3 Ergebnisse

↓36

3.1  Die Erhöhung der Abortrate durch Stress und durch die Injektion von IL-12 p70

Zuerst wurde überprüft, ob die Applikation von Stress in Form von Lärm die Abortrate und/oder die Anzahl erfolgreicher Implantationen reduziert. Die Applikation von Stress am Tag 5,5 der Trächtigkeit induzierte einen Anstieg der Abortrate von 11,9% in den Kontrolltieren auf 24% in den gestressten Tieren (p < 0,05; Abbildung 5 A). Die Anzahl der Implantationen wurde durch den Stress nicht wesentlich reduziert (Abbildung 5 B). Die Injektion von 100ng rekombinanten IL-12 p70 am Tag 5,5; 6,5; 7,5 und 8,5 der Trächtigkeit erhöhte die Abortrate ähnlich dem Effekt von Stress von 10,52% auf 24,5% (Abbildung 5 A).

↓37

Abbildung 5: Die Resorptionsraten und Implantationen bei Stress und IL-12-Injektion
A: Die Resorptionsrate in Prozent lag bei den stressbehandelten und den IL-12-behandelten Tieren zweifach höher als bei den nicht behandelten Tieren (kein Stress, keine Injektionen).
B: Die durchschnittliche Anzahl an Implantationen pro Tier ist hier angezeigt, wobei Stress und IL-12-Injektion die Anzahl der Implantationen geringfügig reduzierten.

3.2  Der Einfluss von Stress auf die mRNA-Expression von abortogenen Zytokinen

3.2.1  Der Anstieg von TNF-α mRNA nach Stressexposition

Messungen mittels Bioassays und die durchflusszytomterische Analyse von uterinen Lymphozyten zeigten einen deutlichen Anstieg von TNF-α Protein nach Stressexposition (Arck et al., 1995; Joachim et al., 2001). Um die Auswirkung von Stress auf die Menge von TNF-α mRNA zu untersuchen, wurde TNF-α mRNA quantitativ mit der „Real-time“-PCR bestimmt. Stressexposition am Tag 5,5, einen Tag nach dem voraussichtlichen Zeitpunkt der Implantation, bewirkte eine Steigerung der Menge an TNF-α mRNA um das 5fache (p < 0,01; Abbildung 6).

Abbildung 6: TNF- α mRNA in Stress und Kontro l le
Ein 5facher Anstieg der Menge an TNF- α nach Stress im Vergleich zu den nichtbehandelten Tieren.

3.2.2 Die IFN-γ-Expression nach Stressapplikation

↓38

In der Paarungskombination CBA/J x DBA/2J war eine gleichzeitige Injektion von TNF-α und IFN-γ nötig, um die Abortrate signifikant zu erhöhen. Injizierte man jeweils nur ein Zytokin, war der Effekt auf die Abortrate deutlich geringer als bei der gemeinsamen Applikation. Des Weiteren existieren Daten, die einen signifikanten Anstieg von IFN-γ Protein nach Stressexposition in CD26 positiven Lymphozyten beschreiben (Hildebrandt et al., 2001). Daher wurde untersucht, ob IFN-γ mRNA ähnlich TNF-α mRNA durch Stress signifikant hochreguliert wird. Die Messungen zeigen, dass Stress keinen Einfluss auf die Expression von IFN-γ mRNA hat (Abbildung 7).

Abbildung 7: IFN- γ mRNA in Stress und KontrolleKeine Veränderung in der Menge an IFN- mRNA nach Stressexposition.

