Kojetinsky, Corina: Untersuchungen zur Nachstarprävention in vitro mittels des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV

68

Kapitel 5. Diskussion

5.1 Diskussion der Ergebnisse

Das Ziel der hier vorliegenden Untersuchungen bestand darin, die Möglichkeiten der Nachstarprävention mittels des von uns verwendeten zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV in in-vitro-Modellen zu prüfen. Es wurde zum einen dessen Auswirkung auf die Adhäsion von humanen bzw. bovinen Linsenepithelzellen (LEC) beobachtet, zum anderen die Frage beantwortet, ob auch bereits adhärente LEC von ihrer Adhäsionsoberfläche wieder abgelöst werden können.

Schließlich galt es, mit Blick auf einen klinischen Einsatz von cRGDDFV, dessen Wirkung auf andere okuläre Strukturen, hier speziell auf das Hornhautendothel, zu untersuchen.

5.1.1 Diskussion der Ergebnisse zu Adhäsion und Proliferation der LEC auf dem Boden der Kulturschale

Für die Untersuchung der Adhäsion der LEC in Anwesenheit von cRGDDFV verwendeten wir zunächst das Modell der unbeschichteten Kulturschale. Insbesondere in Bezug auf die Bestimmung der Anzahl adhärenter Zellen bietet diese Methode den Vorteil einer einfachen Versuchsdurchführung. Außerdem war auf diese Weise ein annähernder Vergleich der adhäsionshemmenden Potenz des von uns verwendeten cRGDDFV mit dem von Palmade et al. [56] gebrauchten LCM 1910 möglich.

Die Inhibition der Adhäsion boviner LEC auf dem Boden der Kulturschale war bei einer Langzeit-Inkubation mit cRGDDFV schon bei sehr geringen Konzentrationen desselben nahezu vollständig (nach 5 Tagen Inkubation mit cRGDDFV 10-4 M 100 % Adhäsionshemmung im Vergleich zur Kontrollpeptid-Gruppe). Die Inhibition der Adhäsion humaner LEC auf dem Boden der Kulturschale (im Vergleich zur Kontrollpeptid-Gruppe) betrug unter gleichen Bedingungen nach fünf Tagen 68,8 %.

Diese Inhibition der Adhäsion humaner und boviner LEC auf dem Boden der Kulturschale ist in unseren Untersuchungen bei gleicher Konzentration des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV (10-4 M) wesentlich ausgeprägter als es die von Palmade [56] beschriebenen Ergebnisse für bovine LEC mittels LCM 1910 zeigen (ca. 55 % Hemmung der Adhäsion/Proliferation unter siebentägiger Inkubation mit LCM 1910). Daher ist anzunehmen, daß das von uns verwendete zyklische RGD-Peptid cRGDDFV eine wesentlich größere adhäsions- und proliferationshemmende Potenz besitzt, als das als


69

LCM 1910 bezeichnete RGD-Peptid, das die Arbeitsgruppe um Palmade verwendete. Einschränkend muß man jedoch sagen, daß über das Molekulargewicht und mögliche Substituenten des Peptids keine Angaben gemacht wurden, so daß dieser Vergleich nur annähernd möglich ist.

Auch konnte erstmals gezeigt werden, daß humane LEC durch Inkubation mit cRGDDFV eine Adhäsionshemmung auch über mehrere Tage erfahren. Oharazawa et al. [57] hatten humane LEC lediglich für einen Zeitraum von 3 Stunden mit RGD-Peptid inkubiert. Um dem in vivo gegebenen längeren Zeitraum bis zur Entstehung eines Nachstars Rechnung zu tragen, inkubierten wir die humanen LEC für 5 Tage. Allerdings kam es hier bei den Zellen der Kontroll- und Kontrollpeptid-Gruppe zu keiner Proliferation (nach 120 Stunden waren rund 20-30 % der eingesäten Zellen adhärent). So kann lediglich die Aussage getroffen werden, daß nach fünftägiger Inkubation humaner LEC mit cRGDDFV in einer Konzentration von 10-4 M eine sehr ausgeprägte Adhäsionshemmung zu erzielen war (s.o.).

Den in-vivo-Bedingungen entspricht eine fünftägige Inkubation mit RGD-Peptid jedoch nicht. Infolge des Kammerwasser-Turnovers ist mit einem raschen Ausspülen der Wirksubstanz zu rechnen. Unter der Vorstellung, daß ein nur kurzzeitiges Einwirken des RGD-Peptids keinen ausreichenden Hemm-Effekt auf die Adhäsion und Proliferation der LEC haben würde, wurden bereits Versuche zur verzögerten intraokularen Freisetzung des Peptids unternommen:

Zwei Verfahren sind als in-vivo-Untersuchungen vorgestellt worden: Hasegawa et al. [58] implantierten nach Kataraktextraktion am Kaninchen ein osmotisches Pumpsystem in eine subkutane Tasche. Dieses war mit einer im Kapselsack plazierten Kanüle verbunden, so daß zyklisches RGDS-Peptid in einer konstanten Konzentration von 60 mg/ml über die Hinterkapsel abgegeben wurde. Dem Partnerauge wurde auf die gleiche Weise die reine Vehikelsubstanz zugeführt. Während am dritten postoperativen Tag kein Unterschied in der Nachstarentwicklung der beiden Gruppen zu verzeichnen war, konnte eine deutliche Migrationshemmung der LEC auf der zentralen hinteren Kapsel am siebten Tag gesehen werden (Spaltlampenuntersuchung und histologische Beurteilung nach Enukleation am siebten Tag). Keine Angaben werden über die Anzahl der untersuchten Augen und mögliche Nebenwirkungen auf andere okuläre Strukturen


70

gemacht.

Nishi et al. [55] implantierten fünf Kaninchen am Ende der Kataraktchirurgie Polyaktinglykolsäure-Scheiben, die entweder 4 % RGD-Peptid oder eine Kombination aus 23 % EDTA und 10 % RGD-Peptid enthielten, in den Kapselsack. Dafür wurde eine in vitro Freisetzungsrate von RGD-Peptid von 4,4 µg/h bzw. 7,6 µg/h für die kombinierte Form angegeben (Freisetzungsrate von EDTA in der kombinierten Form: 7,8 µg/h). Als Kontrollgruppe diente das jeweilige Partnerauge, das eine Polyaktinglykolsäure-Scheibe ohne RGD-Peptid bzw. EDTA erhielt. Die Nachstarbildung wurde mittels histopathologischer Aufarbeitung ein bzw. zwei Monate nach der Operation, am Tag der Tötung der Tiere, untersucht. Es zeigte sich nur ein geringer Nachstarinhibierender Effekt der RGD-Peptidgruppe gegenüber der Kontrollgruppe. Kein Unterschied zwischen beiden Gruppen fand sich auch im Endothelzellverlust. Andere okuläre Gewebe zeigten keine pathologischen Veränderungen. Bei der Kombination aus EDTA und RGD-Peptid konnten nur wenige LEC überhaupt auf der Hinterkapsel nachgewiesen werden, während ein ausgeprägter Nachstar für die Kontrollgruppe beschrieben wurde. In dieser kombinierten Gruppe bildete sich allerdings ein Endothelödem aus, mikroskopisch war aber kein Endothelzellverlust sichtbar. Iris und Ziliarkörper waren mit Entzündungszellen infiltriert. An der Retina sah man keine pathologischen Veränderungen. Zu diesen Ergebnissen muß kritisch angemerkt werden, daß nicht genau angegeben wird, wieviel Augen bzw. Tiere pro Gruppe untersucht wurden. Die Zahl von fünf Kaninchen ist aber sicher als recht klein zu bewerten. Außerdem wird nicht offengelegt, welche Tiere nach einem Monat und welche nach zwei Monaten untersucht wurden und wieso es überhaupt zwei verschiedene Zeitpunkte der Beendigung des Versuches gab. Auch ist eine Aussage über eine Steigerung des Nachstarinhibierenden Effektes des RGD-Peptides bei Anwesenheit von EDTA nicht möglich, da die kombinierten Scheiben die 2,7fache Menge an RGD-Peptid enthielten (1,5 mg bzw. 4,0 mg).

Neben den angeführten noch offenen Fragen und Kritikpunkten werden einige Probleme bezüglich der klinischen Umsetzung offenbar: Die von Nishi [55] implantierten Scheiben haben ein ebenso hohes Gewicht wie die für die optische Rehabilitation erforderlichen Intraokularlinsen (IOL). Dadurch ist mit einer recht großen Belastung der Linsenkapsel sowohl durch das erhöhte intrakapsuläre Volumen als auch durch das verdoppelte Gewicht zu rechnen. Es besteht also die Gefahr, daß es zu einer Subluxa


71

tion oder Luxation bzw. Ruptur der Linsenkapsel mit IOL kommt. Auch kann die optische Klarheit der IOL durch die RGD-Peptid-Tägerscheibe beeinträchtigt sein. Das von Hasegawa [58] vorgestellte Prinzip der kontinuierlichen Abgabe von zyklischem RGDS-Peptid in den Kapselsack erfordert eine länger bestehende Bulbusöffnung. So ist ein Eindringen von pathogenen Keimen in das Auge zu befürchten. Es ist außerdem von einem zusätzlichen Spülmechanismus durch das Besprühen der Hinterkapsel mit RGD-Peptid auszugehen - ein zusätzlicher mechanischer Inhibitor der Zelladhäsion.

