VI.  Material und Methoden

VI.1.  Verwendete Substanzen

[Seiten 117 - 118↓]

Glutathion-Bicarbonat-Ringerlösung pH 7,4 (GBR pH 7,4)

GBR I und GBR II wurden getrennt hergestellt, gemischt und mit Phosphorsäure 85% auf pH 7,4 eingestellt.

Phosphatpuffer nach Sørensen pH 6,0/7,0/7,4 (SPP pH 6,0/7,0/7,4) wurde entsprechend der Vorschrift nach [173] hergestellt.

Kaliumdihydrogenphosphatlösung: 9,078 g KH₂PO₄ auf 1000 ml

Dinatriumphosphatlösung: 11,876 g Na₂HPO₄·2H₂O auf 1000 ml

Die kinematische Viskositätν [mm²/s] der verwendeten wässrigen Lösungen wurde mit dem Kapillarviskosimeter nach Ubbelohde mit hängendem Kugelniveau (Schott Geräte, Hofheim a. Ts., D) bei einer Versuchstemperatur von 25°C (Durchsichtthermostat CT 1450/2 und AVS 350, Schott, Hofheim a. Ts., D) bestimmt (n = 5-8). Unter Einbeziehung der Dichte ρ ließ sich aus der kinematischen Viskosität ν die jeweilige dynamische Viskosität η berechnen:

η = ν · ρ [mPa·s]

Die Dichte der verwendeten Lösungen wurde mit dem Densitometer (density meter DMA 38, Paar, Graz, A) bestimmt. Das Messprinzip des Gerätes beruht darauf, dass die Untersuchungsflüssigkeit bei einer Messtemperatur von 25°C in einem U-förmig gebogenen Rohr in Schwingung versetzt wird. Je höher die Dichte der Flüssigkeit, desto größer ist die an der Schwingung beteiligte Masse und desto länger dauert die Schwingung. Aus der [Seite 120↓]gemessenen Schwingungsdauer kann – nach vorausgegangener Kalibrierung mit bidestilliertem Wasser – die Dichte der Untersuchungslösung mit einer Messgenauigkeit von ±10^-3 [g/cm³] errechnet werden (n = 5).

Zur Ermittlung der statischen Oberflächenspannung σ [mN/m] wässriger Lösungen wurde das Ring-Tensiometer TE 1C (Messgerätewerk Lauda, Dr. D. Wobser KG, Lauda-Königshofen, Deutschland) bei 32°C verwendet. Jede Lösung wurde fünfmal vermessen.

VI.2.1.4.  Osmolalität

Die Bestimmung des osmotischen Drucks π [mOsmol/kg] wässriger Arzneistoff- oder CD-Lösungen erfolgte mit einem automatischen Halbmikro-Osmometer (Knauer GmbH, Berlin, D). Das Probenvolumen betrug jeweils 150 µl. Die Kalibrierung erfolgte mit destilliertem Wasser auf 0 mOsmol/kg und mit einer 1,2687%igen wässrigen NaCl-Lösung auf 400 mOsmol/kg.

Der pH-Wert der verwendeten Lösungen wurde mittels pH-Meter Typ CG 825 (Schott-Geräte GmbH, Hofheim a. Ts., D) bestimmt. Die Kalibrierung der Messinstrumente erfolgte mit drei pH-Pufferlösungen (pH 4,01; pH 7,00 und pH 9,21; Mettler Toledo GmbH, Steinbach, D) bei Raumtemperatur.

Bei einer Temperatur von 25°C wurde die Bestimmung der Leitfähigkeit [µS/cm] am Konduktometer Typ KM2 (MLW Labortechnik Ilmenau, D) durchgeführt.

Mit Hilfe einer 0,01 N KCl-Lösung wurde die Messzellenkonstante C mit einem Wert von 0,338 cm^-1 ermittelt. Als Messgröße wurde der Leitwert G bestimmt und durch Multiplikation mit der Messzellenkonstanten C in die Leitfähigkeit umgerechnet. Das vortemperierte Mikroemulsionssystem wurde nach kurzem Umschütteln in die Messzelle gefüllt und nach 2 min vermessen. Es wurden 5 Bestimmungen vorgenommen.

Das Verteilungsverhalten von Arzneistoffen zwischen einer hydrophilen Phase (Wasser oder [Seite 121↓]Pufferlösung) und einer lipophilen Phase (1-Octanol) kann durch den Verteilungs-koeffizienten V_K charakterisiert werden. Als Pufferlösung wurde Phosphatpuffer nach Sørensen oder GBR-Puffer verwendet. Zur Bestimmung des V_K wurden 10,0 ml der Lösung der zu untersuchenden Substanz im Scheidetrichter mit dem gleichen Volumen puffergesättigten Octanols versetzt (Dreifachbestimmung) und 15 min manuell geschüttelt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und anschließend einem geeigneten Verfahren zur Bestimmung des Wirkstoffgehalts (s. Material und Methoden, VI.2.2) unterzogen. Der scheinbare V_K wurde mit Hilfe folgender Gleichung berechnet:

	VW= Volumen der wässrigen Phase [ml]
	VL= Volumen der lipophilen Phase [ml]

Der Partikeldurchmesser der verwendeten MEen wurde mittels Photonen-korrelationsspektroskopie (PCS) bestimmt. Die PCS wird zur Bestimmung mittlerer Teilchengrößen von Emulsionen, Suspensionen, Liposomen und MEen angewendet. Der Messbereich dieser Methode ist die Schnelligkeit, da für die Messungen lediglich der Brechungsindex und die Viskosität des Dispersionsmediums vorbestimmt werden müssen [77, 144].

Die PCS ist ein Messverfahren auf der Basis von Laserlichtstreuung. Dabei wird ein Laserstrahl durch eine Küvette gesandt, in der sich die Probe befindet. Jedes Partikel streut einen Teil des einfallenden Laserlichts [72]. Das Streulicht im 90°C Winkel wird mit einem Elektronenzählrohr detektiert. Das analoge Streulichtsignal wird digitalisiert und einem Korrelator zugeleitet, der daraus die Korrelationsfunktion erstellt. Der Computer analysiert die Daten und errechnet daraus den Diffusionskoeffizienten der Teilchen. Dieser Wert wird in der Stokes-Einstein-Gleichung verwendet, um den mittleren Teilchendurchmesser zu berechnen [77].

VI.2.2.  Gehaltsbestimmungen

Alle im Folgenden beschriebenen Gehaltsbestimmungen erfolgten mittels Hochdruck-flüssigkeitschromatographie (HPLC: H igh P ressure/ P erformance L iquid C hromatography).

In der HPLC erfolgt zunächst eine Stofftrennung, wobei die mobile Phase mittels einer Hochdruckpumpe durch eine Trennsäule (stationäre Phase) gepresst wird. Dabei wird der Analyt reversibel an die stationäre Phase gebunden (und wieder freigegeben). Aufgrund unterschiedlicher Affinitäten der Substanzen zum Säulenmaterial (z.B. alkylierte Kieselgele) wird das Stoffgemisch getrennt. Nach der chromatographischen Trennung erlauben geeignete Detektoren, z.B. Foto- oder Fluorimeter, eine selektive und hochempfindliche qualitative und quantitative Erfassung der Komponenten. Das erzeugte Detektorsignal wird nach Verstärkung einer Registriereinheit, z.B. einem Integrator, zugeführt und grafisch aufgezeichnet. Die Fläche unter dem Peak, die sich proportional zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz verhält, wird berechnet. Durch Kalibrierung mit einem internen oder externen Standard lässt sich die Konzentration der zu messenden Substanz berechnen [190].

