Kojetinsky, Corina: Untersuchungen zur Nachstarprävention in vitro mittels des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV

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Kapitel 6. Zusammenfassung

6.1 Problemstellung

Die Entwicklung eines Nachstars ist eine der Hauptursachen für einen Visusabfall nach erfolgreicher Kataraktoperation. Dabei kommt es zur Adhäsion, Migration und Proliferation verbliebener Linsenepithelzellen (LEC) auf der Linsenkapsel und somit zur Trübung der optischen Achse. Die Inzidenz des Nachstars wird mit 10-50 % [6], [7] angegeben. Trotz verbesserter Operationsverfahren, verschiedenster Variationen des Designs und/oder Materials der Intraokularlinsen (IOL) und Untersuchungen unter Anwendung von immunologischen und pharmazeutischen Agentien ist eine Prävention des Nachstars bisher nicht möglich. Zur visuellen Rehabilitation stehen zwei Verfahren zur Verfügung: die YAG-Kapsulotomie und die chirurgische Nachstar-Absaugung. Beide bergen Risiken, wie das Entwickeln einer Ablatio retinae, eines zystoiden Makulaödems oder - bei chirurgischem Vorgehen - einer Endophthalmitis. Auch sind mit diesen Behandlungsmethoden erhebliche Kosten verbunden.

6.2 Mechanismen der Entstehung eines Nachstars und deren Beeinflussung durch RGD-Peptide

Eine Nachstarmembran entsteht durch Adhäsion, Migration und späterer Proliferation und Differenzierung der LEC auf der Linsenkapsel. Ermöglicht und stabilisiert wird dies durch Zell-Zell-Interaktionen und Zell-Matrix-Verbindungen. Die Linsenkapsel, als extrazelluläre Matrix, enthält Adhäsionsproteine wie Kollagen und Laminin. An diesen können die Adhäsionsmoleküle der LEC anheften. Neben ICAM-1 und CD-44 [18] spielen hier insbesondere die Integrine eine bedeutende Rolle. Viele Subtypen aus der Gruppe der Integrine binden auf der Seite der extrazellulären Matrix an eine bestimmte Aminosäuren-Sequenz: Arginin-Glyzin-Asparagin, kurz „RGD“ genannt. Diese hat sich als unabdingbar für das Zustandekommen von Zelladhäsionen einer Reihe von Zelltypen und Adhäsionsproteinen erwiesen [71], [70]. Durch Zugabe von synthetisch hergestelltem RGD-Peptid konnte dann die Adhäsion verschiedenster Zellen an Laminin, Fibronektin und Vitronektin kompetitiv gehemmt werden [73], [71], [81], [<85>]. So wurde die Wirkung dieser Peptide auch auf die Adhäsion von LEC und somit auf die Nachstarbildung untersucht. In vitro konnten Palmade et al. [56] einen inhibitorischen Einfluß


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des Peptids auf die Adhäsion auf bovinen Linsenkapseln zeigen. In vivo ist durch den hohen Kammerwasser-Turnover mit einem Wirkverlust des Peptids bei lokaler intraokularer Applikation zu rechnen. Systemisch (oral oder intravenös) wäre mit schweren Nebenwirkungen, wie z.B. einer Koagulopathie [75] zu rechnen. Die daher durchgeführten Versuche zur kontinuierlichen Freisetzung des RGD-Peptids im Auge [55], [58] sind jedoch aufgrund bestimmter Risiken nicht auf die klinische Anwendung zu übertragen.

6.3 Zielstellung

Es war deshalb zu untersuchen, ob durch eine Kurzzeit-Inkubation mit dem von uns verwendeten zyklischen RGD-Peptid cRGDDFV eine ausreichende Hemmung der Adhäsion der LEC zu erzielen ist. Außerdem überprüften wir, ob mittels cRGDDFV auch eine Ablösung bereits adhärenter LEC gelingt. Unter der Vorstellung, cRGDDFV der Spüllösung für die Katarakt-Operation zuzusetzen, wären so nicht nur abgelöste Zellen an einer erneuten Adhäsion zu hindern, sondern es wäre dann auch u.U. möglich, die Kapsel vollständig von LEC zu säubern. Desweiteren war ein Vergleich der Nachstarhemmenden Potenz unseres RGD-Peptids mit den Peptiden der vorausgegangenen Arbeiten und eine Prüfung einer eventuellen Toxizität auf das Hornhautendothel angestrebt.

