Köbel, Martin: Die Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms

Aus Institut für Pathologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Die Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms

Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Martin Köbel ,
aus Magdeburg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. med. S. Hauptmann
Prof. Dr. med. H. Kuehn
Prof. Dr. med. D. Schadendorf

Datum der Promotion: 18.06.2001

Zusammenfassung

Seit Anfang der 90-iger Jahre ist bekannt, dass nichtsteroidale Antirheumatika die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms vermindern können. Diese antitumoröse Aktivität wird wahrscheinlich über die Cyclooxygenase-2 (COX-2) vermittelt, welche die Biosynthese von Prostaglandin H2, einer Vorstufe der Prostanoide, katalysiert. Eine Überexpression der COX-2 wurde für verschiedene Karzinome beschreiben. In dieser Studie wurde die Expression und tumorbiologische Relevanz der COX-2 im malignen Melanom, als Vertreter nichtepithelialer Tumoren, untersucht.

Im Western blot wurde COX-2 Protein in den sechs untersuchten Melanomzelllinien nachgewiesen. Mittels eines spezifischen ELISAs wurde PGE2 im Überstand der Zelllinien nachgewiesen. Die PGE2-Biosynthese wurde durch den COX-2-spezifischen Inhibitor NS 398 konzentrationsabhängig inhibiert. Die IC50 der COX-2 für NS 398 wurde mit etwa 6 microM bestimmt. NS 398 inhibierte die Matrigelinvasion aller sechs Melanomzelllinien, ohne Einfluss auf die Proliferation zu haben. Die Invasionshemmung war PGE2-unabhängig, weil i) exogenes PGE2 die Invasionshemmung nicht wieder aufhob, ii) die erforderliche Konzentration von NS 398 zur Invasionshemmung im 8-fachen Bereich der IC50 der COX-2 lag.

Die COX-2 ist Melanomzellen konstitutiv exprimiert und synthetisiert PGE2. NS 398 hemmt die Invasion von Melanomzellen in PGE2-unabhängiger Weise und könnte somit über ein sog. Non-COX-target wirken.

Schlagwörter:
Cyclooxygenase-2, Prostaglandin E2, NS 398, Melanom

Abstract

Accumulating evidence indicates that nonsteroidal anti-inflammatory drugs can reduce the incidence of colorectal cancers in humans. This antineoplastic activity is largely related to the inhibition of the inducible cyclooxygenase-2 (COX-2), which catalizes the biosynthesis of prostaglandin H2 the precursor of prostanoids. Elevated expression of COX-2 has been described in several types of epithelial tumors. In this study we evaluate the expression and function of COX-2 in malignant melanoma as a model of a non-epithelial tumor.

With Western blot COX-2 protein was detected in all of six malignant melanoma cell lines. These cell lines produced prostaglandinE2 (PGE2) which was measured by a specific ELISA. PGE2 biosynthesis was blocked in a concentration dependent manner by the COX-2-specific inhibitor NS 398. The COX-2 IC50 for NS 398 was determined with 6 microM. In all six cell lines treatment with NS 398 reduced the invasion through a matrigel coated membrane while cell proliferation was not influenced. The inhibition of invasion was not mediated by PGE2, because i) exogenous PGE2 did not restore invasion, ii) the concentration needed for inhibitory effects on invasion was 8-fold higher than the IC50 of the COX-2.

COX-2 is constitively expressed in malignant melanoma cells and is capable to produce PGE2. NS 398 reduces melanoma cell invsaion in a PGE2-independent manner, thus it likely further acts via a non-COX-target.

