Ergebnisse und Diskussion

Betarezeptorenblocker

Ziel der nachfolgenden Studie war es, das Permeationsverhalten der drei jeweils strukturell ähnlichen Betarezeptorenblocker-Paare (Pindolol/Mepindolol, Metoprolol/Betaxolol, Alprenolol/Oxprenolol) durch isolierte Schweinecornea vergleichend zu untersuchen.

Diese β-Rezeptorenblocker sind β-Sympatholytika, die sich chemisch vom Aryloxy-propanolamin ableiten. Sie unterscheiden sich durch ihren Substituenten (Theoretische Grundlagen, III.3.2.1) am C 1 des Isopropylamino-2-propanols, d.h. an der 1-Hydroxylfunktion, die mit einem carbo- oder heterocyclischen Aromaten verethert ist.

Dabei liegen im Pindolol und Mepindolol Substanzpaare mit einem Indolylsubstituenten vor. Metoprolol und Betaxolol leiten sich vom β-Methoxyethylphenylether des pharmakologischen Grundkörpers (Theoretische Grundlagen, III.3.2.1) ab. Alprenolol trägt einen o-Allyl-phenylrest, während Oxprenolol eine o-Allylethergruppierung am Phenyl-substituenten besitzt.

Darüber hinaus sollte der Einfluss verschiedener CDe (α-CD, HP-α-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD) auf die In-vitro-Permeation eines ausgewählten Betablockers (Mepindololsulfat (MEP)) getestet werden.

Am Pindolol (PIN), das als einziger Ausgangsstoff als schwerlösliche Base vorlag (Untersuchungen, IV.1., Tabelle 11), wurde die Komplexbildungstendenz mit den nativen CDen (α-, β-, und γ-CD), deren hydroxypropylierten Derivaten bzw. mit α-CD-Polymer (α-CD-Pol) sowie mit carboxymethyliertem α-CD-Polymer (CM-α-CD-Pol) in wässriger Lösung studiert. Der nachfolgenden Untersuchung des Permeationsverhaltens ausgewählter wässriger PIN/CD-Lösungen lag die Idee zugrunde, die hydrophobe PIN-Base, welche biologische Membranen erwartungsgemäß besser durchdringt als ein entsprechendes hydrophiles Salz (vgl. Pilocarpin-HCl und Pilocarpin-Base [143, 202]), durch einen CD-Einschluss bei neutralem pH-Wert in wässriger Lösung zu halten. Verglichen wurden diese Komplexlösungen mit dem Handelspräparat Pindoptan^® 0,5%, das 0,5% PIN enthält.

In-vitro-Permeation aus Pufferlösungen

Die wasserlöslichen Salze der Betablocker (vgl. Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle 4) wurden in 0,5%iger Konzentration (berechnet als Base) in GBR pH 7,4 gelöst und hinsichtlich ihres Permeationsverhaltens durch isolierte Schweinecornea über fünf Stunden verglichen (Material und Methoden, VI.2.4). PIN konnte aufgrund seiner Schwerlöslichkeit nicht einbezogen werden.

Tabelle 12 gibt die Permeabilitätskoeffizienten (P_eff) für die als Salz vorliegenden wasser-löslichen Betablocker sowie die nach 300 min prozentual freigesetzte Arzneistoffmenge Q₃₀₀ wieder.

t_lag: lag time (٪: keine t_lag); Mittelwert ± SD (n = 5-10); (*) signifikanter Unterschied (Single-Factor-Anova) zu Betaxolol-HCl, Metoprololtartrat, Mepindololsulfat für p < 0,05
Arzneistoff

P_eff [10^-6cm/s]

Q₃₀₀ [%]

Betaxolol-HCl

2,84 ± 0,63
٪

2,74 ± 0,86

Metoprololtartrat

2,77 ± 0,31
٪

2,25 ± 0,41

Mepindololsulfat

2,52 ± 0,54
٪

2,09 ± 0,50

Alprenolol-HCl

0,87* ± 0,27

t_lag =120 min

0,77* ± 0,33

Oxprenolol-HCl

0,27* ± 0,04

t_lag = 120 min

0,42* ± 0,11

Tabelle 12 : Effektive Permeabilitätskoeffizienten (Peff) und nach 300 min kumulativ freigesetzte Arzneistoffmenge (Q300) für Betablocker (SchweinecorneaE)

Betaxolol, Metoprolol und Mepindolol unterscheiden sich weder im P_eff noch in ihrer am Versuchsende kumulativ freigesetzten Gesamtkonzentration Q₃₀₀ signifikant (p < 0,05).

Bei pH 7,4 liegen die Substanzen fast vollständig als freie Base vor. Die unterschiedlichen Anionen (Chlorid, Tartrat bzw. Sulfat) nehmen offensichtlich keinen nennenswerten Einfluss auf die Wirkstoffpermeation. Da von molekularen Konzentrationen, bezogen auf die jeweilige Base, ausgegangen wurde und sich die Molmassen der Wirkstoffbasen lediglich geringfügig unterscheiden (vgl. Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle 5), war auch kein wesentlich abweichendes Diffusionsverhalten zu erwarten.

Ein weiterer Aspekt ist der Molekülradius, der für Betaxolol 5,0 und für Metoprolol 4,8 Å [168, 238] beträgt. Der Porenradius von Schweinecornea (Epithel) wird mit < 3 nm [70, 226] angegeben, so dass weder Molekülgröße noch -masse ein Limit für einen konvektiven Transport sein sollten.

Nimmt man allerdings die in der Literatur referierten Verteilungskoeffizienten (V_K) dieser drei Verbindungen (vgl. Tabelle 5) ins Visier, so fällt der höhere Wert des Betaxolols bei pH 7,4 auf (3,9 gegenüber 1,58 für Metoprolol und 0,79 für Mepindolol). Dieser deutlich stärker apolare Charakter ließe einen Beitrag an passiver Diffusion erwarten, wofür die Werte in Tabelle 12 aber nicht sprechen.

Alprenolol und Oxprenolol permeierten in einem wesentlich geringeren Ausmaß durch isolierte Schweinecornea^E als die drei zuvor genannten β-Blocker (Tabelle 12). Sowohl die P_eff als auch die nach 300 min prozentual freigesetzte Arzneistoffmenge unterscheiden sich signifikant zu Betaxolol, Metoprolol und Mepindolol. Die für Alprenolol und Oxprenolol ermittelten Werte differieren jedoch untereinander nicht signifikant. Auffallend ist die ermittelte „lag time“ beider Wirkstoffe von 120 min.

Schoenwald et al. [200] untersuchten das Permeationsverhalten verschiedener β-Blocker durch Kaninchencornea in vitro nach abnehmender Lipophilie (V_K: Penbutolol > Bufuralol > Bevantolol = Propranolol = Levobunolol, Oxprenolol, Timolol, Metoprolol, Acebutolol, Nadolol, Sotalol, Atenolol). Sie konnten zeigen, dass der P_eff der Wirkstoffe unterschiedlicher Lipophilie mit steigendem V_K (Octanol/Sørenson-Phosphatpuffer pH 7,65) in der Regel zunimmt.

Die Lipophilie von Alprenolol ist nach den in Tabelle 5 (Theoretische Grundlagen, III.3.2.1) aufgeführten Literaturdaten am höchsten (V_K bei pH 7,4: Alprenolol (21,88) > Oxprenolol (5,25) > Betaxolol (3,9) > Metoprolol (1,58) > Pindolol (1,20) > Mepindolol (0,79)).

An der chemischen Struktur der beiden strukturverwandten Verbindungen Alprenolol und Oxprenolol (Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle 4) fällt auf, dass sich die Substituenten am Aromaten (Indolyl- bzw. Phenyl-) in ortho-Stellung befinden, wohingegen sie bei Metoprolol und Betaxolol eine para-Stellung aufweisen. Das am wenigsten permeable Oxprenolol verfügt im Vergleich zu Alprenolol darüber hinaus über eine Ethergruppierung zwischen Phenyl- und Allylrest, was die Hydrophilie der Verbindung erhöht (vgl. V_K). Andererseits könnten die freien Elektronenpaare am Sauerstoff aber auch für intra- und intermolekulare Wechselwirkungen prädestiniert sein, was möglicherweise zu großen und unflexiblen Molekülverbänden führen kann. Sofern auch für das o-substituierte Alprenolol derartige Assoziatbildungen denkbar wären, ließe sich die verminderte Freisetzungsrate für beide Moleküle erklären. Dieses Phänomen könnte einen Ansatz für weitere Untersuchungen darstellen.

Dissoziationsgrad und Molekülgröße kommen auch für die Alprenolol- und Oxprenolol-Permeation nicht als Determinanten in Betracht. Beide Wirkstoffe lagen beim Versuchs-pH von 7,4 fast vollständig als Base vor (vgl. pK_a, Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle5). Der für beide Moleküle gefundene Radius von 4,7 Å [168, 238] ist mit den für Betaxolol (5,0 Å) und Metoprolol (4,8 Å) zitierten Werten praktisch identisch.

Prausnitz und Noonan [168] führten eine Literaturanalyse bezüglich des okularen Permeationsverhaltens verschiedener Arzneistoffe durch isolierte Kaninchencornea durch. Die referierten P_eff für Betaxolol, Metoprolol, Alprenolol und Oxprenolol unterscheiden sich mit 2,7; 2,8; 2,9 bzw. 3,2·10^-5cm/s nur unwesentlich untereinander. Im Vergleich mit den ermittelten P_eff für Schweinecornea differieren die Ergebnisse allerdings um ca. eine Zehnerpotenz. Dies lässt vermuten, dass die von Prausnitz und Noonan zitierte Kaninchencornea für die zuvor genannten Betablocker leichter permeabel ist als Schweinecornea^E.

Für die Permeationsstudien durch isolierte Schweinecornea wurde ebenfalls erwartet, dass die P_eff der getesteten Betablocker sich untereinander nicht wesentlich unterscheiden. Letzteres konnte in den durchgeführten Versuchen aber nicht bestätigt werden. Es bleibt offen, ob die Ursache hierfür in der Verwendung der unterschiedlichen Membranen zu suchen ist oder andere Ursachen verantwortlich waren.

Aufgrund der geringen Permeabilität von Alprenolol und Oxprenolol durch isolierte Schweinecornea wurden im Folgenden keine weiteren Versuche durchgeführt.

In-vitro-Permeation aus Cyclodextrin-Formulierungen Versuchsdurchführung

Mepindololsulfat (MEP) wurde als Modellsubstanz für In-vitro-Permeationsstudien aus CD-haltigen Formulierungen ausgewählt. Wie auch in der Vorläuferarbeit von Siefert [207], in der die Permeation einer 2%igen Pilocarpinhydrochlorid (P)-Lösung in Gegenwart von CDen durch isolierte Rindercornea getestet wurde, lag MEP (Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle 4) als gut wasserlöslicher Arzneistoff vor. P wurde in der vorhergehenden Arbeit [207] im Zusammenhang mit relativ hohen CD-Konzentrationen (13,92% α-CD; 22,08% Hydroxyethyl-β-cyclodextrin (HE-β-CD); 22,96% HP-β-CD) getestet. Diese Ergebnisse zeigten eine signifikante Zunahme des P_eff für α-CD. Im Gegensatz dazu nahm der P_eff in Gegenwart von HE-β-CD und HP-β-CD signifikant ab.

In der vorliegenden Arbeit sollte an MEP der konzentrationsabhängige Einfluss von α-CD auf die corneale Permeation, insbesondere in niedrigeren Konzentrationen, getestet werden. Analog dazu war der Einfluss des hydroxypropylierten α-CD-Derivats (HP-α-CD) zu untersuchen, um gegebenenfalls Unterschiede zwischen dem nativen und substituierten CD aufzuzeigen. Darüber hinaus wurden die ebenfalls hydroxypropylierten Derivate des β-CDs (HP-β-CD) und des γ-CDs (HP-γ-CD), deren gute okulare Verträglichkeit bis zu einer Konzentration von 12,5% bekannt ist [87, 221], in die Untersuchungen einbezogen. Im Unterschied zur Vorläuferarbeit wurden diese In-vitro-Permeationsversuche an isolierter Schweinecornea an Stelle von Rindercornea durchgeführt (Material und Methoden, VI.2.4).

Weiterhin wurde das Permeationsverhalten des strukturverwandten, aber in der vorliegenden Basenform schwerlöslichen Pindolols (PIN, Theoretische Grundlagen, III.3.2.1, Tabelle 4), das mit Hilfe von CDen in Lösung gebracht werden konnte, untersucht.

Ein weiteres Anliegen war die Untersuchung einer Kombination eines ausgewählten β-Blockers mit dem ebenfalls glaukomwirksamen Sympathomimetikum P (Theoretische Grundlagen, III.2.3). Derartige Kombinationspräparate werden in der Literatur [22, 48, 247] als effektiv und nebenwirkungsarm beschrieben. Für die eigenen Versuche wurde das MEP ausgewählt, für das es bisher weder ophthalmologische Mono- noch Kombinationspräparate gibt.

Da Arzneistoff/CD-Komplexbildung Ursache für veränderte In-vitro-Verfügbarkeit sein kann, wurden darüber hinaus entsprechende Untersuchungen am MEP und PIN mit ausgewählten CDen nachgestellt (V.1.2.6).

Mepindolol / α-Cyclodextrine

Die Permeationsparameter für MEP-Formulierungen, die α-CD bzw. HP-α-CD in abgestuften Konzentrationen enthielten, gibt Tabelle 13 wieder. Der Zusatz von α-CD in den molaren Verhältnissen 1:1, 1:2 und 1:5 erhöhte den P_eff von MEP (2,52 ± 0,54·10^-6cm/s) um das 1,4/ 2,5/ 3,2fache, wobei sich die Werte erst ab 3,7% α-CD (1:1) signifikant von der Referenz unterschieden.

Mittelwert ± SD (n = 6-10); *signifikant zur Referenz für p < 0,05 (t-Test)
0,5 % MEP

MEP : CD

[mol : mol ]

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

sine CD (Referenz)

2,52 ± 0,54

2,09 ± 0,50

+ 1,85%

α-CD

1 : 1

3,49 ± 0,60

2,80 ± 0,52

+ 3,7%

α-CD

1 : 2

6,32^* ± 1,23

5,04* ± 0,90

+ 10%

α-CD

1 : 5

8,00^* ± 0,47

6,29* ± 0,40

+ 4,7%

HP-α-CD

1 : 2

3,34 ± 0,73

3,55 ± 0,87

+ 11,7%

HP-α-CD

1 : 5

3,50 ± 0,38

3,46 ± 0,65

+ 20%

HP-α-CD

1 : 8

3,02 ± 0,93

2,87 ± 0,78

Tabelle 13 : Permeabilitätsparameter von Mepindolol (MEP; 0,5% — bezogen auf die Base) sowie aus a- und HP-a-CD-Lösungen (isolierte SchweinecorneaE )

Im Gegensatz dazu ergab die leichte Zunahme des P_eff in Anwesenheit von HP-α-CD im Donator keine Signifikanz zur Referenzund auch keine tendenzielle Konzentrations-abhängigkeit. Die Werte lagen zudem signifikant unter den P_eff für das native α-CD bei gleichem Arzneistoff/CD-Verhältnis.

Zur Interpretation dieser Ergebnisse müssen prinzipiell sowohl die potentielle Komplexierungstendenz der getesteten CDe als auch der direkte Einfluss dieser Hilfsstoffe auf die biologische Membran in Betracht gezogen werden. Da für eine Komplexierung von MEP in den α-CD-haltigen Lösungen keine eindeutigen Hinweise vorlagen (V.1.2.6.2), wurde vordergründig dem Aspekt der Membranschädigung nachgegangen. Hierzu erfolgte eine jeweils halbstündige Vorbehandlung der Cornea (Material und Methoden, VI.2.4.3) mit den Test-CDen.

