Zur Erlangung der medizinischen Doktorwürde

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät
der Humboldt-Universität zu Berlin

vorgelegt von Jan Holger Knierim aus Rendsburg

Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. Roland Felix

Gutachter:
1. Priv.-Doz. Dr. med. R.R. Schumann
2. Prof. Dr. A.J. Ulmer
3. Priv.-Doz. Dr. Dr. med. TH. Hartung

eingereicht: 22.12.1999
Datum der Promotion: 16.10.2000

Charakterisierung LPS-inhibierender Effekte von Lipoproteinen und Lipopolysaccharid Bindendem Protein (LBP) in murinem Serum

LPS wird von Gram-negativen Bakterien freigesetzt und führt mit Hilfe von LBP zur Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine aus Monozyten und Makrophagen. Diese von LPS ausgelöste Kaskade, ist entscheidend an der Entstehung der Sepsis beteiligt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die LPS-induzierte Stimulation von Makrophagen durch murines Serum gehemmt werden kann. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit im Mausmodell verdeutlicht werden, welche Rolle Lipoproteine und LBP bei dem protektiven Serumeffekt spielen. Von den in Mausseren verschiedener Mausstämme bestimmten Parametern korrelierte der Phospholipidgehalt relativ gut mit dem inhibitorischen Serumeffekt. Eine Depletion von Lipoproteinen aus den Seren führte zu einer starken Reduktion des inhibitorischen Serumpotentials, während die Verwendung von LBP-defizienten Seren keinen Einfluß auf den Serumhemmeffekt hatte.

Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichte verursachten in Gegenwart von LBP eine deutliche Reduktion der LPS-Effekte, die gut mit ihrem Phospholipidgehalt korrelierte. In Abwesenheit von Serum und LBP konnten Lipoproteine LPS-Effekte auch bei hohen Phospholipidkonzentrationen kaum noch inhibieren. In nativen murinen Lipoproteinen hoher Dichte und lipoproteindefizientem Serum ließ sich LBP nachweisen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß native Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichten als Akzeptoren für LPS dienen können. Ihr inhibitorisches Potential korreliert am besten mit ihrem Phospholipidgehalt. Der Transport von LPS in diese Lipoproteine wird durch LBP katalysiert, was den protektiven Effekt hoher LBP-Konzentrationen erklärt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß LBP nicht der einzige Bestandteil von murinem Serum ist, der LPS in Lipoproteine transferiert. Vermutlich ist bei den, in dieser Arbeit verwendeten Serumkonzentrationen der PLTP-Gehalt ausreichend, diesen LPS-Transfer in Abwesenheit von LBP zu vollziehen.

Bei der Interaktion zwischen Lipoproteinen und LPS handelt es sich um einen physiologischen Weg des Organismus, um auf bakterielle Endotoxine zu reagieren und so der Sepsis entgegenzuwirken. Mit genaueren Kenntnissen über diese Interaktion, bei der Lipidtransferproteine wie LBP und PLTP eine entscheidende Rolle spielen, können eventuell in Zukunft Methoden gefunden werden, diese physiologischen Vorgänge des Körpers zu unterstützen, um so eine Sepsis zu therapieren.

Schlagwörter:
Lipopolysaccharid Bindendes Protein, LBP, Lipopolysaccharid, LPS, Lipoproteine, Sepsis, Mäuse, Serum

Charakterisation of LPS-inhibiting effects of lipoproteins and lipopolysaccharide binding protein (LBP) in murine serum

LPS released by gram-negative bacteria is bound by LBP and initiates the release of proinflammatory cytokines in makrophages and monocytes. These cytokines are thought to play a central role in the pathophysiology of sepsis.

In these studies I was able to show an inhibitory effect of murine serum on the LPS-induced stimulation of macrophages. Furthermore the role of lipoproteins and LBP in this protective effect of serum was investigated.

The inhibitory effect of serum from different mouse strains was best correlated to its phospholipid content. Depletion of serum from lipoproteins strongly reduced its LPS-inhibitory potential while depletion of serum from LBP had no effect.

Murine VLDL, LDL and HDL were found to be potent inhibitors of LPS-effects in presence of LBP. In abscence of LBP the inhibitory effect was much weaker. LBP could be detected in murine HDL and murine lipoproteindeficient serum.

