Köbel, Martin: Die Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms

1

Kapitel 1. Einleitung

Seit Anfang der 80-er Jahre ist bekannt, dass postoperative Entzündungsprophylaxe mit dem nicht-steroidalen Antirheumatikum (NSAID) Sulindac bei Patienten mit familiärer Adenomatosis coli (FAP) die Anzahl und Größe neu auftretender Adenome reduziert ( Waddell and Loughry 1983 ). Aus Tierversuchen wusste man schon seit 1978 von der Unterdrückung der Tumorinduktion durch NSAIDs bei kolorektalen aber auch anderen Karzinomen und Sarkomen ( Lynch et al. 1978 , Pollard and Luckert 1981 ). Danach wurde in prospektiven epidemiologischen Studien gezeigt, dass die Einnahme von NSAIDs das Risiko an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken um nahezu die Hälfte senkt ( Thun et al. 1993 ).

1.1 Arachidonsäurestoffwechsel

Die antiinflammatorischen, antipyretischen und analgetischen Effekte der NSAIDs beruhen auf der Hemmung der Cyclooxygenase (COX), welche neben der Lipoxygenase das Schlüsselenzym des Arachidonsäurestoffwechsels darstellt (Abb.1).

Abbildung 1: Arachidonsäurestoffwechsel


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Die Arachidonsäure (Eikosatetraensäure) ist der wichtigste Vertreter der Gruppe mehrfach ungesättigter C-20-Fettsäuren (Eikosaene). Sie wird durch die Phospholipase A2 aus ihren intrazellulären Speichern, den Membranphospholipiden, abgespalten und stellt bei durchschnittlicher mitteleuropäischer Kost das wesentliche Substrat der COX dar. Die COX ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für eine Kaskade von Reaktionen, aus welchen Moleküle entstehen, die als zentrales Strukturelement die Prostanoidsäure enthalten (Abb. 2).

Abbildung 2: Struktur der Prostanoidsäure

Die entstandenen Moleküle, Prostaglandine und Thromboxane, werden als Prostanoide zusammengefasst, häufig vereinfacht aber auch nur Prostaglandine (PG) genannt. Diese Bezeichnungen gehen darauf zurück, dass sie irrtümlicherweise für ein Sekret der Prostata gehalten wurden.

Die COX katalysiert in zwei Schritten die Umwandlung der Arachidonsäure (AA) zu dem intermediären Prostaglandin H2 (PGH2). Im ersten Schritt erhält die Arachidonsäure durch oxidative Zyklisierung unter Verlust von zwei Doppelbindungen einen zentralen C-5 Ring. In einem zweiten Schritt wird das Zwischenprodukt Prostaglandin G2 durch die Peroxidaseaktivität des Enzyms zu PGH2 reduziert. Aus diesem Grund existieren für die COX synonyme Bezeichnungen wie Prostaglandin-Endoperoxidase-Synthase oder PGH-Synthase ( Smith and Marnett 1991 ). Welche der heute über einhundert bekannten Prostaglandine, die sich hinsichtlich ihrer funktionellen Gruppe (Abb. 3) unterscheiden, aus der Vorstufe PGH2 konvertiert werden, hängt von der weiteren enzymatischen Ausstattung der Zellen ab. Die Nomenklatur der Prostaglandine basiert auf der Vergabe von Buchstaben für die funktionelle Gruppe und einer Nummerierung, welche die Anzahl der Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette bezeichnet. Aus anderen Substraten der COX, wie Eikosatriensäure, entstehen die Prostaglandine der Serie 1 (PG1), aus Eikosapentaensäure diejenigen der Serie 3 (PG3).


3

Abbildung 3: Funktionelle Gruppen der wichtigsten Prostaglandine und Thromboxane

Die höchsten Konzentrationen für PGE2 und PGF2alpha wurden in Niere, Herz und Milz gemessen, PGD2 stammt hauptsächlich aus Mastzellen. PGI2, bekannt auch als Prostacyclin, wird vorwiegend von Endothelzellen und TXA2 von Thrombozyten gebildet ( Marnett 1992 , DuBois et al. 1998 , Taketo 1998 ).

1.1.1 membranäre Prostaglandinrezeptoren

Prostaglandine wirken autokrin sowie parakrin und damit lokal am Ort ihrer Synthese. Sie werden hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und aus der Zelle geschleust. Ungewöhnlich für lipophile Substanzen sind die spezifischen Rezeptoren der Prostaglandine an der Zellmembran lokalisiert. PGE2 bindet an eine Gruppe von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (EP2-4) und wirkt je nach Art des Rezeptor-G-Protein Komplexes stimulierend (GS) oder inhibierend (GI) auf den second messenger cAMP. Der PGE2 Rezeptor EP1 erhöht dagegen die intrazelluläre Ca2+-Konzentration über G-Proteine der Gq-Familie. Damit läßt sich die Diversität der PGE2 Wirkungen in verschiedenen Geweben erklären. Der PGF2alpha Rezeptor besitzt zwei alternativ gespleißte Isoformen FPA und FPB mit ähnlicher Wirkung. Als second messenger dienen Inositol-Trisphosphat (IP3), welches Ca2+ mobilisiert, und Diacalglyzerol, welches die Proteinkinase C (PKC) aktiviert (Tab.1, Narumiya et al. 1999 ).

