Kojetinsky, Corina: Untersuchungen zur Nachstarprävention in vitro mittels des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV

47

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Untersuchungen zum Adhäsionsverhalten boviner Linsenepithelzellen unter cRGDDFV auf dem Boden der Kulturschale

Das Adhäsionsverhalten boviner LEC wurde nach zwei verschiedenen Einwirkzeiten von cRGDDFV verglichen:

  1. unter permanenter Anwesenheit des cRGDDFV über einen Zeitraum von 5 Tagen und
  2. nach nur einstündiger cRGDDFV-Einwirkung.

Wurde das cRGDDFV in einer Konzentration von 10-4 M über 5 Tage auf den LEC belassen, so betrug die Adhäsionhemmung der ausgesäten Zellen nach 5 Tagen 100 % (keine adhärenten Zellen in der cRGDDFV-Gruppe gegenüber 162.500 adhärenten Zellen in der Kontrollpeptid-Gruppe) (s. Abb. 4.1. a) und b), Abb. 4.2. und Tab. 4.1.). Dabei berechnet sich die Adhäsionshemmung zu einem bestimmten Zeitpunkt wie folgt: Der Median der Anzahl adhärenter Zellen der Kontrollpeptid-Gruppe des ausgewählten Zeitpunktes wird 100 % gesetzt. Die im Vergleich dazu x % Adhäsion der cRGDDFV-Gruppe zum gleichen Zeitpunkt wird von 100 % abgezogen.

Die Unterschiede zwischen den Medianen der Anzahl adhärenter Zellen waren statistisch signifikant (p<0,0001). Im paarweise multiplen Vergleich mittels Dunns Methode lag ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Medianen der Anzahl adhärenter Zellen der Kontroll- und cRGDDFV-Gruppe bzw. der Kontrollpeptid- und cRGDDFV-Gruppe vor (p<0,05), nicht jedoch zwischen Kontroll- und Kontrollpeptid-Gruppe (p>0,05).

Tab. 4.1.: 5-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-4 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.

Zeit [h]

Kontrolle

Kontr.peptid

cRGDDFV 10-4 M

1

2375

2500

250

48

8500

6750

0

72

29000

30000

0

120

160000

162500

0

Abb. 4.1. a) und b): 5-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-4 M: a) Kontrollpeptid-Gruppe und b) cRGDDFV 48 Stunden nach Beginn des Experimentes. In Abb 4.1. b) sind ausschließlich runde, nicht-adhärente Zellen sichtbar. (jeweils hundertfache Vergrößerung)


48

Abb. 4.2.: 5-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-4 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen. Als Parameter für die Streuung der Werte werden die oberen und unteren Quartile der Mediane angezeigt. (Adhäsion auf dem Boden eines 12-Well-dish; n=6)


49

Wurden aber die bovinen LEC für nur eine Stunde mit dem zyklischen RGD-Peptid cRGDDFV in einer Konzentration von 10-4 M inkubiert, kam es im Verlauf einer Woche zu einem stetigen Abfall der Adhäsionshemmung (s. Tab. 4.2. a) und Abb. 4.4. a)): Nach 48 Stunden betrug diese noch 90,3 %, nach 7 Tagen nur noch 48,5 %. Trotz dieser immer noch recht hohen Adhäsionsinhibition waren die Zellen in der cRGDDFV-Gruppe bereits nach fünf Tagen konfluent.

Deshalb wurde untersucht, ob mit einer Peptidkonzentration von 10-3 M bei gleicher Einwirkzeit (1 Stunde) eine effektivere Hemmung der Adhäsion der LEC möglich sei. Wie aus Tab. 4.2 b) hervorgeht, nahm die Adhäsionshemmung darunter nicht zu (41,9 % am 7.Tag); auch hier waren die Zellen bereits konfluent (s. Abb. 4.3. a) und b) und Abb. 4.4. b)).

Ein mikroskopisch sichtbarer Unterschied zwischen Kontrollpeptid- und cRGDDFV-Gruppe lag am siebten Tag des Experimentes nicht vor.