My data shows that HDL, LDL and VLDL can act as acceptors of LPS. Their inhibitory potential is best correlated to their phospholipid content.

LBP catalyses transport of LPS into lipoproteins. This could be an explanation for its protective effect in high doses.

Furthermore it could be shown that LBP is not the only serum component that transfers LPS into Lipoproteins. Possibly the used serum contained enough PLTP to perform this transfer in absence of LBP.

The interaction between Lipoproteins and LPS is a physiological way of the organism to react on endotoxines and inhibit the development of sepsis. PLTP and LBP play major roles in this interaction. Understanding the pathways of LPS-detoxification may help to support the organism‘s physiological answer and establish new methods to treat sepsis.

Keywords:
Lipopolysaccharid binding Protein, LBP, Lipopolysaccharid, LPS, Lipoproteins, Mice, Serum, sepsis

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Charakterisierung LPS-inhibierender Effekte von Lipoproteinen und Lipopolysaccharid Bindendem Protein (LBP) in murinem Serum
Widmung
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungen:
1	EINLEITUNG
1.1	Infektion, Sepsis und Systemisches Inflammationssyndrom (SIRS)
1.1.1	Bedeutung bakterieller Infektionskrankheiten
1.1.2	Definition von Bakteriämie, Systemischem Inflammationssyndrom (SIRS) und Sepsis
1.1.3	Erreger der Sepsis
1.1.4	Die durch Gram-negative Bakterien ausgelöste Sepsis und die Rolle der Monozyten und Makrophagen
1.2	Die Akut-Phase-Reaktion (APR)
1.3	Das Lipopolysaccharid (LPS)
1.4	Das Lipopolysaccharid Bindende Protein (LBP)
1.4.1	LBP ist ein Akut-Phase-Protein
1.4.2	LBP moduliert LPS-Effekte
1.4.3	LBP transferiert LPS in Lipoproteine hoher Dichte (HDL), Detoxifizierung von LPS
1.4.4	Andere Proteine mit Sequenzähnlichkeiten zu LBP und deren Funktion
1.5	Die zellulären LPS-Rezeptoren CD14, Toll-like Rezeptor 2/4 (TLR2/4) und CD11/CD18
1.5.1	Die verschiedenen CD14-Varianten
1.5.2	Der Toll-like Rezeptor (TLR) 2/4
1.5.3	CD11/CD18
1.6	LPS-induzierte Stimulation von CD14-postiven und -negativen Zellen
1.6.1	Die LPS-induzierte, LBP-abhängige Stimulation von CD14-positiven Zellen
1.6.2	Lösliches CD14 dient der LPS-vermittelten Stimulation von Zellen ohne membranständiges CD14
1.7	Serum kann die Wirkung von LPS auf CD14-positive Zellen hemmen
1.7.1	Cationic antimicrobial proteins (CAP)
1.7.2	Lipopolysaccharid Bindendes Protein (LBP)
1.7.3	Transferrin, Gc-globin, 2-Makroglobulin
1.7.4	Lipoproteine und Lipidtransferproteine
1.8	Zielsetzung dieser Arbeit
2	MATERIAL UND METHODEN
2.1	Material
2.2	Methoden
2.2.1	Zellkultur
2.2.1.1	Zellinien
2.2.1.2	Kulturbedingungen
2.2.1.3	Zellstimulation
2.2.2	Toxizitätstests
2.2.2.1	Trypanblau-Färbung
2.2.2.2	Proteinbestimmung der lysierten Zellen
2.2.2.3	LDH-Bestimmung im Zellüberstand
2.2.3	Blutentnahme und Serumpräparation
2.2.4	Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
2.2.4.1	ELISA zur Messung von murinem TNF-
2.2.4.2	ELISA zur Messung murinen LBPs
2.2.5	Isolierung von Lipoproteinen aus Mausseren
2.2.5.1	Sequentielle Flotationsdichtezentrifugation
2.2.5.2	Sterilfiltration
2.2.5.3	Dialyse der isolierten Lipoproteine
2.2.5.4	Kontrolle der Reinheit der isolierten Lipoproteine
2.2.6	Kommerziell erworbene komplette Assays („Kits“)
2.2.6.1	Cholesterinmessung
2.2.6.2	Phospholipidmessung
2.2.6.3	Laktatdehydrogenase-Messung
2.2.7	Proteinbestimmung nach Bradford
2.2.8	Endotoxinmessung
2.2.9	Nachweis von LBP in den Lipoproteinen
2.2.9.1	SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.2.9.2	Transfer des elektrophoretisch aufgetrennten LBP auf Membranen
2.2.9.3	Immunodetektion von LBP (Western Blot)
2.2.10	LBP-Depletion aus NMRI-Serum
2.2.11	Statistik
3	ERGEBNISSE
