sein Fluoreszenzsignal, welches mittels des TaqMan registriert werden kann. Folglich erhält man für jede synthetisierte cDNA-Sequenz des spezifischen Abschnittes ein Fluoreszenzsignal. Dieser Prozess wiederholt sich in jedem Zyklus und interferiert nicht mit der exponentiellen Akkumulation des PCR-Produktes.

↓22

Abbildung 4: Prinzip der quantitativen PCR
1. Die Sonde ist linear an die cDNA gebunden und das Quencher-Molekül inhibiert die Fluoreszenz des Reporters.
2. Bei der Synthese der cDNA wird die Sonde von der cDNA abgespalten. Der Quencher inhibiert nicht länger den Reporter.

1µl RT-Produkt wurde mit 0,5µl Forward-Primer, 0,5µl Reverse-Primer, 0,3µl TaqMan-

Sonde, 0,1µl Amplitaq Platin und 22,6µl Master Mix versetzt. Als Reaktionsgefäße wurden spezielle Micro-Amp-Optical-Tubes mit entsprechenden Micro-Amp-Optical-Caps verwendet. Als Negativkontrolle dienten Ansätze ohne das RT-Produkt, um eine Kontamination der Templates auszuschließen. Pro gemessener Platte wurden mindestens drei Negativkontrollen pipettiert. Wenn möglich wurden die Primer so gewählt, dass sie Intron-überspannend waren. Als erster Zyklus der Amplifikation wurde das Reaktionsgemisch für 10min auf 95°C (hot start) erhitzt, anschließend folgten 40 Zyklen von jeweils 15sec bei 95°C und 1min bei der jeweilig spezifischen Temperatur, die optimal für die Sonde ist (siehe Tabelle unten). Die Echtzeitanalyse wurde durch spezielle Software (siehe oben) ausgewertet. Alle gemessenen Daten wurden auf HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) als Referenzgen bezogen. Die Sonden wurden alle auf ihre Spezifität für cDNA geprüft, das heißt genomische DNA wurde nicht amplifiziert.

↓23

Primer-Sequenzen:

Murines HPRT:

Ex 7,8: 5’-gTTggATACAggCCAgACTTTgT

Reverse: 5’-CACAggACTAgAACACCTgC

Murines IFN-γ:

Forward: 5’-CagCAACAACATAAgCgTCAT

Reverse: 5’-CTCCTTTTCCgCTTCCTgA

Murines TNF- α :

Forward: 5’-AgCCTgTAgCCCACgTCgTAg

Reverse: 5’-ggCAgCCTTgTCCCTTgAAg

Murines fgl2:

Forward: 5’-CAACAgTTTggATggCAAgTg

Reverse: 5’-CTTTgTATATTAgATgAACCgg

Murines IL-12 p40:

Forward: 5’-TTCAgTgTCCTgCCAggAgg

Backward: 5’-CgggTCTggTTTgATgATgTC

Murines IL-12 p35:

Forward: 5’-CCACCCTTgCCCTCCTAAAC

Reverse: 5‘-ggCAgCTCCCTCTTgTTgTg

Sonden-Sequenzen:

Murines HPRT: 5’-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p

PCR-Temperatur: 60°C oder 63°C

Murines IFN- γ : 5’-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p

PCR-Temperatur: 60°C

Murines TNF- α : 5’-6FAM-gTAgACAAggTACAACCCA XT CggCTg p

PCR-Temperatur: 63°C

Murines fgl2: 5’-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gCA p

PCR-Temperatur: 63°C

Murines IL-12 p40: 5’-6FAM-TgTCACCCTgCCCAAC XT gCCgAg p

PCR-Temperatur: 60°C

Murines IL-12 p35: 5’-6FAM-ACCTCAgTTTggCCAgggTCAT XT CCA p

PCR-Temperatur: 60°C

Das X steht für den Quencherfarbstoff Tamra.