Wie andere bioaktive Lipide haben Prostaglandine eine sehr kurze Halbwertszeit in vivo. So wird TXA2 zum Beispiel innerhalb von Minuten in das stabile aber inaktive TXB2 überführt.


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Tabelle 1: membranäre Prostaglandinrezeptoren nach Narumiya et al. 1999

Rezeptor

Ligand

Signaltrans-

duktion

Gewebeverteilung

der Rezeptoren

Funktion

DP

PGD2

GS - cAMP

Thrombozyten,

Gefäßmuskel,

Inhibition der Aggregation

 

 

 

Darm

Nervengewebe

Relaxation glatter Muskulatur

Promotion des Schlafes

EP1

PGE2

Gq - Ca2+

Niere, Lunge, Milz, Hoden, Uterus

Kontraktion glatter Muskulatur

EP2

PGE2

GS - cAMP

Lunge, Plazenta

Relaxation glatter Muskulatur

EP3

PGE2

GI - cAMP-Hemmung

Magen,

Niere

Hemmung der Säureproduktion

Hemmung der Wasserabsorption

 

 

 

Uterus,

Hoden, Lunge,

Uteruskontraktion

 

 

 

Nebenniere, GIT

Kontraktion glatter Muskulatur

EP4

PGE2, PGE1

GS - cAMP

GIT, Lunge, Uterus,

Monozyten,

Relaxation glatter Muskulatur

Chemotaxis

 

 

 

Thymus, Niere,

Gehirn, Herz

 

FPA/B

PGF2alpha

IP3 + Ca2+

PKC

Uterus

Gelbkörper

Uteruskontraktion

Luteolyse

 

 

 

Lunge

Bronchuskontraktion

IP

PGI2

GS - cAMP

Thrombozyten

Gefäßmuskel

Hemmung der Aggregation

Vasodilatation

 

 

 

Thymus

Verminderung der T-Zell-

Proliferation

 

 

 

Niere, Leber, Lunge

 

TP

TXA2

IP3 + Ca2+

Thrombozyten

Gefäßmuskel

Thrombozytenaggregation

Vasokonstriktion

 

 

 

Lunge

Thymus, Milz,

Bronchuskontraktion

 

 

 

Niere, Herz

 


5

1.1.2 nukleäre Prostaglandinrezeptoren

Aus älteren elektronenmikroskopischen Untersuchungen ist bekannt, dass cholesterinsenkende Fibrate zu einer Proliferation von Peroxisomen führen. Als Mediatoren dieses Effekts wurden Anfang der 90-er Jahre die „peroxisome proliferator-activated receptors“ (PPARs) identifiziert. Die Besonderheit dieser nukleären Rezeptoren besteht darin, dass sie mit dem 9-cis-Retinoid-säurerezeptor (RXR, Retinoid X Rezeptor), ein Heterodimer bilden und als solches an ein sequenzspezifisches Response-Element binden. Die Ligandenbindung an dieses Heterodimer führt zur Induktion der Transkription. Die bisher beschriebenen PPAR-Liganden sind in Tabelle 2 aufgeführt. An dieses Heterodimer binden sowohl PPAR-Liganden als auch RXR-Liganden, wobei die Bindung beider Liganden zu einer Potenzierung der Aktivität führt.

Drei PPAR Isotypen wurden in Vertebraten bisher nachgewiesen: alpha, delta (auch beta und NUC1 genannt) und gamma. Sie unterscheiden sich durch ihre Gewebeexpression, Aktivatoren und Zielgene und die damit verbundenen Funktionen (Tab. 2, Kersten et al. 2000 ) .

Synthetische Agonisten für PPARalphagamma (Fibrate) und PPARgamma (Thiazoledinedione, TZDs) werden in der Therapie des metabolischen Syndroms eingesetzt. Neue TZDs wie Rezulin und Avandia besitzen antidiabetische Effekte bei Typ II Diabetikern. Der Wirkmechanismus des antidiabetischen Effekts der TZDs verläuft über die PPARgamma-vermittelte Speicherung von Fettsäuren im Fettgewebe und einer damit verbundenen Verbesserung der Insulinwirkung am Muskel.

Darüber hinaus sind PPARalpha und PPARgamma in die Atherogenese involviert. PPARalpha senkt die Plasmakonzentration von Lipoproteinen und proatherosklerotischen Proteinen wie Fibrinogen und CRP. PPARgamma fördert einerseits die Bildung von Schaumzellen, andererseits erhöht er durch Verminderung der Gefäßwandentzündung die Plaquestabilität ( Kersten et al. 2000 ).

Schon lange ist bekannt, dass Tumorzellen vermehrt Peroxisomen enthalten, was darauf hinweist, dass PPARs in Tumoren abnorm aktiviert sind. Die Datenlage zur Rolle der PPARs in Tumoren ist jedoch kontrovers. Die tumorbiologische Bedeutung von PPARalpha ist bisher unbekannt. PPARgamma Agonisten induzierten die Redifferenzierung von Liposarkomzellen und Mammakarzinomzellen, so dass die Aktivierung von PPARgamma eher einen negativen Effekt auf die Tumorprogression hat ( Kersten et al. 2000 ).

PPARdelta wird in Abschnitt 1.4.6. genauer beschrieben.


