Kojetinsky, Corina: Untersuchungen zur Nachstarprävention in vitro mittels des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV

33

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Zellkultur von Linsenepithel-und Hornhautendothelzellen

Wir erhielten bovine Bulbi des Schlachthofes Kasel-Golzig spätestens fünf Stunden nach Schlachtung der Tiere. Zunächst wurden sie unter fließendem Wasser abgespült und grob peribulbäre Anhangsgebilde entfernt. Anschließend erfolgte die Dekontamination der Bulbi durch Einlegen in PVD-Jodlösung für fünf Minuten, danach die Titration des Jods mittels Gabe der Bulbi in PBS-Natriumthiosulfat-Pufferlösung und zuletzt Spülung in PBS-Pufferlösung - wieder jeweils für fünf Minuten.

3.1.1 Gewinnung von Hornhautendothelzellen

Zunächst wurde mit dem Skalpell perilimbal die Sklera durchtrennt. Die so gewonnene Korneoskleralscheibe konnte dann vorsichtig in PBS-Pufferlösung gelegt werden. Ebenso wurden ca. zwölf Hornhautscheiben präpariert, die, da dieser Vorgang einige Zeit in Anspruch nahm, zwischenzeitlich in PBS-Pufferlösung auf Eis gesammelt wurden. Es konnte dann die Hornhaut, mit dem Endothel nach oben liegend, in eine Petrischale gelegt und die Endothelzellen mit einem Hockeymesser unter vorsichtigem Druck abradiert werden. Aufgrund eines besseren Proliferationsverhaltens wurden Zellen der zentralen Kornea bevorzugt. Auch konnte so eine Mischkultur mit anderen Zellen leichter vermieden werden. Die so gewonnenen Zellen wurden in 2 ml PBS-Pufferlösung gesammelt. Dann erfolgte die Zugabe einer Trypsin/EDTA-Lösung in einer Konzentration von 1 % für maximal sieben Minuten zur vollständigen Vereinzelung der Zellen. Nach Zugabe einer zehnfachen Menge Medium + 10 % Fetales Kälberserum (FCS) wurde diese Zell-Lösung für zehn Minuten bei 1.000 U/min und 15 °C zentrifugiert. Nach Verwerfung des Überstandes konnte das Pellet in 2 ml Kulturmedium + 10 % FCS resuspendiert und zu gleichen Teilen auf die sechs Wells der 6-Well-Kulturschale (Falcon, Becton & Dickinson Comp., New Jersey, U.S.A.) gegeben werden. Pro Well gab man 2 ml Medium zu. Unter dem Lichtmikroskop waren dann die noch schwimmenden Endothelzellen erkennbar.

3.1.2 Gewinnung von Linsenepithelzellen

Die Bulbi, die, nun ohne Korneoskleralscheibe, in PBS-Pufferlösung bis maximal 24


34

Stunden nach Präparationsbeginn noch im Kühlschrank aufbewahrt werden konnten, wurden innerhalb dieses Zeitraumes außerdem zur Gewinnung von Linsen verwendet. Dazu wurde der Bulbus zunächst in eine sterile Petrischale gelegt. Mit einer Pinzette konnte nun vorsichtig die Iris von der Linsenvorderfläche abgezogen werden. Die Linse ließ sich dann leicht zwischen den Branchen einer anatomischen Pinzette aus dem Bulbus herausdrücken. Pro Präparationssitzung konnten so wiederum ca. zwölf Linsen gewonnen werden, die dann in einer Petrischale noch sorgfältig von eventuell an der Linsenkapsel haftendem Irisgewebe gereinigt werden mußten. Die Linsenkapsel wurde mit Pinzetten von der Linsenrinde abgezogen und mit einer chirurgischen Pinzette in kleine Exzidate von ca. 3-4 mm Durchmesser geschnitten. Bevorzugt war hier die Übergangsregion zwischen Vorder- und Hinterkapsel mit den stoffwechselaktivsten und am stärksten proliferierenden Epithelzellen [1]. Diese Kapselexzidate wurden nun gleichmäßig auf die zwölf Wells einer 12-Well-Kulturschale verteilt und pro Well 2 ml DMEM + 10 % FCS zugegeben. Lichtmikroskopisch konnten einige Zellen auf den Kapselstücken gesehen werden.

