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2  Material und Methoden

Die hier beschriebene Versuchsreihe wurde an 12 weiblichen deutschen Hausschweinen mit einem Gewicht von 30 ± 5 kg durchgeführt. Alle Versuche wurden im Vorfeld genehmigt (SenGesSoz IV A4/5; AZ 0272/94).

2.1 Versuchstierpräparation

Die Tiere wurden zu Beginn des Versuchs tierärztlich untersucht. Ihre Körpertemperatur und die Leukozytenzahl waren normal.

Die Prämedikation erfolgte mit Ketamine (10 mg/kgKG i.m.), Midazolam (0,5 mg/kgKG i.m.) und Atropin (0,01 mg/kgKG i.m.). Anschließend wurde eine 18G Verweilkanüle in die Ohrvene eingebracht und die Narkose mit Methohexital (8 mg/kgKG i.v.) und Fentanyl (0,01 mg/kgKG i.v.) eingeleitet. Die Narkose wurde durch eine kontinuierliche Infusion von Methohexital (50 µg/kgKG/min) und Fentanyl (3 µg/kgKG/min) aufrechterhalten. Ein Bolus Pancuroniumbromid (0,15 mg/kgKG i.v.) diente zur Relaxierung. Danach wurde Pancuroniumbromid kontinuierlich (2,5 µg/kgKG/min) infundiert.

Nach der Einleitung wurden die Tiere intubiert (7,5-8mm Magill-Tubus, Mallinckrodt Medical, Athlone, Irland). Der Flüssigkeitsbedarf der Tiere wurde mit Ringer-Laktat-Lösung (5 ml/kg/h) ausgeglichen.

Die Tiere wurden zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur (± 0,5 °C vom Ausgangswert) auf einem Heizkissen in Rückenlage fixiert. Zur Überwachung der Kreislauffunktion erhielten die Tiere einen Rechtsherz-Katheter mit Thermodilutionsfunktion (Modell 93A-431-7,5 F., Baxter, Irvine, CA, USA) über eine 8,5 F. Schleuse (Baxter) in der V. femoralis. Zur Blutdrucküberwachung wurde in perkutaner Seldingertechnik ein arterieller Katheter in die A. femoralis gelegt (20G, Vygon).

Nach Anschluss an den Überwachungsmonitor konnten die Parameter der Kreislauffunktion aufgezeichnet werden.

2.2 Beatmung und Induktion des Lungenversagens

Nach Tracheotomie und Umintubation im Operationssaal wurden die Tiere mit einem Servo 900C Respirator (Siemens Elema, Lund, Schweden) volumenkontrolliert beatmet, wobei die Atemfrequenz von 18/min, der PEEP von 5 cmH2O, das Inspirations-Exspirations-Verhältnis von 1:2, die FiO2 von 1.0, das Zugvolumen von 12 ml/kg sowie der Spitzendruck von 40 cmH2O während des Versuchszeitraums unverändert blieben.

Durch wiederholte bronchoalveoläre Lavage nach Lachmann mit 0,9%iger körperwarmer Kochsalzlösung wurde dann das Surfactant ausgewaschen, woraus eine Verschlechterung des Gasaustausches resultierte (Lachmann, et al. 1980). Bei dieser etablierten Methode werden die Lungen nach Dekonnektion vom Respirator über den Tubus mit warmer Kochsalzlösung (0,15 M, 40 ml/kgKG bei 37 °C) in Rückenlage und umgekehrter Trendelenburgposition (ca. 60° bis 70° Kopfhochlage) gefüllt. Durch die darauf folgende Kopftieflage (ca. 45°) kann die Flüssigkeit ausfließen. Anschließend wurden die Tiere in horizontaler Position für mindestens 20 Minuten weiter beatmet. Arterielle sowie gemischt-venöse Blutgase wurden anaerob gewonnen sowie Kreislauf- und Beatmungsparameter aufgezeichnet. Mindestens 4 Lavagen in Bauchlage und drei bis vier in Rückenlage führten zum ARDS mit einem PaO2 < 100 mmHg. Resultat waren histologische und pathophysiologische Veränderungen, welche dem Krankheitsbild des ARDS entsprechen (Lachmann, et al. 1982).