3.1	Ausschluß toxischer Effekte von Mausseren auf RAW 264.7 Zellen
3.1.1	Zählung der Trypanblau-positiven Zellen pro mm2
3.1.2	Ermittlung der Anzahl der adhärenten Zellen nach Exposition mit Mausserum
3.1.3	Messung der Laktatdehydrogenase im Zellüberstand
3.2	Wirkung von Mausserum auf LPS-stimulierte RAW 264.7 Zellen
3.3	Arbeiten mit Serum von LBP-defizienten (LBP-/-) Mäusen und LBP-depletiertem Serum
3.3.1	Inhibition der LPS induzierten TNF--Synthese von RAW 246.7 Zellen durch Serum von LBP-/- Mäusen in Gegenwart von rekombinantem LBP
3.3.2	Inhibition der LPS-induzierten TNF--Synthese von RAW 246.7 Zellen durch LBP-depletiertes Serum im Vergleich zu Kontrollserum
3.3.3	Inhibition der LPS-induzierten TNF--Synthese von RAW 246.7 Zellen durch Serum von LBP-/- Mäusen in der Abwesenheit von LBP
3.4	Arbeiten mit Lipoproteinen
3.4.1	Ergebnisse der Lipoproteinisolation
3.4.2	Nachweis von LBP in lipoproteindefizentem Serum und Lipoproteinen
3.4.3	Stimulation von RAW 264.7 Zellen mit LPS in Gegenwart von murinen Lipoproteinen und rekombinantem LBP
3.4.4	Stimulation von RAW 264.7 Zellen mit LPS in Gegenwart von rekombinan-tem LBP und lipoproteindefizientem Serum im Vergleich zu Normalserum.
3.4.5	Stimulation von RAW 264.7 Zellen mit LPS in Gegenwart von murinen Lipoproteinen und Abwesenheit von rekombinantem LBP
4	DISKUSSION
4.1	Ausschluß toxischer Effekte von Mausseren
4.2	Serum hemmt LPS-Effekte
4.3	Lipoproteine als Akzeptor des Lipopolysaccharides (LPS)
4.4	Geschwindigkeit der Inaktivierung durch Lipoproteine
4.5	Nachweis von LBP in Lipoproteinen
4.6	Der protektive Effekt von LBP
4.7	Verhalten von Lipoproteinen und LBP im Serum
Bibliographie	Literatur
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:	Schematische Struktur des Lipopolysaccharid (LPS, Endotoxin). LPS ist ein Bestandteil der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Es besteht aus einem nach außen ragenden Zuckeranteil, der bei den verschiedenen Bakterienspezies stark variiert oder gänzlich fehlen kann und einem Lipidanteil, dem Lipid A, welches der Verankerung des Lipopolysaccharids in der Bakterienmembran dient. Der Polysaccharidanteil besteht aus dem inneren und dem äußeren Kern, sowie dem O-Antigen. Die Variabilität der Zucker-strukturen nimmt vom inneren Kern zum O-Anti-gen zu. Lipid A ist für die meisten pathophysio-logischen Eigenschaften des LPS verantwortlich. Sowohl die beiden Phosphatgruppen, als auch die Anzahl, Länge und Verzweigung der Lipidketten sind wichtig für die Aktivität des Lipid A Moleküls.
Abbildung 2:	Eine weitere Funktion von LBP und PLTP. Lipopolysaccharid wird von Gram-negativen Bakterien freigesetzt. Es wird an LBP gebunden und von ihm entweder an die zellulären Rezeptoren transportiert, was zum Beispiel zur Zytokinausschüttung führen kann, oder aber in das HDL transportiert. Die Internalisierung von LPS in Lipoproteinpartikel überführt dieses in eine inaktive Form. PLTP kann LPS ebenfalls in HDL-Partikel transportieren. Ein Transport zu den zellulären Rezeptoren und eine damit verbundene Stimulation ist nicht möglich.
Abbildung 3:	LPS-abhängige, LBP-vermittelte Stimulation von CD14-positiven Zellen. Das von Gram-negativen Bakterien freigesetzte Lipopolysaccharid (LPS) wird von dem LPS Bindenden Protein (LBP) gebunden und zum LPS-Rezeptor-Komplex, bestehend aus CD14 und dem Toll-like Rezeptor 2/4 transportiert. Die Bindung von LPS bewirkt die Ausschüttung verschiedener Zytokine, wie TNF-, IL-1 und IL-6.
Abbildung 4:	LPS-abhängige Stimulation CD14-negativer Zellen. CD14-negative Zellen werden von LPS zur Sezernierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren sowie zur Expression von Adhäsions-molekülen angeregt. Diese LPS-abhängige Stimulation wird durch lösliches CD14 (sCD14) verstärkt. Auch hierbei dient der Toll-like Rezeptor 2 bzw. 4 (TLR2/4) der Signalübermittlung ins Zellinnere.