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Tabelle 2: PPARs nach Kersten et al. 2000

 

PPARalpha

PPARgamma

PPARdelta

Expression

braunes Fettgewebe

Leber

Fettgewebe

Kolon, Makrophagen,

ubiquitär

v.a. in Darm, Niere,

 

Niere, Herz,

Skelettmuskel

Endothel, glatte

Muskulatur, Retina

Herz

Agonisten

Linolsäure, AA, Clofibrat

Linolsäure, AA

TZD

Linolsäure, AA

 

Leukotrien B4

GW7647

PGJ2

PGI2

GW2433

aktivierte Zielgene im

Fettstoffwechsel

z.B. Carnitin-

Lipoproteinlipase

 

 

Palmitoyl-Transferase I

Apolipoprotein AI, AII

Acyl-CoA-Synthase

Acyl-CoA-Synthase-2

metabolische Funktion

Katabolismus der

Fettsäure in der Leber

Speicherung der

Fettsäuren im

unbekannt

 

 

Fettgewebe

 

Rolle bei der Entzündung

Hemmung der

Hemmung der

unbekannt

 

Transkription von

iNOS, COX-2;

Transkription von

Il-2, Il-6, Il-8,

 

 

Hemmung und

Stimulation von TNFalpha

COX-2

 

inflammatorische Wirkung

widersprüchlich

antiinflammatorisch

unbekannt

Rolle bei malignen Tumoren

unbekannt

Hemmung der

Förderung der

 

 

Tumorprogression

Tumorprogression


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1.2 Zwei Isoformen der Cyclooxygenase

Seit Anfang der 90-er Jahre ist bekannt, dass zwei Isoformen der COX existieren: COX-1 und -2 ( Xie et al. 1991 ). Sie werden von verschiedenen Genen kodiert und unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung und Expressionsregulation. COX-1 wird konstitutiv unter anderem in Niere, Magen, Thrombozyten und Gefäßendothel exprimiert und kann als sogenanntes “house-keeping enzyme“ schnelle physiologische Adaptationen einleiten. Die COX-1 generiert vasodilatierende Prostaglandine, welche den renalen Blutfluss sowie die Mikrozirkulation in der Magenschleimhaut bei systemischer Vasokonstriktion aufrechterhalten ( Marnett 1992 ). Die Bildung von Thromboxan A2 durch aktivierte Thrombozyten fördert deren Aggregation und wirkt zudem gefäßverengend. Zur Aufrechterhaltung der normalen Hämostase sezernieren Endothelzellen den potenten TXA2-Gegenspieler PGI2 ( Schafer 1995 ).

Die COX-2 wird in den meisten Geweben nicht konstitutiv exprimiert, sondern kann durch Interleukin-1beta (Il-1beta), Tumornekrosefaktor-alpha (TNFalpha) und andere Zytokine induziert werden. Glukocortikoide und antiinflammatorische Zytokine wie Il-4 und Il-10 hemmen die Expression des Enzyms. Durch die verzögerte Induktion wirkt die COX-2 auf Prozesse wie Entzündung, Mitose und Ovulation sekundär verstärkend. Als Beispiel für die COX-2-Induktion im Rahmen eines physiologischen Prozesses sei die Ovulation angeführt. Hier aktiviert die COX-2 Proteasen, die zur Ruptur des Follikels führen ( Tsafriri 1995 ). Eine konstitutive Expression der COX-2 findet sich in Gehirn, Hoden und Macula densa der Nieren ( DeWitt and Smith 1995 ).

Tabelle 3: Unterschiede von COX-1 und COX-2 nach Taketo 1998

 

COX-1

COX-2

Genlokus

9q32 - q33.3

1q25.2 - q25.3

Gengröße

22 kb

11 exons

8 kb

10 exons

Größe der mRNA

2,8 kb

4,0 kb

Molekulargewicht

der Proteine

85.000 Da

72.000 Da

Die Entwicklung von COX-knockout Mäusen weist darauf hin, dass die Funktionalität beider Enzyme weit verschiedenerer Art ist, als ursprünglich erwartet und wahrscheinlich auch 8Pathways reguliert werden, die nichts mit der Prostaglandinsynthese zu tun haben. So sind COX-1-null Mäuse wenig beeinträchtigt, obwohl die Prostaglandinsynthese gegenüber normalen Versuchstieren um 99% erniedrigt ist. Dagegen besteht bei COX-2-null Mäusen eine hohe Frühsterblichkeit durch Peritonitis oder progressive Nephropathie, obwohl keine Alteration des Prostaglandinspiegels vorliegt. Weiterhin beobachtete man keine kompensatorische Hochregulation einer Isoform bei Wegfall der anderen ( Langenbach et al. 1999 ).

Tabelle 4: Phänotypen von COX defizienten Mäusen nach Langenbach et al. 1999

Phänotyp

COX-1 defiziente Maus

COX-2 defiziente Maus

Allgemeine Gesundheit

relativ normal

schwere Beeinträchtigung

PG-Niveau

1% der Kontrolle

induzierbar

normal

nicht induzierbar

Überleben

normal

60% überleben die

ersten Wochen

Gastrointestinal

verminderte Heilung

induzierter Ulzera

verminderte Heilung

induzierter Ulzera

Entzündungsreaktion

 

 

Air pouch Modell

gering verminderte

Makrophagenrekrutierung;

50 % verminderte

Makrophagenrekrutierung;

 

gering verminderte Auflösung

des Entzündungsexsudates

stark verminderte Auflösung

des Entzündungsexsudates

Infektionen

normal

vermehrt Peritonitis

Karzinogenese

 