Die Kalibrierung erfolgte jeweils durch einen externen Standard in einem Konzentrationsbereich, in dem auch die unbekannten Konzentrationen zu erwarten waren. Bei Lösungen (z.B. Gewebeaufarbeitung der In-vivo-Studien am Kaninchen), bei denen der Konzentrationsbereich völlig unbekannt war, wurde die Kalibrierung zuerst geschätzt und dann entsprechend angepasst, so dass die Unbekannten im Datenschwerpunkt lagen. Die Kalibrierung erfolgte mittels linearer Regression, die von folgenden Voraussetzungen ausgeht [50] (Validierung der Kalibrierung):

1. Die unabhängige Variable wird als fehlerfrei angesehen.
2. Es liegen Stichproben vor, die einer Normalverteilung gehorchen.
3. Die Streuungsmaße in den Einzelstichproben y_x müssen innerhalb des Arbeitsbereiches von x_min bis x_max gleich groß bzw. statistisch nicht unterscheidbar sein (Varianzenhomogenität, Gleichheit der Varianzen).
4. Die Zufallsvariablen y_i dürfen nicht voneinander stochastisch abhängig sein, d.h. die Daten dürfen z.B. keinen Trend aufweisen.
5. Es muss ein linearer Zusammenhang zwischen der Messgröße y und der Zustandsgröße x bestehen.

Vor jeder neuen Messreihe wurde eine Kalibrierfunktion erstellt.

Für die unter VI.2.2.1 - VI.2.2.4 beschriebenen HPLC-Gehaltsbestimmungen galten folgende Bedingungen:

VI.2.2.1.  Pilocarpin-HCl

Die Gehaltsbestimmung von Pilocarpin-HCl erfolgte in Anlehnung an die Methode nach Wiesend [243]. Insgesamt bestanden folgende Versuchsbedingungen:

Die Methode zur Bestimmung der einzelnen Betablocker wurde nach orientierenden Angaben von „XTerra Columns Applications Notebook“ modifiziert. Der Eluent bestand aus einem Phosphatpuffersystem und Acetonitril. Der Acetonitrilanteil der mobilen Phase variierte entsprechend der unterschiedlichen Lipophilie der Substanzen. Im Detail lagen folgende Versuchsbedingungen vor:

[Seite 124↓]

1gültig für Raumtemperatur (22 ± 0,5 °C). A/B-Verhältnis musste bei extrem hohen Außentemperaturen allerdings verändert werden.

Da die HPLC-Analytik in einem nicht-klimatisierten Raum stattfand und die HPLC-Anlage (insbesondere die Säule) nicht gleichmäßig temperiert werden konnte, war diese Methode – aufgrund von hohen Außentemperaturen im Sommer – starken Temperaturschwankungen ausgesetzt. Dies führte zu temperaturabhängig veränderten Retentionszeiten. Die Retentionszeit konnte durch Variation des Acetonitril-Anteils modifiziert werden. Vor jeder Messreihe wurde eine neue Kalibrierfunktion erstellt.

VI.2.2.3.  Mycophenolatmofetil / Mycophenolsäure

Die HPLC-Analytik zur Bestimmung von MMF und MPA erfolgte nach [58]:

VI.2.2.4.  ZK 216771 / ZK 247756

Die quantitative Bestimmung der verwendeten SEGRAs wurde nach der Methode von Schering so verändert, dass sie für die zur Verfügung stehenden Geräte unkompliziert war. Diese Modifizierung bezog sich in erster Linie auf die Optimierung des Gradienten:

Die Drehung der Schwingungsebene des linear polarisierten Lichts infolge des Einflusses einer optisch aktiven Verbindung ist von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts, von der Temperatur, vom Lösungsmittel, vom pH-Wert, von der Schichtdicke der Küvette und von der Konzentration des jeweiligen Stoffs abhängig. Der Gehalt an CD, einer optisch aktiven Substanz, kann somit in wässriger Lösung über eine Messung des Drehwinkels quantitativ bestimmt werden. Die Konzentration c [g/100 ml] einer optisch aktiven Verbindung ist bei Kenntnis der spezifischen Drehung [α]_D ²⁰ durch folgende Gleichung gegeben:

	c = Konzentration [g/100 ml]
	α = gemessener Drehwinkel [°]

[Seite 127↓]

VI.2.3.1.  Komplexherstellung

Mit dem leicht löslichen β-Blocker MEP wurden beispielhaft durch Lyophilisation feste Assoziate mit α-, β-, und γ-CD im molaren Verhältnis 1:1 hergestellt. Dazu wurden die Substanzen in bidestilliertem Wasser gelöst, bei -80°C für mindestens 24 h eingefroren und anschließend 24 h lyophilisiert (Christ-Loc-1m Alpha 1-4, Christ). Die entstandenen Lyophilisate (LP) sahen weiß bis gelblich, schaumstoffartig und voluminös aus. Weiterhin wurden zum Vergleich Physikalische Mischungen (PM) von MEPmit α-, β- bzw. γ-CD im molaren Verhältnis 1:1 durch Verreiben (ca. 10 min) im Mörser hergestellt. Pistill und Wände des Mörsers wurden mehrmals mit einem Kartenblatt abgeschabt, um eine effektive Durchmischung zu gewährleisten.

VI.2.3.2.1.  Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR)

Die lyophilisierten Proben bzw. die physikalischen Verreibungen (Material und Methoden, [Seite 128↓] VI.2.3.1) wurden mit Kaliumbromid (KBr) mittels Mörser und Pistill gut verrieben und zu sehr dünnen Tabletten verpresst. Die so entstandenen KBr-Presslinge wurden in eine passende Halterung gespannt und am Infrarotspektrometer (Biorad, USA) vermessen. Die Spektren wurden auf Folie kopiert und anschließend die einzelnen Banden durch Übereinanderlegen dieser Folien verglichen (Vergleich: Arzneistoff-Spektrum – CD-Spektrum – Arzneistoff/CD-Spektrum).

VI.2.3.2.2.  Röntgendiffraktometrie ⁷ (X-RD)

Röntgenstrahlen sind energiereiche elektromagnetische Wellen mit Wellenlängen von 10 nm-2 pm. Ein Untersuchungsverfahren mit Röntgenstrahlen stellt die Röntgendiffraktometrie (X-RD), eine Röntgenfeinstrukturanalyse durch Beugung weicher Röntgenstrahlen an Kristall-gittern, dar [133].

In der Pharmazie werden zur Durchführung von Röntgenbeugungsuntersuchungen ausschließlich Pulververfahren eingesetzt. Das Interesse richtet sich auf die Untersuchung von Kristallmodifikationen und -veränderungen sowie auf die Untersuchung des Kristallinitätsgrads. Beim Pulververfahren wird ein feines Kristallpulver mit mono-chromatischer Röntgenstrahlung untersucht. Es ermöglicht ferner die Untersuchung von Substanzgemischen und von Gitterdefekten [133].