3.1.3 Zellkultur

Das für die Versorgung der Zellen verwendete komplette Kulturmedium setzte sich wie folgt zusammen:

Der Medienwechsel erfolgte nach jeweils drei Tagen. Die Linsenkapselexzidate wurden durch besonders sorgfältiges Pipettieren beim Medienwechsel in der ersten Woche in der Kulturschale belassen. War dann lichtmikroskopisch ein Herunterwachsen der Zellen von den Kapselstückchen auf den Boden der Kulturschale sichtbar, konnten diese entfernt werden. Die Konzentration des Serums im Kulturmedium wurde bei gutem Wachstum sowohl der Epithel- als auch der Endothelzellen von anfänglich 10 % auf


35

5 % reduziert. Die Zellen wuchsen bei einer Temperatur von 37,0 °C sowie bei 95 % O2 und 5 % CO2 -Gehalt der Luft im Brutschrank.

Hatten die Zellen Konfluenz (geschlossener Zellrasen am Boden der Kulturschale) erreicht, erfolgte die erste Passagierung. Dies war sowohl bei bovinen Hornhautendothelzellen als auch bei bovinen Linsenepithelzellen nach zehn bis zwölf Tagen möglich.

Zur Passagierung der Zellen wurde jedes Well der Kulturschale mit 1 ml PBS und danach mit 1 ml PBS-EDTA (zur Lösung der Interzellularverbindungen) gespült. Anschließend erfolgte die Trypsinisierung (Ablösung der Zellen vom Boden der Kulturschale) mit 1 %iger Trypsin/EDTA-Lösung für maximal sieben Minuten. Wie auch bei der Gewinnung der Hornhautendothelzellen wurde das Trypsin wiederum mit der zehnfachen Menge DMEM + 10 % FCS neutralisiert und diese Zell-Lösung für zehn Minuten bei 1.000 U/min und 15 °C zentrifugiert.

Nach Verwerfen des Überstandes resuspendierte man das Zellkonzentrat in 1,0 ml DMEM + 10 % FCS. Linsenepithelzellen, die im oben beschriebenen Zeitraum ein sehr ausgeprägtes Wachstumsverhalten zeigten, wurden in 2,0 bzw. 3,0 ml DMEM + 10 % FCS resuspendiert (je nach mikroskopischem Eindruck von der ungefähren Menge der Zellen vor der ersten Passage).

Man ermittelte dann die vorhandene Zellzahl durch Auszählen in der Neubauer Zählkammer (Tiefe: 0,100 mm) (Gesellschaft für Laborbedarf mbH, Würzburg). Die so gewonnene erste Passage der Zellen konnte dann weiter für die Untersuchungen zur Adhäsionsinhibition bzw. der Ablösung von Zellen verwendet werden.

3.2 Gewinnung humaner Linsenepithelzellen und humaner intakter Hornhäute

Für die Untersuchungen an humanen Linsenepithelzellkulturen und humanen exzidierten Hornhäuten wurden Bulbi von Hornhautspendern verwendet. Es handelte sich dabei um Bulbi, die bei einer erst nach der Bulbusentnahme bekannt gewordenen systemischen Infektionskrankheit des Spenders nicht mehr für eine Gewebegewinnung zur späteren Transplantation in Frage kamen. Weitere Gründe für die Nicht-Eignung zur Transplantation bestanden in einer zu niedrigen Endothelzellzahl (weniger als 2.000/mm2), in zentralen Hornhautnarben, die das funktionelle Ergebnis in Frage stellen, und in früheren intraokularen Eingriffen an diesen Augen. Diesbezügliche Informationen konnten in diesen Fällen erst nach Enukleation bzw. durch die Präparation der


36

Augen gewonnen werden.

Das Präparationsverfahren humaner Bulbi entsprach dem der bovinen Bulbi, die verwendeten Substanzen zur Herstellung des kompletten Kulturmediums sind die oben aufgeführten (s. 3.1.3.).

Auf die unter 3.1.2. beschriebene Weise wurden humane Linsenepithelzellen gewonnen. Allerdings erfolgte hier die Zugabe von 1 ml DMEM + initial 20 % FCS, das dann im weiteren Verlauf auf 10 % FCS reduziert werden konnte. Die humanen Linsenepithelzellen zeigten ein insgesamt langsameres Wachstumsverhalten bis zum Erreichen der Konfluenz (ca. vier bis sechs Wochen), weshalb die bei der Präparation gewonnenen Kapselexzidate in die Wells einer 24-Well-Kulturschale gegeben wurden. So erhielt man eine insgesamt größere Anzahl Zellen. Außerdem standen pro Präparationssitzung maximal zwei bis vier Bulbi zur Verfügung. Der Wechsel des Kulturmediums war nur zweimal wöchentlich erforderlich.