Zwischen den Medianen der Anzahl adhärenter Zellen bestand ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,0001 bzw. p<0,0001 für cRGDDFV und Kontrollpeptid der Konzentration 10-4 M bzw. 10-3 M). Zwischen Kontrollgruppe und Kontrollpeptid-Gruppe lag bei einer Konzentration von 10-4 M kein statistisch signifikanter Unterschied vor (p>0,05), jedoch bei einer Konzentration von 10-3 M (p<0,05).

Tab. 4.2. a) und b): 7-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV a) 10-4 M und b) 10-3 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.


50

Abb. 4.3. a) und b): 7-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M: a) Kontrollpeptid-Gruppe und b) cRGDDFV 168 Stunden nach Beginn des Experimentes. Die Zell-Layer sind in beiden Gruppen konfluent, wobei in Abb. 4.3. a) noch kleine Zellzwischenräume zu sehen sind. (jeweils hundertfache Vergrößerung)

Abb. 4.4. a) und b): 7-Tages-Adhäsionsexperiment boviner LEC mit 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV a) 10-4 M und b) 10-3 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.
Als Parameter für die Streuung der Werte werden die oberen und unteren Quartile der Mediane angezeigt. (Adhäsion auf dem Boden eines 12-Well-dish; n=6)

Abb. 4.4. a)


51

Abb. 4.4. b)

4.2 Untersuchungen zum Adhäsionsverhalten humaner Linsenepithelzellen unter cRGDDFV auf dem Boden der Kulturschale

Ebenso wie unter 4.1. für die bovinen LEC beschrieben, untersuchte man unterschiedliche Inkubationszeiten (5 Tage bzw. 1 Stunde) mit cRGDDFV bzw. Kontrollpeptid.

Wurden humane LEC für 5 Tage mit cRGDDFV in einer Konzentration von 10-4 M inkubiert, so betrug die Adhäsionshemmung am Boden der Kulturschale am fünften Tag des Experimentes 68,8 %. Verglichen mit der Adhäsionshemmung, die unter gleichen Bedingungen bei bovinen LEC erreicht worden war, bedeutete dies eine um 31,2 % geringere adhäsionsinhibierende Wirkung von cRGDDFV bei humanen LEC. Eine Konfluenz der Zellrasen wurde in keiner der drei Gruppen bis zum fünften Tag erreicht (s. Tab. 4.3. und Abb. 4.5.). Zwischen den Medianen der Anzahl adhärenter Zellen bestand ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,0001). Im paarweise multiplen Vergleich nach Dunn zeigte sich zwischen Kontrollgruppe und Kontrollpeptid-Gruppe kein statistisch signifikanter Unterschied (p>0,05).


52

Abb. 4.5.: 5-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC mit permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-4 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.
Als Parameter für die Streuung der Werte werden die oberen und unteren Quartile der Mediane angezeigt. (Adhäsion auf dem Boden eines 24-Well-dish; n=6)

Tab. 4.3.: 5-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC unter permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-4 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.

Zeit [h]

Kontrolle

Kontr.peptid

cRGDDFV 10-4 M

1

1375

1000

0

72

2875

2000

625

Abb. 4.6. a) und b): 7-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC unter 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M: a) Kontrollpeptid-Gruppe und b) cRGDDFV 72 Stunden nach Beginn des Experimentes. In Abb. 4.6. b) sind keine adhärenten Zellen zu sehen (jeweils zweihundertfache Vergrößerung).


53

Wurden die humanen LEC hingegen nur für eine Stunde mit cRGDDFV 10-3 M inkubiert, so zeigte sich eine Inhibition der Adhäsion auf dem Boden der Kulturschale von 100 % am siebten Tag (s. Tab. 4.4. und Abb. 4.6. und 4.7. a) und b) sowie 4.8.).

Zwischen den Medianen der Anzahl adhärenter Zellen bestand ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,0001). Im paarweise multiplen Vergleich nach Dunn zeigte sich zwischen Kontrollgruppe und Kontrollpeptid-Gruppe kein statistisch signifikanter Unterschied (p>0,05).

Abb. 4.7. a) und b): 7-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC unter 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M: a) Kontrollpeptid-Gruppe und b) cRGDDFV 168 Stunden nach Beginn des Experimentes (jeweils hundertfache Vergrößerung). In Abb. 4.7. b) ist lediglich Zelldetritus zu sehen.

Tab. 4.4.: 7-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC unter 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.

