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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Antikörper, Chemikalien und Kits

Antimaus-IgG, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase	Tropix, Bedford, USA
Arachidonsäure	Sigma, Deisenhofen, D
BCA Protein Assay Kit	Pierce Rockfort, UK
CDP-Star	Tropix, Bedford, USA
monoklonaler COX-1 Antikörper	Cayman, Ann Arbor, USA
monoklonaler COX-2 Antikörper	Transduction Laboratories, Lexington, USA
DMEM	GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, D
DMSO	Sigma, Deisenhofen, D
Fötales Kälberserum	PAA Laboratories, Linz, Au
High range Molekulargewichtsmarker	Sigma, Deisenhofen, D
I-Block	Tropix, Beford, USA
Matrigel	Becton Dickinson, Heidelberg, D
MTT-Reagenz	Sigma, Deisenhofen, D
NS 398	Alexis, Grünberg, D
Prostaglandin E2	Sigma, Deisenhofen, D
PGE2-ELISA	R&D Systems, Wiesbaden, D
Trypsin/ EDTA-Lösung	GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, D
XTT-Reagenz	Boehringer, Mannheim, D
weitere Chemiekalien	Sigma, Deisenhofen, D

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3.2 Instrumente und Verbrauchsmaterial

CASY-Cell Counter	Schärfe Systems, Reutlingen, D
Densitometer G760	Bio Rad, Richmond, USA
ELISA-Reader	Bio-Tek Instruments, Winooski, USA
Hyperfilm	Amersham, Braunschweig, D
Kulturplatten 12 bzw. 96 well	Falcon/ Becton Dickinon, Heidelberg, D
Molecular Analyst Software	Biorad, Richmond, USA
Potran-Membran	Schleicher und Schwell, Dassel, D
Transwellmembraneinsätze,
Porengröße 8µm	Corning Costar, Cambridge, USA

3.3 Gele, Puffer und Lösungen

Blocking-Puffer	0,2% I-Block 1x PBS
	0,1% Tween-20
Coomassie-Färbelösung	0,6% Coomassie-Blau, G250 10% Essigsäure
Färbe-Fixierlösung für Comassie	25% Isopropanol 10% Essigsäure
Gelatinegel	10% Gelatine 2,25 ml Acrylamid
	3 ml Gelpuffer (0,4% SDS, 1,5 M TRIS-HCl 8,8) 120 µl APS 10%
	12 µl TEMED 6,75 µl H2O
Polyacrylamidgel 10%	25% Acrylamid 0,375 M TRIS-HCl (pH 8,8)
	0,1% SDS 0,05% APS

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	0,005% TEMED
Proteinlysispuffer	62,5 mM TRIS-HCl (pH 6,8) 2% SDS
	10% Glycerol 50 mM DTT
	0,1% Bromphenolblau
Kollagenasepuffer	150 mM NaCl 10 mM CaCl2
	0,05 % NaN3 50 mM Tris-HCl
Proteinladungspuffer 4x	1,25 ml TRIS-HCl 0,5 M 2,5 ml Glycerol
	5 ml 20% SDS 1,25 ml 1% Bromphenolblau
	+1/5 -Mercaptoethanol
SDS 2x	250 mM TRIS-HCl 4% SDS
	10% Glycerol
Standardkulturmedium DMEM	10% FKS 2% Glutamin
Transferpuffer, pH 8,3	2,9g Glycin 5,8g TRIS-Base
	0,37g SDS 200 ml Methanol auf 8000 ml Aqua bidest
TRIS-Puffer 10x, pH 7,4	9g TRIS-Base 68,5g TRIS-HCl
	87,8g NaCl auf 1000 ml Aqua bidest
Waschpuffer Western Blot	1% PBS 0,1% Tween-20

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3.4 Zelllinien und Zellkultur

Die humanen Melanomzelllinien A 375 ( Giard et al. 1973 ), C 8161 ( Bregmann et al. 1986 ), IGR 37 ( Weinreb and Travo 1984 ), MeWo, SK Mel 13 und SK Mel 28 ( Fogh et al. 1977 ) wurden von der American Tissue Culture (ATCC) bezogen und sind umfangreich charakterisiert ( Welch et al. 1991 , Eberle et al. 1993 ). Die Zellen wuchsen unter sterilen Bedingungen bei 37°C in einer H₂O-gesättigten, 5%igen CO₂-Atmosphäre. Die Zelllinien wurden in DMEM-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum und 2% L-Glutamin, über maximal 10 Passagen kultiviert.

3.5 Western Blot

Die subkonfluenten Zelllinien lysierte man auf Eis in einer 40 mm Petrischale mit 100µl Proteinlysispuffer. Das Lysat wurde mittels einer Insulinspritze mehrmalig mechanisch degradiert und bei -20°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen konnten mit dem BCA Protein Assay Kit nach Anleitung des Herstellers bestimmt werden. Die Proteinproben (100µg) wurden mit 2x SDS auf 10 µl aufgefüllt und mit dem dritten Teil Proteinladungspuffer versetzt und der heißen Lyse bei 95 °C für 10 Minuten unterzogen. Es folgte die Auftrennung der Proben in einem 10%igen Polyacrylamidgel mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese bei 90 V für 2 Stunden. Danach blottete man die Proteine in einem Semi-Dry-System bei 100mA für 90 min auf eine Nitrozellulosemembran. Die Inkubation über Nacht in Blocking-Puffer bei 4°C blockierte unspezifische Bindungsstellen. Die monoklonalen Primärantikörper wurden, jeweils 1:250 verdünnt, in Blocking-Puffer für eine Stunde auf die Membran gegeben. Nach anschließendem dreimaligen Waschen mit Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit dem sekundären goat-anti-mouse Antikörper, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase, in einer Verdünnung von 1:5000 in Blocking-Puffer für 45 min. Nach nochmaligem Waschen reagierten die Banden für 5 min mit dem CDP-Star RTU Lumineszenzsystem und belichteten einen Hyperfilm.