Die Vorbehandlung der Cornea mit HP-α-CD (11,7%) änderte die Membranpermeabilität nicht (Abb. 15). Weder der P_eff noch der Q₃₀₀-Wert (Tabelle 14) wichen signifikant von der Referenz ab. Im Gegensatz dazu resultierte bei Vorinkubation der Cornea mit 3,7 bzw. 10% α-CD eine signifikante Erhöhung des P_eff von MEP gegenüber der Referenz in der gleichen Größenordnung wie sie bei primärem Vorliegen von α-CD im Donatorkompartiment ermittelt wurde. Dieses Resultat legt die Vermutung nahe, dass die durch α-CD hervorgerufenen Permeabilitätssteigerungen vorwiegend durch Veränderungen am cornealen Gewebe verursacht worden waren.

Abb. 15 : Permeabilitätskoeffizienten von Mepindolol (0,5%) durch isolierte SchweinecorneaE; Mittelwert ± SD (n = 6-10); *signifikant zur Referenz (sine CD) für p < 0,05

Effekte, die die Integrität der biologischen Membran betreffen, sind für α-CD aus der Literatur bekannt [96, 106, 149, 227]. Auch für weitere CDe (Methyl-β-Cyclodextrin (M-β-CD), Dimethyl-β-Cyclodextrin (DM-β-CD) [87] wird beschrieben, dass sie in der Lage sind, Bestandteile der Zellmembranen (z.B. Cholesterol, Phospholipide und Proteine) zu inkludieren und damit „herauszulösen“. Nicht geklärt ist bisher, ob diese membranbedingten Enhancereffekte einiger CDe als reversibel oder irreversibel zu betrachten und bis zu welchem Ausmaß sie zu tolerieren sind. Weiterhin bleibt offen, ob sich diese Schädigung lediglich auf das Epithel, das im Allgemeinen gut regenerierfähig ist [38], beschränkt oder auch eine mögliche irreversible Schädigung von Stroma und Endothel erfolgt.

Mittelwert ± SD (n = 5-6); *signifikant zur Referenz (ohne Vorbehandlung) für p < 0,05
Cornea vorbehandelt mit:

P_eff [10^-6cm/s]

Q₃₀₀ [%]

ohne Vorbehandlung

2,52 ± 0,54

2,09 ± 0,50

3,7% α-CD

6,09* ± 1,18

5,31* ± 1,00

10% α-CD

9,96* ± 0,60

9,03* ± 2,08

11,7% HP-α-CD

2,73 ± 0,56

2,88 ± 0,55

Tabelle 14 : Permeationsparameter von Mepindolol (MEP; 0,5% — bezogen auf die Base) ohne/nach Vorbehandlung der SchweinecorneaE mit Cyclodextrin (CD)-Lösungen

Es ist anzunehmen, dass eine okulare Anwendung von α-CD in vivo aufgrund der sehr kurzen Kontaktzeit von Augentropfen zu wesentlich weniger dramatischen Membraneffekten führen würde als im In-vitro-Versuch, bei dem α-CD langzeitig intensiv auf das Epithel einwirken kann. Weitere Untersuchungen sind hierfür erforderlich. Da α-CD, das kleinste Molekül unter den nativen CDen, befähigt ist, biologische Membranen wie die Cornea partiell zu passieren [207], könnte es auch eine Carrierfunktion ausüben und den Arzneistoff, sofern komplexierbar (Komplexe konnten nicht sicher nachgewiesen werden, s. V.1.2.6.2), in Form eines CD-Komplexes durch die Membran schleusen.

Die Membranpermeation von α-CD selbst ist offensichtlich konzentrationsabhängig. Während Siefert et al. [207] eine Permeationsrate aus 13,92%iger Lösung von ~17% nach
5 h fanden, resultierte aus den eigenen Versuchen mit 3,7% α-CD lediglich ein kumulativer Endwert von 0,36% (Abb. 16). Auffällig ist allerdings die Zunahme des permeierten Anteils mit der Zeit in beiden Versuchsreihen. Zur Erklärung der α-CD-Permeation gibt es weitere Postulate:

Da der Durchmesser des α-CDs lediglich 4,7-5,3 Å (0,47-0,53 nm) beträgt, könnten die wassergefüllten interzellulären Zwischenräume im Corneaepithel (Durchmesser < 3 nm) sowie epitheliale Poren mit Durchmessern von 1-3 nm [70] mögliche Passagewege durch die Cornea darstellen. Weiterhin wurde eine mögliche Inklusion membranständiger Ca⁺⁺-Ionen durch das CD-Molekül und eine daraus resultierende Weitung der Tight-junctions diskutiert [207].

Abb. 16 : Permeation von a-CD durch isolierte SchweinecorneaT (Ausgangslösung: 3,7% α-CD); Mittelwert ± SD (n = 5)

Mit der Anwendung von α-CD in Augentropfen-Vehikeln beschäftigten sich auch andere Forschungsgruppen [5, 97, 193, 222]. Beispielsweise wurde α-CD im Zusammenhang mit dem Immunsuppressivum Cyclosporin zur okularen Anwendung getestet [193]. Die corneale Toxizität des α-CD in dieser Formulierung wurde von Kanai et al. [96] untersucht. Sasamoto et al. [193] zeigten, dass eine topische Cyclosporin-Anwendung (0,075%) in α-CD als Vehikel bei endotoxininduzierter Uveitis am Kaninchenauge, insbesondere im vorderen Augenabschnitt, effektiv ist. Takano et al. [222] stellten fest, dass 0,025%ige Cyclosporin-Augentropfen (mit 4% α-CD) die Cornea (Kaninchen) 5 bis 10mal stärker penetrierten als eine analoge Konzentration an Cyclosporin in verschiedenen lipophilen Vehikeln. Diese Studie sowie die von Akiyama et al. [5] durchgeführten Untersuchungen belegen die sinnvolle Anwendung von Cyclosporin/α-CD-Formulierungen nach Keratoplastik am Kaninchen. In neueren In-vivo-Studien wurden ferner die okulare Penetration von Delta9-tetrahydrocannabinol in einer α-CD-Formulierung am Kaninchen untersucht [71].

Mepindolol / HP-β-CD, HP-γ-CD

Da HP-β-CD und HP-γ-CD bisher häufig ophthalmologisch eingesetzt bzw. getestet wurden und im Allgemeinen am Auge sehr gut verträglich sind (s.v.), gelangten sie auch mit MEP (0,5% — bezogen auf die Base) für Permeationsstudien zur Testung. In Analogie zu Literaturangaben wurde eine CD-Konzentration von 12,5% gewählt. Zu Vergleichszwecken wurde auch eine 12,5% HP-α-CD enthaltende Formulierung in diese Versuchsserie einbezogen. Der resultierende P_eff (Tabelle 15) entspricht den bereits in Tabelle 13 für HP-α-CD dokumentierten Werten (für 4,7/ 11,7/ 20% HP-α-CD) und unterscheidet sich nicht signifikant von der Referenz. Es ergaben sich keine Unterschiede in Abhängigkeit von den getesteten Konzentrationen (Tabellen 13 und 15).

Im Gegensatz dazu verringerte HP-γ-CD den P_eff signifikant etwa auf die Hälfte des Wertes der CDfreien Referenz (Tabelle 15). Mögliche Komplexierung von MEP mit HP-γ-CD könnte die Ursache der verminderten Permeation des Arzneistoffs sein. Allerdings liegt der kumulative Endwert Q₃₀₀ von Referenz und HP-γ-CD-haltigem Versuch in der gleichen Größenordnung.

Die Ergebnisse der MEP-Permeation in Gegenwart von 12,5% HP-β-CD (Tabelle 15) zeigten nicht die ebenfalls erwartete Abnahme des errechneten P_eff, sondern führten zu einer signifikanten (1,73fachen) Zunahme dieses Wertes und auch zur vergleichsweisen Erhöhung von Q₃₀₀.

An dieser Stelle muss eingefügt werden, dass die Bezugsquelle für Schweineaugen aufgrund der Schließung des Schlachthofs Eberswalde-Britz (Material und Methoden, VI.2.4.1) gewechselt werden musste. Da hierbei differierende Ergebnisse resultierten, wurden in diesem Teil der Arbeit die MEP-Versuche mit den hydroxypropylierten CDen und zur Kontrolle auch mit α-CD sowohl mit Corneae vom Schlachthof Eberswalde (gekennzeichnet als Schweinecornea^E) als auch vom Versuchsschlachtbetrieb Teltow (Schweinecornea^T) durchgeführt, deren Ergebnisse in den Tabellen 15 und 16 dokumentiert sind. Es fällt auf, dass die P_eff durch Schweinecornea^T, die eine schonendere Vorbehandlung erfuhr (s. Material und Methoden, VI.2.4.1), für die Referenz (Tabelle 16) etwa den doppelten Wert gegenüber Tabelle 15 (Schweinecornea^E) aufweist (signifikanter Unterschied!) und auch die MEP-Permeation mit CDen bei Schweinecornea^T für HP-γ-CD und α-CD zu höheren Werten tendiert. Nicht eindeutig ist auch das Resultat für HP-β-CD. Während entsprechend Tabelle 15 der P_eff um den Faktor 1,73 gegenüber der Referenz erhöht ist, resultiert nach Tabelle 16 eine um den Faktor 0,54 erniedrigte MEP-Permeation. Diese Abnahme des P_eff ist jedoch nicht signifikant. Der statistisch ermittelte Fehler ist hoch und beträgt 52,6%. Weiterhin ist anzumerken, dass die MEP-Permeation durch Schweinecornea^E aus 12,5%iger HP-β-CD-Lösung eine „lag time“ von 90 min aufweist (Tabelle 15). Dafür ließ sich bisher keine Erklärung finden.

Mittelwert ± SD (n = 5-10); *signifikant zur Referenz (sine CD) für p < 0,05; 1lag time: 90 min
(Für die anderen P_eff existiert keine lag time.)
0,5 % MEP

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

Faktor

[P_{eff CD}/P_{eff sine}]

Referenz (sine CD)

2,52 ± 0,54

2,09 ± 0,50

-

+ 12,5% HP-α-CD

3,31 ± 0,57

2,70 ± 0,41

1,31

+ 12,5% HP-β-CD

¹4,37* ± 0,55

3,19* ± 0,68

1,73

+ 12,5% HP-γ-CD

1,50* ± 0,18

2,01 ± 0,41

0,60

+ 3,7% α-CD

6,32* ± 1,23

5,04* ± 0,90

2,51

Tabelle 15 : Permeationsparameter von Mepindolol (MEP) durch isolierte SchweinecorneaE sowie in Gegenwart von 12,5% hydroxypropyliertem a-, b-, g-Cyclodextrin (CD) und 3,7% a-CD

Im Resümee verdeutlichen diese Unterschiede, dass die Verwendung von Schweinecornea unterschiedlicher Herkunft bzw. von Schweinecornea von Schweinen, mit denen nach der Schlachtung unterschiedlich verfahren wurde („Überbrühen“, Material und Methoden, VI.2.4), zu veränderter Permeabilität führen kann.

Eine Standardisierung der Testmembranen scheint kaum realisierbar. Innerhalb des gleichen Ausgangsmaterials können jedoch Effekte, die durch Hilfsstoffe wie CDe hervorgerufen werden, im Vergleich zur Referenz diskutiert werden. Dagegen scheint ein Vergleich von Absolutwerten (z.B. Flux und P_eff), resultierend aus unterschiedlichem biologischen Ausgangsmaterial unzulässig. Diese Erkenntnis macht deutlich, wie problematisch der Vergleich eigener Daten mit Literaturangaben ist.

Mittelwert ± SD (n = 5-8); *signifikant zur Referenz (sine CD) für p < 0,05;
(Für alle P_eff existiert keine lag time.)
0,5 % MEP

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

Faktor

[P_effCD/P_effsine]

Referenz (sine CD)

5,99 ± 0,29

4,89 ± 0,17

-

+ 12,5% HP-β-CD

3,29 ± 1,73

2,72 ± 1,43

0,54

+ 12,5% HP-γ-CD

3,04* ± 0,90

2,53* ± 0,71

0,51

+ 3,7% α-CD

13,04* ± 0,35

10,11* ± 1,13

2,18

Tabelle 16 : Permeationsparameter von Mepindololsulfat (MEP) durch isolierte SchweinecorneaT sowie in Gegenwart von HP-b/g-CD und a-CD

Zur Absicherung der Ergebnisse und zur ggf. eindeutigeren Interpretation der Permeationsdaten, erfolgte mit den hier verwendeten CD-Derivaten in 12,5%iger Konzentration eine Überprüfung ihrer Eigenpermeation. Nach Vorversuchen im Arbeitskreis [207] und Literaturhinweisen [122, 123] dürften diese „sperrigen“ Hydroxypropyl-CDe jedoch kaum permeabel sein. Die an Schweinecornea^T gewonnenen Ergebnisse sind in Abb. 17 - Abb. 19 dargestellt.

Abb. 17 : Permeation von HP-a-CD durch isolierte SchweinecorneaT (Donatorlösung: 12,5% HP-a-CD); Mittelwert ± SD (n = 5)

Demnach war die Eigenpermeation von HP-α-CD, HP-β-CD und HP-γ-CD sehr niedrig (durchschnittlich 0,07-0,19%) und mehr oder weniger über den Versuchszeitraum konstant. Allerdings sind die relativen Standardabweichungen, insbesondere für HP-γ-CD (35,4-141,4%) und HP-β-CD (81,3-160,9%), sehr hoch, was dafür spricht, dass sich die CDe über den Testzeitraum nicht absolut indifferent gegenüber der Membran verhalten.

Abb. 18 : Permeation von HP-b-CD durch isolierte SchweinecorneaT (Donatorlösung: 12,5% HP-b-CD); Mittelwert ± SD (n = 5)

Abb. 19 : Permeation von HP-g-CD durch isolierte SchweinecorneaT (Donatorlösung: 12,5% HP-g-CD); Mittelwert ± SD (n = 5)

Auch die von Siefert et al. [207] durchgeführten Versuche mit 12,5% HP-γ-CD an Rindercornea zeigten große Schwankungen und eine Permeationsrate von 1,1% nach fünf Stunden. Prinzipiell bestätigen die Permeationsversuche mit den hydroxypropylierten CDen Hypothesen bzw. Untersuchungen aus der Literatur, die annehmen, dass diese CD-Derivate nur mit äusserster Schwierigkeit die Cornea passieren können [122, 127, 137].

Pindolol

Ausgehend von den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien bzw. der Komplex-bildungseigenschaften des PIN (V.1.2.6.1, Tabelle 21) und unter Berücksichtigung der guten Verträglichkeit von HP-β-CD [87] und HP-γ-CD [221] wurde PIN mit diesen CD-Derivaten in Lösung gebracht und daraufhin durch isolierte Schweinecornea^Epermeiert.

In CD-haltigem GBR pH 7,4 konnte das schwerlösliche PIN nur 0,15%ig in Lösung gebracht und vergleichend permeiert werden. In dieser Konzentration lag der Wirkstoff sowohl in Gegenwart von 12,5% HP-β-CD als auch von 12,5% HP-γ-CD vollständig gelöst vor, nicht aber in 12,5%iger HP-α-CD-Lösung, weshalb auf letztere in In-vitro-Permeationsstudien zu verzichten war. Das Permeationsverhalten der HP-β-CD- und HP-γ-CD-haltigen Formulierungen wurde mit dem des Fertigpräparats Pindoptan^®0,5% – verdünnt auf 0,15% mit GBR pH 7,4 – verglichen.Tabelle 17stellt die Permeationsparameter vergleichend dar.

Mittelwert ± SD (n = 5-8)
0,15% Pindolol

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

Pindoptan^®, verdünnt

5,24 ± 0,36

4,26 ± 0,24

+ 12,5% HP-β-CD

3,33 ± 1,21

2,59 ± 0,44

+ 12,5% HP-γ-CD

4,05 ± 0,84

3,99 ± 0,25

+ 12,5% HP-γ-CD + BAC

5,97 ± 1,52

5,04 ± 1,31

Tabelle 17 : Permeationsparameter für Pindolol
(0,15%; aus Pindoptan® bzw. 12,5% HP-b/g-CD) durch isolierte SchweinecorneaE

Der P_eff der PIN/HP-β-CD-Formulierung beträgt lediglich 64% des P_eff von Pindoptan^® und der P_eff der HP-γ-CD enthaltenden PIN-Formulierung 77%, d.h., es besteht eine Tendenz zur Abnahme des P_eff in Anwesenheit von hydroxypropyliertem β- und γ-CD, jedoch kein statistisch signifikanter (p < 0,05) Unterschied. Da Pindoptan^® 0,01% des Konservierungs-mittels Benzalkoniumchlorid (BAC) enthält, welches das corneale Epithel schädigen und so als Permeationsverbesserer agieren könnte, wurde eine wässrige Lösung von 0,15% PIN, die außer 12,5% HP-γ-CD noch 0,001% BAC (im Vergleich zum verdünnten Fertigpräparat Pindoptan^® zu niedrig konzentriert! − eine analoge BAC-Konzentration wäre 0,003%) enthielt, geprüft. Sie unterschied sich nicht signifikant zum Handelsprodukt, aber auch nicht signifikant zu den anderen Werten.