Humane Hornhäute wurden nach der unter 3.1.1. (das Endothel beließ man intakt) vorgestellten Methode gewonnen. Zwei Cornae standen zur Verfügung. Eine Hornhaut wurde direkt nach der Präparation mit cRGDDFV inkubiert, da die Spender-Serologie folgende Werte aufwies: HbsAg positiv, CMV positiv und TPHA reaktiv. Die andere Hornhaut war zunächst zur Transplantation vorgesehen und deshalb für fünf Wochen und zwei Tage im Brutschrank bei 37 °C und 95 % O2 und 5 % CO2 in Kulturmedium I aufbewahrt worden. Nach Ablauf der maximalen Lagerungsdauer (vier Wochen) wurde sie dann zur experimentellen Verwendung freigegeben und daraufhin in Kulturmedium II für 48 Stunden entquollen und, wie unter Kapitel 3.4.6. beschrieben, weiter verwendet.

Die Kulturmedien I und II enthalten auf 1.000 ml Medium:

In Kulturmedium II ist außerdem Dextran T 500 50,0 g enthalten.


37

Beide Medien sind steril gefiltert und auf einen pH-Wert von 7,45-7,55 gepuffert. Sie werden von der Apotheke der Charité Berlin, Campus Virchow-Klinikum, hergestellt.

3.3 Untersuchungen zur Adhäsionsinhibition

3.3.1 Untersuchung der Adhäsionsinhibition auf dem Boden der Kulturschale

Für die Untersuchungen zur Adhäsionsinhibition bzw. Lösung adhärenter Linsenepi-thel- bzw. Hornhautendothelzellen wurde das zyklische RGD-Peptid [Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)] cRGDDFV mit einem Molekulargewicht von 574,6 g/mol (Fa. BACHEM Biochemica GmbH, Heidelberg; Deutschland; Produktnummer des Kataloges von 1998 und 1999: H-2574) verwendet. Dieses entspricht dem von Gurrath [72] und Noiri [81] untersuchten RGD-Peptid (s. 1.6.1.). Um auszuschließen, daß Unterschiede gegenüber der nicht mit cRGDDFV behandelten Gruppe nicht von der funktionellen Aminosäurengruppe (Arg-Gly-Asp), sondern der Trägersubstanz des Peptids hervorgerufen wird, benutzten wir außerdem ein Kontrollpeptid gleichen Aufbaus und Molekulargewichtes, das keine Arg-Gly-Asp-Gruppe aufwies (Fa. Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland).

Das Adhäsionsverhalten boviner und humaner LEC wurde sowohl bei verschiedenen Konzentrationen von cRGDDFV als auch bei verschiedenen Inkubationszeiten desselben untersucht (s. Abb. 3.1.).

In jedem dieser Versuchsansätze wurden die Zellen der ersten Passage verwendet. 20.000 bovine LEC pro Well einer 12-Well-Kulturschale (ca. 5.263 Zellen/cm2) bzw. 9.500 humane LEC pro Well einer 24-Well-Kulturschale (ca. 5.278 Zellen/cm2) wurden in neun Wells pro auszuzählendem Zeitpunkt gegeben. In je drei Wells erfolgte die Zugabe von je 1,0 ml (für bovine LEC) bzw. 475 µl (für humane LEC) DMEM + 10 % FCS, in DMEM + 10 % FCS gelöstem Kontrollpeptid bzw. von in DMEM + 10 % FCS gelöstem cRGDDFV. cRGDDFV und Kontrollpeptid wurden im gleichen Versuch jeweils in der gleichen Konzentration verwendet.


38

Abb. 3.1.: Durchgeführte Versuche zur Adhäsionsinhibition boviner und humaner LEC auf Kulturschalen mittels cRGDDFV unterschiedlicher Konzentration und bei unterschiedlichen Inkubationszeiten.