2.12 Analyse der Taq-Man-Daten

Nach 40 Zyklen berechnet der Computer den Verlauf der Intensität der Fluoreszenz im Verhältnis zur Basisfluoreszenz des dem Master Mix beigefügtem Rox-Farbstoffes. Der dazugehörige Graph folgt einem s-förmigen Verlauf. Auf dieser Grundlage berechnet der Computer den Zyklus, bei dem die anfängliche Fluoreszenz exponentiell ansteigt. Dieser Zyklus (Zyklus Ct) wird für jede Probe individuell berechnet. Für jede Probe wurden drei Messungen durchgeführt, wobei der Mittelwert aus den jeweiligen Ct-Werten gebildet wurde. Der Ct-Wert ist linear abhängig von der Menge an cDNA der jeweiligen Sequenz. Je früher die exponentielle Phase der PCR beginnt (= Ct-Wert), desto häufiger findet sich die Sequenz in der untersuchten cDNA. Da bei der quantitativen Bestimmung der Ausgangsmenge an cDNA mittels Photometer sowie dem Pipettieren kleine Ungenauigkeiten nicht sicher vermieden werden können, wird der Ct-Wert der Zytokinsequenz bei jeder Messung individuell ins Verhältnis zum Ct-Wert des HPRT der jeweiligen Probe gesetzt. Es wird folglich ein ΔCt-Wert für jede Probe gebildet:

↓24

Ein niedriges ΔCt, also ein geringer Unterschied in der Menge von HPRT-Expression und Zytokinexpression, bedeutet, dass die Zytokinsequenz in der cDNA, die aus mRNA gewonnen wurde, häufig exprimiert ist. Für eine vereinfachte Darstellung gilt, hohe Werte entsprechen einer großen Menge an cDNA. Hierzu ist eine Formel entwickelt worden, die folgende empirisch gewonnen Werte berücksichtigt: Durch eine Verdünnungsreihe wurde ermittelt, dass ein ΔCt von 3.41 einer Verzehnfachung der Menge an cDNA entspricht.

Folgende Umwandlungsformel wurde berechnet:

↓25

Diese Formel wurde benutzt, um die ΔCt in Säulendiagrammen grafisch darstellen zu können. Nach der Umwandlung muss der Wert mit einem Faktor x (z. Bsp. 10000) multipliziert werden. Für die Darstellung der Korrelation erwies sich die Umwandlung durch diese Formel als zu grob. Daher wurde zur besseren Visualisierung der Korrelationen die Umwandlung vereinfacht:

2.13 Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab (Minipräparation)

Material:

↓26

E.coli Glyzerol-Stamm (pUC19) mit pBluescript®SK(+/-) mit Maus-fgl2-Sequenz

Kulturmedium (LB-Medium)

- 1g Tryptan

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,5g Pilz-Extrakt

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 5g Kochsalz

Merck, Darmstadt, D

- 100 ml steriles Aqua dest.

Braun, Melsungen, D

Kultur-Agar (LB-Agar)

- 5g Tryptan

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 2,5 g Pilz-Extrakt

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 5g Kochsalz

Merck, Darmstadt, D

- 7,5 g Agar

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 500 ml steriles Aqua dest.

Braun, Melsungen, D

Ampicillin (100mg/ml)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

QIAprep Spin Miniprep Kit

Qiagen, Hilden, D

Brutschrank

Heraeus, Hanau, D

Die Plasmid-DNA diente als Matrize unter anderem zur Gewinnung der für die In-situ-Hybridisierung benötigten RNA-Sonde. Der Escheria-coli-Glyzerolstock enthielt Bakterien mit einem Plasmid, welches die benötigte DNA-Sequenz und gleichzeitig die Information der Ampicillin-Resistenz kodierte. Zunächst wurde 1µl des Glyzerol-Stockes auf einer Agarplatte ausgestrichen und im Brutschrank für eine Nacht (37°C) inkubiert. Dann wurde eine Kolonie geerntet, auf einer neuen Agarplatte ausgestrichen und vor erneuter Inkubation mit Ampicillin beimpft. Dadurch wurden ausschließlich die Plasmid tragenden Bakterien selektiert. Die Plasmid-DNA wurde durch Reinigung auf einer Silikagel-Membran aus den Bakterien gewonnen.