Entsprechend den vorliegenden Resultaten zeigte die PIN/HP-β-CD- bzw. die PIN/HP-γ-CD-Lösung keine entscheidende Veränderung im Permeationsverhalten in vitro im Vergleich mit dem auf analoge Arzneistoffkonzentration verdünnten Handelspräparat Pindoptan^®, jedoch sind weder ein Retardierungseffekt noch eine höhere effektive Arzneistoffkonzentration völlig auszuschließen. Neben der Löslichkeitsverbesserung des PIN durch die CDe könnte ein weiterer Vorteil in einer möglichen Verminderung der Augenreizung bei Applikation von CD-haltigen Tropfen zu sehen sein [140]. Diskutiert wird auch über den Einsatz von CDen zur Behandlung der Indikation des Trockenen Auges [212]. Da b-Blocker für ihre potentielle Tränenfilmstörung bekannt sind, könnte eine Rezeptur mit CDen diesbezüglich protektiv wirken.

Mepindolol / Pilocarpin-Kombinationen

Eine kombinierte Formulierung, die den β-Rezeptorenblocker Mepindololsulfat (MEP) und Pilocarpinhydrochlorid (P) enthielt − wie sie durchaus zur effektiven Glaukomtherapie relevant sein kann − sollte auf die In-vitro-Permeation der Wirkstoffe durch isolierte Schweinecornea getestet werden. Analog zum Handelspräparat Timpilo^®, das eine Kombination aus Timolol und P darstellt (Theoretische Grundlagen, III.3.2.2, Tabelle 7), wurden der β-Blocker 0,5%ig (bezogen auf die Base) und P 2%ig eingesetzt. Ziel dieser Untersuchung war es, festzustellen, ob sich die Arzneistoffe untereinander beeinflussen und somit − verglichen mit einem Monopräparat − zu einer Veränderung im Permeationsverhalten in vitro und letztlich der biologischen Verfügbarkeit führen. Darüber hinaus sollte auch in diesem Rahmen der Einfluss der hydroxypropylierten CDe auf die Mono- bzw. die Kombinationsformulierungen evaluiert werden.

Es lagen folgende Ausgangsbedingungen vor: Die relativen Molekülmassen M_r der beiden Arzneistoffe sind ähnlich (Mepindolol (Base): 262,36; Pilocarpin (Base): 208,3), allerdings liegt die effektive Konzentration von P ca. 3fach über der eingesetzten MEP-Konzentration. Auch die Verteilungskoeffizienten in Octanol/GBR pH 7,4 sind vergleichbar (MEP: 0,79 (Theoretische Grundlagen, III.3.1.1, Tabelle 5), P: 0,62 [202]). Die physiko-chemischen Parameter Viskosität (0,99 bis 1,005 mPas) und Oberflächenspannung (54,8 bis 58,2 mN/m) der Mono-Rezepturen wurden durch den Zusatz der CDe bzw. durch die Kombination beider Arzneistoffe lediglich geringfügig verändert. Jedoch wurde die Osmolalität durch HP-α-CD, HP-β-CD und HP-γ-CD erhöht. Diese Formulierungen waren hyperton (≥ 400 mOsm/kg), was zur Veränderung der Membranpermeabilität führen könnte. Das Auge toleriert nur eine Osmolalität von ca. 215-430 mOsm/kg [232], sodass die getesteten Lösungen im Grenzbereich der Verträglichkeit lagen und für eine mögliche Anwendung in vivo entsprechend modifiziert werden müssten.

Der P_eff von P wurde mit 2,46 ± 0,81·10^-6cm/s bestimmt, entsprechend einer prozentualen Freisetzungsrate von 1,97 ± 0,50 % nach 300 min. Ein Zusatz von 12,5% HP-α-CD, HP-β-CD bzw. HP-γ-CD zu einer 2%igen P-Lösung änderte deren Permeation nicht signifikant. Tendenziell führten HP-β-CD und HP-γ-CD jedoch zu einer Steigerung der Werte für Schweinecornea^E. Letztere zeigt sich deutlicher in der signifikanten Zunahme der kumulativ freigesetzten Arzneistoffmenge nach 300 min (Q₃₀₀; Tabelle 18, Abb. 20).

Im Gegensatz dazu führten Versuche mit Schweinecornea^T, die analog durchgeführt wurden, zu einer signifikanten Abnahme des P_eff für die HP-β-CD- bzw. HP-γ-CD-haltigen P-Formulierungen (Tabelle 19). Dieses Ergebnis korreliert mit den zuvor beschriebenen, unterschiedlichen Permeationsparametern von MEP, ebenfalls als Mono-Wirkstoff-Formulierung, bei Verwendung von Schweinecornea^E bzw. Schweinecornea^T (V.1.2.3, Tabellen 15 und 16). Die Ursachen hierfür bleiben jedoch ungeklärt, da eine weitere, vergleichende Charakterisierung des Ausgangsmaterials aufgrund der Schließung des Schlachthofs Eberswalde nicht mehr möglich war (Material und Methoden, VI.2.4.1). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen für MEP (V.1.2.3, Tabellen 15 und 16) resultierte für die P-Referenz (CD-freier Wert) ebenfalls ein höherer Wert bei Anwendung von Schweinecornea^T gegenüber -cornea^E, der allerdings nicht signifikant ist (Tabelle 19).

In der Literatur liegen durchaus vergleichbare Werte für die P_eff von P aus 2%iger Lösung durch biologische Membranen vor (isolierte Schweinecornea^E: 2,54 ± 0,75·10^-6cm/s [202] (vgl. Tabelle 18); isolierte Rindercornea: 4,05·10^-6cm/s [92] bzw. 1,6·10^-6cm/s [207]; isolierte Kaninchencornea: 2,8·10^-6cm/s [218]). Järvinen et al. [92] zeigten, dass bei Zusatz von HP-β-CD (0,25%) zum Donator der P_eff nicht signifikant verringert wird (3,55·10^-6cm/s gegenüber 4,05·10^-6cm/s; n = 3), was keinen entscheidenden Einfluss des zugefügten CDs in der getesteten Konzentration erkennen lässt.

Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant gegenüber Referenz (sine CD); p < 0,05 (t-Test)
Pilocarpin (P)

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

sine CD

2,46 ± 0,81

1,97 ± 0,50

+ HP-α-CD

2,47 ± 1,57

2,23 ± 1,41

+ HP-β-CD

3,57 ± 0,18

3,22* ± 0,17

+ HP-γ-CD

3,20 ± 0,29

2,88* ± 0,27

Kombination mit MEP (P/MEP); sine CD

5,35 ± 2,24

5,53 ± 2,46

+ HP-α-CD

2,01 ± 1,43

1,79* ± 1,86

+ HP-β-CD

1,74* ± 0,84

1,52* ± 0,76

+ HP-γ-CD

2,07* ± 0,95

3,15* ± 0,74

Cornea vorbehandelt mit 0,5% MEP¹

sine CD

2,67 ± 1,11

2,17 ± 0,94

Tabelle 18 : Permeationsparameter von 2% Pilocarpinhydrochlorid (P) durch isolierte SchweinecorneaE (1SchweinecorneaT) sowie in Gegenwart von Mepindolol (MEP, 0,5% — bezogen auf die Base) und 12,5% hydroxy-propyliertem a-, b- und g-Cyclodextrin (CD)

In Gegenwart von MEP (Tabelle 18, Abb. 20, Schweinecornea^E) kam es zu einer signifikanten Verdopplung von P_eff für P (5,35 ± 2,24·10^-6cm/s) bei allerdings relativ hoherStandard-abweichung von41,9%gegenüber 32,9% im MEP-freien Versuch. Auch aus den Versuchen mit den CDen ergab sich ein deutlich erhöhter Fehler bei der P/MEP-Kombination. Dennoch unterscheiden sich die für P in Kombination mit MEP errechneten P_eff bei Anwesenheit von 12,5% HP-β-CD bzw. HP-γ-CD gegenüber der Referenz (P/MEP) signifikant (p < 0,05) (Tabelle 18, Abb. 20).

Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant zur Referenz (sine CD) für p < 0,05 (t-Test)
P

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

sine CD

3,19 ± 0,46

2,80 ± 0,47

+ HP-β-CD

1,48* ± 0,47

1,09* ± 0,34

+ HP-γ-CD

1,53* ± 0,71

1,31* ± 0,68

Tabelle 19 : Permeationsparameter von 2% Pilocarpinhydrochlorid (P) durch isolierte SchweinecorneaT (ohne/ mit 12,5% HP-b/g-CD)

Um die gefundene tendenzielle Zunahme der P-Verfügbarkeit in Gegenwart von MEP (CD-freier Donator) zu hinterfragen, wurde die Schweinecornea^T mit 0,5%iger (bezogen auf die Base) MEP-Lösung vorbehandelt (Material und Methoden, VI.2.4) und durch diese anschließend eine 2%ige P-Lösung permeiert. Im Ergebnis beeinflusste diese Vorbehandlung der Membran die P-Permeabilität (2,67 ± 1,11·10^-6cm/s), verglichen mit der unbehandelten Membran (2,46 ± 0,81·10^-6cm/s), nicht signifikant

Diese Aussage ist kritisch zu werten, da der P-Permeationsversuch nach Vorbehandlung mit MEP nur durch Schweinecornea^T und nicht wie die gesamte Versuchsreihe durch Schweinecornea^E durchgeführt werden konnte.

Für die Zunahme der P-Permeabilität in Kombination mit MEP ist demnach eher eine Interaktion zwischen beiden Arzneistoffen anzunehmen, die auch Ursache für die hohe Standardabweichung sein kann. Es sollte insofern in Betracht gezogen werden, dass bei Anwendung von Augentropfen in dieser Kombination eine corneale Permeationszunahme von P nicht auszuschließen ist.

Diese Hypothese steht nicht im Widerspruch zu den in der Literatur berichteten In-vivo-Studien mit β-Blocker/P-Kombinationen. So konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass die Glaukombehandlung durch feste Kombinationen von Betablockern mit P zu verbessern war. Zadok et al. [247] stellten fest, dass der IOP bei lokaler Anwendung einer Timolol/P-Kombination wesentlich niedriger lag als bei Einzelanwendung von Timolol bzw. P. Außerdem wiesen Drago et al. [48] nach, dass der Wirkstoff Metipranolol in Kombination mit P effektiver den IOP senkt und zu weniger bradykardialen Nebenwirkungen führt als eine Timolol/P-Formulierung. Dagegen zeigte eine weitere klinische Studie mit Carteolol in Kombination mit P im Vergleich zu einer Timolol/P-Kombination bei der Behandlung des Offenwinkelglaukoms oder der okulären Hypertension keine wesentliche Verbesserung hinsichtlich der IOP-Senkung [22].

In der aktuellen Fachinformation des Präparats Timpilo^®, einer Timolol/P-Kombination [56], wird bezüglich der Wechselwirkungen gesagt, dass die augeninnendrucksenkende Wirkung von timololhaltigen Augentropfen durch die Gabe von adrenalin- und pilocarpinhaltigen Augentropfen verstärkt wird. (In diesem Zusammenhang würde man allerdings eine höhere Permeationsrate des Betablockers erwarten.) Außerdem senkt Timpilo^® bei 2-mal täglicher Gabe den Augeninnendruck vergleichbar einer gleichzeitigen Verabreichung von Timolol-Augentropfen bei 2-mal täglicher Gabe und Pilocarpin-Augentropfen 4-mal täglich in entsprechenden Konzentrationen [56]. Systematische Studien an derartigen β-Blocker/ Pilocarpin-Formulierungen, auch im Hinblick auf deren Wirkstoffkonzentration, fehlen allerdings in der Literatur.

Abb. 20 : Permeabilitätskoeffizienten von 2% Pilocarpinhydrochlorid (P) allein und in Kombination mit 0,5% (bezogen auf die Base) Mepindololsulfat (MEP) ohne/ unter Zugabe von 12,5% HP-α/β/γ-CD (SchweinecorneaE); Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant gegenüber der jeweiligen Referenz (sine CD); p < 0,05 (t-Test)

Tabelle 20 fokussiert die Permeation von MEP, indem wieder die Formulierungen ohne und mit Hydroxypropyl-CDen sowie in Kombination mit P betrachtet werden. Der P_eff von MEP allein (2,52 ± 0,54·10^-6cm/s) liegt in der Größenordnung des P (2,46 ± 0,81·10^-6cm/s). Durch Zusätze von 12,5% HP-α-CD bzw. HP-β-CD erhöhte sich die MEP-Permeation, wobei sich jedoch lediglich für HP-β-CD eine Signifikanz (Tabelle 19) errechnete (s. auch V.1.2.3, Tabellen 15 und 16). Berücksichtigt werden muss dabei allerdings die in Gegenwart von 12,5% HP-β-CD nachgewiesene „lag time“ für MEP von 90 min. Eine verzögerte Arzneistofffreisetzung trat bei der Referenz nicht auf.

Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant zur Referenz (sine CD) für p < 0,05 (t-Test), ¹lag time: 90 min (Für die anderen P_eff existiert keine lag time.)
MEP

P_eff
[10^-6cm/s]

Q₃₀₀[%]

sine CD

2,52 ± 0,54

2,09 ± 0,50

+ HP-α-CD

3,31 ± 0,57

2,70 ± 0,41

+ HP-β-CD

4,37¹* ± 0,55

3,19* ± 0,68

+ HP-γ-CD

1,50* ± 0,18

2,01 ± 0,41

Kombination mit P (MEP/P)

sine CD

1,74 ± 0,32

1,97 ± 0,43

+ HP-α-CD

1,32 ± 1,09

0,60* ± 0,18

+ HP-β-CD

0,49* ± 0,19

0,52* ± 0,10

+ HP-γ-CD

0,48* ± 0,18

0,54* ± 0,11

Tabelle 20 : Permeationsparameter von 0,5% (berechnet auf die Base) Mepindololsulfat (MEP) durch isolierte SchweinecorneaE sowie in Gegenwart von 2% Pilocarpinhydrochlorid (P) und 12,5% hydroxypropyliertem a-, b- und g-Cyclodextrin (CD)

In das Konzept von CD-Einschlussverbindungen, das eine Abnahme der Permeabilitätsrate erwarten ließe, passt das bei Zusatz von 12,5% HP-γ-CD ermittelte Ergebnis mit signifikant verminderter (ca. 1,5fach) MEP-Permeation gegenüber der hilfstofffreien MEP-Formulierung. Aufgrund dieses Resultats ist eine Interaktion zwischen MEP und HP-γ-CD im Donatormedium zu vermuten.

Der Vergleich der CD-freien Referenzwerte für MEP alleine und in Kombination mit P ergibt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05), die entsprechende Berechnung für die kumulativ freigesetzten Arzneistoffmengen nach 300 min hingegen nicht (Tabelle 20).

Die Kombination MEP/P führte generell zu einer P_eff-Reduzierung gegenüber dem jeweiligen MEP-Wert (Tabelle 20), zeigte aber nur für HP-β-CD und HP-γ-CD Signifikanz. Alle MEP/P-P_eff-Werte lagen deutlich unter dem MEP-Wert ohne CD und ohne P (2,52 ± 0,54·10^-6cm/s) und ergaben eine Abnahme in folgender Reihenfolge: MEP/P sine CD > HP-α-CD >> HP-β-CD = HP-γ-CD. Dabei resultiert für den Zusatz des HP-α-CD zur MEP/P-Kombination keine Signifikanz, β- und γ-Hydroxypropyl-CD sind im Vergleich zu den entsprechenden P-freien MEP-Daten nicht signifikant verschieden.