6.4 Material und Methoden

Verwendet wurden sowohl bovine als auch humane Linsenepithelzellkulturen, bovine Hornhautendothelzellkulturen, präparierte humane Hornhäute sowie explantierte Kapselsäcke humaner Spender. Sowohl zur Untersuchung der Adhäsionshemmung als auch der Ablösung adhärenter Zellen wurden unterschiedliche Inkubationszeiten und Konzentrationen von cRGDDFV verwendet. Als Kontrolle diente ein Kontrollpeptid nahezu gleichen Molekulargewichtes ohne die RGD-Sequenz. Zur Sichtbarmachung avitaler Zellen verwendete man Trypan-Blau. Die Experimente wurden fotodokumentiert, bzw. es erfolgte eine Auszählung der Anzahl adhärenter Zellen. Zur statistischen Auswertung wurde der ANOVA-Rangsummen-Test nach Friedmann bzw. Fischers Exakter Test eingesetzt.


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6.5 Ergebnisse

Während eine Hemmung der Adhäsion (69-100 % Hemmung) bzw. eine vollständige Lösung adhärenter LEC vom Boden der Kulturschale schon mit sehr geringen Konzentrationen an cRGDDFV (10-4 M) gelang, blieben beide Vorgänge auf Linsenkapseln unbeeinflußbar. Die Experimente zur Adhäsion auf dem Boden der Kulturschale zeigten eine bei gleicher Konzentration größere Potenz unseres RGD-Peptids im Vergleich zu dem der Gruppe um Palmade [56].

Nach dreitägiger Inkubation mit cRGDDFV (10-4 M) gelang es, die Nachstarmasse aus einer explantierten humanen Kapsel unter Spüldruck zu lösen.

Unter Einwirkung von cRGDDFV entstanden Defekte im konfluenten Zellrasen boviner Hornhautendothelzellen in der Kulturschale, während präparierte humane Hornhäute keine Zunahme avitaler Zellen aufwiesen.

6.6 Diskussion

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorgestellten Ergebnisse nicht zu weiteren in-vivo-Studien ermutigen, da keine ausreichende Adhäsionshemmung boviner und humaner LEC auf Linsenkapseln zu erzielen war. Erklärbar ist dies durch die Vielzahl weiterer Adhäsionsmechanismen: mittels RGD-unabhängiger Integrine und Integrin-unabhängiger Adhäsionen. Auf dem Boden der Kulturschale sind hingegen nur wenige Adhäsionsmechanismen wirksam, die durch RGD-Peptid ausgesprochen gut zu beeinflussen waren. Dies ist jedoch auf die klinische Anwendung nicht übertragbar. Eine Prävention des Nachstars scheint nach unseren Untersuchungen mit dem von uns verwendeten cRGDDFV nicht erfolgversprechend. Eine Ablösung adhärenter Zellen von Kapseln gelang nicht, da für die Stabilität der Verbindungen auch Zell-Zell-Interaktionen durch Cadherine eine große Rolle [84] spielen. Diese sind ausschließlich Kalzium-abhängig. Das zugefügte synthetische RGD-Peptid bindet kompetitiv zu den Adhäsionsproteinen der extrazellulären Matrix, so daß auch ein Überwiegen der Liganden auf deren Seite gegenüber dem löslichen RGD-Peptid denkbar ist. Auch ist davon auszugehen, daß nach Ausbildung eines adhärenten Zellrasens eine große Anzahl verschiedenster Adhäsionsmechanismen wirkt. Bereits bestehende Verbindungen waren somit nicht mehr zu lösen. Lediglich die Nachstarmasse des humanen Spenders ließ sich unter Druck und nach Einwirkung von cRGDDFV sehr gut lösen. Hier ist bereits mit ei


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ner reduzierten Adhäsion dieser transformierten Zellen zu rechnen. Aufgrund der kleinen Anzahl an zur Verfügung stehenden Spendern sind sicherlich weitere Untersuchungen erforderlich. Eine Nutzung des RGD-Peptids cRGDDFV zur erleichterten Nachstar-Absaugung wäre denkbar.


Fußnoten:
<85>

Aumailley M, Gurrath M, Müller G, et al.: "Arg-Gly-Asp constrained within cyclic pentapeptides. Strong and selective inhibitors of cell adhesion to vitronectin and laminin fragment P1." FEBS 1991; 29/1: 50-54


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