Abbildung 5:	Zählung Trypanblau-positiver Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden entweder nur mit 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP inkubiert, oder es wurden zusätzlich 5 % FKS bzw. 5 % NMRI-Serum hinzugegeben. Nach 4 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit Trypanblau inkubiert. Die Zahl der sich anfärbenden Zellen ist hier dargestellt. Die Ergebnisse wurden jeweils in 12 Versuchen ermittelt. Die abgebildeten Balken entsprechen den Mittelwerten, die Fehlerbalken der Standardabweichung. Die Zahl der Trypanblau-positiven Zellen ist in Abwesenheit von Serum signifikant höher als in Gegenwart von 5 % FKS (p= 0,045) und 5 % NMRI-Serum (p< 0,0001).
Abbildung 6:	Quantifizierung der adhärenten Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden entweder nur mit 0,5 ng/ml LPS und 1µg/ml LPB inkubiert, oder es wurden zusätzlich 5 % FKS bzw. 5 % NMRI-Serum hinzugegeben. Nach vier Stunden wurden die Zellen gewaschen und lysiert. Danach wurde die Proteinkonzentration des Lysats bestimmt. Die Ergebnisse wurden in jeweils 2 Versuchen ermittelt.
Abbildung 7:	LDH-Messung im Zellüberstand nach Inkubation mit NMRI-Serum oder FKS. RAW 264.7 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen NMRI-Serum oder FKS in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP vier Stunden inkubiert. Danach wurde die Laktatdehydrogenase-Konzentra-tion im Überstand mit einem kommerziellen Kit bestimmt. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Serum wurden in sechs Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse in Anwesenheit von Serum entsprechen jeweils drei Versuchen. Die Zugabe von 0,31 % Serum führt zu einem signifikanten Anstieg der LDH (p< 0,0001). Steigende Serumkonzentrationen führen zu keinem weiteren, signifikanten Anstieg der LDH im Zellüberstand (p= 0,392).
Abbildung 8:	Einfluß verschiedener Mausseren auf die TNF--Sekretion. RAW 264.7 Zellen wurden mit 0 bis 5 % Serum der angegebenen Mausstämme in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP für 4 Stunden inkubiert. TNF- wurde im Überstand mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Serum wurden in zwölf Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse bei den verschiedenen Serumkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen. Die Reduktion der TNF--Produktion bei 0,31% Serum ist signifikant (p= 0,002). Die verschiedenen Seren unterschieden sich weder bei 0,31% noch bei 5% Serumkonzentration signifikant voneinander (p=0,123), (p= 0,82).
Abbildung 9:	Einfluß von Serum von LBP-/- Mäusen auf die LPS-induzierte TNF--Synthese in Gegenwart von LBP. RAW 264.7 Zellen wurden mit 0 bis 5 % Serum von LBP-/- Mäusen in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP für 4 Stunden inkubiert. TNF- im Zellüberstand wurde mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse bei den verschiedenen Serumkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen.
Abbildung 10:	Vergleich von LBP-depletiertem und Normalserum bezüglich des Einflusses auf die TNF--Ausschüttung. RAW 264.7 Zellen wurden mit 0 bis 10 % LBP-depletiertem und Kontrollserum in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP für 4 Stunden inkubiert. TNF- im Zellüberstand wurde mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Serum wurden in fünf Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse für nicht depletiertes Serum in verschiedenen Konzentrationen entsprechen jeweils zwei Versuchen, die für depletiertes Serum drei Versuchen.