Abb. 21 : Permeabilitätskoeffizienten von 0,5% Mepindolol (MEP) allein und in Kombination mit 2% Pilocarpin (P) unter Zugabe von 12,5% HP- α/β/γ-CD (SchweinecorneaE); Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant gegenüber der jeweiligen Referenz (sine CD) für p < 0,05 (t-Test)

Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die hydroxypropylierten CDe, insbesondere HP-β-CD und HP-γ-CD deutlichen Einfluss auf die In-vitro-Verfügbarkeit von MEP nehmen (Tabelle 20, Abb. 21) und in Kombination mit P zu signifikant verminderten P_eff führen. Dieses Phänomen könnte eine Arzneistoffretardierung und folglich eine verlängerte Wirkungsdauer verursachen. Rückschlüsse auf die In-vivo-Verfügbarkeit sowie auf eine sinnvolle ophthalmologische Anwendung lassen sich daraus allerdings nur unter Vorbehalt ziehen.

Die Gegenüberstellung der prozentual freigesetzten Arzneistoffe aus den Mono- und Kombinationsformulierungen sowie bei Anwesenheit der CDe in letzteren (Abb. 22) verdeutlicht, dass Wechselwirkungen der Arzneistoffe untereinander bzw. mit den Hilfsstoffen sehr wahrscheinlich sind. Die Abnahme des Q₃₀₀-Wertes in Anwesenheit hydroxypropylierter CDe in der Kombination ist sowohl für MEP als auch für P signifikant. Für MEP ergibt sich eine ca. 3,5fache Abnahme der prozentual freigesetzten Arzneistoff-menge aus allen drei CD-Formulierungen. Auch für P errechnet sich Signifikanz, allerdings liegen hier die Fehler sehr hoch (Abb. 22).

Abb. 22 : Arzneistofffreisetzung Q300 [%] von Mepindolol (MEP) und Pilocarpin (P) nach 300 min (SchweinecorneaE); Mittelwert ± SD (n = 5-9); *signifikant zum jeweiligen Wert in P/MEP für p < 0,05 (Single-Factor-Anova)

Der relativ geringe Fehler für die Monolösungen P und MEP (Abb. 22) ist möglicherweise vorwiegend auf alternierende Wechselwirkungen mit der biologischen Membran bzw. auf deren unterschiedliche Beschaffenheit zurückzuführen. Die vergleichsweise hohen Fehler der Kombinationslösungen für Q₃₀₀, insbesondere bei der Berechnung der P-Werte, könnten auf Arzneistoff-Arzneistoff-Wechselwirkungen vor der Membran sowie (zumindest teilweise) auf Konkurrenzreaktionen um die jeweiligen CD-Derivate zurückzuführen sein. Um diese möglichen Fehlerquellen bzw. Einflussparameter zu differenzieren, wären entsprechende Versuche an einer indifferenten künstlichen Membran (z.B. Nephrophan^® = regenerierte Cellulose) hilfreich.

Ausgehend von den Ergebnissen der In-vitro-Permeation ist eine Komplexbildung zwischen P bzw. MEP mit HP-α-CD sowohl für die Mono-Formulierung als auch für die Kombination eher unwahrscheinlich. Jedoch kann aufgrund dieser Daten eine Interaktion von MEP mit HP-β-CD bzw. HP-γ-CD angenommen werden (Tabelle 20, Abb. 21). Letzteres gilt sowohl für MEP allein als auch in Kombination mit P. Auf welche Weise diese Wechselwirkungen erfolgen, bleibt offen.

Wechselwirkungen mit Cyclodextrinen

Im Folgenden sollten diskutierte Wechselwirkungen von MEP und PIN mit ausgewählten CDen (s. Theoretische Grundlagen, III.4.1.1, Tabelle 9) als Ursache für Permeations-veränderungen genauer untersucht werden. Da PIN als hydrophobe Base vorlag, war eine Komplexcharakterisierung in wässriger Lösung durch Löslichkeitsisothermen möglich. Es konnten Stabilitätskonstanten (Untersuchungen, IV.2) errechnet werden. Gegebenenfalls sollten durch das Komplexierungsverhalten von PIN in wässriger Lösung Rückschlüsse auf das strukturverwandte MEP gezogen werden.

Für MEP selbst wurden feste CD-Komplexe hergestellt und mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) und Röntgendiffraktometrie (X-RD) charakterisiert.

Pindolol

Um Wechselwirkungen zwischen dem schwerlöslichen Pindolol (PIN) (Wasserlöslichkeit: 0,16 mg/ml) und CDen zu erfassen, wurden zunächst Löslichkeitsstudien in Wasser (pH 6,3) durchgeführt. Neben den nativen und hydroxypropylierten α-, β- und γ-CDen kamen ein nichtionisches α-CD-Polymer (α-CD-Pol) sowie das ionische carboxymethylierte α-CD-Polymer (CM-α-CD-Pol) zur Anwendung.

Die Löslichkeitsisothermen zeigten unterschiedliche Kurvenverläufe (vgl. Abb. 13). Bei α-CD ergibt sich der B_S-Typ; HP-β-CD folgt dem A_P-Typ. Alle anderen Löslichkeitsisothermen (HP-α-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD, α-CD-Pol, CM-α-CD-Pol) repräsentieren mehr oder weniger den A_L-Typ, d.h. die Entstehung von 1:1-Komplexen kann angenommen werden.

Die im überprüften CD-Konzentrationsbereich ermittelten Stabilitätskonstanten (19,0 - 2018,1 l/mol) für PIN/CD-Komplexe in Wasser sind vergleichsweise sehr niedrig (Tabelle 21). Die beste Wasserlöslichkeit und höchste Komplexbildungskonstante von PIN wurde durch CM-α-CD-Pol erreicht, wobei jedoch ionische Wechselwirkungen zwischen dem Arznei- und Hilfsstoff dominieren dürften. Da bisher noch keine Daten zur okularen Toleranz oder Toxizität dieses ionischen Polymers vorliegen und nicht genügend Substanz zur Verfügung stand, wurde zunächst von weiteren Untersuchungen Abstand genommen. Gleiches gilt für das ebenfalls für weitere Versuche interessante nichtionische Polymer (α-CD-Pol).

¹ Faktor für Löslichkeitsverbesserung gegenüber Wasser (pH 6,3); Löslichkeit von PIN in Wasser: 0,16 mg/ml; R²: Korrelationskoeffizient der entsprechenden Geradengleichung (lineare Regression);
c_S = Sättigungslöslichkeit; ^x)nicht durchführbar (β-CD-Löslichkeit < 10%);
*berechnet im Geradenabschnitt; n = 3
CD

Typ

K_Stab

[l/mol]

R²

c_S PIN bei CD_10%[mg/ml]

Faktor¹

[CD_10% : CD_0%]

α-CD

B_S

65,6

1,00*

0,58

3,63

HP-α-CD

A_L

19,0

0,99

0,25

1,56

β-CD

A_L

604,7

0,92

^x)

^x)

HP-β-CD

A_P

63,8

0,95*

0,41

2,56

γ-CD

A_L

53,7

0,98

0,65

4,06

HP-γ-CD

A_L

51,3

0,96

0,65

4,06

α-CD-Pol

A_L

312,5

0,98

1,76

11,0

CM-α-CD-Pol

A_L

2018,1

0,99

6,38

39,9

Tabelle 21 : Stabilitätskonstanten von Pindolol (PIN)/Cyclodextrin (CD)-Komplexen

Die Löslichkeit (c_S) in den nativen CDen (ausgenommen β-CD) und ihren Hydroxypropyl-derivaten in 10%iger Konzentration (realistisch für die Formulierung eines Ophthalmikums) unterscheidet sich nicht wesentlich und liegt im Bereich von 0,25-0,65 mg/ml. Im Zusammenhang mit β-CD muss die sehr begrenzte Löslichkeit des β-CDs selbst (1,85 g/100 ml) in Betracht gezogen werden.

Weitere Löslichkeitsstudien erfolgten in GBR-Puffer pH 7,4 bei Raumtemperatur sowie durch Erhitzen im Autoklaven. Diese Versuche beschränkten sich auf hydroxypropyliertes β- und γ-CD. Die erzielten Sättigungslöslichkeiten (c_S) in Wasser, Puffer und Puffer (nach Autoklavierung) sind in Tabelle 22 vergleichend gegenüber gestellt.

Unter Zusatz von HP-β-CD erwies sich das Puffermedium (GBR pH 7,4) generell als vorteilhafter für die PIN-Löslichkeit. Gegenüber Wasser pH 6,3 war die Löslichkeit mit 10% HP-β-CD etwa verdoppelt (Tabelle 22). Im Gegensatz dazu blieb die PIN-Löslichkeit in GBR pH 7,4 unter HP-γ-CD-Zusatz bis 10% unverändert (Tabelle 21); in höheren Konzentrationen (15 bzw. 20% HP-γ-CD) erfolgte sogar eine verminderte Löslichkeit gegenüber Wasser.

Abb. 23 : Löslichkeitsisothermen von Pindolol (PIN) in GBR-Puffer pH 7,4; (A): nach Autoklavieren (121°C, 200 kPa, 15 min); n = 3

In Anlehnung an Untersuchungen von Loftsson et al. [107, 121, 124] ließ sich die Löslichkeit von PIN durch Autoklavieren einer PIN/HP-γ-CD- bzw. PIN/HP-β-CD-Zubereitung in GBR-Puffer wesentlich steigern (Tabelle 22), z.B mit 20% HP-γ-CD auf das 20fache und mit 20% HP-β-CD sogar auf das 58fache (Tabelle 22) gegenüber Wasser ohne CD. Auch in der eher ophthalmologisch relevanten Konzentration von 10% HP-β/γ-CD zeigte sich das β-Derivat hinsichtlich der Löslichkeitsverbesserung von PIN ebenfalls deutlich überlegen (35,7fach gegenüber 16,9fach durch HP-γ-CD). Diese Ergebnisse lassen zudem auf eine höhere Komplexierungstendenz (bei Hitzeeinwirkung im Autoklaven) des PIN mit HP-β-CD gegenüber HP-γ-CD schließen.

Weiterhin fällt auf, dass im Zusammenhang mit HP-β-CD die in GBR bestimmten Sättigungskonzentrationen zu deutlich höheren Werten im Vergleich zu Wasser führten (Tabelle 22). Neuere Studien [126] haben gezeigt, dass Arzneistoff/CD-Komplexe häufig eine recht komplizierte Zusammensetzung und Struktur aufweisen. Es wird postuliert, dass solche Komplexe in einigen Fällen aus einer Mischung von Einschlusskomplexen und Nicht-Einschlusskomplexen (z.B. Seitenkettenassoziaten) bestehen. Weiterhin können Arzneistoff/ CD-Komplexe auch Aggregate bilden, die aus Hunderten von Einzelkomplexen bestehen.

c_S/W: Löslichkeit in Wasser pH 6,3 bei Raumtemperatur (22 ± 3°C); n = 3
c_S/P: Löslichkeit in GBR-Puffer pH 7,4 bei Raumtemperatur (22 ± 3°C); n = 3
c_S/A: Löslichkeit in GBR-Puffer pH 7,4 nach Autoklavieren (121°C, 200 kPa, 15 min); n = 3
HPβCD

Löslichkeit [mg/ml]

Löslichkeitsverhältnis

[%]

c_S/W

c_S/P

c_S/A

c_S/A/c_S/W

c_S/A/c_S/P

c_S/A/c_S/W0%CD

0

0,16

0,17

1,97

-

-

-

1

0,19

0,35

2,06

11,0

5,9

12,6

5

0,31

0,44

3,69

12,0

8,5

22,7

10

0,41

0,88

5,82

14,1

6,6

35,7

15

0,72

1,35

8,01

11,1

5,9

49,2

20

1,75

2,41

9,47

5,4

3,9

58,2

R²

0,95

0,94

0,97

HPγCD

Löslichkeit [mg/ml]

Löslichkeitsverhältnis

[%]

c_S/W

c_S/P

c_S/A

c_S/A/c_S/W

c_S/A/c_S/P

c_S/A/c_S/W0%CD

0

0,16

0,17

1,97

-

-

-

1

0,31

0,31

2,33

7,4

7,5

14,3

5

0,60

0,50

2,37

4,0

4,7

14,6

10

0,65

0,63

2,75

4,2

4,3

16,9

15

0,92

0,71

3,13

3,4

4,4

19,3

20

1,20

0,86

3,30

2,8

3,8

20,3

R²

0,96

0,98

0,99

Tabelle 22 : Löslichkeit (cS) von Pindolol durch hydroxypropyliertes b/g-Cyclodextrin (CD) im Vergleich

Darüber hinaus zeigen Untersuchungen von Loftsson et al. [126] eine deutliche Löslichkeitsverbesserung von Hydrocortison/β-CD durch Zusatz kurzkettiger anionischer bzw. kationischer organischer Salze zum wässrigen Medium. In den vorliegenden Studien mit PIN könnten möglicherweise Substanzen, die in GBR-Puffer enthalten sind (Material und Methoden, VI.1), eine löslichkeitsfördernde Funktion übernehmen. Letzteres genauer zu untersuchen, wäre ein interessanter Ansatzpunkt für Folgearbeiten.

Mepindolol

Als Beispiel für die eingesetzten hydrophilen β-Blocker-Salze und als Erklärungsversuch für die Permeationsphänomene (V.1.2) wurden von MEP mit α-, β-, und γ-CD auf dem Wege der Lyophilisation und durch Physikalische Mischungen (Material und Methoden, VI.2.3.1) Feste Dispersionen erzeugt und versucht, diese mittels X-RD und FT-IR (Material und Methoden, VI.2.3.2.2 und VI.2.3.2.1) zu charakterisieren.

Die Anwendung der X-RD zum Nachweis eines Kavitats [51, 53, 64, 65, 101, 154, 167, 192] im festen Zustand beruht auf der Ausbildung einer anderen Kristallmodifikation bzw. des amorphen Zustands des betreffenden Arzneistoffs. Liegt aber die Ausgangsverbindung bereits amorph vor, lassen sich in der Regel keine Aussagen treffen. Die meisten bisher untersuchten Kavitate mit Derivaten der nativen CDe weisen röntgenamorphe Strukturen auf.

Im vorliegenden Fall wurde der kristallin vorliegende Arzneistoff MEP selbst (sowie das ebenfalls kristalline α-CD [220]) durch den Gefriertrocknungsprozess in den amorphen Zustand überführt. Demzufolge waren auch aus den Röntgendiffraktogrammen der Lyophilisate (LP) (MEP/α-CD im molaren Verhältnis 1:1 und 1:2) keine Hinweise auf Komplexbildung durch Änderung der Kristallstruktur zu entnehmen. Die entsprechenden Physikalischen Mischungen (PM) von MEP/α-CD lagen kristallin vor. Letztere ließen ebenfalls nicht auf Komplexbildung schließen.

Die FT-IR als gelegentlich verwendete Methode zur Komplexcharakterisierung zwischen Arzneistoffen und CDen [33, 95, 116] führt nicht immer zu interpretierbaren Ergebnissen. Im vorliegenden Fall wurde versucht, sie für orientierende Aussagen über mögliche Assoziate heranzuziehen. Die Absorptionsbanden (Abb. 24) im Bereich der Wellenzahlen 3700 -
2500 cm^-1 repräsentieren die OH-Schwingungen des jeweiligen Moleküls (zusätzliche OH-Schwingung im Bereich 1400 - 1000 cm^-1). Die Wellenzahlen 3500-2200 cm^-1 ^{stellen die NH-Schwingungen}des MEP-Moleküls dar [41, 189]. Entsteht ein Arzneistoff/CD-Kavitat durch nicht-kovalente Bindungen des Gastmoleküls an die OH-Gruppen im Hohlraum des CD-Moleküls, ist eine Verbreiterung der OH-Bande („inhomogene Verbreiterung“ durch Vorliegen von freiem Arzneistoff und Arzneistoff/CD-Komplex) zu erwarten. Sowohl die Physikalischen Verreibungen als auch die Lyophilisate führten lediglich zu einfachen Überlagerungen des MEP-Spektrums mit dem CD-Spektrum (Abb. 24). Die Existenz eines MEP/CD-Komplexes kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.