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3.6 PGE₂-ELISA

Konfluente Zellen säte man nach Trypsinierung und Zentrifugation (1100 U/min, 10 min) in mehrere 12-well-Kulturschalen in einer Dichte von 50.000 Zellen /500 µl in serumhaltigem Medium aus. Es folgte die Inkubation mit und ohne NS 398 (50 µM) und für die MeWo-Zelllinie in einer Konzentrationsreihe für NS 398 von 0,1 bis 50 µM. Nach 24 h wurde das Medium durch identisches Volumen mit und ohne das Substrat Arachidonsäure (20 µM) erneuert. Nach 1 h zentrifugierte man den Überstand (5000 U/min, 10 min) und blockierte die Cyxlooxygenase durch 10 µg/ ml Indomethacin. Es folgte die Lagerung der Aliquots bei -80° C. Die Kulturschalen wurden mit 250 µl Trypsin behandelt und die Zellzahl im CASY-Cell Counter bestimmt.

Die Konzentration von PGE₂ in den Überständen konnte mittels eines spezifischen ELISAs nach Anleitung des Herstellers bestimmt werden. Die Extinktion war im ELISA-Reader bei 405 nm und einer Referenzwellenlänge von 590 nm messbar. Die Konzentration von PGE₂ wurde anhand von korrespondierenden Absorptionen der kalkulierten Standardkurve berechnet. Die Sensitivität des Tests lag bei 36 pg/ml. Die Ergebnisse sind in pg/ml bezogen auf 10⁵ Zellen dargestellt.

3.7 Proliferationsassay

Die Zellen wurden in gleicher Konzentration (20.000 Zellen/ ml) in eine 96-well-Kulturschale ausgesät und wuchsen in Standardmedium. NS 398 wurde als Stammlösung in 100 mM DMSO gelöst. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO in entsprechenden Konzentrationen. Verschiedenen wells gab man NS 398 in verschiedenen Konzentrationen von 0,01 µM bis 100 µM. In gleicher Weise wurde eine Konzentrationsreihe für PGE₂ von 0,01 nM bis 1 µM angefertigt. Nach 72 h erfolgte die Zugabe des XTT-Reagenzes und nach 4 Stunden Reaktionszeit schloss sich die Messung bei 490 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm im ELISA-Reader an.

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3.8 Matrigel-Invasionsassay

Transwelleinsätze mit Polykarbonatmembranen (Porengröße 8 µm) in 6-well-Kulturplatten wurden mit verdünntem Matrigel (1mg/ml in serumfreiem DMEM) in einer Konzentration von 675 µl/ 4,7 cm2 unter strengem Arbeiten auf Eis beschichtet und für 60 min bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Membranen mit serumfreiem DMEM folgte das Absaugen des nichtpolymerisierten Matrigels. Die Zellen säte man im oberen Kompartiment in einer Dichte von 2 x 10⁵/ml in serumfreiem Zellkulturmedium aus. NS 398 (50µM) oder die Kontrolle DMSO (0,05 %) gab man in das obere und untere Kompartiment. In einigen Versuchen erfolgte eine Stunde nach Zugabe von NS 398 die zusätzliche Gabe von PGE₂ (0,05 - 100 nM). PGE₂ wurde auf Grund von Messungen von Durant et al. 1988 , wonach die Halbwertzeit von PGE₂ in vitro 24 h beträgt, täglich supplementiert. Nach 72 h schloss sich die Inkubation der Kulturen mit 0,5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) für 4 h an ( Imamura et al. 1994 ). Danach wurden die Zellen auf der Unterseite des Transwellfilters mit einem Zellscraper vorsichtig mechanisch abgewischt und in 200 µl DMSO gelöst. Separat erfolgte die Lösung der nichtinvadierten Zellen im oberen Kompartiment in 200 µl DMSO und nach 1:10 Verdünnung der Zellen aus dem oberen Kompartiment wurden die Proben in eine 96-well-Kulturplatte überführt.

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Abbildung 6: Matrigel-Invasionsassay: Transwellmembraneinsätze wurden mit Matrigel (grau) beschichtet und die Tumorzellen in das obere Kompartiment ausgesät. Nach 72 h erfolgte die Quantifizierung der Zellen an der Unterseite der Membran

Die Extinktion war am ELISA-Reader bei 490 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm messbar. Um einen Effekt des NS 398 auf den MTT-Metabolismus auszuschließen, wurde in einigen Fällen NS 398 direkt vor dem MTT dazugegeben. Die Hemmung der Invasion drückte man in Prozent zur Kontrolle aus.

3.9 Zymogramm

Die Überstände des Invasionsassays wurden bei -20° C gelagert. 20 µl Probe konnten in einer Gelatinegelelektrophorese bei 150 V in 2,5 h getrennt werden. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurde das Gel in Kollagenasepuffer über Nacht inkubiert. Es folgt die Färbung mit Coomassie-Färbelösung über eine Stunde. Unter Entfärbelösung zeigten sich die Banden. Das Gel wurde am Densitometer eingescannt und mittels Molecular Analyst Software analysiert.

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