In dieser Arbeit wurden physikalische Mischungen und lyophilisierte Produkte von MEP mit ausgewählten CDen mittels Röntgendiffraktometrie (Horizontalzählrohrgoniometer, Freiberger Präzisionsmechanik, Freiberg, D; Cu-K_a-Irradiation, Scanningrate: 2θ/5s) untersucht. Die Röntgendiffraktogramme der Substanzmischungen wurden mit denen der Einzelsubstanzen (fein zermörsert bzw. lyophilisiert) verglichen und evaluiert.

VI.2.3.2.3.  Löslichkeitsstudien

Für die schwerlöslichen Substanzen Pindolol und ZK 216771 wurden mit ausgewählten CDen in abgestufter Konzentration Löslichkeitsstudien zur Charakterisierung der Komplexbildung [Seite 129↓]durchgeführt.

Die jeweilige Sättigungslöslichkeit von PIN wurde bestimmt, indem ein Überschuss an PIN zu der betreffenden wässrigen CD-Lösung (α-, β-, γ-CD und ihre hydroxypropylierten Derivate; α-CD-Pol und CM-α-CD-Pol) unterschiedlicher Konzentration gegeben wurde. Die so entstandenen Suspensionen wurden in einem Schüttelinkubator (25°C) mindestens 15 h geschüttelt und noch mindestens 3 d bei Raumtemperatur (ungefähr 22°C) stehen gelassen. Die Suspensionen wurden anschließend membranfiltriert (Celluloseacetat, Porengröße: 0,2 µm, NeXstar Pharmaceuticals, Inc. San Dimas, CA 91773, USA). Der Arzneistoffgehalt des Filtrats wurde nach geeigneter Verdünnung mittels HPLC ermittelt (Material und Methoden, VI.2.2).

Neben der Wasserlöslichkeit erfolgte die Bestimmung der Löslichkeit von PIN in GBR-Puffer pH 7,4 unter Zugabe 12,5%iger Lösungen von HP-β-CD bzw. HP-γ-CD. Die GBR-Löslichkeit wurde sowohl bei Raumtemperatur (s.o.) als auch nach Autoklavieren der Ansätze unter Standardbedingungen (121°C, 2·10⁵ Pa, 15 min; Autoklav: MM VAKULAB S 3000; Zersetzung von PIN < 5%) bestimmt. Die auf diese Weise erhaltenen Suspensionen wurden ebenfalls mindestens 3 d bei Raumtemperatur gelagert und, wie oben beschrieben, filtriert und analysiert.

ZK 216771

Die Löslichkeitsstudien an ZK 216771 entsprachen prinzipiell der oben beschriebenen Methode für PIN. Jedoch wurden die wässrigen CD-Lösungen, die einen Überschuss an Arzneistoff enthielten (Miniansätze wegen Substanzmangels), mit einem Magnetrührer in einem kleinen Messzylinder (1 bzw. 2 ml) mindestens 12 h gerührt.

Ein Überschuss an ZK 216771 wurde 10/ 20/ 30%igen wässrigen CD-Lösungen zugesetzt. Das verwendete bidestillierte Wasser wies einen pH-Wert von 6,3 auf. Einige dieser Suspensionen wurden in einem Autoklaven, wie zuvor beschrieben, erhitzt und dann unter Rühren (Magnetrührer) abgekühlt (A). Andere Suspensionen enthielten zusätzlich 5% Ethanol (E). Alle Suspensionen wurden membranfiltriert (s.o.) und der Gehalt an ZK 216741 im Filtrat mittels HPLC bestimmt (Material und Methoden, VI.2.2.4).

VI.2.4.  Wirkstoffpermeation durch isolierte Schweinecornea

VI.2.4.1.  Präparation der Cornea

Für die Permeationsstudien an isolierter Schweinecornea wurden Bulbi frisch geschlachteter Hausschweine ⁸ unterschiedlichen Alters von den Eberswalder Fleischwerken (Eberswalde-Britz) bzw. der Lehr- und Versuchsanstalt Teltow ⁹ (LVAT Ruhlsdorf, Groß Kreuz, D) verwendet.

Der Augapfel wurde makroskopisch auf corneale Integrität überprüft. Daraufhin wurde er zwischen Daumen und Mittelfinger der linken Hand fixiert (enganliegende, möglichst rutschfeste Handschuhe) und mit GBR bzw. SPP gespült. Anschließend wurde die Cornea mit einem Skalpell rund ausgeschnitten, sodass sich um das unbeschädigte Gewebe noch ein ca. 2-3 mm breiter Scleralring befand. Unter Vermeidung eines Austritts größerer Mengen an Kammerwasser oder Glaskörper wurde die ausgeschnittene Cornea mit einer chirurgischen Pinzette leicht angehoben, und ggf. noch verbliebene Scleralfasern wurden mit einer Präparationsschere durchtrennt. Die Cornea wurde anschließend vom unterseits anhaftenden Iris-Ziliarkörper abgezogen¹⁰.

VI.2.4.2.  Permeationsapparatur

Ein von unserer Arbeitsgruppe entwickeltes Rindercornea-Permeationsmodell (Innen-durchmesser d = 1,2 cm, Permeationsfläche A = 1,13 cm²) [208] aus Acrylglas^® (Grünberg Kunststoffe, Rödermark, D) (Abb. 35) wurde für die hier durchzuführenden Versuche an die kleinere Schweinecornea angepasst (d = 0,8 cm, A = 0,5 cm²) ¹¹. Mit diesem Modell konnte der Einfluss verschiedener Hilfsstoffe, z.B. der CDe, auf die cornealen Diffusions-eigenschaften des Wirkstoffs ermittelt werden.

	Abb. 35 : Permeationszelle

Das Modell wurde in Anlehnung an eine in der Arbeitsgruppe etablierte Gleichgewichts-dialysezelle [105] entworfen. Es wurde so modifiziert [207], dass die Auflagefläche für die Cornea auf der Donatorseite als zirkuläre Vertiefung und auf der Akzeptorseite als ringförmige Erhebung vorliegt (Abb. 35). Diese Konstruktion gewährleistet, dass die anatomisch bedingte Krümmung der Cornea erhalten bleibt.

Das Donatorkompartiment (1 ml) wurde mit Hilfe einer 10 ml-Glasspritze befüllt. Der Verschluss der Befüllungskanäle (hohle Metallstifte) erfolgte mit Stopfen über einen Siliconschlauchadapter. Die Akzeptorflüssigkeit (zumeist GBR oder SPP, 20 ml) wurde kontinuierlich mittels einer Schlauchpumpe (ISMATEC Mehrkanal-Schlauchpumpe IP-8, ISM941/3769-00002, Ismatec Laboratoriumstechnik GmbH, Wertheim-Mondfeld, D) umgepumpt.

	Abb. 36 : Permeationsapparatur für Schweinecornea und Nephrophan®

VI.2.4.3.  Versuchsdesign

Die Cornea der Schweineaugen wurde innerhalb von 2-3 h nach der Schlachtung der Tiere präpariert (Material und Methoden, VI.2.4.1). Dabei war insbesondere darauf zu achten, dass die Epithelschicht des Schweineauges nicht verletzt wurde. Die epitheliale Seite der Cornea war der Donatorseite zugewandt. Die beiden Zellhälften wurden mit drei Schraubenmuttern (467 Ni, Schrauben Scholz, Berlin, D) verschraubt. Die Cornea wurde so eingespannt, dass keine Faltenbildung entstand.