 

induzierte

Hautpapillome

~ 75% reduziert

~ 75% reduziert

induzierte intestinale

Adenome

~ 75% reduziert

~ 75% reduziert


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1.3 Cyclooxygenase und Entzündung

1838 wurden aus Weidenrinde Salizinglykoside extrahiert und daraus die Salizylsäure isoliert. 1893 synthetisierte der deutsche Chemiker Felix Hoffmann, angespornt durch das Leiden seines Vaters an rheumatoider Arthritis, die azetylierte Form der Salizylsäure: Aspirin. Aus dieser Entdeckung entwickelte man eine ganze Reihe schmerzlindernder und zugleich antientzündlich wirkender NSAIDs, die auch heute noch zu den meist genutzten Arzneimitteln zählen. Den zellulären Wirkungsmechanismus der NSAIDs beschrieben Vane allerdings erst 1971 ( Vane 1971 ). Allen NSAIDs gemeinsam ist die Hemmung der enzymatischen Aktivität der COX und damit eine Synthesehemmung von Prostaglandinen. Die oben beschriebene Identifizierung einer zweiten Isoform mit unterschiedlichen Eigenschaften erweckte das Interesse an deren selektiver pharmakologischer Hemmbarkeit. Es wurde vermutet, dass eine selektive Hemmung der COX-2 eine antiphlogistische Wirkung bei fehlender Beeinträchtigung der COX-1-abhängigen Funktionen entfalten könnte. Argumente wonach die COX-2 im besonderen Maße in das entzündliche Geschehen eingebunden ist, lieferten Cao et al. 1997 , indem sie demonstrierten, dass der Fieberanstieg mit einer Expression der COX-2 in Rattenendothelzellen des Gehirns einhergeht. In Tiermodellen für die chronische Arthritis konnte eine klare Beziehung zwischen der COX-2 Induktion und der Prostaglandinproduktion im entzündeten Gelenk dargestellt werden ( Anderson et al. 1996 ). Neue selektive COX-2 Inhibitoren werden heute als Standardtherapeutika in der Rheumatologie angewandt. Die COX-2-spezifischen Inhibitoren Celebrex (Celecoxib, SC-58635, Searle & Pfizer, Heumann) und Vioxx (Rofecoxib, MSD) sind nach erfolgreicher klinischer Prüfung für die Indikationen Arthroseschmerzen und chronische Polyarthritis zugelassen ( Brune et al. 2000 ).

Neben der klaren proinflammatorischen Rolle der Prostaglandine untermauerten Gilroy et al. 1999 ,die Hypothese, wonach die Prostaglandine auch in der späten Phase für die Resolution der Entzündung bedeutsam sind. Sie zeigten einen zeitlichen Zusammenhang zwischen einem frühen PGE2 Gipfel (nach 8 h) mit der Induktion der COX-2 Expression und der Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in das Entzündungsgebiet. Nach 48 h folgte ein zweiter Prostaglandingipfel von PGD2 und PGJ2, begleitet von einer noch stärkeren COX-2 Induktion und einer Auflösung der Entzündung. Somit ist die Rolle der COX-2 in der Entzündungsreaktion komplexer als bisher angenommen.


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Tabelle 5: Konzentration verschiedener NSAIDs, die zur Halbierung der enzymatischen Aktivität der COX-1 und COX-2 nötig sind (nach Taketo 1998 )

NSAID

IC50 (µM) für COX-1

IC50 (µM) für COX-2

Aspirin

0,3

50

Indomethacin

0,01

0,6

Diclofenac

0,5

0,35

Celebrex (SC 58215)

10

0,05

NS 398

75

1,77

1.4 COX-2 und maligne Tumore

Nachdem die Risikoreduktion für kolorektale Karzinome durch die Einnahme von NSAIDs in epidemiologischen Studien beschrieben wurde, folgten eine Reihe immunhistologischer Untersuchungen zur Expression von COX-1 und COX-2 in verschiedenen Karzinomen. Eberhart et al. 1994 beschrieben eine im Vergleich zur normalen Mukosa erhöhte Expression der COX-2 in 86% der kolorektalen Karzinome und 40% der kolorektalen Adenome. Im Gegensatz dazu wurden keine Unterschiede bezüglich der Expression der COX-1 in transformierten und normalen Kolongeweben gefunden ( Eberhart et al. 1994 , Kargmann et al. 1995 , Sano et al. 1995 ).


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Tabelle 6: Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der COX-2 in Karzinomen

Karzinomtyp

Häufigkeit der Expression in Karzinomen

Stärke der Expression im Normalgewebe

Autor

Kolon

76% (n=25)

100% (n=15)

schwach

schwach

Kargmann et al. 1995

Sano et al. 1995

 

90% (n=20)

n.u.

Dimberg et al. 1999

Magen

83% (n=23)

schwach

Uefuji et al. 1998

Lunge

Adeno

90% (n=21)

n.u.

Wolff et al. 1998

Plattenepithel

100% (n=11)

n.u.