Abb. 24 : FTIR-Spektren von MEP/ a-, b-CD (1 : 1); Ordinate: Transmission [%], Abszisse: Wellenzahl [cm-1]; PM = Physikalische Mischung, LP = Lyophilisat

Um eindeutige Aussagen über eine mögliche Komplexbildung zwischen MEP und den nativen CDen machen zu können, müssten noch weitere Methoden zur Komplex-charakterisierung wie z.B. die Protonenresonanzspektroskopie (¹H-NMR) [33, 51, 64, 65, 95, 167], die UV/VIS-Spektroskopie [68] oder die HPLC [59] herangezogen werden.

Corneale Verträglichkeit

Die Raster-Elektronenmikroskopie (REM) kann herangezogen werden, um Veränderungen der cornealen Epitheloberfläche sichtbar zu machen. Diese können z.B. durch in Ophthalmika verwendete Substanzen (Arzneistoffe, Konservierungsmittel, Hilfsstoffe) verursacht werden und u.a. zum Verlust bzw. zur Verkleinerung der Oberflächenmikrovilli, zu einer Störung im Aufbau der Zellmembranen, zum Klumpen der Tonofilamente sowie zum Loslösen der Oberflächenepithelzellen führen [158]. Hinterfragt wurden in dieser Arbeit in erster Linie die CDe.

Mittels REM wurden α-CD in den drei bei den Permeationsversuchen eingesetzten Konzentrationen (1,85/ 3,7/ 10%), sein Hydroxypropylderivat (4,7/ 11,7%) sowie 12,5% HP-β-CD im Vergleich zum Lösungsmedium GBR pH 7,4 (Referenz) auf ihre epitheliale Kompatibilität getestet. Außerdem gelangte das Handelspräparat Pindoptan^® zur Überprüfung. Hierzu wurde isolierte Schweinecornea^E, wie unter Material und Methoden, VI.2.8, beschrieben, vorbehandelt.

Die elektronenmikroskopischen Bilder (Abb. 25) zeigen weder für HP-α-CD noch für HP-β-CD manifeste Veränderungen gegenüber der Referenz. Auch für das Fertigpräparat Pindoptan^® ließen sich im Vergleich zu GBR pH 7,4 keine epithelialen Schädigungen erkennen. Im Gegensatz dazu schien bereits die Vorbehandlung des cornealen Epithels mit nur 1,85% α-CD eine Mikroerosion der Oberflächenepithelzellen zu bewirken. Die REM-Aufnahme mit 3,7% α-CD zeigt dagegen keinen deutlichen Unterschied zur Referenz (GBR pH 7,4), während die Behandlung der Gewebe mit 10% α-CD zur Kraterbildung führte, welche als Schädigung des cornealen Epithels zu interpretieren ist. Kanai et al. [96] überprüften das Immunsuppressivum Cyclosporin in Gegenwart von α-CD (1/ 2/ 4/ 8%) auf corneale Verträglichkeit mittels REM, Lichtmikroskopie sowie mittels Draize-Test. Die Autoren konstatierten, dass α-CD in 4%iger Konzentration (Cyclosporinkonzentration 0,025%) die geringste corneale „Toxizität“ aufweist, was mit den vorliegenden Resultaten im Einklang zu stehen scheint

Diese Aussage ist in sofern kritisch zu bewerten, da bei den Versuchen von Kanai et al. die Toxizitätsuntersuchungen zusammen mit dem Arzneistoff Cyclosporin durchgeführt wurden.

. Ferner belegen REM-Untersuchungen von Jansen et al., dass 12,5% HP-β-CD für das corneale Epithel nicht toxisch ist [87].

Der Einsatz von α-CD ist aufgrund der bereits in der Literatur dokumentierten Erkenntnisse [207] generell kritisch zu beurteilen, jedoch deuten die vorliegenden REM-Daten an, dass offensichtlich eine starke Konzentrationsabhängigkeit besteht und CD-Konzentrationen um 4% eine vergleichsweise bessere Kompatibilität aufweisen als niedrigere und höhere Konzentrationen. Überprüfungen im größeren Umfang und nach wiederholter Applikation wären erforderlich.

Um eindeutigere Aussagen über die corneale Verträglichkeit machen zu können, müsste auch das corneale Endothel auf die gleiche Art und Weise untersucht werden. Duncker et al. [49] untersuchten Veränderungen des cornealen Endothels von Schweineaugen nach Einwirkung des ansonsten als gut verträglich beschriebenen HP-β-CDs in unterschiedlicher Konzentration. Bei einer Konzentration von 10% HP-β-CD wurden manifeste Veränderungen, wie z.B. eine Verminderung der Zelldichte, beobachtet.

In diesem Zusammenhang ist hervorzuheben, dass zumindest Schädigungen des cornealen Epithels − selbstverständlich in Abhängigkeit von Art und Ausmaß − durch das Gewebe selbst wieder „regeneriert“ werden können, d.h. reversibel sind. Die Reparatur in vivo ist ein biphasischer Prozess, bei dem zunächst über 5-6 h keine Epithelzellmigration auftritt (latente Phase) und danach das bloße Stroma von den noch vorhandenen, in Migration befindlichen Epithelzellen bedeckt wird. Die Zellproliferation wird nachfolgend initiiert, und die normalen 4-6 Zellschichten des Epithels werden wiederhergestellt [38].

Abb. 25 : Elektronenmikroskopische Aufnahmen des cornealen SchweineepitheliumsE, Vergrößerung x20000

Kapitelzusammenfassung

□Die P_eff bzw. Q₃₀₀-Werte von Betaxolol, Metoprolol, Mepindolol lagen in der gleichen Größenordnung (P_eff = 2,5 bis 2,8·10^-6cm/s). Die entsprechenden Daten für Alprenolol und Oxprenolol ergaben signifikant niedrigere P_eff, verglichen mit den zuvor erwähnten Betarezeptorenblockern, obwohl dies hinsichtlich der V_K nicht zu erwarten war. Auffallend war bei den letzteren eine 120minütige „lag time“.

□Ein Zusatz von α-CD (3,7 bzw. 10% α-CD) zur gepufferten MEP-Lösung (0,5% — bezogen auf die Base) führte zur signifikanten Erhöhung des P_effgegenüber der CDfreien Referenz. Im Gegensatz dazu veränderte HP-α-CD in abgestufter Konzentration die P_eff nur unwesentlich.

□Eine Vorbehandlung der Schweinecornea^E mit α-CD (10%) führte zu einer Erhöhung der P_effvon MEP, was die Vermutung von CD-verursachten Veränderungen im cornealen Epithel nahe legte.

□Die Permeation von α-CD (10%) selbst durch isolierte Schweinecornea^T zeigte eine zeitabhängige Zunahme des permeierten Anteils. Allerdings lag die kumulativ freigesetzte Menge nach 300 min insgesamt lediglich bei 0,36%.

□Die Permeation von MEP (0,5% — bezogen auf die Base) bzw. P (2%) aus mit hydroxypropyliertem β- bzw. γ-CD formulierter Lösung ergab bei Schweinecornea unterschiedlicher Herkunft differierende Ergebnisse. Unter Verwendung von Schweinecornea^T (besonders schonende Behandlung der Schlachttiere) resultierte für MEP etwa der doppelte Wert (signifikanter Unterschied) gegenüber Schweinecornea^E (Schlachttiere gebrüht, vgl. Material und Methoden); für P der 1,3fache Wert.

□Ein Zusatz von 12,5% HP-γ-CD zu 0,5% (bezogen auf die Base) MEP führte an beiden Membranen zur Abnahme des P_eff auf etwa die Hälfte, was eine Einschlussverbindung und folglich verzögerte Arzneistofffreisetzung vermuten lässt. Die entsprechenden Versuche mit HP-β-CD zeigten an Schweinecornea^E eine Permeationszunahme für MEP um den Faktor 1,73 (lag time: 90 min). Bei Verwendung von Schweinecornea^T erfolgte dagegen eine nichtsignifikante Abnahme des P_eff um etwa die Hälfte.

□HP-α/β/γ-CD änderte die Permeationsparameter (P_eff und Q₃₀₀) von P nicht signifikant (Schweinecornea^E). In Kombination mit MEP ergab sich allerdings eine signifikante Abnahme in Gegenwart von HP-β- bzw. HP-γ-CD. Auch für MEP konnte ein analoger Effekt in den Kombinationspräparaten erfasst werden.

□Der Vergleich der Q₃₀₀-Werte von MEP und P aus der Kombination demonstrierte generell eine signifikante Abnahme in Anwesenheit von HP-α/β/γ-CD in Gegenüberstellung zur CD-freien Kombination. Diese Ergebnisse lassen sowohl auf Arzneistoff-Arzneistoff- als auch auf Arzneistoff-CD-Interaktionen schließen, die allerdings mit den angewandten Methoden (X-RD und FTIR) nicht verifiziert werden konnten.

□Die vergleichende Permeation von PIN, das mit HP-β/γ-CD 0,15%ig in Lösung gebracht wurde, zeigte gegenüber einem verdünnten CD-freien Fertigpräparat (Pindoptan^®) lediglich eine tendenzielle Abnahme.

□Löslichkeitsstudien mit PIN in GBR (pH = 7,4) brachten dessen höchste Sättigungslöslichkeit für HP-β-CD (10%) nach Autoklavieren gegenüber Wasser als Lösungsmittel.

Mycophenolatmofetil (MMF) und Mycophenolsäure (MPA)

Die In-vitro-Permeabilität von Mycophenolatmofetil (MMF) durch isolierte Schweinecornea wurde in früheren Studien unserer Arbeitsgruppe untersucht [203]. Sie wurde mit einer 1%igen MMF-Lösung, die 10% HP-β-CD enthielt, durchgeführt. GBR pH 7,4 diente hierfür als Lösungsmittel in Donator- und Akzeptorkompartiment. Um eine klare Lösung zu erhalten, war ein Autoklavierungsprozess unter Standardbedingungen (121°C, 200 kPa, 15 min) erforderlich. Dabei erfolgte jedoch eine partielle Esterhydrolyse des Prodrugs MMF. Die HPLC-Analytik ergab 56% MPA; dementsprechend verblieben 44% der Ausgangsverbindung MMF [203]. Tabelle 23 gibt einige Parameter der Ausgangslösung bzw. -komponenten wieder.

RI: Brechungsindex; OS: Oberflächenspannung
1% MMF

Medium

Viskosität

η [mPas]

Osmolalität

[mOsmol/kg]

RI

Dichte ρ

[g/cm³]

OS σ

[mN/m]

pH

sine CD

GBR

0,825

364

1,331

1,001

58,45

7,32

10% HP-β-CD

GBR

0,990

410

1,348

1,035

55,13

7,28

Tabelle 23 : Physikalische Kenngrößen einer MMF/HP-b-CD-Lösung; nach [202]

Der bestimmte Verteilungskoeffizient (n-Octanol/GBR pH 7,4) für MMF betrug 23,41; derjenige für MPA 3,73. Der Verteilungskoeffizient (n-Octanol/HP-β-CDhaltige Testlösung) wurde für MMF mit 12,25 und für MPA zu 0,46 ermittelt, d.h. durch CD wird die Hydrophobie sowohl des Esterprodrugs als auch der freien Säure deutlich gesenkt [203].

Aus den Permeationsstudien der Vorläuferarbeit [203] ergab sich, dass MMF in drei von zehn Zellen im Akzeptormedium nicht detektierbar war; in sieben Zellen betrug die Permeationsrate (Schweinecornea^E) nach 300 min für MMF lediglich 0,23% (0,38 µg/ml). Ein P_eff für MMF wurde nicht berechnet, da messbare Konzentrationen von MMF teilweise zeitlich stark verzögert (t > 210 min) zu erfassen waren. Hingegen konnte ein linearer Zusammenhang zwischen permeierter MPA-Konzentration und der Versuchsdauer beschrieben werden. Der P_eff betrug 2,81 ± 1,03·10^-6cm/s. Die Permeationsrate war ebenfalls niedrig. Nach 300 min gelangten lediglich 1,00 ± 0,38% (2,42 ± 0,97 µg/ml) der Ausgangskonzentration an MPA in das Akzeptorkompartiment.

Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die metabolische Aktivität des isolierten Gewebes erhalten blieb und das im Donator vorliegende Prodrug bei der Membranpassage nahezu vollständig enzymatisch gespalten wurde.

In der folgenden Studie sollten die okulare Verträglichkeit sowie die intraokulare Verfügbarkeit und Verteilung von MMF aus einer Mycophenolatmofetil-Lösung (MMF/CD; Ausgangskonzentration: 1% MMF, 10% HP-β-CD) sowie aus einer 1%igen MMF-Suspension (MMF/SP) am Kaninchen untersucht werden. Im Gegensatz zu den Experimenten in vitro mit GBR pH 7,4 wurden die MMF-Lösungen bzw. -Suspensionen in Phosphatpuffer nach Sørensen (SPP) pH 7,4 (s. Material und Methoden, VI.2.4.4.1) hergestellt, um einer realistischen Augentropfen-formulierung eher zu entsprechen. Die Hydrolyse von MMF zu MPA nach dem Autoklavierungsprozess erfolgte analog zum GBR-Medium (Material und Methoden, VI.2.6.1). Darüber hinaus wurde zum Vergleich das okulare Verteilungsverhalten einer entsprechenden MPA-Lösung (MPA/CD: 1% MPA, 10% HP-β-CD) analysiert.

Intraokulare MMF / MPA-Verteilung

Nach Applikation von jeweils 5 x 50 µl (Material und Methoden, VI.2.6) einer 1%igen MMF/CD-Lösung bzw. -Suspension (Material und Methoden, VI.2.6.1) an jeweils vier Kaninchen wurden nach 30, 60 bzw. 240 min die Tiere getötet und anschließend die zu untersuchenden Flüssigkeiten und Gewebe entnommen (Material und Methoden, VI.2.6.3). Die Konzentrationen an MMF und MPA wurden in den Flüssigkeiten Kammerwasser (KW), Glaskörper (GK) und Plasma (P) sowie in den festen Geweben Cornea (CR), Sclera (SC), Conjunctiva (CJ) und Iris-Ziliarkörper (IZ) bestimmt. Nach Aufarbeitung und analytischer Auswertung war nach MMF/CD-Applikation lediglich die aktive Wirksubstanz MPA nachzuweisen (Abb. 26 - Abb. 29), nicht mehr das Prodrug MMF. Äußerst geringe Konzentrationen an MMF ließen sich dagegen nach Applikation von MMF/SP in den okularen Geweben detektieren (Abb. 30).

Abb. 26 präsentiert die Kammerwasser-Spiegel zu den drei Versuchszeiten 30, 60 und 240 min. Nach 30 min konnten sowohl für MMF/CD als auch für MMF/SP etwa gleiche, relativ hohe Wirkstoffkonzentrationen im Kammerwasser nachgewiesen werden (23,98 ± 3,16 bzw. 24,49 ± 2,14 µg/ml). Nach Applikation von MMF/CD war die MPA-Konzentration dagegen nach 60 min im Vergleich zu MMF/SP signifikant auf das 4,3fache erhöht (52,20 ± 16,81 gegenüber 14,71 ± 3,92 µg/ml). Sowohl nach Verabreichung der CD-Lösung als auch der Suspension war MPA noch nach 240 min analytisch zu erfassen, wenn auch in sehr niedrigen Konzentrationen (1,59 ± 0,18 bzw. 1,08 ± 0,63 µg/ml).

Abb. 26 : MPA-Spiegel im Kammerwasser des Kaninchenauges nach Applikation von MMF/CD und MMF/SP; Mittelwert ± SD (n = 4); *signifikanter Unterschied zwischen MMF/CD und MMF/SP für p < 0,05 (t-Test und Single-Factor-Anova)

Wie aus Abb. 27 hervorgeht, fand sich auch in Cornea, Sclera und Conjunctiva nach 60 min ein durch MMF/CD signifikant erhöhter MPA-Spiegel im Vergleich zu MMF/SP. Im Gegensatz dazu war der MPA-Spiegel in der Conjunctiva nach 30 min signifikant niedriger für MMF/CD (6,75 ± 7,84·10^-6µg/µg), verglichen mit MMF/SP (30,15 ± 4,89·10^-6µg/µg).