Die entsprechenden Lösungen (Material und Methoden, VI.2.4.4) wurden in die Donator-halbzellen gefüllt und die Akzeptorhalbzellen durch Silikonschläuche mit den im Wasserbad auf 33°C vortemperierten Pufferlösungen (Thermostat: T Lauda, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, D) verbunden. Die Zellen wurden während des gesamten Versuchs (300 min) ebenfalls im Wasserbad (33°C) temperiert. Es konnten maximal 6 Zellen parallel verwendet werden (Abb. 36).

Versuche mit synthetischer Membran erfolgten mit dem künstlichen Nierenschlauch Nephrophan^®, bestehend aus regenerierter Cellulose (Porengröße: 2,4 nm; Dicke: 14-15 µm, mit Sorbitol und Glycerol als Weichmacher imprägniert, Filmfabrik Wolfen, D), der vor der Verwendung ca. 1 h vorgewässert wurde. Anschließend wurden die vorbereiteten Membranen mit Hilfe einer gerundeten, feinen Schere auf eine Fläche (Durchmesser ca. 1,2 cm) zurecht geschnitten.

Vorbehandlung der Membran: Um eine mögliche direkte Beeinflussung der Schweinecornea durch einzelne Arzneistoffe oder Hilfsstoffe (z.B. CDe) zu klären, wurden Corneae in jeweils [Seite 133↓]2 ml der zu prüfenden Arzneistoff- oder Hilfsstofflösung für 30 min eingelegt, daraufhin mit einem isotonen Puffer pH 7,4 (SPP oder GBR) abgespült und in die Permeationszelle eingespannt. Nachfolgend wurde eine Lösung, wie unter Material und Methoden, VI.2.4, beschrieben, permeiert.

Die Membranvitalität von Schweinecornea wurde in unserer Arbeitsgruppe nach [202] untersucht. Zur Prüfung der Integrität und Vitalität der isolierten Gewebe wurde der Farbstoff Fluoreszein, der epitheliale Defekte der Cornea anfärbt, verwendet [148]. Die Inkubation frisch isolierter Corneae in Fluoreszeinlösung ergab punktuell gelbe Färbungen. Nach den fünfstündigen Permeationsexperimenten traten diese Verfärbungen großflächiger auf und wurden durch Betrachtung unter UV-Licht intensiviert [202].

Als weiteres Färbemittel wurde Trypanblau-Lösung (0,4%), die ausschließlich tote Zellen anfärbt, verwendet. Diese Ergebnisse waren mit denen unter Verwendung von Fluoreszein vergleichbar [202]. Direkt nach der Isolierung waren punktuell abgestorbene Zellen durch Blaufärbung zu erkennen, die nach der Permeation häufiger und großflächiger auftraten [202].

VI.2.4.4.  Herstellung der Lösungen

VI.2.4.4.1.  Arzneistofflösungen

Zur Herstellung der Testlösungen unmittelbar vor dem betreffenden Permeationsversuch [Seite 134↓]erfolgten die Einwaagen direkt in entsprechende kleine Maßkolben. Zu den jeweiligen Salzen der Betablocker (Tabelle 34), die alle leicht löslich in Wasser sind, wurde unter Rühren (Magnetrührer) GBR pH 7,4 zugegeben.

Tabelle 34 : 0,5%ige Betablocker-Lösungen für die cornealen Permeationsstudien in vitro (berechnet auf die jeweilige Base)

Für die Versuche zur Permeation von MEP in Anwesenheit ausgewählter CDe (1,85/ 3,7/ 10% α-CD; 4,7/ 11,7/ 20,0 % HP-α-CD) wurden Ansätze mit 0,5% MEP (berechnet auf die Base) hergestellt; das entspricht einer Einwaage von 0,118g Arzneistoff ad 10,0g GBR pH 7,4. Die jeweilig eingesetzten CDe wurden zusammen mit MEP direkt in einen 10 ml Maßkolben eingewogen. Danach wurde unter Rühren (Magnetrührer) die Pufferlösung in Anteilen (bis ca. ⅔ des Endvolumens) zugegeben. Erst nach vollständigem Auflösen der Festsubstanzen wurde mit GBR pH 7,4 bis zur Messmarke aufgefüllt und ca. 1 h weitergerührt.

MEP und P-Lösungen ohne und mit 12,5% HP-α-, HP-β- bzw. HP-γ-CD wurden untereinander verglichen bzw. in Kombination gebracht.Die Konzentration an MEP betrug 0,5% (bezogen auf die Base), diejenige von P 2%. Die Herstellung erfolgte wie zuvor beschrieben.

Mit dem schwerlöslichen PIN wurden 0,15%ige Lösungen hergestellt, indem HP-β-CD bzw. HP-γ-CD (12,5%) eingewogen und mit GBR pH 7,4 aufgefüllt wurde. Um klare Lösungen herzustellen, wurden die Zubereitungen mindestens 12 h bei Raumtemperatur gerührt (Magnetrührer). Bei einer PIN/HP-γ-CD-Lösung wurde 0,001% BAC (Normaltropfenzähler) zugesetzt. Die selbst hergestellten PIN-Lösungen wurden mit dem Fertigpräparat [Seite 135↓]Pindoptan^{® 12} 0,5% (Kanoldt Arzneimittel, Ismaning, D) verglichen. Da in letzterem PIN 0,5%ig vorliegt, erfolgte eine Verdünnung mit GBR pH 7,4 auf 0,15% PIN.

Für die Permeationsversuche mit den SEGRA ZK 216771 und ZK 247756 wurden die unter Material und Methoden, VI.2.7.1/VI.2.7.2, beschriebenen Formulierungen verwendet. Für ZK 216771 und ZK 247756 wurde eine Akzeptorlösung von SPP pH 7,0 verwendet.

Zur Membranpermeabilität von CDen wurden die jeweiligen CDe (α-CD: 3,7%ig, HP-α/β/γ-CD: 12,5%) direkt in einen 10 ml Maßkolben eingewogen, mit GBR pH 7,4 aufgefüllt und solange gerührt (Magnetrührer), bis eine vollkommen klare Lösung entstand.

VI.2.5.  Wirkstoffpenetration in isolierte Schweinecornea

Je Einzelversuch wurden 3 Corneae (gewogen, Einwaage als Feuchtgewicht) von frisch geschlachteten Schweinen in 5 ml einer Arzneistoffformulierung (0,25%ige ZK 247756-Mikroemulsion (ME-CD-SEGRA), Ergebnisse und Diskussion, V.3.1.1, Tabelle 32) 30, 60 und 120 min eingelegt und bei Raumtemperatur gerührt (Magnetrührer). Daraufhin wurden die Corneae mehrfach mit isotonem SPP pH 7,4 abgespült und mit Hilfe einer chirurgischen Schere so klein wie möglich geschnitten, in jeweils vorher tarierte Eppendorfgefäße überführt und mit 500 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) extrahiert.