 

Adeno

Kleinzellig

70% (n=59)

negativ

schwach

Hida et al. 1998

Oesophagus

Plattenepithel

91% (n=172)

schwach

Zimmermann et al. 1999

Adeno

78% (n=27)

schwach

 

Pankreas

90% (n=10).

negativ

Tucker et al. 1999

Kopf-und Halstumoren

100% (n=6)

schwach

Chan et al. 1999

Hepatozellulär

(HCC)

97% (n=29)

100% (n=44)

schwach

schwach

Shiota et al. 1999

Koga et al. 1999


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Welche Schritte der Tumorigenese durch NSAIDs und neuerdings auch durch COX-2-spezifische Inhibitoren moduliert werden, ist in Abb. 4 dargestellt und wird im Folgenden detailliert besprochen.

Abbildung 4: Antitumorigene Angriffspunkte der NSAIDs


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1.4.1 Tumoriniation und Tumorpromotion

Aus dem Vorläuferprostaglandin PGH2 kann enzymatisch das Mutagen Malondialdehyd (MDA) entstehen, welches an desoxygenierte Basenreste der DNA bindet. Inwiefern MDA in die Mutagenese genomischer DNA in vivo involviert ist, ist nicht bekannt, weswegen diese Rolle der COX-2 in der Tumoriniation hypothetisch bleibt ( Marnett 1992 ).

Die Promotion epidermaler Tumoren durch Eikosanoide am Mausmodell wurde von der Arbeitsgruppe um Furstenberger et al. 1989 gezeigt. Nach chemischer Papillominduktion verstärkte der Tumorpromoter 12-O-tetradekanoyl-phorbol-14-azetat (TPA) die Ausbildung der Hautpapillome sowie die Synthese von PGE2 und PGF2alpha. Die lokale Gabe von Indomethacin kurz vor dem induzierten Prostaglandingipfel, welcher mit erhöhter COX-2 Expression einherging, blockierte die Papillombildung.

Weitere Argumente für die tumorpromovierende Wirkung der COX-2 lieferte ein APC-knock-out Mausmodell. Diese Mäuse entwickelten, wie Patienten mit FAP, multiple Polypen im Intestinaltrakt. Die Entstehung der Polypen konnte sowohl durch einen COX-2-spezifischen Inhibitor als auch durch die Ausschaltung des COX-2-Gens unterdrückt werden. Es zeigte sich insofern ein Gendosiseffekt, als dass COX-2-heterozygote APC-knock-out Mäuse eine mittelgradige Polypenreduktion aufwiesen ( Oshima et al. 1996 ).

Diese Ergebnisse ließen sich in der MIN (Multiple intestinale Neoplasien)-Maus verifizieren. Die MIN-Maus trug eine karzinogeninduzierte nonsense-Mutation des APC-Gens und entwickelte in 100% der Fälle intestinale Polypen. Die Adenomentwicklung konnte durch Ausschaltung des COX-2-Gens um 70% reduziert werden ( Chulada et al. 2000 ). Auch im karzinogeninduzierten Kolonkarzinom der Ratte konnte durch einen COX-2-spezifischen Inhibitor eine Unterdrückung der Tumorbildung um etwa 90 % erzielt werden ( Kawamori et al. 1998 ).

Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für Konzepte zur Chemoprävention ( DeWitt and Smith 1995 ).Erste erfolgversprechende klinische Daten mit dem NSAID Sulindac Sulfon erbrachten randomisierte plazebokontrollierte Studien bei Patienten mit FAP. Sulindac Sulfon wurde nach subtotaler Kolektomie als Sekundärprophylaxe verabreicht und verminderte signifikant die Anzahl der neugebildeten Polypen ( Nugent et al. 1993 ). Neuerdings werden bei FAP auch COX-2-spezifische Inhibitoren wie Celebrex erfolgreich eingesetzt ( Steinbach et al. 2000 ).


14

1.4.2 Tumorzellproliferation

Bei der Untersuchung der Proliferation verschiedener Karzinomzelllinien in vitro unter Einfluss von COX-2-spezifischen Inhibitoren ergaben sich abhängig vom Zelltyp unterschiedliche Ergebnisse. (Tab.7)

Tabelle 7: Wirkung COX-2-spezifischer Inhibitoren auf das Wachstum verschiedener Karzinomzelllinien

Karzinom

Karzinomzelllinie

COX-2-

spezifischer

Konzentration

Zellwachstumseffekt

Autor

 

 

Inhibitor

 

 

 

Kolorektal

HCA-7

SC 58125

25 µM

-35 %

Coffey et al. 1997

 

HCA-7

SC 58125

NS 398

25 µM

50 µM

-46 %

-80 %

Chinery et al. 1999

 

HCA-7

SC 58125

25 µM

-55 %

Sheng et al. 1998

 

HT-29

S/KS

NS 398

82 µM

78 µM

-50 %

-50 %

Elder et al. 1997

 

LIM 1899

NS 398

100 µM

+/- 0

Murphy et al. 1997

 

COLO205

NS 398

10µM

+/- 0

Hong et al. 1999

Oesophagus

OSC-2

NS 398

100 µM

-52 %

Zimmermann et al. 1999

Prostata

LNCaP

NS 398

5 µM

-50%

Liu et al. 1998

Mamma

SKBR3

ZR75

NS 398

10 µM

+/- 0

Hong et al. 1999


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Sehr wahrscheinlich wird die Wachstumsreduktion bei COX-2 Inhibition nicht durch Eingriff in den Zellzyklus verursacht, sondern durch Apoptoseinduktion. Dies konnte für die kolorektale Karzinomzelllinie HCA-7 bereits gezeigt werden ( Sheng et al. 1998 ). Weiterhin wurde nachgewiesen, dass normale intestinale Rattenepithelzellen, welche auf extrazellulärer Matrix apoptotisch werden, nach COX-2 Transfektion dazu nicht mehr in der Lage sind, aber nach Inkubation mit dem NSAID Sulindac wieder den programmierten Zelltod einleiten ( Tsujii and DuBois 1995 ).