Berechnet man die Gesamtkonzentration für die jeweilige Formulierung zum Zeitpunkt 30 bzw. 60 min, indem man die durchschnittlichen Einzelwerte für Cornea, Conjunctiva, Sclera und Iris-Ziliarkörper addiert, ergibt sich folgendes: Nach 30 min wird für MMF/SP eine höhere Gesamtkonzentration erreicht (1,29fach höher als MMF/CD). Nach 60 min hingegen, ist die Gesamtkonzentration an MPA für MMF/CD 2,36fach höher verglichen mit MMF/SP.

Abb. 27 : MPA-Gewebespiegel im Kaninchenauge nach Applikation von MMF/CD und MMF/SP; Mittelwert ± SD (n = 4); *signifikanter Unterschied zwischen MMF/CD und MMF/SP für p < 0,05 (t-Test und Single-Factor-Anova)

Darüber hinaus wurden die unterschiedlichen galenischen Zubereitungen (MMF/CD, MMF/SP) durch einen zweifaktoriellen (Two factor-) Anova-Test (Material und Methoden, VI.2.9.1) statistisch geprüft. Hierbei wurden die einzelnen Zeitpunkte („time effect“) sowie die Formulierungen MMF/CD und MMF/SP („type effect“) untereinander verglichen.

Nach diesen Berechnungen waren die Werte zu den einzelnen Zeitpunkten, zu denen die Gewebekonzentrationen bestimmt wurden, für p < 0,05 signifikant verschieden, ebenso die Unterschiede zwischen den Formulierungen MMF/CD und MMF/SP.

Die ermittelten Konzentrationen von MPA im Glaskörper (Abb. 28) waren im Vergleich zum Kammerwasser (Abb. 26) extrem niedrig (549,27 ± 822,55 ng/ml für MMF/CD bzw. 19,13 ± 38,25 ng/ml für MMF/SP nach 30 min) und liegen damit jedoch nur tendenziell für MMF/CD etwas höher. Dieser nichtsignifikante Unterschied besitzt auch keine therapeutische Relevanz. Die Plasmaspiegel wurden in der gleichen, niedrigen Konzentration, nämlich in Nanogramm-Mengen (46,79 ± 62,19 ng/ml für MMF/CD bzw. 547,36 ± 440,31 ng/ml für MMF/SP), bestimmt, wobei die Tendenz hier umgekehrt liegt, indem MMF/SP die etwas höheren Werte erbrachte. Dieser Befund ist als sehr wertvoll zu betrachten, insofern als mögliche systemischen Nebenwirkungen durch Anwendung von MMF/CD minimiert sein müssten.

Abb. 28 : MPA-Spiegel im Glaskörper des Kaninchenauges nach Applikation von MMF/CD und MMF/SP; Mittelwert ± SD (n = 4)

Abb. 29 : MPA-Spiegel im Plasma des Kaninchenauges nach Applikation von MMF/CD und MMF/SP; Mittelwert ± SD (n = 4)

Hinsichtlich der nachgewiesenen „Restmengen“ an ungespaltenem MMF in den Geweben (Abb. 30) ist es bemerkenswert, dass MMF weder für die CD-haltige Lösung noch für die Suspension in der Cornea gefunden wurde. Das Prodrug MMF war lediglich in Conjunctiva, Sclera und Iris-Ziliarkörper nach Anwendung von MMF/SP zu erfassen. Die MMF-Spiegel blieben insgesamt niedrig und fallen durch hohe Fehler auf (Abb. 30). Verglichen mit den korrespondierenden MPA-Spiegeln betragen sie ca. 10% (Abb. 27).

Abb. 30 : MMF-Gewebespiegel im Kaninchenauge nach Applikation von MMF/SP: Cornea (CR), Conjunctiva (CJ), Sclera (SC) und Iris-Ziliarkörper (IZ); Mittelwert ± SD (n = 4)

Vergleichende MMF- und MPA-Applikation

Tabelle 24 stellt die Konzentrationen an MPA, die nach Applikation von MMF/CD und MPA/CD nach 30 und 60 min erreicht wurden, vergleichend gegenüber. Obwohl die MMF/CD-Formulierung nur noch ungefähr 50% intaktes MMF und demzufolge ungefähr 50% MPA enthielt (Material und Methoden, VI.2.6.1), lagen die erzielten MPA-Spiegel überwiegend höher als diejenigen, die aus der direkten MPA/CD-Applikation resultierten. Lediglich die Plasmaspiegel und der 30 min-Wert der Conjunctiva zeigten eine Tendenz zu höheren Werten durch MPA/CD. Ersteres begünstigt wiederum MMF/CD im Hinblick auf Verminderung potentieller systemischer Nebenwirkungen. Letzteres spricht für eine Präferenz des nicht-cornealen/conjunktivalen Absorptionsweges der freien Säure und weist auf ein verzögertes Anfluten von MPA aus dem Prodrug hin, das zunächst esteratisch gespalten werden muss. Hinsichtlich der Plasmawerte und der zu erwartenden systemischen Effekte wäre demnach die MMF/CD-Formulierung zu bevorzugen. Jedoch reicht die Anzahl von nur vier Versuchstieren, wie auch die hohen Standardabweichungen erkennen lassen, nicht aus, um eindeutige Aussagen zu treffen.

KW: Kammerwasser, GK: Glaskörper, P: Plasma, CR: Cornea, SC: Sclera, CJ: Conjunctiva, IZ: Iris-Ziliarkörper; Mittelwert ± SD (n = 4) außer (1) n = 2
Flüssigkeit/

MPA/CD

MMF/CD

Gewebe

Dimension

30 min

60 min

30 min

60 min

KW

[µg/ml]

6,4 ± 2,3

5,1 ± 2,9

24,0 ± 3,2

52,2 ± 16,8

GK

[ng/ml]

72 ± 38

42 ± 58

549 ± 823

689 ± 608

P

[ng/ml]

931 ± 93

126 ± 224

47 ± 62

40 ± 47

CR

[10^-6µg/µg]

25,4 ± 14,6

16,3 ± 4,9

90,8 ± 21,2

56,9 ± 6,9

SC

[10^-6µg/µg]

7,7 ± (¹)

2,0 ± 0,8

11,9 ± 5,9

14,1 ± 2,9

CJ

[10^-6µg/µg]

16,4 ± 17,8

1,5 ± 2,5

6,8 ± 7,8

21,1 ± 8,3

IZ

[10^-6µg/µg]

0,03 ± 0,07

0,06 ± 0,12

6,8 ± 4,7

5,4 ± 6,0

Tabelle 24 : MPA-Spiegel (30 und 60 min) im Kaninchenauge nach Applikation von MPA/CD bzw. MMF/CD

Mitreaktion des unbehandelten Auges

Die Applikation von MMF/CD, MMF/SP und MPA/CD erfolgte ausschließlich in den Bindehautsack des rechten Auges. Das linke Auge blieb unbehandelt (Referenzauge), wurde aber analog zum rechten Auge aufgearbeitet (s. Material und Methoden, VI.2.6.3). Das Prodrug MMF konnte in keinem Fall in den Geweben des Referenzauges detektiert werden. Auch MPA wurde in Conjunctiva, Iris-Ziliarkörper und Glaskörper zu keinem Zeitpunkt nachgewiesen. Dagegen wurden wider Erwarten nach Applikation aller drei Formulierungen geringe Mengen an MPA im Kammerwasser quantifiziert. Nach Verabreichung von MMF/SP wurde zum Zeitpunkt 240 min MPA in der Cornea der vier unbehandelten Augen erfasst. In der Sclera konnte nach Applikation von MMF/CD nach 60 min in einem Auge eine Minimalkonzentration detektiert werden (Tabelle 25).

Auffallend an diesen Auswertungen ist, dass nach Applikation der MMF-Suspension schon nach 30 min in allen vier Augen nachweisbare MPA-Konzentrationen vorhanden und nach 60 min sogar noch weiter erhöht waren (Tabelle 25). Nach 240 min war im Kammerwasser kein MPA mehr detektierbar, wohl aber in der Cornea (Tabelle 25).

KW: Kammerwasser; SC: Sclera; CR: Cornea; n = 4; (-): nicht nachweisbar (Bestimmungsgrenze: 0,04 µg/ml); ¹bezogen auf das rechte, mit Augentropfen (MMF/CD, MMF/SP bzw. MPA/CD) behandelte Auge
MMF/CD

KW [µg/ml]

%¹

SC [10^-6µg/µg]

%¹

CR [10^-6µg/µg]

%¹

30 min

0,135/ 0,118/ -/ -
(0,063 ± 0,073)

0,26

-

-

60 min

-

0,143/ -/ -/ -
(0,036 ± 0,072)

0,3

-

240 min

-/ -/ 0,904/ -
(0,226 ± 0,452)

14,2

-

-

MMF/SP

30 min

0,088/ 0,100/ 0,242/ 0,130
(0,140 ± 0,070)

0,57

-

-

60 min

0,509/ 0,354/ 0,185/ 0,210
(0,315 ± 0,150)

0,60

-

-

240 min

-

-

0,187/ 0,459/ 0,418/ 0,492
(0,389 ± 0,138)

15,0

MPA/CD

30 min

0,0370/ -/ -/ -
(0,009 ± 0,019)

0,14

-

-

60 min

-

-

-

Tabelle 25 : MPA-Konzentrationen nach Applikation von MMF/CD, MMF/SP und MPA/CD im Referenzauge (links)

Die Fehler der für MMF/CD und für MPA/CD nachgewiesenen MPA-Konzentrationen sind sehr hoch (115-211%), da in der Mehrzahl der Augen kein MPA detektierbar war. Im Gegensatz dazu sind die Fehler für MMF/SP niedrig (35-50%). Dieser Befund ist darauf zurückzuführen, dass hier − wenn MPA nachgewiesen wurde − MPA in allen vier Augen gefunden wurde.

Das im Kammerwasser des Referenzauges gefundene MPA nach Applikation von MMF/CD beträgt nach 30 min durchschnittlich 0,26% der Konzentration des rechten, behandelten Auges. Hierbei muss angemerkt werden, dass MPA nur in zwei von vier Augen zu erfassen war. Weiterhin wurde nach 240 min nur ein Einzelwert für das Kammerwasser bestimmt, genauso wie nach 60 min für die Sclera.

Aussagekräftiger erscheinen die für MMF/SP bestimmten Werte. Nach 30 min konnten 0,57%, nach 60 min 0,30% im Kammerwasser des Referenzauges nachgewiesen werden (verglichen mit dem rechten, mit MMF/SP behandelten Auge). Auffallend ist außerdem die MPA-Konzentration nach 240 min in der Cornea, die sogar 15% verglichen mit dem rechten Auge darstellt. Diese Daten sind vergleichbar mit den für MMF/SP gefundenen deutlich höheren Plasmaspiegeln verglichen mit MMF/CD.

Insbesondere die Daten für MMF/SP verdeutlichen, dass eine Mitreaktion des unbehandelten Auges zumindest mit in Erwägung gezogen werden sollte. Man kann davon ausgehen, dass MPA die Blut-Kammerwasserschranke (Theoretische Grundlagen, III.1.3) teilweise passieren kann und ein Teil der vom rechten Auge ins Serum gelangten Substanz dann im linken, unbehandelte Auge detektierbar wird. Auch in der Literatur werden solche Effekte beschrieben, z.B. geben systematische Studien nach systemischer Verabreichung von CsA Hinweise auf die Wiederfindung im Kammerwasser [157].

Resümee

Nach topischer Anwendung von Arzneistoffen in der Ophthalmologie gibt es zwei dominante Wege für den Arzneistofftransport ins Auge (Theoretische Grundlagen, III.2.1). Auf dem Hauptweg, den viele lipophile Arzneistoffe bevorzugen, wandert das Molekül aus dem präcornealen Gebiet via Cornea ins Kammerwasser und weiter zu den intraokularen Geweben. Der zweite Weg nach präcornealer Applikation geht über Conjunctiva und Sclera zu den intraokularen Geweben. Die nicht- oder para-corneale Absorption über die Conjunctiva steht bevorzugt großen und überwiegend hydrophilen Arzneistoffmolekülen zur Verfügung [204]. Neben dem polaren bzw. apolaren Charakter (z.B. charakterisiert durch den Verteilungskoeffizienten) eines Arzneistoffs [201] nehmen weitere Stoffeigenschaften Einfluss auf die In-vivo-Verteilung.

Sowohl MMF/CD als auch MMF/SP führten in den vorliegenden Verteilungsstudien am Kaninchenauge bereits nach 30 min zu relativ hohen Konzentrationen an MPA, dem aktiven Teil (Elternverbindung) des Prodrugs MMF, in Cornea und Kammerwasser. Dieses Ergebnis lässt auf bevorzugte Affinität des lipophilen MMF zum lipophilen cornealen Epithel schließen, in dem das Prodrug rasch durch Esterasen gespalten wird. Für Hornhauttransplantationen, nach denen hohe Konzentrationen an MPA in Cornea und Kammerwasser angestrebt werden, könnte dieser Effekt von Bedeutung sein.

Es fällt auf, dass nach MMF-Applikation nur der aktive Metabolit MPA in Cornea und Kammerwasser nachzuweisen war. Dieser Befund entspricht den von Babiole et al. [11] berichteten Ergebnissen zur cornealen Permeabilität von Unoprostonisopropyl, das ebenfalls ein Esterprodrug darstellt. Diese Studie beschäftigte sich mit der cornealen Permeation des Prostaglandin-Prodrugs und seines Metaboliten, der eigentlichen Wirkkomponente, durch isolierte Schweinecornea in vitro. Im Fokus der zitierten Arbeit stand die enzymatische Arzneistoffhydrolyse im cornealen Epithel von Schweineaugen. Darüber hinaus wurde der Arzneistoffmetabolismus an isolierten Gewebehomogenaten untersucht. Auch in dieser Studie ließ sich nach In-vitro-Permeation durch intakte Schweinecornea (mit Epithel) lediglich der Metabolit (d.h. die freie Säure) im Akzeptorkompartiment detektieren. Der lipophile Ester Unoprostonisopropyl war so gut wie nicht in der Lage, die Cornea ohne Epithel, d.h. primär das Stroma, zu permeieren. Wurde dagegen die entsprechende freie Säure im Donatorkompartiment vorgelegt, verhielt sich die corneale Permeabilität genau umgekehrt: die freie Säure permeierte kaum die intakte Cornea. Wurde jedoch das Epithel entfernt, resultierte ein stromaler P_eff in der gleichen Größenordnung wie zuvor für das Prodrug nach Passage der intakten Cornea. Babiole et al. [11] wiesen die Hauptesteraseaktivität im cornealen Epithel nach. Offensichtlich ist die Esterhydrolyse im Epithel zum hydrophileren Metaboliten Voraussetzung für die weitere Permeation der wirksamen Elternverbindung durch Stroma und Endothel bis zum Kammerwasser. Auch andere Autoren berichten von einer hohen Esteraseaktivität im cornealen Epithel [37, 110, 111]. Die Esteraseaktivität weist speziesspezifische Unterschiede auf. Rinderaugen zeigen gegenüber Kaninchen eine höhere Esteraseaktivität im Stroma [111], während beim Kaninchen erhebliche Unterschiede in der Zusammensetzung der Esterasensubgruppen zwischen pigmentierten und Albino-Kaninchen gefunden wurden [110].

Weiterhin muss in der vorliegenden Studie mit in Betracht gezogen werden, dass CDe möglicherweise esteratische Vorgänge katalysieren [219].

Wie die gefundene Arzneistoffverteilung in den Geweben nach Applikation der Suspension (MMF/SP) verdeutlicht (Abb. 30), wird von MMF partiell auch der nicht-/para-corneale Weg über Conjunctiva, Sclera und Iris-Ziliarkörper zurückgelegt. Allerdings konnten nur sehr niedrige Gewebekonzentrationen mit extrem hohen Fehlerschwankungen nachgewiesen werden (z.B. nach 30 min: CJ: 3,77 ± 3,87; SC: 1,18 ± 3,87; IZ: 3,77 ± 3,77∙10^-6µg/µg und ähnlich nach 60 min) (Abb. 30). Diese okularen Gewebe sind weniger lipophil als das corneale Epithel und verfügen deshalb über eine weitaus geringere Affinität zum lipophilen Prodrug MMF. Außerdem ist die Esteraseaktivität in der Conjunctiva geringer, was ebenfalls zur Erklärung des nachgewiesenen Prodrugs in Conjunctiva, Sclera und Iris-Ziliarkörper nach partikulärer MMF-Applikation in Form der Suspension herangezogen werden kann.