↓27

Darauf folgten: Inkubation der LB-Kulturmediums mit 1µl des E.coli-Glyzerol-Stammes über Nacht bei 37°C im Brutschrank, Selektion der Phagen tragenden Bakterien durch die Inkubation einer Kolonie mit 10µg Ampicillin in 10ml Kulturmedium (LB-Medium) über Nacht bei 37°C. Anschließend erfolgte die Plasmidpräparation nach dem Protokoll des QIAprep-Spin-Miniprep- Kits: Zunächst wurde eine alkalische Lyse durchgeführt, um anschließend die DNA durch ein Silikagel zu extrahieren. Silika (Kieselgel) ist ein chaotropes Salz, welches die DNA durch Entfernung der Hydrathülle zu binden vermag. Anschließen wurde die DNA eluiert und in 50µl 10mM Tris-HCl (niedrige Salzkonzentration) gelöst. Die Konzentration der Plasmid-DNA betrug 0,7µg/µl.

2.14 Linearisierung der Plasmid-cDNA

Material:

↓28

pBluescript®SK(+/—) mit humanem TNF-α/

Maus-fgl2-Sequenz

Stratgene, Amsterdam, NL

Restriktionsenzyme Sma I und EcoR V

Promega, Mannheim, D

Restriktionspuffer

Promega, Mannheim. D

DEPC H2O

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Agarosegel (1-1,2%):

- 0,7-0,8g Agarose

Biozym, Oldendorf, D

- 70-80ml TAE-Puffer

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 1µl Ethidium-Bromid (1µg/ml)

Gibco BRL, Karlsruhe, D

Biometra Volt

Biometra, Göttingen, D

UV-Transluminator

Fröbel, Lindau, D

Für die fgl2-Sonde wurde das aus 650 Basenpaaren bestehende Exon 2 des murinen fgl2 verwandt. Um die Plasmid-DNA in eine RNA-Sonde für die In-situ-Hybridisierung umschreiben zu können, muss die DNA-Sequenz aus dem Plasmid isoliert und linearisiert werden. Dazu wurde das Plasmid an den vorgesehen Abschnitten mit den Enzymen Sma I und EcoR V geschnitten, um dann die DNA mit Hilfe der Agaroseelektrophorese (siehe oben) aufzutrennen. Anschließend musste die DNA aus dem Gel herausgelöst und gereinigt werden.

↓29

Inkubation von 20µl Plasmid-DNA mit 2µl des jeweiligen Restriktionsenzyms sowie 3µl Puffer und 5µl H2O für 2h bei 37°C zur Linearisierung der Plasmid-DNA. Nach der Inkubation wurde die linearisierte cDNA (3µl) mit 3µl H2O plus 1µl Farbpuffer auf das Agarosegel aufgetragen. Das Gel wurde bei 100V für ungefähr 35-45min laufen gelassen. Die cDNA wurde aus dem Gel mit einer RNAse freien Rasierklinge ausgeschnitten und mit dem QIAquick-Gel-Extraktions-Kit aus dem Gel herausgelöst. Das Prinzip des Kits beruht auf einer Silikagel-Membran zur Bindung von DNA in hoch konzentrierter Salzlösung. Die gereinigte dsDNA wurde anschließend in 50µl 10mM Tris-HCl gelöst und bei –20°C aufbewahrt.

2.15 Synthese der 35S-markierten RNA-Sonde

Die TNF-α-Sonde für humanes Gewebe wurde uns freundlicherweise von Dr. Richard Lea vom Rowett Research Institute, Aberdeen, Schottland überlassen. Die fgl2-Sonde für murines Gewebe wurde in der klinischen Forschergruppe „Transplantation“ des Toronto Hospitals, Toronto, Kanada entwickelt und für die Nutzung freigegeben.