3.2.3 Die Beeinflussung der mRNA-Expression von IL-12 durch Stress

IL-12 ist ein wichtiges Zytokin, welches die Entwicklung von T-Zellen zu Th1-Zellen reguliert. Daher ist interessant, ob Interleukin 12 eine Rolle in der Entstehung des TNF-α dominanten Milieus nach Stressexposition spielt. Das IL-12 p70 Protein setzt sich aus zwei verschiedenen Ketten zusammen. Zum einen besteht IL-12 p70 aus der IL-12 p40- und zum anderen aus der IL-12 p35-Kette (Wolf et al., 1991). Es wird die 10fache Menge an IL-12 p40 im Vergleich zum IL-12 p35 exprimiert. Aufgrund dieser Konstellation kann angenommen werden, dass IL-12 p35 die Menge an IL-12 p70 Protein reguliert. Biologisch aktiv ist allein das komplette IL-12 p70-Protein. Aus diesen Gründen ist die mRNA-Expression beider IL-12-Ketten untersucht worden. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass Stress die Expression von IL-12 p40 um das 1,2fache herunterreguliert (Abbildung 8 A). Im Gegensatz dazu induziert Stress die Expression von IL-12 p35 mRNA um das 2,8fache (Abbildung 8 B). Man könnte nun argumentieren, dass der Anstieg von IL-12 p35 eine vermehrte Bildung von IL-12 p70 trotz der geringeren IL-12 p40 Menge nach sich ziehen müsste. Es ist aber wichtig, sich zu vergegenwärtigen, dass IL-12 p40 in einer 10fachen Menge translatiert wird, und daher eine um das 1,2fach niedrigere Menge an IL-12 p40 die Menge an IL-12 p70 entscheidend beeinflusst. Der konsequenterweise zu erwartende Anstieg von IFN-γ durch eine erhöhte Menge an IL-12 p70 unter Stress blieb aus.

↓39

Abbildung 8: IL-12 p40 und Il-12 p35 in Stress und Kontrolle
A: Die Stressexposition der trächtigen Mäuse reguliert die Expression von IL-12 p40 um das 1,2fache herunter.
B: Die Stressexposition der trächtigen Mäuse reguliert die Expression von IL-12 p35 um das 2,8fache herauf.

3.2.4 Das Verhältnis der Abortrate zu der quantitativen Menge an Zytokinen

Ob des Anstieges von TNF-α nach Applikation von Stress wurde die Möglichkeit eines Zusammenhanges zwischen der Menge an TNF-α und der Resorptionsrate untersucht. Die Berechnung ergab, dass es einen engen Zusammenhang zwischen der Menge an TNF-α und der Resorptionsrate gibt (r = 0,611; p < 0,05; Abbildung 9) und dass dieser nach der Applikation von Stress noch eindeutiger ist (r = 0,817; p < 0,05; die Daten sind grafisch nicht dargestellt).

Abbildung 9: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter TNF- α mRNA
Es zeigt sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an TNF- α mRNA und dem Prozentsatz an Resorptionen bei einem Korrelationskoeffizienten von r = 0.611.

↓40

Im Gegensatz dazu zeigt IFN-γ keine Beziehung zu der Resorptionsrate (Abbildung 10).

Abbildung 10: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter IFN- γ RNA
Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IFN-γ und dem Prozentsatz an Resorptionen.

Ebenfalls lassen IL-12 p40 (r = 0.24) und IL-12 p35 (r = -0,29) keinen Zusammenhang zu dem Anteil an Resorptionen erkennen (Abbildung 11 und Abbildung 12).

↓41

Abbildung 11: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an expr i mierter IL-12 p40 mRNA
Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IL-12 p40 und dem Prozentsatz an Resorptionen.

Abbildung 12: Zusammenhang zwischen der Abortrate in Prozent und der Menge an exprimierter IL-12 p35 mRNA
Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IL-12 p35 und dem Prozentsatz an Resorptionen.

3.3 Das Zytokinprofil nach der Injektion von IL-12

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Die Frage ist, ob IL-12 als T-zellaktives Zytokin eine Th1-Immunantwort in der Maus induzieren kann, die dann zu einem Anstieg der Abortrate führt. Nach der Injektion von IL-12 ergaben die Messungen einen Anstieg von IFN-γ mRNA um das 9,5fache (Abbildung 13). Interessanterweise nahm das injizierte, rekombinante IL-12 auch Einfluss auf die Expression von TNF-α: Nach der Injektion stieg die Expression von TNF-α mRNA um das 8,8fache (Abbildung 13). Nach der Stimulation durch IL-12 bestand folglich eine vergleichbare Zytokinkonstellation mit gleichzeitiger Präsenz von hohen Mengen an TNF-α und IFN-γ, wie bei der simultanen Injektion beider Zytokine:

Abbildung 13: Zytokinregulation nach der Injektion von IL-12 p70Deutlicher Anstieg von TNF-α und IFN-γ nach der Injektion von rekombinanten IL-12 p70.

3.4 Der Vergleich der Expression von fgl2 mRNA bei Stress und
nach Injektion von IL-12

Die In-situ-Hybridisierung zeigt histologisch die Lokalisation der fgl2 mRNA im Uterus von CBA/J-Mäusen am Tag 13,5 der Trächtigkeit (Abbildung 14).