Wurde direkt die freie Mycophenolsäure als CDhaltige Formulierung (MPA/CD) appliziert, resultierte eine weit geringere Penetrationsrate für MPA als nach Gabe der Prodrug-Lösung (MMF/CD; ca. 50% MPA enthaltend). Es wurden lediglich 25% der Kammerwasser-konzentration nach 30 min und 10% nach 60 min erreicht (vgl. Gegenüberstellung Tabelle 24). Dieses Ergebnis entspricht dem Prodrug-Konzept [93, 112, 231], bei dem das lipophilere Prodrug die entscheidende, biologische Barriere überwindet und dann an seinem Zielort in seine aktive(n) Komponente(n) gespalten wird.

Weiterhin veranlassten die vorliegenden Daten zur Diskussion über den transcornealen sowie den para-cornealen Penetrationsweg lokal applizierter Pharmaka am Auge allgemein [19]. MMF wurde in diesem Zusammenhang lediglich als Modellsubstanz betrachtet.

Über die Anteile der beiden Penetrationswege liegen nur wenige Untersuchungen vor. Der trans-corneale Weg kann beispielsweise durch Versiegelung der cornealen Oberfläche mit einer aufgeklebten Kontaktlinse blockiert werden [4]. Bei derartigen experimentellen Ansätzen können allerdings erhebliche Artefakte entstehen, da davon auszugehen ist, dass die Blockade eines Transportwegs gleichzeitig zur Erhöhung des über den anderen Weg penetrierten Substanzanteils führt [19]. Günstiger erscheinen dagegen Untersuchungen, die auf dem Einsatz von Substanzen (wie z.B. MMF) beruhen, die bei transcornealer bzw. para-cornealer Penetration quantitativ unterschiedlich metabolisiert werden. Der Anteil der jeweils penetrierten bzw. permeierten Substanz kann dann durch Messung der entsprechenden Metaboliten bestimmt werden. Eine ausführliche Diskussion zu diesem Thema lässt sich bei Bertelmann et al. [19] nachlesen.

Nach subjektiver, makroskopischer Beurteilung wurde die MMF/CD-Lösung von allen Kaninchen gut vertragen. Im Gegensatz dazu war bei den mit der MMF/SP-Suspension behandelten Tieren eine leichte Hyperämie zu beobachten. Die gute okulare Verträglichkeit von HP-β-CD [61, 107, 129], die bereits zur Auswahl dieses CD-Derivats bewogen hatte, konnte somit auch in den vorliegenden Studien bestätigt werden.

HP-β-CD ist, wie auch andere CDe, in der Lage, lipophile Arzneistoffe in Lösung zu bringen, ohne deren lipophilen Charakter zu ändern [63]. Die gefundene Zunahme der Arzneistoffverfügbarkeit in Anwesenheit von HP-β-CD ist auf eine schnelle Dissoziation des Arzneistoff/CD-Komplexes zugunsten des freien Arzneistoffmoleküls vor dem Epithel zurückzuführen. Weiterhin lässt diese Studie, wenn man die MPA-Konzentrationen nach Applikation von MMF/CD im Kammerwasser (Abb. 26) nach 60 min betrachtet, einen die Wirkungsdauer verlängernden, retardierenden Arzneistofffreisetzungsprozess vermuten.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die MMF/CD-Formulierung (und mit Einschränkung auch MPA/CD) zu therapeutisch relevanten Wirkstoffkonzentrationen im Kaninchenauge (Cornea, Kammerwasser) führen. Die im Glaskörper erzielten Konzentrationen für MMF/CD, MMF/SP und MPA/CD sind hingegen an der Grenze der biologischen Wirksamkeit von MPA in vitro (Proliferationshemmung von Lymphozyten in der Zellkultur) [6]. Aufgrund der erheblich niedrigeren MPA-Konzentrationen im hinteren Augenabschnitt (s. Abb. 28, Tabelle 24), ist eine Wirksamkeit des topisch applizierten MMF bei der intermediären und der posterioren Uveitis eher nicht zu erwarten. Für immunmediierte Erkrankungen der okulären Oberfläche und des vorderen Segments könnte die topische Therapie mit MMF dagegen einen vielversprechenden Ansatz darstellen [19]. Dieser Befund ist außerdem von Bedeutung in Hinblick auf Anwendung nach Keratoplastik (s. Theoretische Grundlagen, III.2.3).

Noch unveröffentlichte Daten aus der Kooperation mit den klinischen Ophthalmologen [166] demonstrieren die potentielle Eignung von MMF/CD zur topischen Anwendung bei endotoxininduzierter Uveitis. Als Versuchstiere wurden Lewis-Ratten verwendet. Bereits acht Stunden nach Induktion (intraperitoneale Injektion von Salmonella Typhimurium) der Uveitis zeigte die Behandlung mit MMF/CD eine Tendenz, die zelluläre Entzündungsreaktion in der vorderen Augenkammer im Vergleich zur Kontrollgruppe zu hemmen. Allerdings erwies sich die MMF/CD-Gruppe in Bezug auf den entzündungshemmenden Effekt gegenüber einem Fertigpräparat, das 1% Prednisolon enthielt, als unterlegen [166].

Kapitelzusammenfassung

□Die intraokulare Wirkstoffverteilung in Kammerwasser, Cornea, Sclera, Conjunctiva und Iris-Ziliarkörper nach Applikation von MMF/CD, MMF/SP bzw. MPA/CD wurde nach 30, 60 und 240 min bestimmt. Zusätzlich wurden die Plasmaspiegel ermittelt.

□Es konnte nach topischer Anwendung von MMF/CD lediglich die aktive Wirksubstanz MPA nachgewiesen werden. Ausschließlich nach Applikation von MMF/SP waren Minimalkonzentrationen an MMF in Conjunctiva, Sclera und Iris-Ziliarkörper detektierbar.

□In der Cornea konnte MMF in keinem Fall gefunden werden, was auf eine hohe Esteraseaktivität im cornealen Epithel zurückzuführen ist (esteratische Spaltung von MMF zu MPA). Letztere ist in Conjunctiva, Iris-Ziliarkörper und Sclera deutlich niedriger.

□Nach Applikation von MMF/CD waren die MPA-Kammerwasserspiegel nach 60 min, verglichen mit MMF/SP, 4,3fach (signifikant) höher.

□Auch in Cornea, Sclera und Conjunctiva fanden sich nach 60 min durch MMF/CD (signifikant) erhöhte MPA-Spiegel im Vergleich zu MMF/SP. Ein signifikant niedrigerer MPA-Spiegel resultierte dagegen in der Conjunctiva nach 30 min.

□MPA war in Minimalmengen auch im linken, unbehandelten Auge nachzuweisen, insbesondere nach Verabreichung von MMF/SP. Dieser Befund korreliert mit den höheren Plasmaspiegeln bei Anwendung von MMF/CD (verglichen mit MMF/SP).

□Obwohl die MMF/CD-Ausgangslösung nur ca. 50% MMF und folglich ca. 50% MPA enthielt, lagen die bestimmten MPA-Spiegel überwiegend höher als diejenigen, die aus der direkten MPA/CD (100% MPA)-Applikation hervorgingen.

□HP-β-CD wurde in allen Fällen vom Kaninchenauge gut vertragen.

Selektive Glucocorticoidrezeptoragonisten ZK 216771 Rezepturentwicklung

Zur Durchführung der vorgesehenen In-vitro- (Permeation durch isolierte Schweinecornea^T, Penetration in isolierte Schweinecornea^T) und In-vivo-Studien (topische, okulare Behandlung von Ratten nach Keratoplastik) im Hinblick auf eine spätere patientenfreundliche Anwendung war für die neue SEGRA-Verbindung ZK 216771 eine leicht applizierbare, möglichst wässrige Lösung zu entwickeln. Weiterhin sollte die Formulierung stabil und am Auge gut verträglich sein.

L: ZK 216771 [mg/ml]

Cyclodextrin

[%]

W

A

E

g-CD

10

0,116

-

-

20

0,159

-

-

30

0,251

-

-

HP-g-CD

10

0,785

0,669

0,944

20

1,327

1,086

1,044

30

1,782

1,283

1,451

HP-b-CD

10

0,097

0,080

20

0,181

0,186

30

0,225

0,277

Tabelle 26 : Sättigungslöslichkeit (cS) von ZK 216771 in wässrigen Cyclodextrinlösungen

W:

Wasser für Injektionszwecke pH 6,3 bei Raumtemperatur

A:

Erhitzen im Autoklaven unter Standardbedingungen (121°C, 200 kPa, 15 min)

E:

Zusatz von 5% Ethanol bei Raumtemperatur

Zur Löslichkeitsverbesserung der extrem schwerlöslichen Substanz ZK 216771 (Theoretische Grundlagen, III.3.4) kamen bevorzugt CDe in Betracht. Die mit 10, 20 oder 30% γ-CD, HP-γ-CD bzw. HP-β-CD erzielten Sättigungslöslichkeiten in Wasser (pH = 6,3) (Material und Methoden, VI.2.3.2.3) sind in Tabelle 26 wiedergegeben. Die Ergebnisse lassen eine CD-Konzentrationsabhängigkeit erkennen und zeigen für HP-γ-CD den besten Effekt (Löslichkeitsverbesserung gegenüber Phosphatpuffer pH 7,4 (7,4 µg/ml) für 20/ 30% HP-γ-CD um den Faktor 179,3/ 240,9). Zusätzliches Anlösen in Ethanol (Endkonzentration 5%) oder Autoklavieren unter Standardbedingungen erbrachten dagegen keinen Vorteil (s. Tabelle 26) bzw. sogar eher Nachteile.

Um eine vermutlich therapeutisch relevante Konzentration zu erzielen, wurde eine 0,12-1%ige Konzentration von ZK 216771 angestrebt. Die in diesem Bereich liegenden Werte der HP-γ-CD-Serie sind in Tabelle 26 kursiv geschrieben. Die relevanten, im unteren angestrebten Konzentrationsbereich liegenden Lösungen weisen jedoch einen hohen CD-Gehalt (20/ 30% HP-γ-CD) auf und scheinen zur Anwendung als Ophthalmikum eher ungeeignet. Okulare Irritationen sind nicht auszuschließen und die Arzneistofffreisetzung könnte verzögert sein. Grundsätzlich sollte eine möglichst niedrige CD-Konzentration angestrebt werden [125].

Mit dem Ziel der Erhöhung der ZK 216771-Konzentration bei gleichzeitiger Erniedrigung der CD-Konzentration in der Formulierung wurde durch Manipulierung der Herstellung (s.v.) eine erfolgreiche Rezeptur mit nur 10% HP-g-CD und 2% Ethanol gefunden, die 0,25% des Wirkstoffs enthielt (Tabelle 27). Außerdem enthielt die Lösung 0,04g Natriumchlorid, womit eine annähernde Isotonie erreicht wurde.

Substanzen

Einwaage [g]

ZK 216771

0,025

Ethanol

0,20

HP-γ-CD

1,00

Natriumchlorid

0,040

Wasser für Injektionszwecke

ad 10,0

Tabelle 27 : Rezeptur wässriger Augentropfen von ZK 216771

Diese wässrigen Augentropfen wiesen einen pH-Wert von 6,3 auf und hatten nach fünfwöchiger Überprüfung (Lagerung im Kühlschrank) einen ZK 21677-Gehalt von 91,6%.

Entscheidend für das erfolgreiche Auflösen von 0,25% ZK 216771 war das Hinzufügen der gesamten HP-γ-CD-Menge in Form von Festsubstanz zur ethanolischen Wirkstofflösung unter Rühren und die nachfolgende allmähliche Zugabe des Wassers für Injektionszwecke. Es ist ausdrücklich anzumerken, dass die Herstellung nicht erfolgreich verlief, wenn zur Lösung von ZK 216771 in Ethanol die entsprechende 10%ige wässrige HP-γ-CD-Lösung hinzugefügt wurde.

In-vitro-Permeation

Es wurden in Analogie zu den unter Untersuchungen IV.3 aufgeführten allgemeinen Angaben zur Versuchsdurchführung Permeationsstudien an isolierter Schweinecornea^T durchgeführt. Die Donatorkonzentration an ZK 216771 betrug 0,25%. Der pH-Wert der frisch hergestellten Lösung wurde zu 6,3 ermittelt. Im Akzeptorkompartiment wurde, um den physiologischen Bedingungen nahe zu sein, ein pH von 7,0 gewählt. Die HPLC-Analytik der aus dem Akzeptor (SPP pH 7,0) entnommenen Proben zeigte zwei Peaks mit Retentionszeiten von 2,76 min und 4,59 min, wobei letzterer der Ausgangsverbindung ZK 216771 zuzuordnen war. Wie eine orientierende Stabilitätskontrolle in Lösung (Tabelle 28) ergab, verläuft der ZK-Abbau zeitabhängig (vgl. auch Angaben des Herstellers unter Theoretische Grundlagen, III.3.4).

Zeit [h]

Abbaurate [%]

1,5

5,4

2,5

8,7

3,5

11,5

Tabelle 28 : Stabilität von ZK 216771 in SPP pH 7,0 (33°C)

Bereits nach 30minütiger Permeation konnten lediglich noch Minimalkonzentrationen an ZK 216771 im Akzeptorkompartiment nachgewiesen werden (0,53 ± 0,11 µg) und nach 60 min war der Peak für die intakte Substanz ZK 216771 (Retentionszeit 4,59 min) verschwunden. Die Konzentration des bisher nicht näher charakterisierten polareren Abbauprodukts (Retentionszeit: 2,76 min, „Reversed Phase“-Säule) nahm dagegen bis zum Versuchsende (300 min) kontinuierlich zu.

Da die Struktur dieses polareren Abbauprodukts nicht bekannt ist und somit keine HPLC-Gehaltsbestimmung mittels internem oder externem Standard möglich war, ließen sich die Konzentrationen nicht exakt bestimmen. Alternativ wurde die Ausgangsverbindung ZK 216771 als externer Standard verwendet. Die lineare Regression der zeitabhängigen Permeationswerte ergab eine Gerade (Abb. 31) mit dem Korrelationskoeffizienten R² = 0,987. Bei einer Permeationsfläche von 0,5 cm² errechnet sich daraus ein Flux zu 0,0342 µg/(min·cm²) (Theoretische Grundlagen, IV.3.1.2).

Das rasche Verschwinden der Ausgangsverbindung im Akzeptorkompartiment kann einerseits durch pH-bedingte chemische Instabilität von ZK 216771 (s. Theoretische Grundlagen, III.3.4) verursacht sein; andererseits muss auch an einen enzymatischen Abbau im cornealen Epithel gedacht werden. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob dieses Abbauprodukt pharmakologisch aktiv ist. Letzteres ist nach bisherigen Untersuchungen von Schering nicht der Fall [198].

Abb. 31 : Kumulative Permeabilitätsraten durch isolierte SchweinecorneaT für das polarere Abbauprodukt von ZK 216771 (Kalibrierung mit der Ausgangsverbindung); Mittelwert ± SD (n = 5)

Der Befund, dass nach 3,5 h beim Versuchs-pH-Wert von 7,0 lediglich 11,5% Zersetzung gefunden wurden (Tabelle 28), spricht eher für eine enzymatische Spaltung in der biologischen Membran (vermutlich im cornealen Epithel, da hier die Enzymaktivität am höchsten ist).

Eine Zersetzung im Donatorkompartiment ist aufgrund des pH-Wertes von 6,3 sehr unwahrscheinlich. Eine hydrolytische Spaltung durch Enzyme im cornealen Epithel könnte an der Säureamidgruppierung (s. Strukturformel, Theoretische Grundlagen, III.3.4/ III.3.5) erfolgen und zur Säurekomponente sowie zum primären Amin führen. Außerdem kann eine Hydrolyse des Benzoxazinonringes erfolgen [198]. Hier sind noch umfangreiche Untersuchungen an ZK 216771 durchzuführen.