Die Untersuchungen von Nishi und Hasegawa gehen davon aus, daß eine nur kurzzeitige Inkubation mit RGD-Peptid keinen ausreichenden und dauerhaften Effekt auf die Inhibition von Adhäsion, Migration und Proliferation der LEC haben würde. Untersucht wurde dies bisher jedoch nicht. Daß eine systemische Applikation des RGD-Peptids sicher keinen Nachstarinhibierenden Effekt, aber Nebenwirkungen (z.B. eine Koagulopathie) bewirken würde, wurde bereits beschrieben (s. 1.6.2.). Bei den erwähnten Nachteilen und der sehr aufwendigen Durchführung einer verzögerten Freisetzung des Peptids würde beispielsweise das Zufügen von RGD-Peptid zur Spüllösung für die Katarakt-Operation jedoch eine viel einfachere praktische Handhabung und kostengünstigere Alternative zur Nachstarprävention darstellen.

Nach einer einstündigen Inkubation boviner LEC mit dem von uns verwendeten RGD-Peptid cRGDDFV in einer Konzentration von 10-4 M betrug die Hemmung der Adhäsion bzw. Proliferation nach sieben Tagen 48,5 %. Durch eine Verzehnfachung der Peptid-Konzentration konnte die Adhäsions-/ Proliferations-Hemmung nicht erhöht werden (41,9 % Adhäsion am siebten Tag) (s.a. 4.1.2. und 4.2.). Die Zellen bildeten bereits am fünften Tag des Experimentes einen konfluenten Rasen im Well der Kulturschale, so daß die eigentlich recht hohe inhibitorische Wirkung des Peptids als nicht ausreichend angesehen werden muß. Humane LEC zeigten nach einstündiger Inkubation mit cRGDDFV in einer Konzentration von 10-3 M eine 100%ige Hemmung der Adhäsion - nach einer Stunde ebenso wie am siebten Tag des Experiments - (s. 4.1.2. und 4.2.). Wie beschrieben, war es zu keiner Proliferation der Zellen der Kontrollgruppe innerhalb dieser einen Woche gekommen. So ist zumindest für die Adhäsion humaner LEC auf dem Boden der Kulturschale von einem ausreichenden Effekt auf die Hemmung derselben durch cRGDDFV (10-3 M) auszugehen. Eine Schlußfolgerung, ob auf diese Weise eine Nachstarprävention gelingt, ist jedoch nicht möglich, da auch wir keine Aussage über die Hemmung der Proliferation treffen konnten. Hier werden tierexperimentelle Untersuchungen unerläßlich sein.


72

Nach einstündiger Inkubation mit cRGDDFV der Konzentration 10-3 M wurde bei bovinen LEC ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der Kontrollpeptid-Gruppe festgestellt. So ist zu vermuten, daß das Kontrollpeptid in dieser hohen Konzentration auch ohne funktionelle RGD-Sequenz die Zelladhäsion boviner LEC hemmt. Die Aussage über die adhäsionsinhibierende Potenz des von uns verwendeten cRGDDFV ist daher in diesem Fall nur eingeschränkt möglich, da sich hier möglicherweise die Effekte der Trägersubstanz und der RGD-Sequenz addieren. Es könnte sich aber auch um einen zufälligen Effekt handeln, der z.B. auf einen Fehler in der Versuchsdurchführung zurückzuführen ist, da ein gleicher Versuchsansatz mit humanen LEC keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Kontrollgruppe und Kontrollpeptid-Gruppe zeigte. Ein Effekt, der ausschließlich durch die RGD-Sequenz hervorgerufen wird, liegt bei statistisch signifikantem Unterschied zwischen Kontrollpeptid- und cRGDDFV-Gruppe des Experimentes mit bovinen LEC aber sicher vor.

Zusammenfassend ist bezüglich der hier vorgestellten Experimente zur Langzeit- bzw. Kurzzeit-Inkubation boviner und humaner LEC festzustellen, daß eine Hemmung der Adhäsion der LEC mittels des von uns verwendeten cRGDDFV auf dem Boden der Kulturschale sehr gut bis vollständig möglich ist. Die Zellen adhärieren vorwiegend unter Vermittlung von Vitronektin, welches reichlich im bovinen Serum des Kulturmediums vorhanden ist [<82>], nur gering via Fibronektin. Vitronektin ist kein nachgewiesener Bestandteil von Linsenkapseln. Eine stark adhäsionshemmende Wirkung an diesem Liganden durch RGD-Peptide ist bereits durch mehrere Arbeitsgruppen beschrieben worden [72], [73] (s. auch 1.6.1.). Auch ist bekannt, daß humane LEC in Langzeit-Kulturen (nach 450 Tagen) in der Lage sind, selbst Linsenkapsel-Proteine zu synthetisieren (Laminin und Kollagen IV) [60]. Wann diese Synthese einsetzt, ist nicht bekannt. Möglicherweise sind Laminin und Kollagen IV schon früher Adhäsionsgrundlage für Zellen in Zellkultur. Die sehr hohe Adhäsionshemmung auf Kulturschalen mittels cRGDDFV läßt jedoch nicht vermuten, daß dies schon im Verlaufe unserer Experimente der Fall ist.

