IV.  Untersuchungen

IV.1.  Löslichkeitsversuche

Löslichkeitsversuche waren in der vorliegenden Arbeit Voraussetzung, um die schwerlöslichen Arzneistoffe PIN-Base, MMF, MPA, ZK 216771 und ZK 247756 in eine bevorzugt wässrige Lösung bzw. Rezeptur zu bringen und um die vorgesehenen Untersuchungen durchführen sowie eine okulare Applikation ermöglichen zu können. Tabelle 11 zeigt die Wasserlöslichkeiten der genannten Arzneistoffe.

PIN lag als einziger der zu untersuchenden β-Blocker als lipophile Base vor und sollte der Versuchsplanung entsprechend bei pH 7,4 mittels CDen in Lösung gebracht werden. Da eine ungeladene Base im Vergleich zum meist besser löslichen Salz die Cornea leichter permeiert, war bewusst auf Salzbildung des Ausgangsstoffs zu verzichten. Stattdessen sollte die Permeation durch isolierte Schweinecornea aus einem PIN/CD-Assoziat untersucht werden (Ergebnisse und Diskussion, V.1.2.4).

Mit dem β-Blocker PIN dienten Löslichkeitsversuche mit wässrigen CD-Lösungen gleichzeitig dazu, Aussagen über das Entstehen möglicher Einschlussverbindungen zu erbringen(Ergebnisse und Diskussion, V.1.2.6.1).

Tabelle 11 : Schwerlösliche Arzneistoffe

Arzneistoff

Sättigungslöslichkeit in Wasser [µg/ml] bei RT

Pindolol-Base (PIN)

160

Mycophenolsäure (MPA)

63,9

Mycophenolatmofetil (MMF)

43,0

ZK 216771

7,4

ZK 247756

2,6

RT: 22 ± 0,5°C

Vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe beschreiben die Löslichkeit von MMF bzw. MPA in HP-β-CD-Lösungen (Verhältnis MMF/MPA ohne CD-Zusatz in GBR pH 7,4: 5,4 : 1 bis 7,6 : 1 [202]). Bei einer Konzentration von 10% HP-β-CD konnte für MMF eine [Seite 51↓]ca. 20fache Löslichkeitsverbesserung gegenüber dem Pufferwert erreicht werden, für MPA eine ca. 3fache [202].

Die extrem schwerlöslichen SEGRA-Verbindungen ZK 216771 und ZK 247756 (Tabelle 11) wurden ebenfalls in wässrigen CD-Lösungen komplexiert (Ergebnisse und Diskussion, V.3.1.1). Um eine therapeutisch relevante Konzentration zu erreichen, waren zusätzliche Maßnahmen (Zusatz von Ethanol, veränderte Herstellungsverfahren, Herstellung einer CDhaltigen Mikroemulsion) erforderlich (Ergebnisse und Diskussion, V.3.2.1).

Die Durchführung der Löslichkeitsversuche erfolgte, indem ein Arzneistoffüberschuss zu CDhaltigen (native CDe, hydroxypropylierte Derivate, (carboxymethyliertes) α-CD-Polymer) Pufferlösungen gegeben wurde. Die Sättigungskonzentration wurde mittels HPLC aus dem Filtrat bestimmt (Material und Methoden, VI.2.3.2.3).

IV.2.  Bestimmung der Arzneistoff/CD-Komplexierung

Die am meisten angewandte Methode zur Erfassung der Komplexierung zwischen einem Arzneistoff und einem ausgewählten CD im gelösten Zustand ist die Bestimmung der Arzneistofflöslichkeit in wässrigen CD-Lösungen abgestufter Konzentration. Die Ergebnisse werden in einer sog. Löslichkeitsisotherme (Abb. 13) dargestellt, indem die molare Konzentration des gelösten Arzneistoffs (Ordinate) als Funktion der CD-Konzentration (Abszisse) aufgetragen wird. Gemäß Higuchi und Connors [80, 81] werden die Löslichkeitsisothermen in A- und B-Typen eingeteilt. Die A-Typen sind charakteristisch für wasserlösliche CDe und lassen auf Bildung löslicher Einschlussverbindungen zwischen Arzneistoff und CD-Derivat schließen. Im Gegensatz dazu beschreiben die B-Typen eher den durch native CDe vermittelten Löslichkeitsverlauf. Sie demonstrieren eine begrenzte Wasserlöslichkeit des gebildeten Komplexes.