Eine weitere Zerkleinerung (ca. 5 min) des Materials erfolgte unter Eiswasserkühlung mittels Ultraschallstab (Bandelin Sonoplus HD 70, Gerätetyp UW 70, Netzspannung 220-240 V, Cycle 70, Power kleiner MS 72/D; Bandelin electronic, Berlin, D). Für die anschließende Zentrifugation (Zentrifuge: Hermle ZK 380, Gosheim, D) bei 12000 U/min (ca. 15 min) zur Abtrennung des Extraktionsmittels vom Gewebe, wurden die Eppendorfgefäße mit den Corneae in toto in die Zentrifugengläser überführt. Der Überstand wurde abpipettiert und der Arzneistoffgehalt durch HPLC (VI.2.2.4) quantitativ bestimmt.

VI.2.6.  Verteilung von Mycophenolatmofetil am Kaninchenauge

VI.2.6.1.  Testlösungen

Die am Kaninchenauge getesteten Lösungen bzw. Suspensionen (Tabelle 35) wurden kurz vor der Anwendung unter aseptischen Bedingungen („Laminar-airflow“) hergestellt. Die Feststoffe MMF, MPA, HP-β-CD und Natriumchlorid (NaCl) wurden direkt in ein strahlensterilisiertes Augentropfen-gefäß eingewogen. Dann wurde mit sterilfiltriertem (Sterilfilter: 0,22 µm, Celluloseacetat) SPP pH 7,4 (Lösungsmittel: Wasser für Injektionszwecke) aufgefüllt. Die zunächst entstandenen Suspensionen wurden unter Standardbedingungen autoklaviert (121°C, 2·10⁵ Pa, 15 min), wodurch eine vollständige Auflösung von MMF bzw. MPA in den HP-β-CD-haltigen Formulierungen erfolgte. Gleichzeitig konnte hierdurch die nach dem Europäischen Arzneibuch [54] geforderte Sterilität der ophthalmologischen Zubereitungen erzielt werden.

Wie bereits unter, V.2, erwähnt, führte der Autoklavierungsprozess zu einer Teilhydrolyse des Prodrugs MMF zu MPA. So enthielt die frisch hergestellte MMF/CD-Lösung nach Autoklavierung 48,50 ± 5,48 % MPA; die MMF-Suspension dagegen 10,35 ± 1,35% MPA.

Die MPA/CD-Lösung blieb nach Autoklavierung 100%ig stabil, d.h. es konnten durch HPLC keine Abbauprodukte der MPA erkannt werden. Die Konzentrationen an MMF bzw. an MPA in den autoklavierten Lösungen (MMF/CD; MMF/SP) waren bei Lagerung im Kühlschrank mindestens 2 Wochen konstant. Die für die In-vivo-Versuche verwendeten MMF/MPA-Lösungen (Tabelle 35) wurden am Versuchstag oder am Tag zuvor hergestellt und im Kühlschrank gelagert.

Die MMF-Suspension (MMF/SP) wurde ohne Viskositätserhöher oder andere Hilfsstoffe zur Verbesserung ihrer physikalischen Stabilität, der Aufschüttelbarkeit des Sediments und/oder zur verbesserten Dosierungsgenauigkeit hergestellt, um den Vergleich zur MMF/CD-Lösung zu gewährleisten. Demzufolge war es notwendig, die Suspension unmittelbar vor der Applikation am Kaninchenauge zur gleichmäßigen Verteilung des Wirkstoffs 10 min in ein Ultraschallbad zu stellen. Die applizierte MMF/SP wies gemäß der im Europäischen Arzneibuch geforderten Teilchengröße eine Partikelgröße von < 25 µm (Mikroskop) auf. Die Einstellung der Tonizität erfolgte mit NaCl. Der osmotische Druck (Knauer Osmometer, Berlin, D) wurde zu 311-324 mOsmol/kg bestimmt, so dass die Lösungen schwach hyperton [Seite 137↓]waren. Zur In-vivo-Testung gelangten die in Tabelle 35 aufgeführten Formulierungen:

Tabelle 35 : Rezepturen für okulare MMF/MPA-Formulierungen

CD: Lösung, die 10% Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin enthält, SP: Suspension
10,10 g MMF (M_r: 433,50) entspricht 0,074 g MPA (M_r = 320,35)

VI.2.6.2.  Tierversuche (Kaninchen)

Die tierexperimentellen Versuche am Kaninchen wurden ordnungsgemäß beantragt und von der zuständigen Behörde des Landes Berlins genehmigt.

Es wurden insgesamt 32 Kaninchen (pigmentierte Chinchilla Bastard, 4-6 Wochen alt; 3,0-3,5 kg, Charles River Deutschland GmbH, Kißlegg/Sulzfeld, D) verwendet. Die Tierhaltung entsprach den Anforderungen des Deutschen Tierschutzgesetzes (12h-Tag/Nacht-Rhythmus, freier Zugang zu Wasser und Futter etc.). Die Tierversuche wurden entsprechend den Vorgaben der ARVO (The Association for Research in Vision and Ophthalmology) durchgeführt.

Eine „loading dose“ von 5 x 50 µl der jeweiligen Augentropfenformulierung (MMF/SP, MMF/CD, MPA/CD) wurde in einminütigen Abständen in den Bindehautsack des jeweils rechten Auges appliziert und anschließend leicht einmassiert. Das linke Auge des Versuchstiers diente als Kontrolle und wurde in der gleichen Weise exzidiert und aufgearbeitet. Für die Formulierungen MMF/CD und MMF/SP wurden Gewebeproben nach 30, 60 und 240 min entnommen, für die Formulierung MPA/CD nach 30 und 60 min. Pro Kontrollzeit wurden vier Kaninchen eingesetzt.

Die Kaninchen wurden i.m. mit Rompun^® 2% (Bayer, Leverkusen, D; Wirkstoff: Xylazin-hydrochlorid) in Vollnarkose versetzt und nach 30, 60 bzw. 240 min mit einer intrakardialen [Seite 138↓]Injektion von Kaliumchlorid getötet. Unmittelbar danach wurden ca. 5 ml Serum entnommen. Das Kammerwasser beider Augen (jeweils ca. 200 µl) wurde durch Vorderkammerpunktion mit einer Insulinspritze aufgezogen. Danach erfolgte das Herauspräparieren der Conjunctiva und Cornea mit Hilfe einer chirurgischen Pinzette bzw. Schere. Der Glaskörper wurde mit einer 2 ml-Spritze aufgezogen; der Iris-Ziliarkörper mit einer Pinzette isoliert. Zuletzt wurde die Sclera vollständig herauspräpariert und mittels Rasierklinge oder Skalpell auf einem Objektträger von Resten benachbarter Gewebe befreit.

Das Blut wurde sofort zentrifugiert und so von seinen festen Bestandteilen getrennt. Der Überstand wurde abgenommen und in Plastikröhrchen überführt. Die okularen Gewebe-flüssigkeiten (Kammerwasser, Glaskörper) und festen Gewebe (Cornea, Sclera, Iris-Ziliarkörper, Conjunctiva) wurden in tarierte Eppendorfgefäße überführt und zur Ermittlung ihres Feuchtgewichts gewogen (Analysenwaage Sartorius). Bis zur weiteren Aufarbeitung wurden alle Proben bei -84° C tiefgefroren (GFL 6380-Gefriertruhe, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, D).