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Abbildung 2 zeigt den arteriellen Sauerstoffpartialdruck während einer typischen Lavageabfolge.

Abbildung 2: Der PaO2-Verlauf (FiO2 1,0) dieses Kontrolltieres wurde kontinuierlich mit Hilfe eines arteriellen PaO2-Katheters (Paratrend 7, Agilent Technologies, Palo Alto, USA) aufgezeichnet. Die deutlichen Einschnitte sind Folge der kurzfristigen Beatmungsunterbrechungen während der Lavage.

2.3 Experimentelles Protokoll

Nach Induktion des Lungenschadens wurde 6 der 12 Tiere FC 3280 intratracheal verabreicht (Behandlungsgruppe), die anderen 6 erhielten keine weitere Behandlung (Kontrollgruppe). FC 3280 ist ein hochgereinigtes C8F18 Perfluorocarbon (Fluorinert™ Liquid FC-3280®, 3M Chemical Products, Neuss, Deutschland). Es hat eine spezifische Dichte von 1,75 g/cm3, einen Dampfdruck von 61 Torr, eine Oberflächenspannung von 12 mN/m bei 25 °C und eine Viskosität von 0,7 Centistokes. In 100 ml löst es 40 ml O2 und 192 ml CO2.

Die PLV wurde mit zweimaliger Instillation von je 7,5 ml/kgKG FC 3280 im Abstand von 30 Minuten durchgeführt. Dabei wurde das Perfluorocarbon während der Inspiration mit Hilfe eines Swivelconnectors (Portex, Kent, Großbritannien) in Rückenlage appliziert. 30 Minuten nach jeder Gabe FC 3280 wurden die Daten eines jeden Tieres bezüglich Hämodynamik und Gasaustausch bestimmt. Danach wurde das Intervall der Datenerfassung auf 60 Minuten verlängert. Die Aufzeichnungen endeten erst mit dem Tode der Tiere oder nach einem 24-stündigen Beobachtungszeitraum.


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2.4  Messmethoden und Monitoring

Bei allen Tieren wurden die Körpertemperatur, die Herzfrequenz, der endexspiratorische CO2-Gehalt sowie die Parameter der Hämodynamik mittels Monitor (Modell 66 S Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland) aufgezeichnet. Über den Femoralarterienkatheter und den Pulmonalarterienkatheter wurden der mittlere arterielle Blutdruck (MAP), der mittlere pulmonalarterielle Druck (PAP), der zentralvenöse Druck (ZVD), der pulmonalarterielle Verschlussdruck (PCWP) und das Herzzeitvolumen (HZV) ermittelt. Der Nullpunkt wurde auf Höhe der mittleren Axillarlinie bei horizontaler Rückenlage definiert. Das HZV wurde mit vier Injektionen von NaCl 0,9% (10 ml bei 1 bis 5 °C) über ein Thermodilutionssystem (Modell 93-600, Baxter Healthcare Corporation, Irvine, CA, USA) bestimmt. Dabei wurden die Messungen zu unterschiedlichen Zeiten des Respirationszyklus durchgeführt.

Zur Bestimmung des pH-Wertes, der Sauerstoff- und Kohlendioxidpartialdrücke im arteriellen und gemischtvenösen Blut (PaO2, PaCO2 bzw. PvO2, PvCO2) dienten Standardblutgaselektroden (ABL 505, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark). Der Gesamthämoglobingehalt (Hb), die Sauerstoffsättigung, der Methämoglobinspiegel und der Carboxyhämoglobinspiegel wurden mit einem Tierspektrometer (OSM3 Hemoximeter, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) bestimmt. Die Proben wurden anaerob gewonnen und bis zur Bestimmung innerhalb von 5 Minuten auf Eis gelagert.