Zur Erstellung des Phasenlöslichkeitsdiagramms wird ein Überschuss an Arzneistoff der entsprechenden wässrigen CD-Lösung in steigender molarer Konzentration zugesetzt und die Konzentration eines Arzneistoffs im Gleichgewichtszustand analytisch erfasst. Im AL-Diagramm steigt die Löslichkeit linear als Funktion der CD-Konzentration an. Es spiegelt die Bildung eines 1:1-Komplexes zwischen Arzneistoff und CD wider. Die Stabilitätskonstante kann nach Gleichung 1 berechnet werden [88]:


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(1)

KStab ist die Stabilitätskonstante für einen 1:1-Komplex nach dem AL-Typ und [cs] die Sättigungslöslichkeit des Arzneistoffs in Wasser in Abwesenheit von CD bei gegebener Temperatur.

Abb. 13 : Verschiedene Typen von Löslichkeitsisothermen; nach [ 81 ]; A: löslicher Komplex; AL: linear, AP bzw. AN: nicht linear bei höherer CD-Konzentration; B: BS: Komplex besitzt schlechtere Löslichkeit als das Substrat, BI: Komplex fällt nach Erreichen einer Löslichkeitsgrenze aus

In einer AP-Löslichkeitsisotherme nimmt die Löslichkeit des Arzneistoffs bei höheren CD-Konzentrationen stärker zu als bei niedrigen (Abb. 13). In diesem Fall werden 1:1- und 1:2-Komplexe (oder Komplexe höherer Ordnung) gebildet. Die Stabilitätskonstanten für AP-Phasenlöslichkeitsdiagramme können nach Gleichung 2 berechnet werden [88]:

(2)

[co] ist die absolute Arzneistoffkonzentration bei einer CD-Konzentration von [cc]. K1:1 und K1:2 sind die Komplexbildungskonstanten für einen 1:1- bzw. 1:2-Komplex. Eine Graphik von ([co]-[cs])/[cc]) gegen [cc] führt zu einem linearen Zusammenhang, aus dem K1:1 und K1:2 berechnet werden können.

Neben der Komplexbestimmung im flüssigen Zustand sollten mögliche Arzneistoff/CD-Komplexe mittels FT-IR bzw. X-RD im festen Zustand charakterisiert werden (Material und Methoden, VI.2.3.2.1/ VI.2.3.2.2).


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IV.3.  In-vitro-Permeationsstudien durch isolierte Schweinecornea

Mit den unter Theoretische Grundlagen, III.3.2 und III.3.4/ III.3.5 aufgeführten Betarezeptorenblockern und SEGRA wurden Permeationsstudien durch isolierte Schweinecornea durchgeführt. Die folgenden Ausführungen sollen einen Überblick über den Hintergrund dieser In-vitro-Versuche geben.

IV.3.1. Theoretische Grundlagen

IV.3.1.1. In-vitro Modelle

Nach dem Europäischen Arzneibuch gibt es verschiedene In-vitro-Modelle zur Simulierung vorwiegend diffusionsbedingter Arzneistofffreisetzung aus festen, halbfesten und flüssigen Zubereitungen [54]. Es wird zwischen „Dissolution-Modellen“ und Freisetzungsmodellen mit Membranen unterschieden. Die „Dissolution-Modelle“ sind in erster Linie zur Prüfung der Arzneistoffliberation aus festen peroralen Arzneiformen relevant [54]. Membranmodelle werden angewendet, um den Einfluss einer Diffusionsbarriere (z.B. Cornea, Haut oder synthetische Barrieren) auf den Freisetzungsprozess zu berücksichtigen und/oder um den Einfluss verschiedener Formulierungsparameter (z.B. Hilfsstoffe, pH-Wert, Elektrolyte) auf den Liberations- und Permeationsvorgang unter konstanten Versuchsbedingungen zu evaluieren. Es werden sowohl künstliche als auch biologische Membranen, die − horizontal bzw. vertikal angeordnet − die Diffusionskammer in ein Donator- und ein Akzeptor-kompartiment trennen, verwendet.

Zur Erklärung ophthalmologischer Fragestellungen werden Membranmodelle unter Nutzung der Cornea vom Kaninchen [46, 83, 143, 183, 200], Schwein [20, 29] und Rind [208] beschrieben. Abgesehen von der Größe, bestehen bezüglich der morphologischen Struktur zwischen Kaninchen-, Schwein- und Menschencornea lediglich geringe Unterschiede [52]. Bezüglich der Enzyme in der Cornea, insbesondere das Epithel betreffend, existieren jedoch einige Unterschiede zwischen den einzelnen Säugetierspezies [67, 175, 194].