1.4.3 Progression

Es gibt bereits Hinweise, wonach die COX-2 Expression prognostische Bedeutung hat Sheehan et al. 1999 korrelierten die Stärke der immunhistologischen COX-2 Positivität in kolorektalen Karzinomen mit dem Lymphknotenbefall und verkürztem Überleben. Ferner steht die COX-2 Expression im Magenkarzinom mit der Lymphgefäßinvasion und dem Lymphknotenbefall in Zusammenhang ( Murata et al. 1999 ). Diesen Beobachtungen griff eine in vitro Studie von Tsujii et al. 1997 voraus, in welcher COX-2 transfizierte humane kolorektale Karzinomzelllinien eine 6-fache Invasivität im Matrigel-Invasionsassay zeigten. Dieser Effekt konnte durch Sulindac Sulfon gehemmt werden. Auch Indomethacin inhibierte die Invasivität von murinen Melanomzellen im Matrigel-Invasionsassay ( Reich et al. 1996 ).

Prostaglandine, vor allem PGE2, können Angiogenesefaktoren induzieren. Tsujii et al. 1998 untersuchten in einer Kokultur von Endothelzellen und COX-2 transfizierten humanen Kolonkarzinomzellen die in vitro Angiogenese. Die Hemmung der COX-2 Expression oder Funktion führte zu einer verminderten Sekretion von angiogenetischen Faktoren durch die Tumorzellen, die Hemmung der COX-1 Expression unterdrückte dagegen direkt die Bildung von kapillarartigen Röhren aus Endothelzellen. Jones et al. 1999 hingegen zeigten anhand von humanen Endothelzellen, welche in definierter Extrazellularmatrix spontan kapillarartige Strukturen bilden, dass auch die spezifische COX-2 Hemmung mittels NS 398 (100µM) zu einer um 85% verminderten in vitro Angiogenese führt. Masferrer et al. 2000 erzielten nur mit dem COX-2-spezifischen Inhibitor Celebrex, aber nicht mit einem COX-1 Inhibitor, eine Hemmung der Blutgefäßneubildung in einem Rattenmodell. Somit lassen diese Studien vermuten, dass


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neben den traditionellen NSAIDs auch neuere COX-2-spezifische Inhibitoren die Angiogenese hemmen.

Mit dem Eintritt in die Blutzirkulation setzen sich Tumorzellen in besonderem Maße der Immunosurveillance des Tumorträgers aus. Die Tumorzellen selber oder von ihnen aktivierte Makrophagen können PGE2 sezernieren, welches die Teilung von zytotoxischen T-Lymphozyten und die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen unterdrückt ( Hwang et al. 1998 ). Die Bildung von gemischten Plättchen-Tumor-Aggregaten scheint das Überleben der neoplastischen Zellen sowie die Filterung im Kapillarbett und damit die Möglichkeit zur Adhäsion zu begünstigen. Unter experimentellen Bedingungen ließ sich eine geringere Metastasierung durch NSAIDs unter Verschiebung des Verhältnisses von TBA2 zu PGI2 erreichen ( Honn et al. 1992 ), was hieße, dass eine antithrombotische Therapie die Metastasierungsrate vermindern könnte.

Xenograft-Metastasierungsstudien in immuninkompetenten Mäusen bestätigten die o.g. Ergebnisse. Die mit COX-2-spezifischen Inhibitoren behandelten Tiere wiesen eine reduzierte Anzahl und Größe von Metastasen der implantierten kolorektalen Karzinomzellen auf ( Sheng et al. 1997 , Chinery et al. 1999 ).

1.4.4 molekularer Mechanismus

Klassischerweise hemmen NSAIDs die COX und damit die Synthese von Prostaglandinen. Einerseits könnte nun die verminderte Bindung von PG an ihre Membranrezeptoren oder ihre nukleären Rezeptoren die o.g. Wirkungen vermitteln. Andererseits gibt es in letzter Zeit Untersuchungen wonach NSAIDs neben der COX andere zelluläre Substrate, sog. non-COX-Targets, besitzen.

1.4.4.1 Interaktion mit membranären Prostaglandinrezeptoren

Welche Prostaglandine könnten tumorigen über Membranrezeptoren wirken? PGA2 und PGD2 wurde frühzeitig eine antitumorigene Aktivität zugeschrieben, indem gezeigt wurde, dass sie das Wachstum von Melanomzellen sowohl in vitro als auch in vivo hemmten ( Stringfellow and Fitzpatrick 1979 , Bregmann et al. 1986 ). TXA2 und PGI2 haben eine spezielle Funktion im Gerinnungssystem. So konzentrierte sich das Interesse auf PGE2 und PGF2alpha, welche beide von


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Tumorzellen gebildet werden ( Hubbard et al. 1988 ). Kolonkarzinomgewebe enthielt mehr PGE2 als die umgebene normale Mukosa ( Maxwell et al. 1990 , Rigas et al. 1993 ). Narisawa et al. 1990 konnten eine Korrelation zwischen dem venösen Plasmaspiegel von PGE2 und dem Ausmaß der Metastasierung in kolorektalen Karzinomen belegen.

