Köbel, Martin: Die Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 COX-Protein Expression

Die sechs untersuchten Melanomzelllinien exprimierten konstitutiv COX-2 in ähnlicher Menge (Abb. 7, untere Reihe). Die Höhe der Banden lag im Bereich des Molekulargewichtsmarkers von 70 kDa und entsprach damit der Proteingröße der COX-2. Die Expression der COX-1 war in allen sechs Zelllinien vergleichsweise gering (Abb. 7, obere Reihe).

MeWo

SK Mel 13

SK Mel 28

A 375

IGR 37

C 8161

Abbildung 7: Western blot COX-1 (oben) und COX-2 (unten) von sechs Melanomzellinien

4.2 Prostaglandin E2-Biosynthese

Mittels eines spezifischen PGE2-ELISAs konnte im Überstand aller sechs Melanomzelllinien basale Prostaglandin E2-Konzentrationen von 60 bis 700 pg /105 Zellen gemessen werden (Abb. 8). Nach Zugabe des Substrats Arachidonsäure (20µM) erhöhten sich die Werte auf 111 ± 25 pg /105 Zellen für die Zelllinie C 8161 und 3752 ± 216 pg /105 Zellen für die Zelllinie A 375. Der COX-2-spezifische Inhibitor NS 398 (50µM) inhibierte die PGE2 Produktion der Zellen bis zu einem Restwert von etwa 100 pg/105 Zellen, mit Ausnahme der Zelllinie SK Mel 28, in welcher die Inhibition nicht so hoch ausfiel.


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Abbildung 8: PGE2-Biosynthese ohne (schwarz) und mit (grau) Zugabe von Arachidonsäure (20µM) als Substrat und Hemmung der faszilierten Biosynthese durch NS 398 (weiß).

In drei Zelllinien (MeWo, SK Mel 13 und IGR 37) wurde die PGE2-Synthese bis auf ein Restwert von etwa 20 % des Ausgangswertes vermindert (Abb. 9). Bei der Zelllinie A 375 wurde die PGE2-Produktion sogar um 96% gehemmt. Die Zelllinien SK Mel 28 und C 8161 ließen sich nur zu etwa 50 % inhibieren

Abbildung 9: Prozentuale Hemmung der PGE2-Biosynthese durch NS 398 (50µM).


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Um die IC50 für die Inhibition der PG2-Biosynthese von NS 398 abzuschätzen, wurden MeWo Zellen mit Konzentrationen von 0,1 bis 50 µM (NS 398) inkubiert und die PGE2-Produktion nach Substratzugabe (20 µM Arachidonsäure) gemessen. Es ergab sich eine dosisabhängige Reduktion der PGE2-Produktion mit einer geschätzten IC50 von 6 µM. (Abb. 10)

Abbildung 10: Konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2-biosynthese durch NS 398 (0,1 µM bis 50µM) in MeWo Zellen.


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4.3 Inhibition der Matrigel-Invasion durch NS 398

Die in vitro Invasivität der Melanomzelllinien wurde mit einem Matrigel-Invasionsassay mit und ohne Zugabe von NS 398 untersucht. NS 398 (50 µM) unterdrückte die in vitro Invasivität der Zelllinien um Werte zwischen 46 % bei MeWo und 86 % bei C 8161 im Vergleich zur Kontrolle. Die Kontrolle wurde mit der entsprechenden Konzentration DMSO, dem Lösungsmittel von NS 398, inkubiert (Abb. 11).

Abbildung 11: Relative Hemmung der Invasion von Melanomzelllinien durch NS 398 (50µM) im Vergleich zu Kontrollen in DMSO (0,05%). Dieser Effekt wurde in drei unabhängigen Experimenten bestätigt.

