Köbel, Martin: Die Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms

42

Kapitel 5. Diskussion

Die gestörte Wachstumskontrolle ist ein Charakteristikum autonomen Tumorwachstums. Benigne Tumoren wachsen lokalisiert in ihrem Ursprungsgebiet. Maligne Tumoren hingegen haben die Eigenschaft das umgebende Gewebe zu infiltrieren und die Wand von Lymph- oder Blutgefäßen zu durchbrechen. Diese Vorgänge sind Voraussetzung für eine Metastasierung und schränken die Erfolgsrate einer kurativen therapeutischen Strategie ein.

Die COX-2 beeinflusst verschiedene Prozesse des Wachstums und der Metastasierung maligner epithelialer Tumoren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Frage untersucht, ob durch eine spezifische pharmakologische Inhibition der COX-2 auch das Verhalten nichtepithelialer Tumoren, wie das des malignen Melanoms, zu beeinflussen ist.

Welche Schlussfolgerungen können aus den Ergebnissen unter Beachtung schon bekannter Modelle gezogen werden ?

5.1 Expression von COX-2 Protein in Melanomzelllinien

Obwohl aus der Literatur bekannt ist, dass verschiedene Karzinome (siehe Tab. 6) und auch davon abgeleitete Zelllinien (4/7 Kolon-, 2/3 Lungen-, 5/7 Mamma- und 1/3 Prostata-karzinomzelllinien, Hong et al. 1999 ) die COX-2 exprimieren, gibt es zum malignen Melanom bisher keine Studie.

In der vorliegenden Arbeit gelang der Nachweis der COX-2 in allen untersuchten Melanomzelllinien. Diese in vitro Daten konnten durch immunhistochemische Untersuchungen an Patientenproben von malignen Melanomen durch unsere Arbeitsgruppe bestätigt werden. 26 von 28 (92%) der untersuchten malignen Melanome zeigten eine deutliche Immunpositivität für die COX-2. Dagegen exprimierten Naevuszell-Naevi dieses Enzym nicht ( Denkert et al. 2001 ).

Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass die untersuchten Melanomzellen die COX-1 im Gegensatz zur COX-2 vergleichsweise gering bilden.


43

5.1.1 Ursachen der erhöhten COX-2 Expression in malignen Tumoren

Wie einleitend bemerkt, wird die COX-2 normalerweise nicht konstitutiv exprimiert. Zytokine wie IL-1beta und TNF-alpha bewirken eine Induktion des Enzyms. Eine Übersicht über die in die Expressionsregulation involvierten Signalwege gibt die Abb. 18. Folgende experimentelle Ansätze gaben Hinweise auf die Bedeutung der aufgeführten Mediatoren:

  1. Sheng et al. 1996 zeigten, dass die Zugabe von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) eine durch PD 98059, einem hochspezifischen Inhibitor der p42/p44 MAP-Kinase, hemmbare COX-2 Induktion bewirkte.
  2. Die gleiche Arbeitsgruppe konstatierte auch eine erhöhte COX-2 Expression in Rat-1 Fibroblasten nach Transfektion mit aktivem Ha-Ras. PD 98059 supprimierte auch diese COX-2 Induktion.
  3. Transfektion von Plasmiden mit dominant negativen Kinasemutanten offenbarte die Bedeutung zweier MAP-Kinase Signalwege, der JNK-Kinase und der p42/p44 MAP-Kinase, für die COX-2 Induktion ( Reddy et al. 2000 ).
  4. In Neuroblastomzellen ist auch die p38 MAP-Kinase in die Induktion der COX-2 involviert ( Fiebich et al. 2000 ).
  5. Shao et al. 2000 zeigten, dass die Expression der COX-2 in kolorektalen Karzinomzellen unter Kontrolle der MAP-Kinase Signalwege steht. Die Halbwertszeit der COX-2 beträgt 3,5 - 8h, wobei der Abbau durch Proteolyse mit Ubiquitin erfolgt.
  6. Aktiviertes Ras erhöht MAPK-vermittelt neben der COX-2 auch die Expression der Phospholipase A2. Dieses Enzym löst Arachidonsäure aus seinen Phospholipidspeichern und macht sie somit als Substrat der COX-2 verfügbar ( Heasley et al. 1997 ).
  7. Das COX-2 Produkt PGE2 kann über seinen membranständigen Rezeptor wahrscheinlich cAMP-abhängig die COX-2 Expression in einer Art selbstverstärkenden Regelkreis steigern ( Tjandrawinata et al. 1997 , Hinz et al. 2000 ).
  8. Phorbolester wie TPA induzieren PKC-abhängig die COX-2 ( Milpeix et al. 1997 ).

    44

  9. Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB bindet an den COX-2 Promoter und leitet die Transkription der COX-2 ein ( Newton et al. 1997 ).
  10. Aktivierung der I_B Kinase (IKK) und Degradation des inhibierenden I_B Proteins vom zytosolischen NF-kappaB Komplex sind für die NF-kappaB Aktivierung essentiell und erfolgen durch reaktive Sauerstoffspezies ( Baeuerle 1998 ).
  11. NSAID können NF-kappaB inhibieren ( Kopp and Ghosh 1994 ).
  12. PGJ2 als PPARgamma Agonist kann die COX-2 Expression supprimieren. Dies könnte ein negatives Feedbacksystem sein, indem das COX-Produkt PGJ2 die Menge des eigenen Enzyms kontrolliert ( Inoue et al. 2000 ).