Direkte Hinweise auf eine prostaglandin-vermittelte Wirkung geben die in Tab.8 aufgeführten Untersuchungen, wo der durch COX-Hemmung erzielte Effekt durch die exogene Gabe von Prostaglandinen wieder aufgehoben werden konnte. Zusätzliche Indizien für PGE2 lieferten Tsujii et al. 1997 in HCA-7 Zellen, indem sie eine Korrelation zwischen der COX-2-Biosynthesehemmung und der in vitro Invasionshemmung durch NS 398 herstellten.

Tabelle 8: Effekte exogen substituierter Prostaglandine bei verschiedenen Tumoren

Autor

exogene Prostaglandine

Wirkung

Furstenberger et al. 1989

PGF2alpha

stellte die durch Indomethacin gehemmte Hautpapillombildung der Maus wieder her.

Young et al. 1990

PGE2

steigerte die in vitro Migration und die in vivo Metastasierung von Lewis Lungenkarzinomzellen in der

 

 

immuninkompetenten Maus.

Reich et al. 1996

PGF2alpha

stellte die durch Indomethacin gehemmte in vitro Invasion von murinen Melanomzellen wieder her.

Sheng et al. 1998

PGE2

hob die durch NS 398 erzielte Apoptosesteigerung in HCA-7 Zellen wieder auf.

Inaba et al. 1999

PGE2

stellte die durch Indomethacin gehemmte Kolonkarzinom-induktion in Ratten wieder her.

Jones et al. 1999

PGE2

stellte die durch NS 398 gehemmte in vitro Angiogenese durch Endothelzellen wieder her.


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1.4.4.2 Interaktion mit nukleären Prostaglandinrezeptoren

Yu et al. 1995 beschrieben Prostaglandine als PPAR-Liganden, wobei als wichtigste Vertreter PGI2 und PGJ2 in Frage kommen (siehe auch Tab. 2).

COX-2 defiziente Mäuse zeigten eine reduzierte Embryoimplantation, welche durch exogenes PGI2 wieder aufgehoben werden konnte. Dieser Effekt wird nicht durch einen membranären IP-Rezeptor, sondern durch PPARdelta vermittelt ( Lim et al. 1999 ). Ausgehend von dieser Beobachtung zeigten Gupta et al. 2000, dass PGI2 auch in Kolonkarzinomzellen PPARdelta aktivieren kann. Darüber hinaus war die Expression von PPARdelta in Kolonkarzinomen im Vergleich zu normaler Mukosa erhöht. PPARdelta wies eine ähnliche Verteilung wie die COX-2 auf.

Chinery et al. 1999 demonstrierten, dass der PPARgamma-Ligand PGJ2 die durch COX-2-Antisense-Oligonukleotide gehemmte Proliferation von HCA-7 Zellen wieder herstellte.

Interessanter Weise besitzen die beiden COX-Isoformen eine unterschiedliche zelluläre Lokalisation. Die COX-1 ist zytosolisch lokalisiert und könnte eher PG für die Membranrezeptoren generieren. Dagegen liegt die COX-2 perinukleär, und die synthetisierten PG könnten als PPAR-Liganden fungieren ( Morita et al. 1995 ).

1.4.4.3 Prostaglandin-unabhängiger Mechanismus

Andererseits gibt es Studien, die einen prostaglandin-unabhängigen Signalweg favorisieren. Sulindac Sulfon, ein Sulindac-Metabolit ohne direkte COX-hemmende Aktivität, bewirkte ebenso wie Sulindac eine Verminderung des Kolontumorwachstums in vitro und in vivo ( Piazza et al. 1995 , Piazza et al. 1997 , Reddy et al. 2000 ). Umgekehrt konnte in vollständig COX-2-defizienten Karzinomzelllinien, in gleicher Weise wie in COX-2-exprimierenden Zelllinien, mittels NSAIDs Apoptose induziert werden ( Elder et al. 1997 ). In gleicher Weise blieben COX-1- und COX-2-null Mäusefibroblasten hinsichtlich der antiproliferativen Wirkung von NSAIDs sensibel ( Zhang et al. 1999 ). Die in COX-2-positiven Kolonkarzinomzelllinien produzierten 19Prostaglandine konnten bei exogener Substitution die Proliferationshemmung durch NSAIDs nicht aufheben ( Hanif et al. 1996 , Coffey et al. 1997 ). Weiterhin waren die Konzentrationen der COX-2-spezifischen Inhibitoren, welche benötigt wurden um zelluläre Effekte wie Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion zu erzielen, 10- bis 100-mal so groß wie die IC50 der Prostaglandinsynthesehemmung, was eine zusätzliche zelluläre Wirkung vermuten lässt (siehe Tab. 5 und 7).

1.4.4.4 Non-COX-Target

Neben den beiden Isoformen der COX wurden für traditionelle NSAIDs weitere zelluläre Substrate beschrieben (Abb. 5).

Kopp and Ghosh 1994 demonstrierten eine inhibitorische Wirkung von Aspirin auf den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Lehmann et al. 1997 zeigten, dass die NSAIDs Ibuprofen und Indomethacin als Liganden PPARalpha und PPARgamma aktivieren.