Es ist als ein besonders interessantes Ergebnis hervorzuheben, daß die Hemmung der Adhäsion/Proliferation der bovinen LEC bei fünftägiger Einwirkung von cRGDDFV (10-4 M) ausgeprägter ausfiel als die der humanen LEC, wohingegen die Kurzzeit-Inkubation mit cRGDDFV der Konzentration 10-3 M zum völligen Adhäsionsverlust der humanen LEC bis zum siebten Tag führte, die bovinen LEC aber keine ausreichende Hemmung der Proliferation erfuhren. Es wäre möglich, daß für humane LEC eine


73

cRGDDFV -Konzentration von 10-3 M bereits ausreicht, um die Apoptose derselben einzuleiten (entsprechend den Untersuchungen von Buckley et al. [74]). Der nahezu vollständige Hemmeffekt auf die Adhäsion der Zellen nach nur einstündiger Inkubation macht sehr wahrscheinlich, daß es in diesem kurzen Zeitraum zur Apoptose der Zellen gekommen ist. Dann wäre die Aktivierung von Pro-Caspase-3 der bovinen LEC erst durch höhere Peptidkonzentrationen auslösbar bzw. ausgeprägter.

Unterschiede in der Expression von Integrinen boviner und humaner LEC sind nicht bekannt.

5.1.2 Untersuchungen zu Adhäsion und Proliferation der LEC auf exzidierten bovinen Vorderkapseln

Um eine Annäherung an die physiologischen Gegebenheiten zu erreichen, untersuchten wir nun die Wirkungen unseres zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV auf die Adhäsion auf bovinen Linsen-Vorderkapseln.

Voruntersuchungen an Linsenkapseln bzw. an einzelnen Komponenten von diesen hatten gezeigt, daß eine Hemmung der Adhäsion, Migration bzw. Proliferation von LEC durch RGD-Peptide an diesen Liganden möglich ist:

Palmade [56] fand unter Anwesenheit von extrazellulärer Matrix (Zellsuspension) eine Adhäsion von rund 20 % nach einstündiger Inkubation mit 10-3 M eines als LCM 1910 bezeichneten RGD-Peptids (keine näheren Angaben) gegenüber ca. 28 % ohne Zugabe von RGD-Peptid (die Prozentangaben beziehen sich jeweils auf 100 % eingesäte Zellen). Auf bovinen Vorderkapseln waren nach einer Stunde und bei einer Peptid-Konzentration von 10-3 M rund 30 % der Zellen adhärent (gegenüber rund 35 % bei einer Peptidkonzentration von 10-3 M). Alle diese Untersuchungen wurden an bovinen LEC und Kapseln durchgeführt.

Oharazawa [57] beschreibt bei humanen LEC, die mit large-T-Antigen von SV 40 transfiziert worden waren, eine Adhäsionshemmung auf Fibronektin von 80 % unter Verwendung von 2 mg/ml des verwendeten RGD-Peptids (keine näheren Angaben) nach drei Stunden. Zum gleichen Zeitpunkt und bei gleicher Peptidkonzentration waren auf Laminin erste adhäsionshemmende Effekte zu verzeichnen. Wie ausgeprägt diese waren, ist nicht angegeben. Auf Kollagen waren schließlich, unabhängig von der Peptidkonzentration, keine Auswirkungen auf die Adhäsionsrate der Zellen zu erkennen.


74

Eine Proliferationshemmung der LEC auf Linsenkapseln in vivo (Kaninchen-Modell) wurde in den unter 5.1.1. aufgeführten Experimenten der Gruppen um Nishi und Hasegawa [58], [55] nachgewiesen.

In unseren Experimenten zeigte sich, daß sowohl humane als auch bovine LEC durch hohe Konzentrationen an cRGDDFV (10-3 M) nicht an einer Adhäsion auf den Kapseln gehindert wurden. Ein Unterschied in der Dichte des Zellrasens der Kontrollpeptid-Gruppe bzw. der cRGDDFV-Gruppe war zu keinem Zeitpunkt lichtmikroskopisch feststellbar.

Die von Palmade et al. [56] gezeigten adhäsionsinhibierenden Effekte des RGD-Peptids LCM 1910 auf extrazellulärer Matrix bzw. Linsenkapseln sind nur sehr gering ausgeprägt. Ob sie im Vergleich mit einer Kontrollgruppe statistisch signifikant wären, ist fraglich und durch die Autoren nicht untersucht. Außerdem wurde hier die Zellzahl lediglich eine Stunde nach Zugabe der Zellen und des RGD-Peptids ermittelt. Da die Adhäsionshemmung nicht vollständig war, ist es möglich, daß die verbliebenen adhärenten Zellen im weiteren Verlauf dennoch migrieren und proliferieren und so der anfängliche Hemm-Effekt verkleinert oder aufgehoben würde.