Um zu ermitteln, ob die Invasionshemmung durch ein Produkt der COX-2 vermittelt wird, wurde zusätzlich zu NS 398 Prostaglandin E2 (100 nM) täglich supplementiert. Die tägliche Gabe wurde aufgrund von Beobachtungen gewählt, wonach die Halbwertzeit von Prostaglandinen in vitro im Bereich von 20 Stunden liegt ( Durant et al. 1988 ). Die Hemmung der Invasivität konnte durch PGE2-Zusatz nicht aufgehoben werden. (Abb. 12)


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Abbildung 12: Relative Hemmung der Invasion durch NS 398 (weiß, s. Abb.11) und zusätzliche Supplementierung von PGE2 (grau, 100nM). Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten.

Für die Melanomzelllinie MeWo wurde dieser mögliche Mechanismus mit einer Konzentrationsreihe von PGE2 (0,05 nM bis 100 nM) in drei unabhängigen Experimenten detaillierter untersucht. Hierbei stellte PGE2 die Invasivität der Zelllinie nicht wieder her (Abb. 13).

Abbildung 13: Relative Hemmung der Invasion durch NS 398 (50µM) und Supplementierung mit drei verschiedenen PGE2-Konzentrationen. Ergebnisse aus die unabhängigen Experimenten.


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4.4 Korrelationen zwischen NS 398 Einfluss auf Invasivität und PGE2-Produktion

Um einen Zusammenhang zwischen Invasionshemmung und der Inhibition der PGE2-Biosynthese abzuleiten, wurden beide Parameter für die einzelnen Zelllinien miteinander verglichen:

Tabelle 9: Vergleich der Invasionshemmung mit der PGE2-Synthesehemmung

Melanomzelllinie

Invasionshemmung in %

Hemmung der PGE2-Produktion in %

MeWo

46

80

SK Mel 13

47

78

SK Mel 28

52

50

A 375

60

96

IGR 37

68

79

C 8161

86

53

Um einen Zusammenhang zwischen der Hemmung der PGE2-Produktion und der Hemmung der Invasivität herzuleiten wurden beide Größen gegeneinander aufgetragen (Abb. 14). Es zeigte sich keine Korrelation beider Größen. Bei C 8161 wurde die Invasivität um 86 % gehemmt, die Prostaglandinsynthese hingegen nur zu etwa 50 % bei einer relativ geringen Absolutsynthese von PGE2. A 375 liegt mit 60 % Invasionshemmung im mittleren Bereich der untersuchten Zelllinien, zeigt aber die deutlichste Hemmung der PGE2 Biosynthese mit 96%.

Abbildung 14: Relative Invasionshemmung in Zusammenhang mit der relativen PGE2-Synthesehemmung.


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4.5 Proliferationseinfluss von NS 398 und PGE2

Die Proliferation der sechs Melanomzelllinien änderte sich unter Inkubation mit dem COX-2-spezifischen Inhibitor NS 398 nicht. Die verwendeten Konzentrationen von 0,1 µM bis 100 µM zeigten keine Einfluss auf die Proliferation über einen Zeitraum von 96 Stunden.


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Abbildung 15: Proliferationseinfluss von NS 398 (0,1µM bis 100µM) nach 72 Stunden auf sechs verschiedene Melanomzelllinien in drei unabhängigen Experimenten.


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Unter Einfluss von PGE2 in verschiedenen Konzentrationen zeigte sich ebenfalls eine konstante Proliferation.


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Abbildung 16: Proliferationseinfluss von PGE2 (0,01 bis 1000 nM) nach 96 Stunden auf sechs verschiedene Melanomzelllinien in drei unabhängigen Experimenten.


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4.6 NS 398 und MMP-2 und -9

Die relative gelatinolytische Aktivität des Überstandes des Invasionsassays wurde im Zymogramm bestimmt und densitometrisch ausgewertet. Es zeigte sich keine signifikante Änderung der Aktivität der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 durch den COX-2-spezifischen Inhibitor NS 398.

Abbildung 17: Relative gelatinolytische Aktivität der MMP-2 und MMP-9 ohne (schwarz) und mit (weiß) Inkubation von NS 398, in einen Einzelexperiment.


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