Sollte nun die Wirkung einer permanenten Inkubation der LEC mit cRGDDFV auf deren Adhäsion untersucht werden, erfolgte die Auszählung der Zellen zu den in Abb. 3.1. genannten Zeitpunkten. Dazu wurde zunächst das Kulturmedium bzw. das in diesem gelöste Kontrollpeptid bzw. cRGDDFV komplett wieder entfernt. Die Wells der Kulturschale wurden mit 1 ml PBS-Pufferlösung und danach mit 1 ml PBS-EDTA-Pufferlösung gespült. Dadurch sollten alle nicht-adhärenten Zellen entfernt werden. Die nun noch am Boden der Kulturschale adhärenten Zellen wurden für maximal sieben Minuten mit 300 µl 1 % Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert, die dann mit der zehnfachen Menge DMEM + 10 % FCS neutralisiert wurde. Mit dieser Lösung konnte der Boden der Wells noch einmal unter dem Strahl der Pipette gründlich gespült werden. Die so gewonnen Zellsuspensionen wurden in Zentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Well) gegeben und zum Zentrifugieren mit 3 ml DMEM auf ca. 6 ml aufgefüllt. Nach der Zentrifugation für zehn Minuten bei 1.000 U/min und 15 °C verwarf man den Überstand. Die zur Resuspension des Zellpellets nötige Menge an DMEM +10 % FCS variierte je nach Art des Experimentes, Zeitpunkt innerhalb des Versuches und Gruppe.

Die Auszählung der zum gegebenen Zeitpunkt adhärenten Zellen erfolgte wiederum in der Neubauer Zählkammer. Dabei wurde die Zellzahl pro Well und Auswertungszeitpunkt durch Bildung des Mittelwertes der vier ausgezählten Kammern bestimmt. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt. Anschließend konnte der Median einer Gruppe aus den Mittelwerten aller ermittelten Zellzahlen der verschiedenen Zeitpunkte aus


39

den zwei gleichartigen Experimenten gebildet werden.

Die optimalen Zeitpunkte zum Auszählen der LEC waren in Vorversuchen gefunden worden. Dabei hatte man 20.000 bovine Zellen pro Well in 12-Well-Kulturschalen gegeben - unter Anwesenheit von 1,0 ml DMEM + 10 % FCS. Es wurde sowohl der Verlauf am ersten Tag als auch die Zahl adhärenter Zellen an jedem der folgenden sechs Tage bestimmt. Dabei zeigte sich, daß die Zellen ohne einen Medienwechsel nur für fünf Tage vital gehalten werden können. Deshalb wurde das Adhäsionsverhalten bei permanenter Inkubation mit cRGDDFV lediglich über einen Zeitraum von fünf Tagen untersucht. Da bei der nur einstündigen Inkubation mit cRGDDFV dieses nach der ersten Stunde bereits wieder entfernt wird, ist ein Medienwechsel in diesem Versuchsansatz möglich, die Versuchsdauer betrug in diesem Fall daher sieben Tage. Der Medienwechsel erfolgte am dritten Tag des Experimentes.

War geplant, die Zellen lediglich für eine Stunde mit cRGDDFV (resp. Kontrollpeptid bzw. Kontrollmedium) zu inkubieren, wurden die Lösungen nach dieser Zeit abpipettiert und die Wells anschließend mit 1 ml PBS-Pufferlösung gespült. Sowohl die abgenommene Lösung als auch die PBS-Spüllösung wurden in Zentrifugenröhrchen (wieder ein Röhrchen je Well) gegeben, mit 4 ml DMEM aufgefüllt und bei 1.000 U/min und 15 °C für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde sodann wieder verworfen und das Pellet in 100 µl DMEM + 10 % FCS resuspendiert und wieder dem entsprechenden Well zugegeben. Auf diese Weise sollte verhindert werden, daß zu diesem Zeitpunkt noch nicht adhärente Zellen durch das Entfernen der Medien verloren gehen. Sofort nach Entnahme der Medien waren jedem Well 900 µl DMEM + 10 % FCS zugefügt worden; die Kulturschalen wurden für die Zeit der Zentrifugation erneut in den Brutschrank gestellt.

3.3.2 Untersuchung der Adhäsionsinhibition auf exzidierten bovinen Vorderkapseln

Die, wie unter 3.1.2., 3.1.3. und 3.2. beschrieben, gewonnene erste Passage humaner und boviner LEC wurde auf bovine Vorderkapselexzidate gesät.