Auch die von Oharazawa vorgestellten Ergebnisse an humanen LEC [57] sprechen nicht für eine adhäsionshemmende Potenz des RGD-Peptids auf Kapseln, da Fibronektin kein nachgewiesener Bestandteil von adulten humanen Linsenkapseln ist. Die Aussage, daß ein erster adhäsionshemmender Effekt auf Laminin verzeichnet wurde, ist ob ihrer Ungenauigkeit kaum zu deuten. Laminin wird in einer anderen Arbeit von Oharazawa et al. [<83>] als wichtigstes Adhäsionssubstrat für humane LEC beschrieben (im Vergleich mit Kollagen IV und Fibronektin). Olivero et al. [68] jedoch kommen bei Untersuchungen an LEC des Kaninchens zu der Schlußfolgerung, daß die Adhäsion der Zellen v.a. durch Kollagen IV (welches aber RGD-unabhängig mit den Integrinen der Zelle interagiert [68], [76]) und viel weniger duch Laminin und Fibronektin bedingt ist. Die Migration hingegen sei vorwiegend auf Fibronektin zurückzuführen und viel weniger auf Kollagen IV und Laminin [68]. Die Langzeituntersuchungen von Nishi [55] und Hasegawa [58] beschreiben einen qualitativ hemmenden Einfluß auf die Nachstarbildung im Tierexperiment. Dieser war bei einer verzögerten Freitsetzung von RGD-Peptid aus der Polyaktinglykolsäure-Scheibe sehr gering. Die Steigerung des Effektes durch Erhöhung der Peptid-Konzentration und Zugabe von EDTA führte dann zu einem den Nachstar hemmenden Effekt und auch zu intraokularen Nebenwirkungen, die ihren


75

klinischen Einsatz sehr beschränken. Auf welchen der beiden Faktoren (RGD-Peptid oder EDTA) diese zurückzuführen sind, ist nicht zu schlußfolgern, da die Konzentration beider Substanzen gegenüber der reinen RGD-Scheibe variiert wurde. Über die sehr kleine Anzahl untersuchter Augen, die rein qualitativ erfaßte Wirkung des RGD-Peptids und die mögliche optische Beeinträchtigung durch die zusätzlich implantierten Scheiben sind bereits kritische Anmerkungen gemacht worden (s. 5.1.1.). Ebenso wurde über die sich ergebenden offenen Fragen und Kritikpunkte der Untersuchung von Hasegawa et al. [58] berichtet (s. 5.1.1.).

5.1.3 Untersuchungen zur Ablösung der LEC

Da die Ablösung sowohl der bovinen als auch der humanen LEC vom Boden der Kulturschale unter schon sehr geringen Konzentrationen an cRGDDFV (10-4 M) gelang und diese bereits nach rund 30 Minuten komplett war, ist von einer recht schwachen Adhäsion der LEC an der Kulturschale auszugehen. Wie unter 5.1.1. beschrieben, haften die Zellen wahrscheinlich überwiegend über Vitronektin am Boden. Ob die Zellen bereits selbst Kollagen IV bzw. Laminin synthetisiert hatten, scheint fraglich, denn beschrieben ist dies bisher nur nach einem Zeitraum von 450 Tagen [60]. Der Untersuchung von Heyman et al. zufolge [76] ist dies dennoch nicht auszuschließen, denn hier konnte gezeigt werden, daß auch Zellen, die ohne Zugabe von Serum kultiviert wurden, nach 24 Stunden Adhärenz durch die Zugabe von RGD-Peptid ablösbar waren. Die Autoren gehen davon aus, daß sich zu diesem Zeitpunkt keine Adhäsion über Vitronektin, sondern ausschließlich über durch die Zellen sezerniertes Fibronektin gebildet hatte. Eine Aufnahme zusätzlicher Zell-Ligand-Beziehungen scheint mangels anderer potentieller Liganden in diesem Modell nicht möglich, so daß ein Ablösen der Zellen durch kompetitive Hemmung der Integrine oder eine Induktion der Apoptose erfolgt. Im Gegensatz zu Buckley et al. [74] gehen Heyman et al. [76] nicht von einem toxischen Effekt des RGD-Peptids aus, da nach der Ablösung der Zellen eine Anfärbung mit Trypan-Blau nicht gelang. Auch waren die Zellen nach einem gründlichen Waschvorgang erneut zur Adhäsion fähig und hatten ihre ursprüngliche Morphologie behalten.

Sind LEC aber auf der bovinen Linsenkapsel adhärent, so ist davon auszugehen, daß mehr als nur Integrin-RGD-Interaktionen diese Adhäsion aufrechterhalten [76]. Zu nennen sind hier weitere Adhäsionsmoleküle wie CD-44 sowie ICAM-1 [18], welche ebenfalls RGD-unabhängig sind. Auch binden LEC z.B. an das Kollagen IV der Linsenkap


76

sel; diese Bindung ist RGD-unabhängig. Aber auch die Ca2+-abhängigen Zell-Zell-Verbindungen mittels Cadherinen spielen eine Rolle für die Stabilität der Zell-Adhäsion und das Überleben der Zellen [<84>]. Die Adhäsion durch Erkennen einer RGD-Sequenz ist nur ein Teil einer Reihe von Mechanismen der LEC, Verbindungen mit extrazellulärer Matrix einzugehen und aufrechtzuerhalten. Ein Beispiel für die Vielfalt von Adhäsionsmechanismen allein durch Integrine der Zelle mit unterschiedlicher extrazellulärer Matrix zeigt Abb. 5.1.