IV.3.1.2.  Flux

Unter den gewählten Versuchsbedingungen, bei denen der Konzentrationsunterschied zwischen Akzeptor- und Donatormedium annähernd konstant bleibt, stellt sich ein „steady-state“ bezüglich des Durchtritts der zu untersuchenden Substanz durch die Membran ein.


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Die Masse Q, die durch eine Flächeneinheit A pro Zeiteinheit (t) hindurchwandert, wird als Flux bzw. Diffusionsstrom bzw. Massenstrom J bezeichnet.

(3)

Der Massenstrom J ist dem Konzentrationsgradienten dc/dx proportional. Gleichung 3 entspricht dem 1. Fick’schen Diffusionsgesetz, in dem die Proportionalitätskonstante D dem Diffusionskoeffizienten entspricht [136].

IV.3.1.3. Permeabilitätskoeffizient

Abb. 14 : Konstanter Konzentrationsgradient eines durch die Membranbarriere M diffundierenden Stoffes; (D = Donatorphase,
A = Akzeptorphase; c (D/A): Konzentration in D/A); nach [136]

Abb. 14 stellt einen mehrstufigen Transportprozess über „drei Phasen“ dar. Zunächst ist der Stoff vollständig in der Donatorphase D gelöst, und in der Akzeptorphase A befindet sich reines Lösungsmittel. Während des Versuchs diffundiert der Stoff über das mittlere Kompartiment, z.B. eine Barriere M, vom Donator in den Akzeptor. Gleichzeitig wird die arzneistoffbeladene Akzeptorlösung kontinuierlich gegen reines Lösungsmittel partiell oder total ausgetauscht, so dass die Konzentration im Akzeptor auf einem sehr niedrigen Niveau gehalten wird [136], d.h. Sink-Bedingungen (Freisetzungskinetik 0. Ordnung) bestehen (c(A) ≈ 0). Im Akzeptorkompartiment dürfen während der gesamten Versuchsdauer 10% der Sättigungskonzentration des Arzneistoffs nicht überschritten werden.

Vorausgesetzt, der Gradient (c(M1)-c(M2))/h (Abb. 14) ist annähernd konstant (quasi-stationärer Zustand), die ruhenden Schichten an den Grenzschichten haben keinen [Seite 55↓]wesentlichen Einfluss auf die Stoffpermeation durch die Barriere, und die Übergangswiderstände sind klein, kann − Sink-Bedingungen im Akzeptorkompartiment angenommen − der Permeabilitätskoeffizient P, ausgehend von Gleichung (3), hergeleitet werden. Letzterer besitzt die gleiche Dimension wie eine lineare Geschwindigkeit [cm/s].

(4)

dQ/dt ist die Änderung der Konzentration [µg/ml bzw. mg/ml] im Akzeptorkompartiment pro Zeiteinheit t [min] und entspricht dem Anstieg der Geraden bei kumulativer Auftragung der permeierten Arzneistoffmenge [µg bzw. mg] gegen die Zeit. 60 ist der Umrechnungsfaktor von Minuten in Sekunden. A bezeichnet die Permeationsfläche (cm2) und c0 die anfängliche Wirkstoffkonzentration.

Der apparente Permeabilitätskoeffizient (P app ) entspricht dem effektiven Permeabilitäts-koeffizienten (P eff. ), welcher sich im Fall der in dieser Arbeit verwendeten Membran (Schweinecornea) aus den Permeabilitäten des transzellulären und des parazellulären Weges sowie der stehenden Wasserschicht vor der Membran zusammensetzt.

Bei Auftreten einer „lag time“ (tlag), d.h. eines anfänglich nahezu parallelen Kurvenverlaufs im Freisetzungs-Zeit-Diagramm, bevor der lineare Anstieg beginnt, wurden die Peff nur für den linear ansteigenden Abschnitts bestimmt. Die tlag wurde durch Extrapolation des linearen Abschnitts auf die Abszisse bestimmt [29].

Als weiterer Permeationsparameter wurde die kumulativ freigesetzte, prozentuale Arzneistoffkonzentration nach 300 min (Versuchsende) berechnet (Q300).

IV.3.2. Versuchsdurchführung

Eine von unserer Arbeitsgruppe entwickelte Permeationsapparatur für Schweinecornea, die ein modifiziertes Ussing-Kammer-System [208] darstellt (vgl. Material und Methoden, VI.2.4.2), wurde zur Bestimmung des In-vitro-Permeationsverhaltens unterschiedlicher Betablocker- und SEGRA-Formulierungen verwendet.