Material:

↓30

Linearisierte cDNA (SmaI und EcoR V)

Polymerasen T3 und T7

Promega, Mannheim, D

Transkriptionskit

Roche, Mannheim, D

DNAse

Roche, Mannheim, D

DTT

Promega, Mannheim, D

DNTP‘s (2mM)

Boehringer, Mannheim, D

Spin Column

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Diethylpyrocarbonat (DEPC)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

35S-UTP

NEN Dupont, B

Die Plasmid-DNA wird für die In-situ-Hybridisierung in eine mRNA-Sonde umgeschrieben. Trotz des wesentlich höheren Arbeitsaufwandes durch die Verwendung einer mRNA-Sonde für die In-situ-Hybridisierungsmethode rechtfertigt die wesentlich höhere Spezifität und Stabilität von mRNA-mRNA-Hybridisierungen im Vergleich zu mRNA-cDNA-Hybridisierungen dieses methodische Vorgehen. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase T3 synthetisiert die RNA — beginnend am EcoR V geschnittenen Ende der DNA — und somit entsteht die mRNA-Antisense-Sonde. Die Antisense-Sonde verhält sich spiegelbildlich zur nachzuweisenden mRNA-Sequenz. Die Polymerase T7 synthetisiert die RNA vom Sma I geschnittenen Ende der DNA aus, woraus die Sense-Probe extrahiert werden kann als identische Basenfolge der nachzuweisenden mRNA. Durch die Sense-Sonde kann daher keine Bindung an die nachzuweisende mRNA erfolgen und dient hiermit als Negativkontrolle, also dem Nachweis, dass die vorgenommene mRNA-Hybridisierung mit der Antisense-Sonde spezifisch für die Sequenz stattgefunden hat.

2.16 In-situ-Hybridisierung

Material:

↓31

Xylol

Merck, Darmstadt, D

Ethanol (100%, 90%, 70%)

Merck, Darmstadt, D

0,2 N HCl

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

SSC (Sodium Chlorid Sodium Citrat) (0,1x, 0,5x, 1x, 2x, 4x):

- 175,32g NaCl (3M)

Merck, Darmstadt, D

- 88,23g Na-Citrat (0,3M)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 1l DEPC-H2O

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

DEPC

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Proteinkinase Puffer:

- 80ml 1m TRIS

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 40ml 0,5m EDTA

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 280ml DEPC H2O

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- Proteinkinase K 80µl 10mg/ml

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

PBS (Phosphate Saline Buffer)

- 8g NaCl

Merck, Darmstadt, D

- 1,16g Na2HPO4

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,2g KH2PO4

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,2g KCl

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

0,4% Paraformaldehyd in PBS

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

0,1m TEA mit 0,25% Acetic Anhydrid

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Hybmix mit:

- 2,5ml Formamid

Sigma -Aldrich, Steinheim, D

- 300µl 5m NaCl

Merck, Darmstadt, D

- 100µl Denhardts

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 50µl 1m TRIS

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 10µl 0,5m EDTA

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 915µl DEPC H2O

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 1ml Dextransulfat

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 100µl t-RNA

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 25µl 2m DTT

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- DPX

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

RNAse (6mg/ml) in 200ml Waschpuffer (20 µg/ml)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 20ml 5m NaCl

Merck, Darmstadt, D

- 2ml 1m Tris

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 0,4ml 0,5m EDTA

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- 178ml Aqua dest

Braun, Melsungen, D

- SSC+DDT (2m)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Fotoentwicklung:

- Entwickler

Kodak, Stuttgart, D

- 1% Essigsäure

Merck, Darmstadt, D

- Fixierer

Kodak, Stuttgart, D

Harris Hämatoxilyn

Merck, Darmstadt, D

Bei der In-situ-Hybridisierung wird in einem fixierten Gewebe (Plazenta, Dezidua) die mRNA eines Proteins nachgewiesen. Insbesondere Zytokinproteine werden in vivo in kurzer Zeit metabolisiert. Der zusätzliche Nachweis der mRNA-Sequenz des Proteins im Gewebe weist sowohl die Synthese des Proteins im Gewebe selbst als auch die Fähigkeit zur Produktion des Zytokins bei negativem Ergebnis der Proteinfärbung (Immunhistochemie). Die In-situ-Hybridisierung erlaubt keinen unmittelbaren Rückschluss auf die Menge an synthetisierten Protein, wohingegen sich aus dem Nachweis des Proteins (Immunhistochemie) keine Schlüsse auf den Syntheseort des Proteins ziehen lassen. Aus diesen Gründen erscheint es sinnvoll, die Methode der In-situ- Hybridisierung mit der Methode der Immunhistochemie zu verknüpfen. In dieser Arbeit ist die Methode der In-situ-Hybridisierung auf den qualitativen Nachweis sowie die Lokalisation der mRNA im Gewebe beschränkt worden, da eine quantitative Auswertung der In-situ-Hybridisierung aus oben genannten Gründen problematisch erschien.