Diese Vorderkapselexzidate konnten folgendermaßen hergestellt werden: Bovine Linsenkapseln wurden mit einer chirurgischen Pinzette in der Mitte der Hinterkapsel beginnend bis zum Äquator aufgerissen. So ließ sich die noch intakte Vorderkapsel sehr gut auf dem Boden einer Petrischale ausbreiten. Mit einem Trepan eines Durchmessers von 5,0 mm konnten nun drei bis vier kreisrunde Exzidate pro Kapsel ausgestanzt


40

werden. Diese wurden dann zur Ablösung noch adhärenter Zellen für zehn Minuten in 10%ige Trypsin/EDTA-Lösung gelegt. Danach erfolgte noch eine möglichst schonende Politur beider Kapselseiten mit einem Hockeymesser. Je ein Exzidat wurde in je einem Well einer 24-Well-Kulturschale ausgebreitet und runde Mikroskopier-Deckgläschen mit einem Durchmesser von 12 mm darübergelegt. Um eine möglichst gute flächige Adhäsion der Vorderkapseln zu erreichen, erfolgte noch ein Beschweren mittels eines sterilisierten handelsüblichen Fitschen-Ringes (Versuchsaufbau s. Abb. 3.2.). Erst dann gab man 1 ml DMEM + 1 % FCS pro Well zu. Nach etwa zehn Tagen konnten sowohl die beschwerenden Metall-Ringe als auch die Deckgläschen entfernt werden. Ein vorsichtiger Medienwechsel wurde vorgenommen. Es war dann ein Großteil der Vorderkapselscheiben adhärent und konnte nun für weitere Untersuchungen gebraucht werden.

In je drei Wells mit Kapsel wurden je 475 µl DMEM + 10 % FCS bzw. darin gelöstes cRGDDFV bzw. Kontrollpeptid der Konzentration 10-3 M und 9.500 humane LEC gegeben. Die Inkubationszeit betrug fünf Tage. Lichtmikroskopisch (Phasenkontrastmikroskop Leica, DM IRB) wurde nun nach einer Stunde und nach drei, vier, fünf und sieben Tagen das Adhäsionsverhalten auf Kapseln in den verschiedenen Gruppen beobachtet und fotodokumentiert. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt. Es erfolgte keine Auszählung der auf den Kapseln adhärenten Zellen, da sich zeigte, daß alle eingegebenen Zellen in der cRGDDFV-Gruppe ausschließlich auf der Kapsel hafteten, während sich in der Kontrollpeptid- und der Kontroll-Gruppe die Zellen gleichmäßig auf Kapsel und Boden des Wells verteilten. Somit erschien ein Vergleich des Adhäsionsverhaltens zwischen der cRGDDFV-Gruppe und der Kontrollpeptid-Gruppe anhand der Anzahl der auf der Kapsel adhärenten Zellen nicht sinnvoll.


41

Abb. 3.2.: Versuchsaufbau zur Erlangung von Adhärenz exzidierter boviner Linsen-Vorderkapseln am Boden der Kulturschale

3.4 Untersuchung zur Lösung adhärenter Linsenepithelzellen und Hornhautendothelzellen

3.4.1 Lösung adhärenter boviner LEC vom Boden der Kulturschale

Die erste Passage boviner bzw. humaner LEC war, wie unter 3.1., 3.1.2. und 3.2. beschrieben, gewonnen worden. 20.000 Zellen/Well einer 12-Well-Kulturschale (bovine LEC) bzw. 9.500 Zellen/Well einer 24-Well-Kulturschale (humane LEC) wurden in die Kulturschalen gegeben - je neun Wells boviner bzw. humaner LEC. Hatten die Zellen nach einigen Tagen bzw. Wochen Konfluenz erreicht, erfolgte die Zugabe von je 1,0 ml Kulturmedium + 10 % FCS (für die Kontrollgruppe), Kontrollpeptid 10-4 M in Kulturmedium + 10 % FCS (Kontrollpeptid-Gruppe) und cRGDDFV 10-4 M in Kulturmedium + 10 % FCS (cRGDDFV-Gruppe) - je Gruppe drei Wells. Das Verhalten der Zellrasen wurde lichtmikroskopisch im fünf- bis zehnminütigem Abstand beobachtet. In der Zwischenzeit stellte man die Kulturschalen wieder in den Brutschrank (37 °C, 95 % O2 und 5 % CO2).