Zeit [h]

Kontrolle

Kontr.peptid

cRGDDFV 10-3 M

1

1250

1125

0

72

1250

1500

0


54

Abb. 4.8.: 7-Tages-Adhäsionsexperiment humaner LEC unter 1-stündiger Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M: Mediane der Anzahl adhärenter Zellen.
Als Parameter für die Streuung der Werte werden die oberen und unteren Quartile der Mediane angezeigt. (Adhäsion auf dem Boden eines 24-Well-dish; n=6)

4.3 Untersuchungen zum Adhäsionsverhalten humaner und boviner Linsenepithelzellen unter cRGDDFV auf exzidierten bovinen Vorderkapseln

Unter permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M gelang es den humanen (s. Abb. 4.9. a) bis c) und 4.10. a) und b)) und bovinen (4.11. a) und b) LEC nicht, in der Umgebung der auf dem Boden der Kulturschale liegenden Kapselexzidate zu adhärieren. Dadurch befanden sich in der cRGDDFV-Gruppe alle eingegebenen Zellen auf der Kapsel. In der Kontroll- bzw. Kontrollpeptid-Gruppe verteilten sich die Zellen sowohl auf der Kapsel als auch auf dem nicht von der Kapsel bedeckten Boden der Kulturschale. Bereits am dritten Tag befanden sich lichtmikroskopisch mehr Zellen auf den Kapseln der cRGDDFV-Gruppe als auf denen der Kontroll- bzw. Kontrollpeptid-Gruppe. Zu keinem Zeitpunkt konnte eine geringere Adhäsion der Zellen auf den Kapseln der cRGDDFV-Gruppe als auf denen der anderen beiden Gruppen festgestellt werden.

Ein Unterschied im Adhäsionsverhalten zwischen bovinen und humanen LEC konnte nicht beobachtet werden, die humanen LEC zeigten lediglich ein wesentlich langsameres Wachstumsverhalten.


55

Abb. 4.9. a), b) und c): Humane LEC auf bovinen Linsenkapseln: a) zu Beginn des Experimentes, direkt nach Zugabe der Zellen in das Well der Kulturschale, b) am 4. Tag des Experimentes unter permanenter Einwirkung des Kontrollpeptids 10-3 M und c) am 4.Tag des Experimentes unter permanenter Einwirkung von cRGDDFV 10-3 M. In Abb. 4.9. c) ist zu erkennen, daß den Zellen unter Anwesenheit von cRGDDFV 10-3 M die Adhäsion lediglich auf der Linsenkapsel, nicht jedoch auf dem Boden der Kulturschale gelingt. (a) bis c) in hundertfacher Vergrößerung).


56

Abb. 4.10.a) und b): Experiment wie in Abb. 4.9. a) bis c): Humane LEC auf boviner Linsenkapsel a) cRGDDFV 10-3 M und b) Kontrollpeptid 10-3 M am 4. Tag des Experimentes (in vierhundertfacher Vergrößerung).

Abb. 4.11. a) und b): Bovine LEC auf bovinen Linsenkapseln: nach 4-tägiger Inkubation mit a) Kontrollpeptid 10-4 M und b) cRGDDFV 10-4 M (fünfzigfache Vergrößerung). Es besteht kein Unterschied in der Zelldichte auf den Kapseln beider Gruppen.

4.4 Untersuchungen zum Ablösungsverhalten konfluenter Linsenepithelzellen

4.4.1 Ablösung boviner LEC vom Boden der Kulturschale

Vom Boden der Kulturschale begannen sich die bovinen LEC bereits zehn Minuten nach Zugabe des cRGDDFV (10-4 M) vom Rand des Wells her zu lösen (s. Abb. 4.12. b)). Nach 35 bzw. 37 Minuten (zwei Experimente) befanden sich nur noch abgelöste größere Zell-Konglomerate in der Kulturschale - diese bereits oben schwimmend. Es waren keine Zellen mehr adhärent (s. Abb.4.12. c)). Dieses Verhalten war völlig unabhängig davon, ob es sich um einen intakten Zellrasen oder um einen mit einer zentral (mittels modifiziertem Trepan) gesetzten Wunde handelte. Wells, die mit 10%igem Me


57

dium (Kontrollgruppe) oder dem Kontrollpeptid (10-4 M) inkubiert wurden, zeigten auch nach zwei Tagen einen intakten Zellrasen um die Wunde. Die Wunden der Kontroll- bzw. Kontrollpeptid-Gruppe hatten sich nach zwei Tagen geschlossen (s. Abb. 4.12. a)). In der cRGDDFV-Gruppe kam es zu keiner erneuten Adhäsion der Zellen.