Die Schnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und in 0,2N HCl gewaschen (20min). Anschließend folgte ein Waschgang mit 2 x SCC (30min, RT). Zur Andauung der Proteinstrukturen wurden die Schnitte mit Proteinkinase behandelt (5min, 37°C), um darauf mit 0,4%igem PFA (20min, 4°C) fixiert zu werden. Daraufhin erfolgte die Inkubation der Schnitte mit 0,25% Acetic Anhydrid (10min, RT) zur Vermeidung der unspezifischen Bindung an positiv geladene Aminogruppen. Vor Auftragen des Hybridisierungsmix wurden die Schnitte dehydriert und getrocknet. Nach Applikation der Sonde Antisense oder Sense — gelöst im Hybridisierungsmix — wur

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den die Schnitte mit Deckgläschen und DPX versiegelt, um eine Kontamination zu vermeiden. Zur Hybridisierung wurden die Schnitte über Nacht bei 59°C inkubiert. Um Hintergrundfärbung durch überschüssige RNA-Sonde zu vermeiden, erfolgte eine Behandlung mit RNAse A (30min, 37°C), nachdem die Schnitte gründlich mit 4 x SSC gewaschen wurden. Die RNAse spaltet nur Einzelstrang-RNA. Es folgten mehrere Waschgänge mit absteigenden Konzentrationen von SSC und DDT (5-30min, RT und 60°C). Danach wurde in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert. Nach dem die Schnitte getrocknet waren, wurden sie in der Dunkelkammer in die Kodak-autoradiografische Emulsion getaucht und verpackt (Alufolie). Das Entwickeln fand zwei Wochen später statt. Danach wurden die Schnitte mit Harris Hämatoxilyn gegengefärbt. Die Färbungen wurden bei 200facher Vergrößerung am Axiophot-Mikroskop ausgewertet; die Fotografien entstanden in Anwendung des integrierten Hyper-HAD.

2.17 Immunhistochemie

Der fgl2-Antikörper für murines Gewebe wurde mit freundlicher Genehmigung der klinischen Forschergruppe „Transplantation“ des Toronto Hospitals, Toronto, Kanada angewendet.

Material:

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Ethanol (100%, 95%, 70%)

Merck, Darmstadt, D

Xylol

Merck, Darmstadt, D

Methanol

Merck, Darmstadt, D

H2O2 (30%)

Merck, Darmstadt, D

Proteinblock

DAKO, Hamburg, D

„Antibody Diluent“

DAKO, Hamburg, D

„Biotinylated Link“

DAKO, Hamburg, D

Streptavidin-HRP

DAKO, Hamburg, D

DAB, Entwickler

DAKO Corporation, D

Hämalaun

Holborn & Söhne, Leipzig, D

Vitroclud

Langenbrink, D

Citratpuffer PH=6

- Stammlösg. A (C6H807 x H20) 18ml

Merck, Darmstadt, D

- Stammlösg. B (CH2CO2Na) 82ml

Merck, Darmstadt, D

- Aqua dest. 900ml

Braun, Melsungen, D

Pufferlösung TBS (1l):

- Tris Base 0,9g

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- Tris-HCL 6,85g

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

- NaCl 8,78g

Merck, Darmstadt, D

Antikörper, Fluoreszenzen:

TNF-α Antikörper (1:300)

Genzyme, Rüsselsheim, D

Fgl2 Antikörper bei den Präeklampsie-Schnitten (1:500)

AG „Transplantation“

Kaninchen IgG (je nach primärer Antikörperkonzentration)

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

(1:250; 1:300 oder 1:500)