Abbildung 11:	Wirkung von Serum von LBP-/- Mäusen auf LPS-Effekte in Abwesenheit von LBP. RAW 264.7 Zellen wurden mit 6 ng/ml LPS und Serum von LBP-/- Mäusen für 4 Stunden inkubiert. Danach wurde die TNF--Konzentration des Zellüberstandes mittels ELISA gemessen (n=3).
Abbildung 12:	Native Gelelektrophorese muriner Lipoproteine. Durch sequentielle Flotationsdichtezentrifugation aus NMRI-Serum isolierte Lipoproteine verschiedener Dichten und NMRI-Serum, sowie lipoproteindefizientes Serum wurden einer nativen Gelelelektrophorese unterzogen. Die Gele wurden dann mit einer Lipid- (A) sowie einer Proteinfärbung (B) gefärbt.
Abbildung 13:	LBP-Western-Blot der murinen Lipoproteine verschiedener Dichten. Murine Lipoproteine wurden mittels sequentieller Flotationsdichtezentrifugation isoliert. LBP wurde in den Lipoproteinen mit einem polyklonalen Antiserum detektiert.
Abbildung 14:	Einfluß von Lipoproteinen auf die LPS-induzierte TNF--Sekretion. RAW 264.7 Zellen wurden mit NMRI-Serum und Lipoproteinen der Dichten 1,063-1,21 g/ml; 1,006-1,063 g/ml und <1,006 g/ml in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP für 4 Stunden inkubiert. TNF- im Zellüberstand wurde mittels ELISA gemessen. Die Lipoproteine und das Serum wurden anhand der Proteinkonzentration angeglichen. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Lipoproteinen wurden in zwölf Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse bei den verschiedenen Proteinkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen. N.d. = nicht durchgeführt.
Abbildung 15:	Einfluß von Lipoproteinen auf die LPS-induzierte TNF--Synthese. RAW 264.7 Zellen wurden mit NMRI-Serum und Lipoproteinen der Dichten 1,063-1,21 g/ml; 1,006-1,063 g/ml und <1,006 g/ml in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1 µg/ml LBP für 4 Stunden inkubiert. TNF- im Zellüberstand wurde mittels ELISA gemessen. Die Lipoproteine und das Serum wurden anhand der Phospholipidkonzentration angeglichen. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Lipoproteinen wurden in zwölf Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse bei den verschiedenen Phospholipidkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen. Die Reduktion der TNF--Synthese bei 0,63 mg/dl ist im Vergleich zur Abwesenheit von Lipoproteinen oder Serum signifikant (p< 0,0001). N.d.= nicht durchgeführt.
Abbildung 16:	Vergleich zwischen lipoproteindefizientem Serum und Normalserum bezüglich der Inhibiton von LPS-Effekten. RAW 264.7 Zellen wurden mit lipoproteindefizientem oder NMRI-Serum in Gegenwart von 0,5 ng/ml LPS und 1µg/ml LBP vier Stunden inkubiert. Die Seren wurden anhand ihrer Proteinkonzentration angeglichen. Danach wurde der TNF--Gehalt des Zellüberstandes mittels ELISA quantifiziert. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Serum wurden in sechs Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse für die verschiedenen Serumkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen.
Abbildung 17:	Einfluß von Lipoproteinen auf die LPS induzierte TNF--Sekretion in Abwesenheit von LBP. Lipoproteine wurden mittels sequentieller Flotationsdichtezentrifugation gewonnen. RAW 264.7 Zellen wurden mit den gewonnenen Lipoproteinen der verschiedenen Dichten (d) in Gegenwart von 6 ng/ml LPS und Abwesenheit von LBP vier Stunden inkubiert. Danach wurde die TNF--Konzentration im Zellüberstand mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse in Abwesenheit von Lipoproteinen wurden in 9 Versuchen ermittelt. Die Ergebnisse bei den verschiedenen Phospholipidkonzentrationen entsprechen jeweils drei Versuchen. Die Reduktion der TNF--Produktion bei 5 mg/dl Phospholipidkonzentration und den Lipoproteinen der Dichten 1,006-1,063 und <1,006 g/ml ist hoch signifikant (p< 0,0001). N.d.= nicht durchgeführt.

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