Abb. 4.12. a) bis c): Ablösung boviner Linsenepithelzellen vom Boden der Kulturschale. In konfluente Zell-Layer wurden mittels eines Trepans zentrale Läsionen gesetzt. Nach zwei Tagen ist in der Kontrollpeptid-Gruppe die Wunde wieder völlig geschlossen (a)). Nach Zugabe von cRGDDFV 10-4 M beginnen sich die Zellen bereits nach zehn Minuten vom Rand des Wells her zu lösen (b)) (im rechten unteren Bildabschnitt ist der umgeschlagene Zellrasen sichtbar). Nach 37 Minuten sind alle Zellen vom Boden der Kulturschale abgelöst, es ist nur noch die Gravur des Trepans vom Setzen der Läsion am Boden der Kulturschale sichtbar (c)). (jeweils fünfzigfache Vergrößerung)

4.4.2 Ablösung boviner LEC von exzidierten bovinen Linsenvorderkapseln

Nach Zugabe von cRGDDFV 10-4 M war bereits nach wenigen Minuten ein Ablösen der Zellen in der Umgebung des Kapselexzidates vom Boden der Kulturschale zu beobachten (s. Kapitel 4.4.1.). Der konfluente Zellrasen auf der Kapsel blieb allerdings im Beobachtungszeitraum von zwei Tagen unverändert, es lösten sich dort keine Zellen ab (s. Abb. 4.13. a) und b).


58

Abb. 4.13. a) und b): Konfluente bovine LEC auf bovinen exzidierten Linsenvorderkapseln a) vor und b) nach Zugabe von cRGDDFV 10-4 M. Auch nach zwei Tagen hatten sich keine Zellen von den Linsenkapseln gelöst. Lediglich auf dem die Kapsel umgebenden Boden der Kulturschale blieben die Zellen nicht adhärent (Zell-Konglomerat am Rand der Kapsel in der Abb. 4.13. b) oben links; dort ist auch der zellfreie Boden der Kulturschale zu sehen). (jeweils fünfzigfache Vergrößerung)

4.4.3 Ablösung humaner LEC von humanen Linsenvorderkapseln

Nach blind durchgeführter Beurteilung der Präparate durch drei Untersucher (s. Tab. 4.5. a) und b)) konnte bei keiner Inkubationszeit bzw. cRGDDFV-Konzentration ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der cRGDDFV-Gruppe bzw. der Kontroll- und Kontrollpeptidgruppe (die letzten beiden zusammengefaßt zu einer „Kontrolle“) festgestellt werden: Die Nullhypothese, daß beide Gruppen der gleichen Grundgesamtheit entstammen, konnte mit p=0,1878 bei 24-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M und p=0,0798 bei 48-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 2x10-3 M nicht abgelehnt werden (Fischers Exakter Test) (s. Abb. 4.14. bis 4.22. a) und b)).

Tab. 4.5. a) und b): Beurteilung der Anzahl adhärenter und vitaler Zellen auf intraoperativ gewonnenen humanen Linsenvorderkapseln nach a) 24-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M bzw. b) 48-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 2x10-3 M. Pro Feld ist die Summe der durch drei unabhängige Untersucher zugeordneten Präparate angegeben.


59

Abb. 4.14. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 24-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Es sind große zellbedeckte Areale zu sehen.

Abb. 4.15. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 24-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Vereinzelt befinden sich Zellnester auf der Kapsel.

Abb. 4. 16. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 24-stündiger Inkubation mit Kontrollmedium: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Es befinden sich keine Zellen auf der Kapsel.


60

Abb. 4.17. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 24-stündiger Inkubation mit Kontrollpeptid 10-4 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Die Kapsel ist von großen Zellnestern bedeckt.

Abb. 4.18. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 48-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 2,5x10-3 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Die Kapsel ist völlig zellfrei.