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Abbildung 14: In-situ-Hybridisierung für fgl2 mRNA im Uterus eines CBA/J-Weibchen am Tag 13,5 der Trächti g keit
(A) zeigt die Sense-Probe und (B) zeigt die fgl2 mRNA positive Antisense-Probe.

Um die Rolle von fgl2 in Stress-vermittelter, physiologisch induzierter Resorption im Vergleich zu Zytokin-induzierten Aborten zu ermitteln, ist die Menge an fgl2 mRNA im Uterus gemessen worden. Die fgl2 mRNA-Menge nach der Stressstimulation war gegenüber den Kontrolltieren um das 3fache verringert. Die Injektion von IL-12 p70 induzierte einen Anstieg von fgl2 mRNA um das 3fache (Abbildung 15 A). Kein Zusammenhang konnte zwischen Fgl2 mRNA und der Resorptionsrate in der Stress- oder Kontrollgruppe festgestellt werden (Abbildung 15 B).

Abbildung 15: Fgl2 mRNA-Expression bei stress-induziertem und inflammatorisch-induziertem Abort A: Fgl2 mRNA nach Stress und nach Injektion von IL-12: Fgl2 mRNA ist nach der Applikation von Stress (Tag 5,5) am Tag 13,5 der Trächtigkeit um das 3fache niedriger, wohingegen die Stimulation mit IL-12 p70 fgl2 mRNA auf das Dreifache erhöht.
B: Zusammenhang zwischen fgl2 und der Anzahl an Aborten: Es ist kein Zusammenhang zwischen der Menge an fgl2 mRNA und der Höhe der Resorptionen erkennbar.

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Es zeigte sich aber, dass die Menge an TNF-α mRNA in einem negativen Zusammenhang mit der Menge an fgl2 mRNA steht (Abbildung 16). Es gab keine statistisch eindeutige Beziehung zwischen fgl2 mRNA und IFN-γ mRNA (Abbildung 17).

Abbildung 16: Zusammenhang zwischen der Menge an TNF- α und der Menge an fgl2 mRNA
Es zeigt sich keine signifikante Korrelation zwischen der Menge an TNF-αund der Menge an fgl2 mRNA, als Tendenz lässt sich ein negativer Zusammenhang zwischen den beiden Parametern erkennen.

Abbildung 17: Zusammenhang zwischen der Menge an IFN- γ mRNA und der exprimierten Menge an fgl2 mRNA
Es zeigt sich keine Korrelation zwischen der Menge an IFN-γ und der Menge an fgl2 mRNA.

3.5 Die Induktion von Apoptose durch Stress und IL-12 im Mausmodell

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Die schwangerschaftsgefährdende Wirkung von Th1-Zytokinen kann einerseits durch die Initiation von Gerinnung, andererseits durch die Provokation von Zelluntergang vermittelt sein. Ob Stress durch freigewordenes TNF-α die abortogene Wirkung über Induktion von Apoptose, den programmierten Zelluntergang, verursacht, sollte durch eine Analyse der apoptotischen Aktivität im Uterusgewebe nach Stressexposition mittels TUNEL-Färbung bearbeitet werden. Die Applikation von Stress erhöhte die Häufigkeit von Apoptose deutlich (Abbildung 18). IL-12 induziert einerseits die Expression von fgl2 mRNA, gleichzeitig ist eine erhöhte Inzidenz an Apoptose in der Dezidua von IL-12 injizierten Tieren zu beobachten (Abbildung 18). TNF-α ist in der Literatur als Vermittler von Apoptose beschrieben worden (Yui et al., 1994).

Abbildung 18: Apoptose nach Stress und nach IL-12-Injektion
Stressstimulation und IL-12-Stimulation erhöhen das Auftreten von Apoptose im Uterus von CBA/J Weibchen.