Auch ist die Bindung des zugefügten löslichen RGD-Peptids an eine Zelle kompetitiv zu der Bindung der Zelle an extrazelluläre Matrix. Liegen also mehr Liganden dieser Matrix als zugefügte synthetische RGD-Sequenzen vor, ist keine Hemmung der Integrin-RGD-vermittelten Zelladhäsion möglich. Sind die Adhäsionsmoleküle der LEC mit den Liganden der extrazellulären Matrix der Linsenkapsel Verbindungen eingegangen, dann sind diese durch das Zufügen löslicher RGD-Peptide nicht mehr zu unterbrechen. Auch eine Ablösung der humanen LEC von den intraoperativ gewonnenen humanen Linsen-Vorderkapseln durch eine 48-stündige Inkubation mit cRGDDFV war nicht zu erzielen.

Abb. 5.1.: Schematisches Modell verschiedener Zell-Interaktionen mit extrazellulären Glykoproteinen mittels spezifischer Erkennungssequenzen. Zellen können Integrin-Rezeptoren (wie dargestellt) oder andere Arten von Rezeptoren zur Interaktion mit spezifischen Peptid-Regionen von Liganden benutzen. Integrin-Rezeptoren bestehen aus Heterodimeren mit einer alpha- und einer beta-Untereinheit, jede Untereinheit kann eine Liganden-Spezifität determinieren. Einige der Zell-Adhäsions-Liganden, wie z.B. Fibronektin, können viele verschiedene Bindungsstellen haben, die wiederum von vielen verschiedenen Integrinen erkannt werden (nach Yamada [67]).

Der Vergleich zweier aus den Augen eines Organspenders entnommener Kapselsäcke mit implantierter Intraokularlinse zeigte allein durch die Inkubation mit cRGDDFV sehr geringer Konzentration (10-4 M) eine Veränderung der Nachstarzellen: sie verloren an Vitalität (Vergrößerung der Zellen mit reichlich Vakuolen im Zellplasma).


77

Auch waren bereits zellfreie Areale entstanden. Durch das Spülen der Kapselsäcke unter Druck gelang schon nach wenigen Minuten das Ablösen großer Zellmengen, in der Kontrollgruppe war dies nicht der Fall. Wir konnten pro Gruppe lediglich ein Nachstarpräparat untersuchen, so daß Schlußfolgerungen nicht gezogen werden können, zumal die explantierten Kapselsäcke mit IOL keinen gleich stark ausgeprägten Nachstar aufwiesen. Es kann höchstens von einem ermutigenden Fallbeispiel gesprochen werden. Eine mögliche Erklärung der Beobachtungen ist, daß die bereits zu Blasenzellen transformierten LEC leichter durch cRGDDFV ablösbar sind oder direkt die Apoptose der Zellen durch cRGDDFV eingeleitet wird. Für die Nachstarprävention wäre dieser Effekt allerdings nicht ausreichend, ein Einsatz von cRGDDFV zur operativen Nachstar-Absaugung jedoch - cRGDDFV als Zusatz zur Spülflüssigkeit - wäre denkbar. Es sind aber zunächst noch weitere Untersuchungen an explantierten humanen Nachstarpräparaten und in vivo erforderlich.

5.1.4 Untersuchungen zur Wirkung von cRGDDFV auf das Hornhautendothel

Konfluente bovine Hornhautendothelzell-Layer waren, anders als die Linsenepithelzell-Layer, durch eine Inkubation mit cRGDDFV nicht vollständig vom Boden der Kulturschale ablösbar. Es bildeten sich allerdings alveolenartige Löcher im Zellrasen, so daß wir von einer Ablösung eines Teils der Endothelzellen ausgehen müssen. Wurden jedoch intakte humane Hornhäute mit cRGDDFV inkubiert, war auch nach mehreren Tagen keine Zunahme avitaler Zellen (sowohl Epithel- als auch Endothelzellen) bzw. keine Ablösung von Endothelzellen der Hornhaut zu verzeichnen.

Diese Ergebnisse stimmen mit denen der in-vivo-Untersuchungen von Nishi [55] überein, die keinen Hornhautendothelzellverlust nach Implantation von RGD-Peptid-haltigen Scheiben in den Kapselsack beschreiben. Daß sich in dieser Studie in der kombinierten Gruppe (RGD-Peptid- und EDTA-haltige Scheiben) ein Endothelödem entwickelte, läßt sich auf die Funktion von EDTA als Ca2+-Chelat-Bildner zurückführen: Auf diese Weise werden interzelluläre Verbindungen durch Cadherine unterbrochen, und Kammerwasser kann leichter in die Interzellularspalten eindringen.