ZK 247756 Rezepturentwicklung

ZK 247756 und ZK 216771 unterscheiden sich durch die Substituenten am Phenylring (Theoretische Grundlagen, III.3.4/ III.3.5). Während ZK 216771 durch eine Hydroxygruppe am C 2 des Phenylrests substituiert ist, trägt ZK 247756 ein Cl-Atom in dieser Position. Weiterhin fehlt bei ZK 247756 das Br-Atom in para-Stellung zu diesem Substituenten, und ein Cyclopropylring steht anstelle von zwei Methylgruppen am C 4 des Pentanamids. Die phenolische OH-Gruppe von ZK 216771 scheint hauptverantwortlich für dessen bessere Wasserlöslichkeit (7,4 mg/l) zu sein, unterstützt durch die Bromierung in para-Stellung
(-I/+M Effekt).

¹Gemischte Mizellen: s. Material und Methoden, VI.2.7.2
Lösungsmittel/Formulierung

ZK 247765 [mg/ml]

25% Ethanol

unlöslich

25% Propylenglycol

unlöslich

25% Macrogol 400

0,03

30% γ-CD

unlöslich

30% HP-β-CD

0,05

30% Sulfobutylether-β-CD (Captisol^®)

0,05

15% Polysorbat 80

1,290

20% Polysorbat 80

2,274

Gemischte Mizellen¹

1,023

Tabelle 29 : Löslichkeit von ZK 247756 bei pH 4,0; nach [182]

ZK 247756 ist wesentlich schlechter wasserlöslich (2,6 mg/l), weshalb auch die für ZK 216771 entwickelte Rezeptur (Material und Methoden, VI.2.7.1) nicht zum Erfolg führte. Ein erprobter Zusatz von Propylenglykol (bis zu 15%) zu dem in Ethanol gelösten ZK 247756 war ebenfalls nicht erfolgreich.

Vorhergehende, von Renz et al. [182] bei pH 4,0 durchgeführte Löslichkeitsstudien sind in Tabelle 29 zusammengefasst und zeigen bescheidene Erfolge. Lediglich hochkonzentrierte Polysorbat 80-Lösungen (15/20%) erbrachten Löslichkeiten im auch hier angestrebten Bereich von 0,12-1%. Obwohl eine hochkonzentrierte Tensidlösung zur ophthalmologischen Anwendung nicht optimal sein dürfte, wurde die 20%ige Polysorbat-Lösung (allerdings bei einem pH-Wert von 6,3) in die Permeationsstudien einbezogen.

Da für die vorgesehenen In-vitro- und In-vivo-Versuche eine Formulierung, in der ZK 247756 in gelöster Form vorliegt, angestrebt wurde, war eine weitere Idee, diese extrem schwer lösliche Substanz durch Anwendung einer Mikroemulsion (ME) als lösungsvermittelnde Grundlage zu formulieren. In unserer Arbeitsgruppe lagen bezüglich der Solubilisierung schwerlöslicher Substanzen in MEen bereits Erfahrungen vor [17, 184]. Deshalb wurde die in Tabelle 30 aufgeführte ME-Rezeptur von Wendorff und Keipert [241] auf ihre Eignung überprüft.

Hilfsstoffe

Anteile

Rizinusöl

1 T

Cremophor^® RH 40

4 T

Macrogol 300

2 T

Wasser für Injektionszwecke

13 T

Tabelle 30 : Mikroemulsion (ME) zur okularen Anwendung; nach [241]

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser ME (Tabelle 30) sind für eine ophthalmologische Anwendung geeignet, was bereits durch die reizlose Verträglichkeit in Tierversuchen (Kaninchen) bestätigt werden konnte [241].

Jedoch konnte ZK 247756 auch mit Hilfe dieses tensidhaltigen Mehrkomponentensystems nicht in ausreichender Konzentration (mindestens 0,12%ig) in Lösung gebracht werden. Erst durch zusätzliche Einarbeitung von 15% HP-γ-CD (s. Material und Methoden, VI.2.7.2) war ZK 247756 in einer Konzentration von 0,25% (entsprechend der Formulierungsentwicklung von ZK 216771) zu lösen. Es resultierte die in Tabelle 32 aufgeführte Rezeptur (ME-CD-SEGRA).

Parameter

Meßgröße

Aussehen

klar

Viskosität

14,4 mPas (25°C)

Oberflächenspannung

40,2 mN/m^(RT)

Brechungsindex

1,381 (25°C)

pH

5,67 (RT)

Osmolalität

1190 mOsmol/kg

Leitfähigkeit

202,02 µS/cm (25°C)

Dichte

1,031 g/cm³ (25°C)

Partikeldurchmesser

(bezogen auf Viskosität u. Brechungsindex der a. Zubereitung/ b. von Wasser)

a. 9/ b. 112 nm

Tabelle 31 : Physikalisch-chemische Eigenschaften der Mikroemulsion (ME);
nach [241]

Ein präziser Herstellungsgang, bei dem zunächst der Wirkstoff mit dem CD-Derivat in wenig ME anzurühren und sukzessive bis zur Klarheit mit weiteren ME-Anteilen unter Rühren aufzufüllen war, musste eingehalten werden.

Substanzen

Einwaage [g]

ZK 247756

0,025

HP-γ-CD

1,5

Mikroemulsion nach Tabelle 30

ad 10,0

Tabelle 32 : Augentropfenrezeptur für ZK 247756
(Mikroemulsionsbasis; ME-CD-SEGRA)

Auf systematische Lösungsversuche unter Variation der CD-Konzentration musste aufgrund von Substanzmangel an ZK 247756 bedauerlicherweise verzichtet werden, so dass keine Optimierung erfolgen konnte. Mit 10% HP-γ-CD – in dieser Konzentration kann man von einer guten okularen Verträglichkeit ausgehen – in der Mikroemulsion war allerdings noch keine befriedigende Löslichkeit von ZK 247756 zu erzielen.

In-vitro-Permeation

Bei einem Permeationsversuch der ME-CD-SEGRA (0,25% Wirkstoff) durch isolierte Schweinecornea^T (Material und Methoden, VI.2.4) war ZK 247756 im Zeitraum zwischen 30 und 300 min im Akzeptorkompartiment nicht nachzuweisen. Es bleibt offen, ob ZK 247756 in diesem Zeitraum aus der ME überhaupt zu quantitativen Mengen freigesetzt wurde und/oder eine längere Verweilzeit (Retardierung) in der biologischen Membran (s. auch V.3.2.3) die Ursache für den negativen Nachweis im Akzeptor war. Ein mögliches Zersetzungsprodukt konnte nicht detektiert werden.

Abb. 32 : Kumulative Permeationsraten von ZK 247756 (ME-CD-SEGRA) durch die synthetische Membran Nephrophan®; Mittelwert ± SD (n = 5)

Um den Effekt der Formulierungsparameter auf die Wirkstofffreigabe zu testen, erfolgten daher Diffusionsstudien an der hydrophilen, synthetischen Membran Nephrophan^® (regenerierte Cellulose). Die Permeationrate (Abb. 32) von ZK 247756 aus der ME-Formulierung durch die synthetische Membran war sehr niedrig (Flux = 0,112 µg/(min·cm²)). Nach 300 min erreichten lediglich 18,96 µg das Akzeptorkompartiment, das entspricht 0,76% der Donatorkonzentration. Daraus ist auf starke Fixierung der Wirksubstanz in den ME-Strukturen bzw. auf Komplexierung mit dem HP-γ-CD zu schließen.

Weiterhin wurden an dieser synthetischen Membran Formulierungen von ZK 247756 in 20%iger Polysorbat 80-Lösung (0,23% ZK 247756, s. Tabelle 29) bzw. Rizinusöl (0,25% ZK 247756) orientierend getestet. Bei Permeation aus der tensidhaltigen Lösung war der Arzneistoff in Minimalkonzentrationen erst nach 240 min (1,04 µg = 0,046%) und 300 min (3,35 µg = 0,160%) zu detektieren. Aus Rizinusöl konnten im Akzeptorkompartiment erst nach 300 min 20,6 µg (= 0,81%) nachgewiesen werden. Also resultierte auch in diesem Trägermedium eine starke Retardierung durch Mizelleinschluss bzw. Fixierung im lipophilen Rizinusöl.

Aufgrund dieser In-vitro-Daten konnte eine Anwendung der Rizinusöl- bzw. der Polysorbat 80-Lösung in vivo vorerst nicht empfohlen werden. Die Permeationsrate aus der Mikroemulsion durch die Nephrophan^®-Membran war zwar sehr gering, führte aber zu einem linearen Zusammenhang zwischen der Arzneistoffkonzentration im Akzeptor und der Zeit. Eine Korrelierbarkeit mit der In-vivo-Verfügbarkeit ist jedoch nicht abzuleiten.

In-vitro-Penetration

Zur Ermittlung der Wirkstoffaufnahme (Penetration) von ZK 247756 aus ME-CD-SEGRA in isolierte Schweinecornea^T, wurden orientierende Versuche durchgeführt (Material und Methoden, VI.2.5). Bereits nach 30 min waren 160,4·10^-6 ± 27,3·mg/mg penetriert, was bei einem durchschnittlichen Feuchtgewicht der Cornea von 177,2 mg etwa 1,136% der eingebrachten Wirkstoffkonzentration in der ME entspricht (Abb. 33).

Abb. 33 : Penetration von ZK 247756 (ME-CD-SEGRA) in isolierte Schweinecornea, Mittelwert ± SD (n = 4); (*) signifikant zum 30 bzw. 60 min-Wert (t-Test und Single-Factor Anova)

Die penetrierte Menge an ZK 247756 unterscheidet sich nach 30 und 60 min nicht signifikant. Nach 120 min ließ sich eine signifikante Steigerung um den Faktor 1,6 erfassen, was zu der Annahme berechtigt, dass ZK 247756 aus dem Trägersystem retardierend freigesetzt wird.

Diese Ergebnisse ermutigten dazu, eine In-vivo-Anwendung nach Keratoplastik und/oder bei endotoxininduzierter Uveitis in Betracht zu ziehen.

In-vivo-Studie nach Keratoplastik

Die In-vivo-Studie an Lewis (LEW)-Ratten unter Anwendung der ME-Formulierung mit 0,25% ZK 247756 nach Keratoplastik erwies sich als erfolgreich. Tabelle 33 und Abb. 34 fassen die Transplantatüberlebenszeit der unbehandelten Ratten im Vergleich zu den mit ME-CD (wirkstofffreies Trägersystem) bzw. ME-CD-SEGRA behandelten Tieren zusammen. Die Transplantate wurden mikroskopisch bewertet (Material und Methoden, VI.2.7.3.5).

Versuchsgruppe

Therapie

ÜLZ [d]

p

n

Syngene Transplantate
Erklärung, s. Material und Methoden, VI.2.7.3.4

1

keine

> 60

-

12

Allogene Transplantate³

2

keine

11,7 ± 1,2

-

6

3

ME-CD

15,0 ± 1,5

0,114

6

4

ME-CD-SEGRA

42,2 ± 4,0

0,00003

6

Tabelle 33 : Mittlere Transplantatüberlebenszeit (ÜLZ) nach Keratoplastik des rechten Auges bei Lewis-Ratten

Bei Ratten, die syngene Transplantate erhielten (Gruppe 1, Tabelle 33), blieb das Transplantat über 60 Tage klar und wurde nicht abgestoßen. Alle unbehandelten, allogenen Transplantate wurden innerhalb von 2 Wochen (11,7 ± 1,2 d) abgestoßen. Behandlung mit ME-CD führte zu einer leichten, nicht signifikanten Erhöhung der Transplantatüberlebenszeit (15,0 ± 1,5 d) verglichen mit der Referenz (Gruppe 2, Tabelle 33). Im Gegensatz dazu zeigten alle mit ME-CD-SEGRA (Gruppe 4, Tabelle 33) behandelten Tiere eine hohe (im Vergleich zu Gruppe 2 u. 3 signifikant höhere) Transplantatüberlebenszeit (42,2 ± 4,0 d). Wurde die Therapie mit ME-CD-SEGRA abgebrochen, erfolgte anschließend eine Transplantatabstoßung.

Die Therapie mit ME-CD bzw. ME-CD-SEGRA wurde von allen Tieren gut vertragen. Postoperative Komplikationen, wie Infektion, Verlust der Vorderkammer, Ausbildung vorderer Synechien oder Kataraktausbildung [160], traten nicht auf.

Abb. 34 : Transplantatüberlebensrate/ zeit nach Keratoplastik bei Lewis-Ratten

Diese Ergebnisse belegen, dass die lokale Anwendung der ophthalmologischen ZK 247756-Formulierung, die auf der Basis einer HP-γ-CD-haltigen Mikroemulsion als transparente Lösung vorlag, eine hocheffektive Therapie zur Verhinderung der Transplantatabstoßung im tierexperimentellen Modell darstellt [164].

Die zugrunde liegenden Wirkmechanismen sind Ziel gegenwärtiger, weiterführender Untersuchungen. Ferner sind In-vivo-Studien an Ratten nach endotoxininduzierter Uveitis in Planung.

Um die Auswirkung der SEGRA-Therapie auf die Cytokinexpression im Transplantat zu untersuchen, wurden zusätzliche Tiere für PCR-Studien verwendet. Der 7. postoperative Tag wurde für diese Analyse gewählt, da zu dieser Zeit auch unbehandelte Tiere noch keine Abstoßungsreaktion erwarten ließen. Tatsächlich waren alle Transplantate zu diesem Zeitpunkt klar. Die Therapie des cornealen Transplantats mit ME-CD-SEGRA verminderte die mRNA-Spiegel aller untersuchten Cytokine und T-Zell-Marker (IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-10 und CD3). Für IL-4 war diese Abnahme signifikant gegenüber der nichtbehandelten Kontrollgruppe. Detaillierte Ergebnisse finden sich in der Publikation von Pleyer et al., im Druck 2004 [164].

Kapitelzusammenfassung

□Die Sättigungslöslichkeit von ZK 216771 in wässrigen CD-Lösungen war für HP-γ-CD (20 bzw. 30%) am höchsten und erreichte gerade einen therapeutisch relevanten Bereich (0,12-1%). Dieser hohe, erforderliche CD-Zusatz scheint allerdings für eine realistische Augentropfenformulierung ungeeignet.

□Um ZK 216771 bei gleichzeitiger Reduktion des HP-γ-CD-Anteils auf 10% ausreichend lösen zu können (0,25%), wurde ein spezielles Herstellungsverfahren entwickelt, bei dem der Arzneistoff mit 2% Ethanol angelöst wurde.

□Bei der In-vitro-Permeation dieser Formulierung konnte ZK 216771 lediglich nach 30 min in Minimalkonzentrationen im Akzeptorkompartiment nachgewiesen werden. Die Konzentration eines nicht näher charakterisierten, polareren Abbauproduktes nahm hingegen bis zum Versuchsende (300 min) linear zu. Dieses Abbauprodukt – höchstwahrscheinlich erfolgt eine enzymatische Spaltung im cornealen Epithel – ist nach bisherigen Erkenntnissen nicht pharmakologisch aktiv.

□Die äußerst schwerlösliche Substanz ZK 247756 konnte mit Hilfe einer HP-γ-CD-haltigen Mikroemulsion (ME) 0,25%ig in Lösung gebracht werden (ME-CD-SEGRA).

□Bei einem Permeationsversuch von ME-CD-SEGRA durch isolierte Schweinecornea^T war ZK 247756 zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen. Ein analoger Versuch mit synthetischer Membran ergab eine sehr niedrige Permeationsrate von ZK 247756 (Flux = 0,112 µg/(min·cm²)).

□Penetrationsstudien an isolierter Schweinecornea^T von ZK 247756 in ME-CD führten zu einer Wirkstoffaufnahme von 1,136% nach 30 min.

□Eine Behandlung von Ratten mit ME-CD-SEGRA nach Keratoplastik zeigte eine hochsignifikant erhöhte Transplantatüberlebenszeit gegenüber einer „Vehikel“ (ME-CD)-Gruppe bzw. einer unbehandelten Kontrollgruppe.