Mikroskop Axiophot

Zeiss, Jena, D

Fotoapparat Hyper HAD

Sony, Köln, D

Coverplates

Hypersil, Aschaffenburg, D

Die Schnitte wurden entparaffiniert (Xylol) und rehydriert (absteigende Alkoholreihe). Blockierung unspezifischer Peroxidaseaktivität des Gewebes durch 3% H2O2 in Methanol (30min, RT). Demaskierung des Antigens durch 10minütiges Kochen in Citratpuffer (bei Überdruck). Als nächster Schritt erfolgte die Behandlung mit Proteinblock (150µl pro Schnitt). Nach der Blockierung wurden die Antikörper hinzugegeben. Die Inkubationszeit betrug bei allen Färbungen 1h bei RT. Danach wurden die folgenden Substanzen nacheinander aufgetragen: Biotinylated Link (150µl pro Schnitt, 10min, RT), Streptaviden-HRP (150µl pro Schnitt, 10min, RT), DAB + 3% H2O2 (150µl pro Schnitt, 5min, RT). Nach jedem der vorangegangenen Schritte wurde gründlich mit TBS gespült. Der Antikörper wurde ohne Waschgang nach dem Proteinblock aufgetragen. Es folgten die Gegenfärbung mit Hämalaun, das Auswaschen mit kaltem Leitungswasser, eine aufsteigende Alkoholreihe und das Eindeckeln mit Vitroclud. Negativkontrollen wurden mit unspezifischem Kaninchen-Antikörpern (IgG) durchgeführt.

Die Färbungen wurden bei 400facher Vergrößerung am Axiophot-Mikroskop ausgeführt; die Fotografien entstanden in Anwendung des integrierten Hyper-HAD.

2.18 TUNEL-Färbung

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Material:

TUNEL Kit

Intergen, Heideberg, D

4[prime],6-diaidino-2[prime]-phenylindole dihydrochlorid (DAPI)

Roche, Mannheim, D

VectaShield

Vector Lab., Burlingame, VT

Zur Untersuchung auf Apoptose wurden sowohl gefrorene Schnitte (Kryoschnitte) als auch in Paraffin eingebettete Schnitte verwandt. Die Paraffinschnitte mussten entparaffiniert und rehydriert werden (siehe oben). Die Kryoschnitte wurden in Formalin fixiert und in Ethanol-Essigsäure postfixiert. Anschließend wurden alle Schnitte der gleichen Behandlung unterzogen. Die fragmentierte DNA wurde mit Digoxgenin-dUTP in Gegenwart von TdT markiert und diese TUNEL+-Zellen durch die Bindung von Anti-Dioxigenin Fluoreszein Isothiozyanat (FITC)- konjugierten F(ab[prime])2-Fragmenten fluoreszenzgefärbt. Die Gegenfärbung erfolgte mit DAPI (1µg/ml Methanol). Mit Deckgläschen und VectaShield wurden die Schnitte vor dem Austrocknen geschützt. Negativkontrollen wurden durch Auslassen der Zugabe von TdT nach den Angaben des Kit-Protokolls durchgeführt.

2.19 Giemsa-Färbung

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Material:

Xylol

Merck, Darmstadt, D

Ethanol (100%, 90%, 75%)

Merck, Darmstadt, D

Giemsa-Lösung 1:10 in 2% Sodiumborat

Merck, Darmstadt, D

Essigsäure 0,02%

Merck, Darmstadt, D

Die Färbung mit Giemsa dient der spezifischen Anfärbung von Granula in Mastzellen. Die Schnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und dann mit der Giemsa-Lösung gefärbt (45min, RT). Danach erfolgte eine Differenzierung der Färbung durch Essigsäure. Die Schnitte wurden in Leitungswasser gewaschen und anschließend dehydriert.

2.20  Statistische Analyse der Daten

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Zur semi-quantitativen Auswertung der Immunhistochemie wurde eine Ordinalskala mit den Bewertungen + / ++ / +++ verwandt. Für die statistische Analyse dieser Daten wurde der Mann-Whitney-U-Test als nicht-parametrischer Test für unabhängige Stichproben angewandt. Die Daten sind in Boxplots grafisch dargestellt. Die Auswertung der Echtzeit-PCR erfolgte wie oben beschrieben. Nach annähernder Prüfung auf Normalverteilung wurden die Daten mit dem Student’s T-Test ausgewertet und in Balkendiagrammen mit Standardabweichung dargestellt.


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20.11.2006