Keywords:
cyclooxygenase-2, prostaglandin E2, NS 398, melanoma


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie Rolle der Cyclooxygenase-2 bei der Invasion des malignen Melanoms
1 Einleitung
1.1Arachidonsäurestoffwechsel
1.1.1membranäre Prostaglandinrezeptoren
1.1.2nukleäre Prostaglandinrezeptoren
1.2Zwei Isoformen der Cyclooxygenase
1.3Cyclooxygenase und Entzündung
1.4COX-2 und maligne Tumore
1.4.1Tumoriniation und Tumorpromotion
1.4.2Tumorzellproliferation
1.4.3Progression
1.4.4molekularer Mechanismus
1.4.4.1Interaktion mit membranären Prostaglandinrezeptoren
1.4.4.2Interaktion mit nukleären Prostaglandinrezeptoren
1.4.4.3Prostaglandin-unabhängiger Mechanismus
1.4.4.4Non-COX-Target
1.5Malignes Melanom
2 Zielstellung
3 Material und Methoden
3.1Antikörper, Chemikalien und Kits
3.2Instrumente und Verbrauchsmaterial
3.3Gele, Puffer und Lösungen
3.4Zelllinien und Zellkultur
3.5Western Blot
3.6PGE2-ELISA
3.7Proliferationsassay
3.8Matrigel-Invasionsassay
3.9Zymogramm
4 Ergebnisse
4.1COX-Protein Expression
4.2Prostaglandin E2-Biosynthese
4.3Inhibition der Matrigel-Invasion durch NS 398
4.4Korrelationen zwischen NS 398 Einfluss auf Invasivität und PGE2-Produktion
4.5Proliferationseinfluss von NS 398 und PGE2
4.6NS 398 und MMP-2 und -9
5 Diskussion
5.1Expression von COX-2 Protein in Melanomzelllinien
5.1.1Ursachen der erhöhten COX-2 Expression in malignen Tumoren
5.2PGE2-Biosynthese in Melanomzelllinien
5.3Proliferationseinfluss von NS 398 und PGE2
5.4Inhibition der Matrigelinvasion durch NS 398
5.4.1Prostaglandin-unabhängiger Mechanismus
5.5Ausblick
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: membranäre Prostaglandinrezeptoren nach Narumiya et al. 1999
Tabelle 2: PPARs nach Kersten et al. 2000
Tabelle 3: Unterschiede von COX-1 und COX-2 nach Taketo 1998
Tabelle 4: Phänotypen von COX defizienten Mäusen nach Langenbach et al. 1999
Tabelle 5: Konzentration verschiedener NSAIDs, die zur Halbierung der enzymatischen Aktivität der COX-1 und COX-2 nötig sind (nach Taketo 1998 )
Tabelle 6: Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der COX-2 in Karzinomen
Tabelle 7: Wirkung COX-2-spezifischer Inhibitoren auf das Wachstum verschiedener Karzinomzelllinien
Tabelle 8: Effekte exogen substituierter Prostaglandine bei verschiedenen Tumoren
Tabelle 9: Vergleich der Invasionshemmung mit der PGE2-Synthesehemmung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Arachidonsäurestoffwechsel
Abbildung 2: Struktur der Prostanoidsäure
Abbildung 3: Funktionelle Gruppen der wichtigsten Prostaglandine und Thromboxane
Abbildung 4: Antitumorigene Angriffspunkte der NSAIDs
Abbildung 5: Molekulare Targets der NSAIDs
Abbildung 6: Matrigel-Invasionsassay: Transwellmembraneinsätze wurden mit Matrigel (grau) beschichtet und die Tumorzellen in das obere Kompartiment ausgesät. Nach 72 h erfolgte die Quantifizierung der Zellen an der Unterseite der Membran
Abbildung 7: Western blot COX-1 (oben) und COX-2 (unten) von sechs Melanomzellinien
Abbildung 8: PGE2-Biosynthese ohne (schwarz) und mit (grau) Zugabe von Arachidonsäure (20µM) als Substrat und Hemmung der faszilierten Biosynthese durch NS 398 (weiß).
Abbildung 9: Prozentuale Hemmung der PGE2-Biosynthese durch NS 398 (50µM).
Abbildung 10: Konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2-biosynthese durch NS 398 (0,1 µM bis 50µM) in MeWo Zellen.
Abbildung 11: Relative Hemmung der Invasion von Melanomzelllinien durch NS 398 (50µM) im Vergleich zu Kontrollen in DMSO (0,05%). Dieser Effekt wurde in drei unabhängigen Experimenten bestätigt.
Abbildung 12: Relative Hemmung der Invasion durch NS 398 (weiß, s. Abb.11) und zusätzliche Supplementierung von PGE2 (grau, 100nM). Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten.
Abbildung 13: Relative Hemmung der Invasion durch NS 398 (50µM) und Supplementierung mit drei verschiedenen PGE2-Konzentrationen. Ergebnisse aus die unabhängigen Experimenten.
Abbildung 14: Relative Invasionshemmung in Zusammenhang mit der relativen PGE2-Synthesehemmung.
Abbildung 15: Proliferationseinfluss von NS 398 (0,1µM bis 100µM) nach 72 Stunden auf sechs verschiedene Melanomzelllinien in drei unabhängigen Experimenten.
Abbildung 16: Proliferationseinfluss von PGE2 (0,01 bis 1000 nM) nach 96 Stunden auf sechs verschiedene Melanomzelllinien in drei unabhängigen Experimenten.
Abbildung 17: Relative gelatinolytische Aktivität der MMP-2 und MMP-9 ohne (schwarz) und mit (weiß) Inkubation von NS 398, in einen Einzelexperiment.
Abbildung 18: Modell der Genregulation der COX-2.

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Fri Aug 17 14:17:42 2001