VI.2.6.3.  Gewebeaufarbeitung

Die Aufarbeitung der okularen Gewebe erfolgte in Anlehnung an [207], teilweise modifiziert bzw. weiterentwickelt. Es standen 4 Kaninchen für Vorversuche zur Verfügung.

Die Gehaltsbestimmung von MMF und MPA in den Kammerwasserproben erfolgte ohne weitere Aufarbeitung direkt mittels HPLC (VI.2.2.3).

VI.2.6.3.2.  Cornea / Sclera

Cornea bzw. Sclera wurden mit Hilfe einer chirurgischen Schere (Aesculap BC 100) in sehr kleine Teile geschnitten, in 1000 µl einer Mischung von SPP pH 7,4 und DMSO (3+7) aufgenommen und mit einem Ultraschallstab (Bandelin Sonoplus HD 70, Gerätetyp UW 70, Netzspannung 220-240 V, Cycle 70, Power kleiner MS 72/D; Bandelin electronic, Berlin, D) direkt im Eppendorfgefäß unter Eiswasserkühlung homogenisiert. Danach wurden die Eppendorfgefäße 15 min in Zentrifugengläsern bei 12000 U/min zentrifugiert (Zentrifuge: Hermle ZK 380, Gosheim, D). Der Überstand wurde abpipettiert und der Wirkstoffgehalt direkt durch HPLC quantitativ bestimmt.

1000 µl der Mischung (3+7) von SPP pH 7,4 und DMSO wurden jeder Gewebeprobe von Conjunctiva bzw. Iris-Ziliarkörper zugesetzt und mit Hilfe des Ultraschallstabs unter Eiswasserkühlung homogenisiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog zu VI.2.6.3.2 (Cornea/Sclera).

1000/3000 µl Tertiär-butyl-methyl-ether (TBME) wurden 500/1000 µl Glaskörper/Plasma zugesetzt und 1 h mittels Magnetrührer gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend abgetrennt und durch vorsichtiges Erhitzen (elektrische Heizplatte) unter Rühren abgedampft. Der Extraktionsvorgang mit TBME wurde mindestens einmal wiederholt. Der Rückstand wurde in SPP pH 7,4 aufgenommen und der HPLC zugeführt.

Die für ZK 216771 entwickelte Rezeptur (Ergebnisse und Diskussion, V.3.1.1, Tabelle 27) wurde wie folgt hergestellt:

ZK 216771 wurde im Verhältnis 1:8 unter Rühren (Magnetrührer) bis zum vollständigen Auflösen in Ethanol gelöst. Danach erfolgte die Zugabe von 40 Teilen HP-γ-CD unter mindestens 10minütigem Rühren. Die Wassermenge (352 Teile) wurde in Anteilen nach und nach zugesetzt. Die so entstandene Lösung wies einen pH von 6,3 auf. Die Stabilität wurde nach 5 Wochen (Lagerung im Kühlschrank) bestimmt, der Gehalt betrug 91,6%.

Im Rahmen der Rezepturentwicklung für ZK 247756-Rezeptur (Ergebnisse und Diskussion, V.3.2.1) wurden die in Tabelle 36 aufgeführten Gemischten Mizellen auf ihre Eignung geprüft.

Die Herstellung der Mikroemulsion (ME, Ergebnisse und Diskussion, V.3.2.1, Tabelle 30) erfolgte, indem Rizinusöl, Cremophor^® RH 40 und Macrogol in ein tariertes Becherglas eingewogen wurden und unter Erwärmen zuerst mit einem Glasstab manuell, dann mit einem [Seite 140↓]Magnetrührer gerührt wurden. Sobald die Bestandteile homogen vermischt waren, wurde das Wasser in Anteilen (unter Rühren, Erwärmen auf ca. 50°C) zugegeben. Die entstandene Mikroemulsion (ME-CD) wurde unter Druck sterilfiltriert (150 ml-EASY FLOW^TM-Filter, 0,22 µm Celluloseacetatmembran, Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ., USA) und in sterilen Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung im Kühlschrank aufbewahrt.

Tabelle 36 : Zusammensetzung der Gemischten Mizellen; nach [182]

Die SEGRA-haltige Mikroemulsion (ME-CD-SEGRA) zur okularen Anwendung (Ergebnisse und Diskussion, V.3.2.1, Tabelle 32) wurde wie folgt hergestellt:

ZK 247756 und HP-γ-CD wurden mit ca. 2-3 g der sterilen Mikroemulsion ME-CD zuerst 5 min bei RT auf einer niedrigen Stufe mittels Magnetrührer gerührt. Danach wurde die restliche Mikroemulsion in Anteilen zugegeben, die Rührgeschwindigkeit langsam erhöht und schließlich auf Höchststufe ca. 30 min weitergerührt, bis eine klare Zubereitung entstand und makroskopisch keine Teilchen von ZK 247756 mehr zu erkennen waren. Zuletzt wurde die fertige Formulierung in ein strahlensterilisiertes Augentropfengefäß (Firma Remy&Geiser, Anhausen, D) direkt steril filtriert (Sterilfilter: 0,22 µm, Celluloseacetat).

Die Keratoplastik wurde an 18 weiblichen Lewis (LEW)-Ratten (Charles River, Kisslegg, D) durchgeführt. Das Gewicht der Ratten betrug 200-250g und der Hornhautdurchmesser durchschnittlich 3,5 mm. Diese Tiere erhielten Transplantate von HLA-Klasse I/II-inkompatiblen DA-Spendertieren. Diese Stämme unterscheiden sich grundlegend in ihrem MHC (Major histocompatibility complex), d.h. die immunologische Barriere ist hoch.

Alle Tiere wurden mit Standardlaborfutter ernährt und hatten freien Zugang zu Leitungswasser.

Die Tiere wurden im Einklang mit den Vorschriften („Guide for the Care and Use of Laboratory animals“) des National Institute of Health (USA) und den Richtlinien der Berliner Senatsverwaltung (D) für die Tierhaltung zu Forschungszwecken gehalten.

Die Spendertiere wurden unter Narkose durch eine Überdosis Pentobarbital (Narcoren^TM, Rhone Merieux, Laupheim, D) getötet. Vor dem chirurgischen Eingriff wurden die Pupillen der Spenderaugen durch 1%ige Atropinsulfataugentropfen (Ciba Vision, Wefling, D) geweitet. Die Pupillenweitung wurde durchgeführt, um eine durch die chirurgische Intervention induzierte Schädigung der Iris sowie Fibrinschleier (Synechien) bei flacher Vorderkammer zu vermeiden. 0,05 ml einer Lösung, die 1 mg/ml Epinephrin enthielt, wurde subconjunctival injiziert, um eine maximale Weitung der Iris aufrecht zu erhalten.

Die Cornea (3,5 mm) des Spendertiers wurde mit Hilfe eines Trepans, gebogenen Castroviejo-Scheren und eines Operationsmikroskops unter sterilen Bedingungen auf einem sterilen Tropfen 1%iger Methylcelluloselösung auf das Empfängertier übertragen. Die Narkose für das Empfängertier erfolgte durch eine Narcoren^TM-Injektion (2,5-5,0 mg/kg).