Kürzlich beschrieben He et al. 1999 , dass dagegen der dritte Isotyp der PPARs, PPARdelta durch NSAIDs gehemmt wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das NSAID Sulindac seine apoptotische Wirkung über PPARdelta vermittelt. 1) Sulindac-induzierte Apoptose wurde durch die Überexpression von PPARdelta gehemmt. 2) Sulindac bindet direkt an PPARdelta und vermindert dessen Affinität zu spezifischen DNA Response-Elementen.

Interessanter Weise ergibt sich auch ein crossover mit dem beta-Catenin/Tcf Signalweg. In Kolonkarzinomen kommen inaktivierende Mutationen des APC-Gens während der Tumoriniation vor. Inaktives APC ist nicht mehr in der Lage beta-Catenin zu degradieren. beta-Catenin, welches normalerweise mit der zytoplasmatischen Domaine von E-Cadherin interagiert, akkumuliert im Zytoplasma. Als Kofaktor bindet das vermehrte beta-Catenin den Transkriptionsfaktor Tcf (T Zell Faktor). Dieser beta-Catenin/Tcf Komplex induziert die Expression von verschiedenen Onkogenen wie c-myc, Zyklin D1 und Matrilysin aber auch von PPARdelta.

Zusammenfassend könnte sich hier zumindest für das kolorektale Karzinom ein Modell eröffnen, wo genetische Veränderungen wie die APC Mutation durch pharmakologische Wirkungen der


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NSAIDs kompensiert werden. Theoretisch könnte eine APC oder beta-Catenin Mutation, die zu einer erhöhten PPARdelta-Aktivität führt, durch NSAIDs wieder supprimiert werden.

Wie in Abschnitt 1.4.4.2. erwähnt, gibt es bereits Untersuchungen zur Expression von PPARdelta in Kolonkarzinomen. PPARdelta war im Kolonkarzinom im Vergleich zu normaler Mukosa erhöht und wies eine ähnliche Verteilung wie die COX-2 auf ( Gupta et al. 2000 ).

Dass auch COX-2-spezifische Inhibitoren wie NS 398 Non-Cox-Targets besitzen, zeigten Zhang and DuBois 2000 . Mittels differentieller Genexpressionsanalyse wurden HCA-7 Zellen mit und ohne Behandlung mit NS 398 (bis 100µM) untersucht. Das proapoptotische Gen Par-4 zeigte eine erhöhte Expression nach NS 398 Behandlung. Somit könnte Par-4 einen Mediator für die apoptotische Wirkung der NSAIDs darstellen.

Daraus lässt sich schlussfolgern, dass mit heutigem Wissensstand eine konträre Datenlage zur Bedeutung der Prostaglandine als Mediatoren der COX-2-vermittelten Tumorhemmung vorliegt. Möglicherweise sind prostaglandin-abhängige und -unabhängige Pfade involviert.


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Abbildung 5: Molekulare Targets der NSAIDs


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1.5 Malignes Melanom

In dieser Studie sollten die Expression und Funktion der COX-2 in malignen Melanomen als Vertreter nichtepithelialer Tumoren untersucht werden. Die Inzidenz maligner Melanome hat in den letzten Jahren ständig zugenommen. Risikofaktoren für deren Entstehung sind neben der Intensität der Sonnenexposition die Anzahl der melanozytären Naevuszell-Naevi, mehr als drei dysplastische Naevi, mehr als drei schwere Sonnenbrände in der Anamnese sowie Lentigo simplex. Die Mortalitätsrate stieg langsamer als die Inzidenzrate an, was auf frühere Diagnose und Exzision zurückzuführen ist ( MaKie 1998 ). Die Prognose wird durch das Auftreten von Lymphknoten- oder Fernmetastasen bestimmt. Zur Abschätzung des Metastasierungsrisikos werden die Eindringtiefe in die Haut ( Clark et al. 1989 ) und die Tumordicke ( Breslow 1975 ) bestimmt. Zwei Wachstumsformen werden unterschieden. Das maligne Melanom kann nach oberflächlicher Ausbreitung in die vertikale Wachstumsphase übergehen und mit einer hohen Wahrscheinlichkeit in Gefäße einbrechen, sowie Tochtergeschwülste bilden. Melanomzellen müssen auf dem Weg aus ihrem primären Tumorverband die Basalmembran des Epithels (Infiltration) und eines Gefäßes (Invasion) durchdringen, um lymphogene oder hämatogene Tumorabsiedelungen (Metastasen) zu setzen. Diese Basalmembranen stellen aufgrund ihrer dichten Matrix, vorwiegend aus Kollagen IV und Laminin, das größte Hindernis für die Tumorzellen dar und sollten mit dem unten beschriebenen Matrigel-Invasionsassay in vitro simuliert werden.

Erste Hinweise, dass die COX auch in die Tumorigenese des malignen Melanoms involviert sein könnte, stammen aus der bereits oben zitierten Arbeit von Reich et al. 1996 . Das konventionelle NSAID Indomethacin hemmte die in vitro Invasion von murinen Melanomzellen.

Da maligne Melanome strahlen- und chemotherapierefraktär sind, sind die therapeutischen Optionen in fortgeschrittenen Stadien eingeschränkt. Somit kommt einer erfolgversprechenden adjuvanten Therapie eine große Bedeutung zu. Einen Angriffspunkt könnte die COX-2 bieten.


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Fri Aug 17 14:17:42 2001