3.6 Die Expression von TNF-α im ersten Trimenon und dritten Trimenon

Der immunologisch regulierten Prothrombinase fgl2 und deren beschriebene Expressionserhöhung bei Schwangerschaftskomplikationen müsste eine Th1-Immunantwort zugrunde liegen. Zur Überprüfung dieser Immunkonstellation wurde TNF-α ausgewählt, weil die vorangegangenen Tierversuche in beiden Abortkonstellationen übereinstimmend eine erhöhte Expression an TNF-α mRNA gezeigt haben. Viele Publikationen deuten auf eine vermehrte Expression von IFN-γ mRNA hin, so dass im humanen Spontanabort von der Zytokinkonstellation TNF-α + IFN-γ↑ ausgegangen werden kann. Eine In-situ-Hybridisierung an der gleichen Patientinnenkohorte hat in einem vorherigen Versuchsaufbau eine erhöhte Expression an TNF-α mRNA bei Spontanabort und eine gleichzeitig vermehrte Stresswahrnehmung berichtet (Arck et al., 2001). Die lange Fixierung des Plazentagewebes in Formaldehyd 37% bei der Routineaufbereitung des Gewebes durch die Pathologie ließ den Nachweis von mRNA mit der hochanfälligen In-situ-Hybridisierung in den Präeklampsie-Plazenten nicht zu. Der Nachweis von TNF-α in Präeklampsie erfolgte daher durch den Proteinnachweis mit Immunhistochemie. Präeklampsie war mit einer erhöhten Menge an TNF-α Protein verbunden. Die semi-quantitative Analyse belegt, dass eine deutlich höhere Färbungsintensität der Trophoblasten für TNF-α in Präeklampsie zu beobachten war (Abbildung 19). Abbildung 20 zeigt die Färbung von normalen, 3.-Trimester-Zotten für TNF-α Protein, wohingegen die Abbildung 21 die Immunhistochemie für TNF-α in einer 3.-Trimester-Plazenta bei Präeklampsie demonstriert. Tabelle 1 verdeutlicht die Gesamtauswertung der Immunhistochemie für TNF-α Protein bei normalen Schwangerschaftsverlauf versus Präeklampsie.

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Abbildung 19: TNF- α Expression in den Gefäßen bei PräeklampsieSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für TNF-α Protein an den Gefäßen in Präeklampsie und Kontrollen.

Abbildung 20: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für TNF-α Protein.

Abbildung 21: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta von Präeklampsie-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für TNF-α Protein.

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Die spezifische Analyse der TNF-α Protein-positiven Zellen in Präeklampsie zeigt die Tabelle 1:

Tabelle 1: Immunhistochemie für TNF- α in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf und von Pr ä eklampsie-PatientinnenVermehrte Expression von TNF-α Protein in Endothelzellen und Trophoblasten bei Präeklampsie (PE) im Vergleich zu einem normalen Schwangerschaftsverlauf. Kein Unterschied in der Expression von TNF-α Protein in Trophoblastzellen und plazentaren Makrophagen.

Gewebeursprung

Endothel

Trophoblast

plazentare

Makrophagen

PE (n = 10)

+/++

+

+/++

Kontrolle (n = 12)

+

+/-

+/++

3.7 Die Expression von fgl2 mRNA und fgl2 Protein in humanem Plazentagewebe

3.7.1  Das erste Trimenon

Abbildung 22 zeigt die mittels In-situ-Hybridisierung gewonnenen Daten.

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Abbildung 22: In-situ-Hybridisierung für fgl2 mRNA 1.-Trimester-Zotte(A) zeigt die Sense-Kontrolle und (B) zeigt die Antisense-Färbung für fgl2 mRNA.

Es sind Plazentazotten mit der zweizelligen Trophoblastschicht — bestehend aus den Syncytiotrophoblasten und den Cytotrophoblasten — welche charakteristisch für das erste Trimenon sind, dargestellt. Die In-situ-Hybridisierung wurde unter Verwendung einer 35S-markierten fgl2 mRNA-Sonde durchgeführt. Bei beiden abgebildeten Zotten zeigt sich eine typische, schwarze Markierung der Trophoblastschicht in der Antisense-Probe, wobei die mRNA-Probe spiegelbildlich der fgl2 mRNA-Sequenz ist. In der Negativkontrolle, der Sense-Probe, in der die Probe identisch mit der fgl2-mRNA Sequenz ist, zeigt sich kein positives Signal. Der Trophoblast weist auch in der Immunhistochemie positive Signale (braun) für fgl2 Protein auf (Abbildung 21).

Abbildung 23: Immunhistochemie für fgl2 in 1.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein sowie einen repräsentativen Gefäßanschnitt.

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Diese Ergebnisse belegen erstmals, dass fgl2 mRNA und fgl2 Protein in humanen Trophoblastzellen exprimiert werden, insbesondere wenn ein Spontanabort erfolgt ist. Die Zahl der fgl2 positiven Gefäße an der Gesamtzahl der Gefäße war erhöht, wenn ein Spontanabort stattgefunden hatte (Abbildung 24).

Abbildung 24: fgl2 Protein-Expression in Endothelzellen von Gefäßen im ersten Tr i menonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Gefäßen in der Dezidua basalis von Kontrolle und Spontanabort.