Beim Eröffnen der Vorderkammer wurde eine viskoelastische Substanz (Healon^TM, Pharmacia, Erlangen, D) instilliert, um die Form der Vorderkammer wiederherzustellen und eine Schädigung von Linse oder Iris zu vermeiden. Nach Wundverschluss wurde die optimale Adaptation der Wundränder mit einer feinen Kanüle oder Pinzette kontrolliert, die Vorderkammer wurde durch die Injektion von physiologischer Kochsalzlösung vertieft.

Eine antibiotische Augensalbe (Ofloxacin, Floxal^TM, Dr. Mann Pharma GmbH, Berlin, D) wurde sofort nach der Hornhauttransplantation sowie in den folgenden Wochen appliziert. Mit der nichttransplantierten Kontrollgruppe wurde analog verfahren.

VI.2.7.3.4.  Topische Behandlung der Ratten

42 Tiere wurden einer orthotopen¹³ Hornhauttransplantation unterzogen. Syngene ¹⁴ Transplantate in 12 LEW-Empfängertieren dienten als Kontrolle für eventuell auftretende technische Probleme (Tabelle 37).

Allogene¹⁵ Transplantate in 18 LEW-Empfängertieren, die DA-Transplantate erhielten, wurden randomisiert einer topischen Behandlung nach Tabelle 37 unterzogen.

Tabelle 37 : Versuchsgruppen bei lokaler Therapie mit ZK 247756 nach Keratoplastik

¹ME-CD: Mikroemulsion mit HP-γ-CD

Die Behandlung wurde am Tag der Transplantation mit einer „loading-dose“ von 5 x 20 µl begonnen. Daraufhin erfolgte 5 x täglich über einen Zeitraum von 35 Tagen die Applikation von 20 µl der ZK 247756-Augentropfen (Gruppe 4, Tabelle 37) in den rechten Bindehautsack.

VI.2.7.3.5.  Beurteilung der Transplantate

Die Beurteilung der Transplantate erfolgte nach etablierten Beurteilungskriterien, basierend auf Hornhauttrübung und Hornhautödem [159, 164]. Die Transplantate wurden dreimal [Seite 143↓]täglich innerhalb der ersten postoperativen Woche unter einem Operationsmikroskop untersucht, danach bis zum Versuchsende einmal am Tag.

Transplantate wurden auf einer Skala von 0-4 hinsichtlich Durchsichtigkeit/ Undurchsichtigkeit bzw. Ödemen bewertet. Die Evaluierung der cornealen Klarheit erfolgte folgendermaßen: 0 = klares Transplantat; 1 = leicht trüb; 2 = zunehmende Trübung (deutlich sichtbare Irisstruktur); 3 = Trübung (Vorderkammerstrukturen schlecht sichtbar); 4 = trübes, undurchsichtiges Transplantat (Vorderkammerstrukturen nicht mehr sichtbar). Ödeme wurden nach folgenden Kriterien eingestuft: 0 = kein Ödem; 1 = leichte stromale Schwellung des Transplantats; 2 = diffuses stromales Ödem; 3 = diffuses stromales und epitheliales Ödem; 4 = bullöse Keratopathie. Ein „Abstoßungswert“ [159], basierend auf der Summe der einzelnen Beurteilungskriterien, wurde an jedem postoperativen Tag berechnet. Corneale Transplantate wurden als „abgestoßen“ eingestuft, sobald moderate bzw. schwerwiegende Veränderungen (s.o.) auftraten.

VI.2.7.3.6.  Bestimmung der immunologischen Parameter

Um das Cytokinmuster im cornealen Transplantat zu bestimmen, wurde an 12 zusätzlichen Ratten eine Keratoplastik durchgeführt. Am 7. postoperativen Tag wurden die Transplantate herauspräpariert und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Daraufhin erfolgte die Isolierung der RNA und die Analyse der mRNA-Expression durch „real-time-polymerase-chain-reaction“ (RT-PCR, Polymerase-Kettenreaktion) (ABI Prism 7700 Sequence Detection System „Taqman“; PE Applied Biosystems, Weiterstadt, D). Die mRNA jedes einzelnen Transplantats wurde in cDNA transkribiert und letztere dann mittels RT-PCR auf Cytokingenexpression untersucht.

VI.2.8.  Raster-Elektronenmikroskopie (REM)¹⁶

Die Elektronenmikroskopie ermöglicht zwar wesentlich höhere Auflösungen als die Lichtmikroskopie, erfordert aber das Arbeiten im Vakuum und einen größeren Aufwand bei [Seite 144↓]der Probenpräparation, da viele biologische Proben unbehandelt zu kontrastschwachen Bildern führen [228].

Das Material für die REM sollte eine hohe Vakuumbeständigkeit haben, sich unter Elektronenbeschuss nicht verändern, keine störenden Aufladungen besitzen und über eine saubere Oberfläche verfügen [228].

Es ist entscheidend, dass die Probe während der Präparation möglichst wenig beschädigt wird, weil sonst Präparationsartefakte auftreten können, die vom Betrachter als natürliche Strukturen fehlgedeutet werden können [228].

Um Untersuchungen über die corneale Verträglichkeit verschiedener Präparate durchzuführen, wurden die einzelnen Proben wie folgt gewonnen:

Aus den Schweineaugen^E frisch geschlachteter Tiere wurden die Corneae etwa 2-3 h nach der Schlachtung herauspräpariert (s. VI.2.4.1) und 30 min einzeln in jeweils 5 ml CD-Lösung (1,85/ 3,7/ 10,0 α-CD; 4,7/ 11,7% HP-α-CD; 12,5% HP-β-CD) eingelegt.

Anschließend wurden die Corneae in 2,5%igem phosphatgepuffertem (SPP pH 7,4) Glutaraldehyd (Serva, Heidelberg, D) über Nacht fixiert. Glutaraldehyd ist für die Vernetzung der Proteine im Gewebe verantwortlich und stabilisiert so die Hornhäute. Anschließend wurden die Gewebe in 2%igem Osmiumtetroxid (Paesel und Lorei GmbH & Co., Hanau, D) gewaschen und nachfixiert. Dieses Reagenz reagiert mit Doppelbindungen und vernetzt z.B. die Phospholipide von Membranen, wobei es selbst reduziert wird und dadurch das Gewebe schwarz bis schwarzbraun färbt. Auf diese Weise wirkt es gleichzeitig als Stabilisierungs- und Kontrastmittel. Nach dem Auswaschen mit Wasser erfolgte eine Entwässerung mit einer Alkoholreihe aus 30, 50, 70, 80, 90 und 96%igem Ethanol (BfB, Offenbach am Main, D). Jeder Schritt dauerte 10 min. Bei der Entwässerung wurde darauf geachtet, dass die Proben nicht mit Luft in Berührung kamen.

Der Alkohol wurde mit Hexamethyldisilazan (HMDS, Sigma, Steinheim, D) vollständig entfernt und somit gleichzeitig eine oberflächenspannungsfreie Trocknung vorbereitet.

Das Trocknen (Lufttrocknung) bzw. der Phasenübergang des Wassers von flüssig nach gasförmig, ist der kritischste Schritt der Aufarbeitung. Aufgrund der hohen Oberflächen-spannung entstehen hierbei leicht Schäden an den Proben, weshalb diese zuvor mit HMDS [Seite 145↓]entwässert wurden. Dann wurden die luftgetrockneten Proben auf einen Präparatehalter aufgebracht und mit Gold „besputtet“ (Hochvakuum-Kleinbeschichtungsanlage MED 020, BAL-TEC, Schalksmühle, D).