Parallel dazu wurden je neun (drei mal drei) Wells untersucht, in die nach Erreichen der Konfluenz eine zentrale Wunde gesetzt worden war. Hierzu war zuvor mittels eines zur Hornhauttransplantation verwendeten sterilen Trepans mit dem Durchmesser 5,0 mm ein ca. 1,5 cm langes Stück eines handelsüblichen elastischen Radiergummis ausgestanzt worden. Dieses Stück legte man für einige Stunden in 70%igen Alkohol ein. Etwa 15 Minuten vor dem Setzen der Wundläsion wurde der Radiergummi dann unter der


42

sterilen Arbeitsbank luftgetrocknet und anschließend in den Trepan eingeführt. Dabei sollte etwa 1 mm des Radiergummis über den Trepanationsrand des Trepans hinausreichen (s. Abb. 3.3.).

Abb. 3.3.: Modifizierter Trepan zum Setzen einer definierten Läsion in den Zellrasen (Photographie mit Erlaubnis übernommen aus: Ryseck,I. Dissertationsskript Berlin 2000)

Der so modifizierte Trepan wurde dann gerade und unter möglichst gleichmäßiger Belastung auf den (noch mit DMEM + 10 % FCS bedeckten) Zellrasen gesetzt. Dies geschah so kräftig, daß eine Gravur der Trepanränder im Boden der Kulturschale entstand. Durch das Radiergummi im Inneren des Trepans sollten die Zellen, die sich innerhalb der Läsion befanden, abradiert werden. Nach vorsichtigem Herausnehmen des Trepans spülte man einmal sehr behutsam über den Zellrasen mit der Läsion. Dazu wurde zunächst das Kulturmedium abpipettiert und dann mit PBS-Pufferlösung gespült. So sollte noch in der Läsion verbliebener Zelldebris entfernt werden. Im Anschluß daran erfolgte, wie oben beschrieben, die Zugabe von 1,0 ml reinem Medium, in Medium gelöstem Kontrollpeptid bzw. cRGDDFV in je drei Wells. Auch hier wurde das weitere Verhalten der konfluenten Zell-Layer mit Läsion, wie eingangs aufgeführt, lichtmikroskopisch (Lichtmikroskop Sedival, Fa. Carl Zeiss Jena) beobachtet.

Das Experiment wurde (mit und ohne Wunde) zweimal durchgeführt.

3.4.2 Lösung adhärenter LEC von exzidierten bovinen Vorderkapseln

Zunächst wurden bovine Linsen-Vorderkapseln, wie unter 3.3.2. geschildert, präpariert.

Zur Untersuchung der Lösung adhärenter LEC von exzidierten bovinen Vorderkapseln gab man zunächst je 10.000 humane LEC der ersten Passage auf die Kapseln. Waren die Zellen auf der Kapsel konfluent, erfolgte die Zugabe von je 1,0 ml DMEM + 10 % FCS bzw. darin gelöstem cRGDDFV bzw. Kontrollpeptid der Konzentration 10-4 M und


43

10-3 M (je Gruppe drei Kapseln). Man beobachtete dann in der ersten Stunde in zehn- bis fünfzehnminütigen Abständen und später im Stundenabstand lichtmikroskopisch (Phasenkontrastmikroskop Leica, DM IRB) das Verhalten der konfluenten Zell-Layer, sowohl auf der Kapsel als auch am umgebenden Boden der Kulturschale. Dieses Experiment wurde einmal wiederholt.

3.4.3 Lösung adhärenter humaner LEC von humanen Vorderkapseln

Intraoperativ, während der Kataraktoperation, wurde durch den Operateur eine vordere Kapsulorrhexis durchgeführt. Die so erhaltenen etwa kreisrunden Vorderkapselexzidate gab man sogleich in bereits vorbereitete Eppendorfgefäße (1,0 ml). Diese enthielten je 1,0 ml DMEM + 10 % FCS bzw. darin gelöstes cRGDDFV bzw. Kontrollpeptid in den Konzentrationen von 10-4 M (zwölf Präparate der cRGDDFV-Gruppe und 17 Präparate der Kontrollgruppe) und 2,5x10-3 M (je acht Präparate der cRGDDFV-Gruppe und der Kontrollgruppe). Als „Kontrollgruppe“ werden sowohl in Kontrollmedium (Kulturmedium mit 10 % FCS) als auch in Kontrollpeptid inkubierte Vorderkapseln bezeichnet. Die Eppendorfgefäße wurden wieder verschlossen und im Brutschrank bei 37 °C und 95 % O2 und 5 % CO2 für 24 (10-4 M) bzw. 48 Stunden (2,5x10-3 M) inkubiert. Sodann entnahm man die Kapseln vorsichtig und breitete sie auf je einem Objektträger aus, trocknete sie an der Luft, und anschließend wurden sie zur Hitzefixation kurz durch die Flamme des Bunsenbrenners gezogen. Zum Schluß erfolgte die Färbung der Kerne und des Protoplasmas der so gewonnenen Präparate mit Giemsa-Farblösung (Dr. K. Hollborn & Söhne, Leipzig): Ein Tropfen Giemsa wurde für ca. 30 Sekunden auf die Kapsel auf dem Objektträger gegeben, dann kurz mit Leitungswasser abgespült und wiederum an der Luft getrocknet.