Corneae frisch geschlachteter Schweine wurden mittels Skalpell und/oder einer chirurgischen Schere so herauspräpariert (Material und Methoden, VI.2.4.1), dass diese noch von einem schmalen Scleralring umgeben waren. Die Cornea wurde zwischen den beiden Hälften des [Seite 56↓]Permeationsmodells (Material und Methoden, VI.2.4.3) fixiert, die corneale Permeationsfläche betrug 0,5 cm2. Für die Studien mit Betablockern und Pilocarpin enthielt das Donator-kompartiment (Epithelseite) i.d.R. eine Lösung von Arzneistoff, CD bzw. Arzneistoff/CD, wobei in Glutathion-Bicarbonat-Ringerlösung (GBR) oder Sørensen-Phosphat-Pufferlösung (SPP) zumeist im neutralen pH-Bereich gearbeitet wurde. Das Akzeptorkompartiment enthielt 20 ml GBR bzw. SPP; die Akzeptorflüssigkeit wurde kontinuierlich umgepumpt. Alle 30 min, bis zu einem Zeitpunkt von 300 min, wurden Proben zu 1 ml aus dem Akzeptorkompartiment entnommen und das fehlende Volumen mit 1 ml unbeladenem Puffer ergänzt, um ein konstantes Volumen von 20 ml Akzeptorflüssigkeit aufrechtzuerhalten.

Um CD-Effekte auf die corneale Integrität zu erfassen, wurden Corneae 30 min in CD-Lösung (1,85/ 3,7/ 10% α-CD; 4,7/ 11,7% HP-α-CD, 12,5% HP-β-CD) getaucht, bevor Permeationsstudien mit reiner Arzneistofflösung durchgeführt wurden (Vorbehandlung der Membran, s. Material und Methoden, VI.2.4).

Die Permeationsversuche durch synthetische Membran (Nephrophan®, regenerierte Cellulose) erfolgten in analoger Weise. Vor Anwendung wurde die Nephrophan®-Membran mindestens eine Stunde in Wasser eingelegt und auf eine Größe von ca. 0,55 cm2 zugeschnitten.

IV.4. In-vivo-Versuche (Kaninchen)

Um die okulare Verteilung des Prodrugs MMF bzw. seiner aktiven Wirksubstanz MPA zu bestimmen, wurden In-vivo-Versuche am Kaninchen (Material und Methoden, VI.2.6.2) durchgeführt. Im Vordergrund stand der Vergleich einer MMF/CD-Lösung mit einer MMF-Suspension. Zusätzlich wurde die okulare Verteilung einer MPA/CD-Lösung vergleichend evaluiert.

Nach Applikation der jeweiligen Augentropfen wurden die Kaninchen (vier Tiere pro Versuchsgruppe) nach 30, 60 und 240 min getötet. Unmittelbar danach erfolgte die Entnahme von Plasma- und Kammerwasserproben sowie das Herauspräparieren von Glaskörper, Conjunctiva, Cornea und Sclera. Nach entsprechender Aufarbeitung (Material und Methoden, VI.2.6.3) wurde der Gehalt an MMF bzw. MPA in den Flüssigkeiten sowie in den jeweiligen okularen Geweben bestimmt.


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IV.5.  In-vivo-Versuche (Ratte)

Weiterhin kam der Selektive Glucocorticoidrezeptoragonist (SEGRA) ZK 247756 in Form einer CD-haltigen Mikroemulsion (ME-CD-SEGRA) bei hornhauttransplantierten Lewis-Ratten zur okularen Anwendung.

Es wurde die Transplantatabstoßung bei lokaler Behandlung mit ME-CD-SEGRA am x. postoperativen Tag im Vergleich zu 2 nichtbehandelten Kontrollgruppen (Gruppe 1: syngene Transplantate, Gruppe 2: allogene Transplantate) sowie einer Gruppe von Lewis-Ratten, denen nur wirkstofffreies Vehikel (ME-CD) appliziert wurde, getestet. Die topische Behandlung mit den jeweiligen Augentropfen erfolgte am Tag der Transplantation mit einer „loading-dose“ von 5 x 20 µl, an den darauffolgenden Tagen wurden 5 x täglich 20 µl appliziert (Material und Methoden, VI.2.7.3.4). Die Transplantate wurden nach etablierten Beurteilungskriterien [160, 164] begutachtet. Ferner erfolgte die Bestimmung der immunologischen Parameter mittels PCR (Material und Methoden, VI.2.7.3.5/ VI.2.7.3.6).


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10.11.2004