Da biologische Materialien eine sehr geringe Leitfähigkeit und eine extrem niedrige Sekundärelektronendichte haben, muss eine möglichst dünne Metallschicht auf die Probe gebracht werden, um möglichst genaue Informationen über das Material zu erhalten. Das Besputtern ist ein spezielles Verfahren, um die Präparate möglichst gleichmäßig mit Gold zu beschichten. Dabei wird eine Goldelektrode mit Ionen beschossen, und feinste Partikel werden auf das Präparat gebracht. Die so vorbereitete Probe wurde in einem Rasterelekronenmikroskop (DSM 982, Gemini, Zeiss, D) bei geeigneten Vergrößerungen betrachtet und fotografiert.

Die tabellierten Werte bzw. die Punkte oder Balken in den Abbildungen geben die Mittelwerte wieder; die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar, wobei ein bestimmter Stichprobenumfang (n) zugrunde gelegt wird [50]. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Mittelwerten einzelner Versuchsreihen wurde mittels zweiseitigem t-Test nach Student oder einem Anova-Test bestimmt [66].

VI.2.9.1.  Betarezeptorenblocker / Mycophenolatmofetil

Um die Varianzen zweier Gruppen zu vergleichen, wurde zunächst ein F-Test durchgeführt. Mit dem F-Test konnte eine Varianzenhomogenität oder eine Varianzeninhomogenität angenommen werden. Abhängig von diesen Ergebnissen wurde ein zweiseitiger t-Test für homogene bzw. inhomogene Varianzen durchgeführt. Signifikanzen wurden für eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p < 0,05) bestimmt [66].

Ein einfaktorieller (Single-Factor-) Anova (Analysis of variance = Varianzanalyse)-Test wurde teilweise zusätzlich durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Mittelwerte von zwei oder mehreren Proben als gleichwertig zu betrachten sind. Diese Methode stellt eine Erweiterung der Tests dar, die nur zwei Mittelwerte vergleichen, wie z.B. der t-Test. Anova vergleicht die Mittelwerte zwischen verschiedenen Gruppen und innerhalb der einzelnen Gruppen. [Seite 146↓]Signifikanzen wurden für eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p < 0,05) bestimmt.

Ein zweifaktorieller (Two-factor-) Anova-Test entspricht dem einfaktoriellen mit einer zusätzlichen Variablen. Dieser Test ist in der Lage, 3 Effekte aufzuzeigen, wohingegen der einfaktorielle Anova-Test nur einen Effekt aufzeigt.

Es wurde die Statistik-Software von Microsoft Excel verwendet.

Transplantatüberlebenszeiten wurden mit Hilfe einer „Mantel Haenszel-Analyse [135] verglichen. Jedes hornhauttransplantierte Tier wurde in die Auswertung mit einbezogen. Tiere, die vorzeitig starben bzw. eine Komplikation entwickelten, konnten nicht in die Statistik einbezogen werden.

Zusätzlich wurden die Überlebenszeiten der Rattentransplantate durch einen einfaktoriellen Anova-Test (VI.2.9.1) verglichen. Die Analyse der RT-PCR-Daten erfolgte mittels eines Mann-Whitney-u-Tests [50] (Test bei nicht normalverteilten Werten).

Fußnoten und Endnoten

⁴ An dieser Stelle sei der Schering AG, Berlin; der Firma Astra, Wedel; Alcon Pharma, Freiburg und Ciba-Geigy, Basel für die kostenlose Überlassung der Betablocker-Substanzproben gedankt.

⁵ Der Firma Roche Bioscience, Palo Alto, USA, danke ich für die kostenlose Überlassung von Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure.

⁶ Herrn Dr. Jens Moldenhauer, Wacker-Chemie, Burghausen, sei hiermit ganz besonders für die unkomplizierte und immer schnelle Lieferung der Cyclodextrin-Gratisproben gedankt.

⁷ Herrn Dr. Burghard Ziemer und Frau Petra Neubauer, Institut für Chemie, sei an dieser Stelle für die freundliche Kooperation bezüglich der Pulveranalyse durch Röntgendiffraktometrie gedankt.

⁸ Die Schweinecorneae wurden zunächst von den Eberswalder Fleischwerken bezogen. Die Tiere wurden dort nach der Schlachtung abgeflammt, um die Borsten zu entfernen, und anschließend durch heißen Wasserdampf („Überbrühen“) geleitet (Fließband). Diese Manipulation führte dazu, dass viele Augen beschädigt waren, was am Epithel oder durch Trübung der Augen zu erkennen war (mögliche Denaturierung der Proteine). Für die von uns durchgeführten Versuche wurden ausschließlich nach intensiver makroskopischer Begutachtung als unbeschädigt erkannte Augen verwendet. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass die Hitzeprozedur zu Veränderungen an der Cornea führte, die sich auf das Permeationsverhalten von Arznei- und Hilfsstoffen ausgewirkt haben könnten. Nach der Schließung der Eberswalder Fleischwerke 2001 konnten Augen von der Lehr- und Versuchsanstalt (LVAT) Ruhlsdorf, Teltow, bezogen werden. Da dies nur ein kleiner Schlachthof ist, der anderen Zwecken dient als der fabrikmäßigen Schlachtung von Tieren, erfolgten keine „denaturierenden Maßnahmen“ (Überbrühen). Fast jedes von dort erworbene Auge war aufgrund eines optisch als unversehrt erkannten Epithels verwendbar. Bei den einzelnen Versuchen sind die aus Eberswalde stammenden Augen bzw. die isolierte Cornea mit ^E gekennzeichnet, die aus Teltow stammenden mit ^T.

⁹ Für die unkomplizierte Beschaffung von Schweineaugen möchte ich mich bei Frau Uwarow (LVAT Ruhlsdorf, Groß Kreuz) bedanken.

¹⁰ Frau Dr. M. Scholz danke ich für die Einweisung in die Präparationstechnik von Schweineaugen.

¹¹ Herrn G. Glowacz, Institut für Chemie, danke ich an dieser Stelle für die Fertigung der Permeationszellen.

¹² Pindoptan^®: 1 ml Lösung enthält: 5,0 mg Pindolol; Benzalkoniumchlorid (als Konservierungsmittel) 0,1 mg, Edetinsäure-Dinatriumsalz, Natriumchlorid, Natriumhydroxid und Salzsäure zur pH-Einstellung, Wasser für Injektionszwecke (gemessener pH-Wert: 6,6-6,7)

¹³ Orthotope Transplantation: Das transplantierte Organ wird anstelle des entfernten eigenen Organs implantiert.

¹⁴ Syngen: Transplantation zwischen genetisch identischen Individuen (eineiige Zwillinge, Inzuchtstämme verschiedener Tiere)

¹⁵ Allogen: Transplantation zwischen Individuen der gleichen Spezies (Artgleichheit) [251]

¹⁶ An dieser Stelle danke ich Frau A. Sänger, Augenklinik, Charité Virchow-Klinikum, für die freundliche Unterstützung bei der Vorbereitung der REM-Proben bzw. der Anfertigung von REM-Aufnahmen sowie deren Auswertung.