Die Präparate wurden ohne Kenntnis der drei Untersucher darüber, ob es sich um die Kontrollgruppe, die Kontrollpeptid-Gruppe oder die cRGDDFV-Gruppe handelte, unter dem Lichtmikroskop (Olympus BH-2) bei hundertfacher Vergrößerung untersucht. Die Zuordnungen der Präparate zu einer der zwei Gruppen (cRGDDFV- bzw. Kontroll-Gruppe) durch die drei Untersucher wurde in 2x2-Felder-Tafeln festgehalten. Es sollte geprüft werden, ob die Erwartungen der Untersucher an die jeweilige Gruppe (cRGDDFV-Gruppe: wenige, avitale Zellen auf der Kapsel; Kontroll- und Kontrollpeptid-Gruppe: viele, vitale Zellen auf der Kapsel) erfüllt wurden. Die Photodokumentation erfolgte mittels des Durchlichtmikroskops Axiophot (Fa. Carl Zeiss Jena) bei fünfzig- und


44

hundertfacher Vergrößerung.

3.4.4 Spender-Intraokularlinse im Kapselsack

Von einem Hornhautspender konnten die im Kapselsack befindlichen Intraokularlinsen (IOL) beider Augen gewonnen werden (Präparation des Bulbus wie unter 3.1. beschrieben). Wie lang die Kataraktoperationen der beiden Augen zurücklagen, war nicht bekannt. Es zeigte sich beidseits eine deutlich ausgeprägte Soemmerring-Ringkatarakt und Kapselfibrose.

Der Kapselsack des rechten Auges wurde in mit 1,0 ml 10 %igem Medium gelöstem Kontrollpeptid (10-4 M), die des linken Auges mit 1,0 ml in Medium gelöstem cRGDDFV (10-4 M) inkubiert, jeweils in einem Well einer 12-Well-Kulturschale. Die Einwirkzeit betrug 96 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C und unter 95 % O2 und 5 % CO2.

Am vierten Tag wurden die Kapseln unter dem Operationsmikroskop für zehn Minuten mit der jeweiligen Inkubationslösung unter dem Druck der Spritze mit Hilfe einer kleinen Kanüle gespült und der noch vorhandene Nachstar im Vergleich zum Zeitpunkt des Beginns des Experimentes lichtmikroskopisch (Phasenkontrastmikroskop Leica, DM IRB) bei fünfzig- und hundertfacher Vergrößerung beurteilt.

3.4.5 Einfluß von cRGDDFV auf konfluente Hornhautendothelzell-Layer

Die erste Passage boviner Hornhautendothelzellen wurde in Wells einer 12-Well-Kulturschale (20.000 Zellen/Well) unter Anwesenheit von je 1,0 ml DMEM + 10 % FCS/Well ausgesät. Waren diese nach einigen Tagen konfluent, wurden die Medien entnommen und in je drei Wells 1,0 ml DMEM + 10 % FCS/Well bzw. darin gelöstes cRGDDFV bzw. Kontrollpeptid (jeweils 10-4 M) zugegeben. In zehnminütigen Abständen erfolgte die lichtmikroskopische Untersuchung über einen Gesamtzeitraum von 4,75 Stunden. Zwischen den Beobachtungszeitpunkten wurde die Kulturschale wieder in den Brutschrank gestellt (37,0 °C, 5% CO2, 95 % O2). Nach Ablauf der Untersuchung konnten die Zellen fixiert und gefärbt werden: Zunächst entfernte man die Medien aller Wells und spülte die Wells mit 1 ml PBS-Pufferlösung möglichst schonend. Danach gab man soviel Methanol in jedes Well, daß der Boden gerade bedeckt war. Nach zehnminütiger Einwirkung wurde das Methanol wieder entfernt und mittels PBS gespült und nun für weitere zehn Minuten ein Tropfen Giemsa auf den Boden der Kulturschale gegeben. Nach anschließender Spülung mit Aqua dest. konnten die Wells über einem Papierhandtuch trocken geklopft werden, so daß eine längere Aufbewahrung ermöglicht wurde. Die Endothelzellen waren nun unter dem Lichtmikroskop (Sedival, Carl Zeiss Jena) bei hundertfacher Vergrößerung zu beurteilen.