Eine Fehlregulation dieser Signalwege könnte zu einer konstitutiven Expression der COX-2 in malignen Tumoren wie auch dem Melanom führen.


45

Abbildung 18: Modell der Genregulation der COX-2.

Neben der gestörten Regulation der COX-2 Transkription könnte andererseits eine Genamplifikation des COX-2 Lokus für den erhöhten COX-2 Nachweis im Tumorgewebe verantwortlich sein. Bastian et al. 1998 zeigten in einer CGH Analyse von Melanomen eine 1q Amplifikation in 8/32 Proben (25%).


46

5.2 PGE2-Biosynthese in Melanomzelllinien

Um die Funktionsfähigkeit der COX-2 zu verifizieren, erfolgte die immunologische Detektion von PGE2, welches im Überstand in Konzentrationen von 0,1 bis 1 ng/105 Zellen nachweisbar war. In der Literatur gibt es bisher keine quantitativen Angaben zur PGE2-Synthese in Melanomzellen. Kolorektale Karzinomzelllinien (HCA-7) produzieren dagegen weit mehr PGE2 (15 bis 27 ng/ml, Chinery et al. 1998, Sheng et al. 1998 ).

Hinweise wonach die COX-2 hauptsächlich an der Synthese von PGE2 beteiligt ist, erhält man aus folgenden Beobachtungen:

  1. Die konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2-Biosynthese durch den COX-2 spezifischen Inhibitor NS 398 ergab eine IC50 von 6 µM. Dieser Wert liegt in der Nähe der in der Literatur angegebenen IC50 von NS 398 mit 1,77 µM ( Barnett et al. 1994 ). Somit dürfte die erzielte PGE2 Suppression auf der Hemmung der COX-2 und nicht der COX-1 beruhen, denn die IC50 von NS 398 für die COX-1 liegt bei 75µM ( Barnett et al. 1994 ).
  2. NS 398 in einer Konzentration von 50µM unterdrückte die PGE2-Biosynthese um etwa 90%, was auf eine partielle Hemmung der COX-1 zurückzuführen ist. Die nicht-hemmbare Restproduktion von 50 bis 100 pg/105 Zellen stammt von der COX-1.

5.3 Proliferationseinfluss von NS 398 und PGE2

Die Wirkung von NS 398 auf Proliferation und Invasion wurde in vitro überprüft. NS 398 hatte in Konzentrationen bis 100µM keinen Einfluss auf die Proliferation. Es liegen zwar keine Daten zum in vitro Proliferationseinfluss von COX-2-spezifischen Inhibitoren in Melanomen vor, die Ergebnisse sind aber vereinbar mit in vitro Ergebnissen von Cahlin et al. 2000 . In dieser Studie konnten COX-Inhibitoren die Größe von Melanomen der Maus nicht verringern. Ebenfalls keinen Proliferationseffekt erzielten Murphy et al. 1997 und Hong et al. 1999 in einem Panel verschiedener Karzinomzellen (Tab.5). In der Untersuchung von Hong bewirkten interessanter weise die Lipoxygenase-Inhibitoren eine signifikante Zellwachstumshemmung, nicht aber die COX-Inhibitoren. Die konstante Proliferation der Melanomzellen unter NS 398 ist konträr zu mehreren Studien an verschiedenen Karzinomzellen (Tab.5). NS 398 bewirkte eine 50%-ige


47

Proliferationshemmung in Konzentrationen von 80 bis 100µM an kolorektalen, oesophagealen und prostatischen Karzinomzellen.

Auch PGE2 (bis 1µM) zeigte keinen Einfluss auf die Proliferation. Somit kann ein möglicher kompensierender Proliferationseffekt von NS 398 oder PGE2 auf die folgenden Ergebnisse ausgeschlossen werden.

5.4 Inhibition der Matrigelinvasion durch NS 398

In diesem Experiment mussten die Tumorzellen eine 50µm dicke Matrigelschicht penetrieren, welche eine natürliche Basalmembran simulierte. Mit 50µM NS 398 konnte eine signifikante Invasionsreduktion erzielt werden. Die als besonders invasiv beschriebene Zelllinie C 8161 ( Welch et al. 1991 ) wurde sogar um 86 % in ihrer Invasivität gehemmt. Die anderen Zelllinien zeigten ein geringere aber reproduzierbare und signifikante Invasionshemmung durch NS 398. Damit liegen erstmals Daten vor, die eine Invasionshemmung humaner Melanomzellen durch COX-2-spezifische Inhibitoren zeigen. ( Reich et al. 1996 ) supprimierten mit dem nichtspezifischen NSAID Indomethacin in einer murinen Melanomzelllinie die in vitro Invasion und die Expression der Gelatinase MMP-2. Die Expression und Funktion der COX-2 wurden in dieser Studie allerdings nicht untersucht.