Abb. 4.19. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 48-stündiger Inkubation mit cRGDDFV 2,5x10-3 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Auf der Kapsel befindet sich nur Zelldetritus.


61

Abb. 4.20. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 48-stündiger Inkubation mit Kontrollmedium: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Auf der Kapsel befindet sich nur Zelldetritus.

Abb. 4.21. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 48-stündiger Inkubation mit Kontrollpeptid 2x10-3 M: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Auf der Kapsel befinden sich große Zellnester.

Abb. 4.22. a) und b): Humane Linsenvorderkapsel nach 48-stündiger Inkubation mit Kontrollmedium: a) fünfzigfache Vergrößerung und b) hundertfache Vergrößerung. Die Kapsel ist nahezu vollständig von Zellen bedeckt.


62

4.4.4 Ablösung humaner LEC von humanen Linsenkapseln mit IOL-Implantat

Nach dreitägiger Inkubation waren die Zellen auf der in cRGDDFV 10-4 M inkubierten Kapsel bzw. IOL blasig verändert, z.T. hatten sich Zellkonglomerate gebildet. Die Zellen der in Kontrollpeptid inkubierten Kapsel mit IOL waren unverändert (s. Abb. 4.23. a) bis c) und 4. 24. a) und b)).

Durch die Spülung mit der Kulturlösung zwischen den Kapselblättern bzw. zwischen Kapsel und IOL konnten bereits nach ca. drei Minuten die ersten sich am Äquator befindenden Zellen der cRGDDFV -Gruppe abgelöst werden. Nach insgesamt sieben Minuten waren nahezu alle Zellen entfernt (s. Abb. 4.25. a) und b)). Trotz intensiver Spülung mit maximal möglichem Druck ließen sich auch nach sieben Minuten kaum Zellen zwischen den Kapselblättern bzw. zwischen Kapsel und IOL der in Kontrollmedium inkubierten Kapsel lösen. Zellfreie Areale auf der Kapsel bzw. der IOL entstanden nicht, lediglich einige Zellkonglomerate (s.Abb. 4.26. a) bis d)).

Abb. 4.23. a) und b): IOL im Kapselsack eines Organspenders: vor der Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M zeigte sich ein dichter regeneratorischer Nachstar im Kapselsack (der Rand der Kapsulorrhexis befindet sich jeweils rechts oben; in Abb. 4.23. b) ist die blaue Haptik der IOL zu sehen). Abb. 4.23. c) zeigt die schon zu Beginn des Experimentes zellfreie Optik der IOL. (alle Abbildungen in hundertfacher Vergrößerung)


63

Abb. 4.24. a) und b): Entspricht Abb. 4.23. a) und b) am 3. Tag des Experimentes vor der Spülung des Kapselsackes. Unter cRGDDFV 10-4 M hatten sich bereits Zellen von der Kapsel gelöst und zu dichten Zellkonglomeraten (in den Fotos dunkel erscheinend) zusammengelagert. (alle Abbildungen in hundertfacher Vergrößerung)

Abb. 4.25. a) und b): Entspricht Abb. 4.23. a) und b) am 3. Tag des Experimentes nach siebenminütiger Spülung des Kapselsackes (cRGDDFV 10-4 M). Es sind zellfreie Bezirke auf der Linsenkapsel zu sehen. In Abb. 4.25. a) am linken Bildrand und in Abb. 4.25. b) am rechten oberen Bildrand befinden sich gelöste Zellkonglomerate. Am linken unteren Bildrand in Abb. 4.25. b) ist wiederum die blaue Haptik der IOL zu erkennen; es sind durch das Spülen z.T. kleine Kapseldefekte entstanden. In beiden Abbildungen befindet sich die Kapsulorrhexis am rechten oberen Bildrand. (alle Abbildungen in hundertfacher Vergrößerung)


64

Abb. 4.26. a) bis d): In Kontrollpeptid 10-4 M inkubierte IOL im Kapselsack eines Organspenders. Das optische Zentrum war klar, jedoch zeigte sich ein deutlicher regeneratorischer und fibrotischer Nachstar im Sinne einer Soemmerring-Ringkatarakt (s. Abb. 4.26. a) und b)). Nach viertägiger Inkubation in Kontrollpeptid war es zu keiner Veränderung im Vergleich zum Zustand vor Beginn des Experimentes gekommen. Nach zehnminütiger Spülung zwischen den Kapselblättern entstanden keine zellfreien Areale, lediglich einige Zellkonglomerate waren sichtbar (Abb. 4.26. c) und d)). (Vergrößerung in Abb. 4.26. a) und c) fünfzigfach, in Abb. 4.26. b) und d) hundertfach)