In der Untersuchung von Heyman et al. [76] wird berichtet, daß auch Endothelzellen durch RGD-Peptid-Zugabe von ihrer Adhäsionsfläche zu lösen waren, genaue Angaben werden jedoch nicht gemacht, so daß ein Vergleich mit unseren Ergebnissen nicht möglich ist.


78

Die bezüglich der Ablösung vom Boden der Kulturschale durch cRGDDFV bestehenden Unterschiede zwischen Hornhaut-Endothel- und Linsen-Epithel-Zellen könnten durch unterschiedliche Adhäsionsmechanismen in vitro erklärt werden. Sowohl über die Adhäsion der Hornhaut-Endothelzellen an der Basalmembran in vitro als auch in vivo ist bisher nichts bekannt. Ob Integrine daran beteiligt sind und wenn ja welche, wird noch zu untersuchen sein.

5.2 Fehleranalyse

5.2.1 Untersuchungen zur Adhäsion der LEC auf dem Boden der Kulturschale

Eine Aussage über den Einfluß des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV auf die Proliferation humaner LEC konnten wir nicht treffen, da nach siebentägiger Versuchsdauer erst rund 20-30 % der Zellen der Kontroll- bzw. Kontrollpeptid-Gruppe adhärent waren. Eine längere Versuchsdauer - bis zum Einsetzten der Proliferation der LEC in der Kontrollpeptid- und Kontrollgruppe - wurde nicht gewählt, da die nötigen Wechsel des Kulturmediums jeweils ein Rückzentrifugieren der noch nicht adhärenten LEC erforderlich gemacht hätte. Dadurch war ein Vitalitätsverlust von Zellen zu erwarten. Auch wollten wir keine größere Anzahl humaner LEC pro Well der Kulturschale aussäen, da dann der Vergleich der Wirkung von cRGDDFV auf bovine bzw. humane LEC unter der gleichen Peptidkonzentration schwierig gewesen wäre (es wurde die gleiche Anzahl humaner bzw. boviner LEC/cm2 Well ausgesät). Eine längere Durchführung des Experimentes hielten wir nicht für sinnvoll, da alle Zellen der cRGDDFV-Gruppe über sieben Tage nicht adhärent gewesen waren. Es war daher mit einem Zelltod dieser Zellen zu rechnen, durch Anoikis oder direkt durch eine durch das cRGDDFV ausgelöste Apoptose. Buckley et al. [74] berichten vom Tod von 50 % nicht adhärenter Zellen (T-Lymphozyten) innerhalb der ersten 24 Stunden unter RGD-Peptid (keine näheren Angaben) 10-4 bzw. 10-3 M. Ein Vergleich der Kontrollpeptid- bzw. cRGDDFV-Gruppe wäre somit nach mehr als sieben Tagen nicht mehr sinnvoll gewesen.

5.2.2 Untersuchungen zur Adhäsion der LEC auf Linsenkapseln

Wir untersuchten die Adhäsion/Proliferation humaner und boviner LEC ausschließlich auf bovinen Linsenkapseln. Es ist möglich, daß Unterschiede im Aufbau humaner und boviner Kapseln bestehen, die auch einen Einfluß auf unsere Untersuchungen haben. Für humane Linsenkapseln ist das Vorhandensein von Laminin und Kollagen I, III


79

und IV beschrieben [2], für bovine Kapseln waren dies v.a. Kollagen IV und Entactin [3]. Gefunden wurde dort auch ein kleiner Anteil an Laminin, Heparansulfat und Fibronektin. Da nach den jeweils nicht nachgewiesenen Proteinen nicht gesucht wurde, kann die Ähnlichkeit beider Kapseln noch größer sein.

Eine mögliche Ungenauigkeit in unseren Experimenten kann dadurch entstanden sein, daß sich die eingesäten Zellen der Kontrollpeptid- und Kontrollgruppe sowohl auf der Kapsel als auch auf dem die Kapsel umgebenden Boden der Kulturschale anhefteten, während es in der cRGDDFV-Gruppe zu keiner Adhäsion auf dem Boden der Kulturschale kam, so daß alle eingesäten Zellen auf der Kapsel adhärierten.

So befanden sich in der cRGDDFV-Gruppe mehr Zellen auf einer Kapsel als in der Kontrollpeptid- und Kontrollgruppe. Es ist vorstellbar, daß durch die große Anzahl der LEC die eigentlich sehr hohe cRGDDFV-Konzentration nicht ausreichend war für die große Anzahl zu besetzender Integrinrezeptoren. Geht man von einem Auslösen der Apoptosis durch RGD-Peptide aus, könnte die dafür notwendige Konzentration unterschritten gewesen sein, bzw. in nur verhältnismäßig wenigen Zellen eine Apoptose induziert haben. Ein Vergleich dieser Werte mit den Daten der Arbeitsgruppe um Palmade [56] ist leider nicht möglich, da ihrer Veröffentlichung nicht zu entnehmen ist wie hoch die Zellzahl pro mm2 Linsenkapsel war.