Um ebenfalls einen wesentlichen Mechanismus der Matrixdegradation zu untersuchen, wurde die gelatinolytische Aktivität des Überstandes des Invasionsassays bestimmt. Im Gegensatz zu Reich et al. 1996 , welche eine quantitative Verminderung der MMP-2 unter Indomethacin beschrieben, konnte in der vorliegenden Arbeit unter NS 398 keine Änderung der funktionellen Aktivität der beiden Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 festgestellt werden. Somit dürfte der Einfluss der COX-2 auf die Invasion entweder über andere matrixdegradadierende Enzyme oder über andere Komponenten der Invasion wie Adhäsion und Migration vermittelt sein.


48

5.4.1 Prostaglandin-unabhängiger Mechanismus

Die molekularen Mechanismen wodurch NS 398 die Invasionshemmung verursacht, sind bisher nicht geklärt. Es stellt sich die Frage, ob die Prostaglandine als Produkte der COX ursächlich für die verminderte Invasivität sind. Folgende Ergebnissen sprechen gegen einen PGE2-vermittelten Mechanismus:

  1. Die exogene Substitution von PGE2 konnte die Invasionshemmung durch NS 398 nicht wieder aufheben. Dabei wurden Konzentrationen von PGE2 bis zu 100 nM, also im dreißigfachen Bereich der gemessenen Eigensynthese der Melanomzellen, verwendet (2,8 nM).
  2. Die Konzentration des Inhibitors zur Invasionshemmung war etwa 10 mal höher als die IC50 für die PGE2-Synthesehemmung der COX-2. Diese Diskrepanz lässt ebenfalls an einen anderen Wirkmechanismus denken. Die verwendeten 50 µM NS 398 hemmten die COX-1 nur partiell, deren IC50 bei 75 µM liegt.
  3. Es bestand keine Korrelation zwischen der Hemmung der Invasivität und der Hemmung der PGE2 Produktion.

Die molekulare Basis der Invasionsregulation durch die COX-2 bedarf weiterer Abklärung. Die vorliegenden Daten sprechen dafür, dass COX-Inhibitoren neben ihrem Hauptziel der COX weitere zelluläre Targets besitzen.

Ein solches non-COX-Target ist PPARdelta, welches direkt durch den NSAID Sulindac Sulfon gehemmt werden kann ( He et al. 1999 ). NSAIDs können über diesen nukleären Rezeptor direkt die Transkription beeinflussen und völlig unabhängig von der COX wirken. Es bliebe zu zeigen, ob auch COX-2-spezifische Inhibitoren die PPARdelta-Aktivität reduzieren.

In diesem Zusammenhang muss man nochmals erwähnen, dass das COX-Produkt PGI2 ein PPARdelta Agonist ist ( Gupta et al. 2000 ). Somit ist eine synergistische PPARdelta-Hemmung einerseits direkt und andererseits indirekt über die Hemmung des COX-generierten PGI2 durch NSAIDs denkbar.


49

5.5 Ausblick

Das vielversprechende Konzept der Chemoprävention ist mit dem Einsatz von Sulindac Sulfon und auch von Celebrex bei Patienten mit FAP zum ersten Mal in der Praxis erfolgreich angewandt worden ( Steinbach et al. 2000 ). Dabei ist ein COX-2-spezifischer Inhibitor einem unspezifischen Inhibitor bei gleicher antitumoröse Wirksamkeit überlegen, weil die Rate an gastroduodenalen Ulzera vermindert ist ( Laine et al. 1999 ). Einchränkend muss man jedoch feststellen, dass es bisher mit keinem COX-Inhibitor gelungen ist, das Tumorwachstum vollständig zu verhindern. Zusätzlich besteht auch bei COX-2-spezifischen Inhibitoren eine potentielle Toxizität in der Langzeitanwendung. Es bietet sich also an, COX-2-spezifische Inhibitoren in Kombination mit anderen Wirkstoffen zu verwenden. Die kürzlich erschienene Arbeit von Torrance et al. (2000) beschreibt eine vollständige Hemmung der Polypenentwicklung in der Hälfte von MIN Mäusen durch eine Kombination von Sulindac Sulfon und dem Inhibitor des EGF-Rezeptors EKB-569. Dieser Ansatz erscheint sinnvoll, da wie oben beschrieben, EGF die Expression der COX-2 induzieren kann. Dieses Beispiel verdeutlicht wie wichtig es ist, die molekularen Mechanismen zu verstehen, um eine erfolgreiche synergistische antitumoröse Kombinationstherapie zu entwickeln. Das Augenmerk der vorliegenden Arbeit richtete sich darauf, den chemopräventiven Ansatz auch auf einen adjuvant therapeutischen auszudehnen. Die Ergebnisse zeigen, dass die weiteren Untersuchungen COX-2-spezifischer Inhibitoren in einer Kombinationstherapie auch bei fortgeschrittenen malignen Melanomen sinnvoll erscheinen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Aug 17 14:17:42 2001