65

4.5 Untersuchungen zum Einfluß von cRGDDFV auf das Hornhautendothel

4.5.1 Hornhautendothelzell-Layer auf dem Boden der Kulturschale

Bereits 30 Minuten nach Zugabe von cRGDDFV 10-4 M begannen sich im Zellrasen dieser Gruppe kleine zellfreie Areale zu bilden. Diese hatten zunächst eine Größe von ein bis zwei Zellen. Am Ende der ersten Stunde nach Zugabe von cRGDDFV hatten sich die Defekte im Zellrasen dann etwa auf 5-Zellen-Größe erweitert. Nach 4,75 Stunden waren die defekten Bezirke so weit vergrößert, daß das Experiment abgebrochen und die Zellen gefärbt und fixiert wurden. Die zellfreien Bezirke zeigten ein alveolenartiges Aussehen (s. Abb. 4.27. a) und b)).

Die Zell-Layer der Kontroll- bzw. Kontrollpeptid-Gruppe blieben hingegen während der gesamten 4,75 Stunden unverändert geschlossen (s. Abb. 4.27. c)).

Abb. 4.27. a), b) und c): Auf konfluente bovine Hornhaut-Endothel-Zellen am Boden der Kulturschale wurde a) und b) cRGDDFV bzw. c) Kontrollpeptid (jeweils in einer Konzentration von 10-4 M) gegeben. Nach 4,75 Stunden Inkubationszeit zeigten sich in der cRGDDFV-Gruppe alveolenartige Defekte im Zellrasen bis hin zu nur noch vereinzelten Zellnestern. Die Kontrollpeptid-Gruppe wies keine Veränderungen auf. (hundertfache Vergrößerung)


66

4.5.2 Hornhautendothel und -epithel humaner Hornhäute

Nach 24- bzw. 48-stündiger Inkubation der Hornhaut mit cRGDDFV 2x10-3 M konnte nach neuerlicher Anfärbung des Endothels bzw. Epithels mit Trypan-Blau Farblösung keine Zunahme der avitalen Bezirke - im Vergleich zum Ausgangsbefund - festgestellt werden. Beide Hornhäute erlitten keinen Endothel- (s. Abb. 4.28 bis 4.30. a) und b)) bzw. Epithelzellverlust (s. Abb. 4.31. a) und b)) bzw. keine Schädigung desselben durch cRGDDFV. Es war lediglich eine Zunahme der Faltenbildung zu verzeichnen. Mikroskopisch konnte kein Unterschied zwischen den Befunden 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach Beginn des Experimentes festgestellt werden. In den Abbildungen ist eine der zwei untersuchten Hornhäute exemplarisch dargestellt, da der Verlauf in beiden Fällen gleich war.

Abb. 4.28. a) und b): Zentrales Hornhautendothel vor Zugabe von cRGDDFV 2x10-3 M (a) in fünfzigfacher und b) in hundertfacher Vergrößerung).

Abb. 4.29. a) und b): Zentrales Hornhautendothel 24 Stunden nach Zugabe von cRGDDFV 2x10-3 M. (a) in fünfzigfacher und b) in hundertfacher Vergrößerung)


67

Abb. 4.30. a) und b): Zentrales Hornhautendothel 48 Stunden nach Zugabe von cRGDDFV 2x10-3 M. (a) in fünfzigfacher und b) in hundertfacher Vergrößerung)

Abb. 4.31. a): Zentrales Hornhautepithel vor Zugabe von cRGDDFV 2x10-3 M (in hundertfacher Vergrößerung). Durch eine Zunahme der Quellung und damit der Faltenbildung sind die Epithelzellen nach 48 Stunden Inkubationszeit (b), in hundertfacher Vergrößerung) nicht mehr beurteilbar. Eine verstärkte Blaufärbung, die auf eine Zunahme avitaler Zellen schließen ließe, lag jedoch nicht vor.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Oct 1 12:29:56 2002