5.2.3 Untersuchungen zur Ablösung der LEC

Zur Untersuchung der Ablösung humaner LEC von humanen Linsen-Vorderkapseln bestanden die Gruppen aus einer recht kleinen Anzahl von Präparaten (cRGDDFV 24 Stunden 10-4 M: 12 Präparate bzw. 17 Präparate der Kontrollgruppe) (cRGDDFV 48 Stunden 2x10-3 M: je acht Präparate beider Gruppen). Obwohl dem bei der statistischen Auswertung Rechnung getragen wurde, ist diese Zahl sicher als recht gering anzusehen. Noch mehr fällt dies ins Gewicht bei der Untersuchung der Intraokularlinsen im Kapselsack eines Organspenders; sie stellt lediglich ein Fallbeispiel dar. Aus ethischen Gründen konnten hier nur die Augen Verwendung finden, deren Hornhäute nicht für eine Organtransplantation geeignet waren.

5.2.4 Untersuchungen zur Wirkung von cRGDDFV auf das Hornhautendothel

Von den zwei untersuchten humanen Hornhäuten wurde diejenige mit cRGDDFV inkubiert, die direkt nach der Präparation verwendet wurde, also als „frischer“ als die bereits fünf Wochen kultivierte Hornhaut angesehen werden muß. Da jedoch neben dem Un


80

terschied zwischen den beiden Hornhäuten auch der Zustand vor und nach der Inkubation mit Kontrollmedium bzw. cRGDDFV verglichen wurde, ist dies zu vernachlässigen.

Wie unter 5.2.3. beschrieben, ist die Anzahl untersuchter Hornhäute als recht klein anzusehen und das Ergebnis stellt lediglich ein Fallbeispiel dar.

5.3 Schlußfolgerung

Zusammenfassend lassen unsere Untersuchungen zur Wirkung des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV auf Adhäsion und Proliferation der LEC auf bovinen Linsenkapseln vermuten, daß ein hemmender Einfluß durch dieses Peptid nicht oder nur in geringem Maße möglich ist, während die Hemmung auf dem Boden der Kulturschale auch nach nur kurzzeitiger Inkubation gelingt. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß durch höhere Konzentrationen an cRGDDFV eine zur Nachstar-Inhibition ausreichende Adhäsionshemmung der LEC auf Kapseln zu erreichen ist. Käme es dann zu einer vermehrten Adhäsionshemmung der Zellen, spräche dies vor allem für die Theorie der Induktion der Apoptose der LEC [74] durch RGD-Peptide, da wie erwähnt RGD-abhängige Integrin-Ligand-Interaktionen auf der Linsenkapsel nur in sehr geringem Maße für die Adhäsion (Laminin und Fibronektin) und stärker für die Migration (Fibronektin) der LEC verantwortlich sind [68]. Da die Untersuchungen von Nishi [55] und Hasegawa [58] eine Hemmung der Nachstarbildung durch langdauernde Einwirkung von RGD-Peptid beschreiben, werden weitere tierexperimentelle Studien zur Überprüfung dieses Effektes erforderlich sein - unter Beachtung der erwähnten Kritikpunkte.

Das Lösen bereits bestehender Adhäsionen von humanen LEC auf humanen Linsenkapseln gelang in unseren Untersuchungen nicht, ebenso waren die Adhäsionen auf bovinen Kapseln durch cRGDDFV nicht zu unterbrechen. Es erwies sich jedoch die druckvolle Spülung des Kapselsackes mit cRGDDFV als erfolgreich beim Lösen von Nachstarzellen aus dem Kapselsack bzw. von der in diesen implantierten IOL eines Organspenders. Es wird tierexperimentell zu untersuchen sein, ob diese erleichterte Ablösung der LEC vom Kapselsack auch unter in-vivo-Bedingungen zu erreichen ist.

Diese ermutigenden Ergebnisse bezüglich einer erleichterten Ablösung transformierter LEC von der Linsenkapsel bzw. der IOL werden auch nicht durch eine Endotheltoxizität des cRGDDFV in Frage gestellt. Das Endothel intakter humaner Hornhäute wies keinen vermehrten Zellverlust auf.


Fußnoten:
<82>

Heymann EG, Pierschbacher MD, Suzuki S, et al .: Vitronectin - a major cell attachment-promoting protein in fetal bovine serum. Exp Eye Res 1985; 160: 245-258

<83>

Oharazawa H, Ibaraki N, Lin L-R, et al.: The effects of extracellular matrix on cell attachement, proliferation and migration in a human lens epithelial cell line. Exp Eye Res 1999; 69: 603-610

<84>

Gumbiner BM: Cell adhesion: The molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell 1996; 84: 345-357


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Oct 1 12:29:56 2002