Die semi-quantitative Auswertung der fgl2-Expression der zottären Trophoblasten zeigt, dass die Patientinnen mit einem Abort eine höhere fgl2-Expression aufweisen als Patientinnen mit einer elektiven Schwangerschaftsbeendigung (Abbildung 25).

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Abbildung 25: fgl2 Protein-Expression in Trophoblasten des ersten TrimenonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Trophoblastzellen der Dezidua basalis in Kontrolle und Spontanabort

Abbildung 26: Immunhistochemie für fgl2 in 1.-Trimester-Plazenta von Abort-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein sowie einen repräsentativen Gefäßanschnitt.

3.7.2 Das dritte Trimenon

Fgl2 Protein konnte gleichfalls in Plazentagewebe aus dem dritten Trimester entdeckt werden. Wegen der langen Fixierung des Gewebes (siehe oben) besteht kein direkter Nachweis von fgl2 mRNA-Expression in Plazentagewebe aus dem dritten Trimester. Die Intensität der fgl2-Immunhistologie ist quantifiziert für die Plazentaproben von Präeklampsie-Patientinnen und unkomplizierten Schwangerschaften (Tabelle 2).

↓51

Tabelle 2: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf und bei Pr ä eklampsie-PatientinnenVermehrte Expression von fgl2 Protein in Endothelzellen, Trophoblasten und Makrophagen bei Präeklampsie-Patientinnen (PE) im Vergleich zu einem normalen Schwangerschaftsverlauf.

Gewebeursprung

Endothel

Trophoblast

plazentare

Makrophagen

PE (n = 12)

+

+

+/++

Kontrolle (n = 12)

+/-

+/-

+

Tabelle 2 fasst die Daten der Immunhistologie zusammen und zeigt eine erhöhte fgl2 Protein-Expression in Trophoblasten, Makrophagen (Hofbauer Zellen) und Zottenendothel, wenn das Plazentagewebe und die angrenzenden Deziduagewebe von einer Patientin mit Präeklampsie stammte. Abbildung 27 zeigt die Analyse der fgl2 Expression der Gefäße und belegt die erhöhte Anzahl fgl2 positiver Gefäße an der Gesamtzahl der Gefäße, wenn eine Präeklampsie bestand.

Abbildung 27: Expression von fgl2 Protein in Endothelzellen im dritten TrimenonSemi-quantitative Analyse der Immunhistochemie für fgl2 an den Gefäßen in Präeklampsie und Kontrollen.

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Die nachfolgende Abbildung 28 zeigt reife Zotten einer Plazenta im dritten Trimenon bei normalem Schwangerschaftsverlauf. Vereinzelt exprimieren die Trophoblastzellen fgl2 Protein (Abbildung 26 B). In Abbildung 29 ist die Plazenta einer Präeklampsie-Patientin dargestellt, wobei die Trophoblasten homogener fgl2 Protein exprimieren.

Abbildung 28: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta bei normalem Schwangerschaftsverlauf(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein.

Abbildung 29: Immunhistochemie für fgl2 in 3.-Trimester-Plazenta von Präeklampsie-Patientinnen(A) zeigt die IgG-Kontrolle und (B) zeigt die Färbung für fgl2 Protein.

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Mit dieser Beobachtung übereinstimmend konnten beeindruckende Ablagerung von Fibrin in den Plazentaproben der Präeklampsie-Patientinnen im Vergleich zu Plazentaproben bei unkomplizierter Schwangerschaft beobachtet werden.

3.8 Apoptose in Präeklampsie und Spontanabort

Th1-Zytokine, insbesondere TNF-α, sind in der Lage programmierten Zelltod, in Form einer Apoptose, auszulösen. Die Untersuchung der apoptotischen Signale im ersten Trimenon und im dritten Trimenon ergaben, dass sowohl in der Dezidua als auch in Präeklampsie-Plazenten eine deutlich höhere Inzidenz an Apoptose zu beobachten war (Abbildung 30).

Abbildung 30: Apoptose im ersten und dritten Trimenon
A: Semi-quantitative Analyse der apoptotischen Signale im Spontanabort.
B: Semi-quantitative Analyse der apoptotischen Signale bei Präeklampsie.

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In Abbildung 31 ist die Apoptose in einer Plazenta im dritten Trimester dargestellt.

Abbildung 31: Apoptose im dritten TrimenonDie Zellkerne sind blau angefärbt, wobei die apoptotischen Fragmente grünfluoreszieren.


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20.11.2006