Die Werte der Blutgasanalysen dienten zur Berechnung von arteriellem (CaO2), gemischt-venösem (CvO2) und kapillärem (CcO2) Sauerstoffgehalt.

Für den Sauerstoffgehalt im arteriellen Blut gilt:

Für den Sauerstoffgehalt im gemischt-venösen Blut gilt die Formel:

Die arteriovenöse Sauerstoffdifferenz errechnet sich aus:

Der intrapulmonale Rechts-Links-Shunt wurde nach folgender Formel berechnet:

Hierbei ist CcO2 der Sauerstoffgehalt im endkapillären Blut einer idealen Alveole, welche mit 100% Sauerstoff ventiliert wird. Es gilt:

Für den alveolären PO2 gilt:

Hierbei ist der inspiratorische PO2 bei einer FiO2 von 1,0 anhand der folgenden Formel 713 mmHg:


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Der arterielle Sauerstofftransport (DO2) in ml/min ist:


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2.5 Histologische Untersuchung

Zur Gewinnung von Gewebeproben wurden alle Tiere seziert und makroskopisch untersucht. Von jedem Lungenlappen (linke Seite: cranialer, caudaler, mittlerer und akzessorischer; rechte Seite: cranialer und caudaler) wurden Gewebeproben von ca. 2 cm mal 5 cm mal 1 cm entnommen und in gepuffertem Formalin über 24 Stunden gelagert, um sie später in Paraffin zu betten. Danach wurden die Schnitte mit Hematoxylin-Eosin (HE), Elastica-van Gieson (EvG) und Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS) gefärbt. Das histologische Muster wurde semiquantitativ in ein 4-Variablen-System eingeteilt.

Die Variablen basieren auf histologischen Veränderungen und beinhalten:

Atelektasen (Kollaps der Alveolen)

ausgetretene Zelltrümmer in den Atemwegen

Anwesenheit von Entzündungszellen (hauptsächlich neutrophile Granulozyten)

Ödem

Für jede dieser Variablen wurde eine Skalierung von 0 bis 4 festgelegt, wobei 0 = keine, 1 = minimale, 2 = leichte, 3 = moderate und 4 = schwere Veränderungen bedeutet. Die Summe aller Variablen für die 5 Lungenproben wird als totale Lungenschädigung (total injury score, TIS) für jedes Tier berechnet. Zusätzlich wurde die Dicke der Alveolarwände bestimmt. Die Bilder der histologischen Schnitte wurden mittels digitaler Kamera (WV-CD 130L, Panasonic, Osaka, Japan) auf einem Leitz Aristoplan Mikroskop (Leitz, Bensheim, Deutschland) bei 250-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Fotos wurden anschließend auf einem PC (Quadra 660 AV, Apple-Macintosh, Cupertino, CA, USA) mit der öffentlichen Bildbearbeitungssoftware NIH (erhältlich unter: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) analysiert.

2.6 Statistik

Die Ergebnisse werden als arithmetisches Mittel mit Standardabweichung wiedergegeben. Behandlungseffekte mit Perfluorocarbon vor, während und nach der Lavage, bzw. den korrespondierenden Zeitpunkten in der Behandlungsgruppe, werden als Mittelwerte dargestellt. Die gruppenübergreifende statistische Analyse wurde mit Hilfe des non-parametrischen U-Tests nach Mann-Whitney durchgeführt; das Überleben wurde mit dem Log-Rank-Test und den Kaplan-Meier-Überlebenskurven analysiert. Zum Vergleich innerhalb einer Gruppe wurde das Zwei-Wege-ANOVA-Model von Friedman mit den Werten nach Lavage als Referenz herangezogen. Alle Signifikanztests sind zweiseitig und Wahrscheinlichkeiten von p < 0.05 oder weniger werden als signifikant bezeichnet.


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02.06.2005