45

3.4.6 Einfluß von cRGDDFV auf humane Hornhäute in vitro

Zwei humane Spenderhornhäute konnten gewonnen werden (s. 3.2.). Beide Hornhäute wurden nach Entnahme aus oben genannten Aufbewahrungsmedien zunächst in Petrischalen gelegt und für eine Minute in steriler physiologischer Kochsalzlösung gespült. Danach erfolgte in einer trockenen Petrischale, in der die Hornhäute mit der Endothelseite nach oben lagen, die Gabe eines Tropfens 5 %iger Trypan-Blau-Farbsubstratlösung (Sigma, St.Louis, U.S.A) auf das Endothel für maximal 60 Sekunden. Erneut wurde dann die Hornhaut in physiologischer Kochsalzlösung geschwenkt, um nicht gebundene Farbreste zu entfernen. Es resultierte die Anfärbung von avitalen Endothelzellen. Auch sammelte sich die Farbe in Falten der Hornhaut. In einer ebenso mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllten Petrischale konnten nun die Hornhäute, sowohl endothelseitig als auch epithelseitig, unter dem Phasenkontrastmikroskop (Leica, DM IRB) bei fünfzig- bzw. hundertfacher Vergrößerung beurteilt werden. Hierbei wurde besonderes Augenmerk auf mit Trypan-Blau gefärbte Bezirke des Endothels und die Zellmorphologie des Endo- und Epithels gerichtet. Dieser Status vor der Inkubation mit cRGDDFV wurde fotodokumentiert, in den oben genannten Vergrößerungen.

Nun wurden die zwei Hornhäute in je ein Well einer 12-Well-Kulturschale, gefüllt mit 1,5 ml cRGDDFV 2 x 10-3 M, eingelegt, wiederum die Endothelseite der Hornhäute nach oben gerichtet. Nach 24 und 48 Stunden entnahm man die Hornhäute, nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden sie gespült. Nach Anfärbung mit Trypan-Blau erfolgte wiederum die Beurteilung und Fotodokumentation von Epithel und Endothel unter Verwendung obiger Vergrößerungen. Nach 48 Stunden wurde die Untersuchung beendet.

Ein Vergleich zwischen dem jeweiligen Anfangsstatus und dem Zustand nach 24 bzw. 48 Stunden konnte anhand der Fotodokumentation deskriptiv vorgenommen werden.

3.5 Statistische Auswertung

3.5.1 Untersuchungen der Adhäsionsinhibition boviner und humaner LEC auf dem Boden der Kulturschale

Es wurden zunächst für alle Untersuchungszeitpunkte zweier gleichartiger (in Bezug auf Konzentration und Inkubationszeit von cRGDDFV und Kontrollpeptid) Experimente die Mediane der Anzahl adhärenter Zellen ermittelt. Alle drei Gruppen (cRGDDFV-, Kontrollpeptid- und Kontroll-Gruppe) wurden sodann mittels des ANOVA Rangsummen-


46

Testes nach Friedman verglichen. Als statistisch signifikant wertete man p-Werte <0,001. Zum paarweise multiplen Vergleich der Gruppen wurde die Korrektur nach Dunn verwendet, statistisch signifikant waren p-Werte <0,05.

Als Maß für die Streuung wurden die oberen und unteren Quartile der Mediane der jeweiligen Untersuchungszeitpunkte (s. Abbildungen des Kapitels 4) benannt.

3.5.2 Lösung adhärenter humaner LEC von humanen Vorderkapseln

Zur Auswertung der 2x2-Felder-Tafeln (falsch positive, falsch negative und richtige Zuordnungen der Untersucher zu den beiden Gruppen) wurde Fischers Exakter Test angewendet. P-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Oct 1 12:29:56 2002