Frau PD Dr. med. P. Welker Aus dem Centrum für Anatomie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Regulation der Freisetzung von SCF aus proliferierenden versus
differenzierenden Keratinozyten/HaCaT

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Christian Kors
aus Düren

Gutachter:
1. Frau PD Dr. med. P. Welker
2. Frau PD Dr. med. K. Hartmann
3. Herr PD Dr. med. B. Gibbs

Datum der Promotion: 05.07.2006……………

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1  Keratinozyten
    • 1.1.1  Vorkommen von Keratinozyten
    • 1.1.2 Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten
    • 1.1.3 Zytokine / Zelltypen und deren Funktion
  • 1.2 HaCaT-Zellen
    • 1.2.1  Herkunft und Wachstum der HaCaT-Zelllinie
    • 1.2.2 Eigenschaften der HaCaT-Zellen
    • 1.2.3 HaCaT-Zellen und Retinoide
    • 1.2.4 HaCaT-Zellen und Glukokortikoide
  • 1.3  Differenzierungsmarker Keratin 5 (K5)
  • 1.4 Involukrin
    • 1.4.1  Vorkommen und Eigenschaften
    • 1.4.2 Wirkung auf Keratinozyten
  • 1.5 Stem Cell Factor (SCF)
    • 1.5.1  SCF und seine Herkunft
    • 1.5.2 Wirkung und Funktion von SCF
    • 1.5.3 SCF und Pathologie
  • 1.6 Die Mastzelle
    • 1.6.1  Herkunft und Heterogenität
    • 1.6.2 Reifung, Adhäsion, Aktivierung und Mediatorfreisetzung der Mastzelle
    • 1.6.3 Mediatoren und biologische Funktionen der Mastzelle
    • 1.6.4 Pathophysiologie der Mastzelle
    • 1.6.5 SCF und Mastzellen
  • 1.7  Der Melanozyt
  • 1.8 Glukokortikoide
    • 1.8.1  Physiologie und Pathophysiologie von Glukokortikoiden (Dexamethason)
    • 1.8.2 Rezeptoren von Glukokortikoiden
  • 1.9 Retinoide / All-Trans-Retinsäure (RA)
    • 1.9.1  Vorkommen von Retinoiden
    • 1.9.2 Rezeptoren der Retinoide
    • 1.9.3 Physiologie / Pathophysiologie der Retinoide
  • 1.10 Zielsetzung der Untersuchungen
• 2.  Methoden
  • 2.1  Chemikalien- und Geräteliste
    • 2.1.1  Chemikalien-/Geräteliste und Zubehör der Zellkultur
    • 2.1.2 Geräteliste und Zubehör des verwendeten ELISA
    • 2.1.3 Chemikalien- und Geräteliste der Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
  • 2.2  Zellkultivierung
    • 2.2.1  Kultivierung der Zelllinie HaCaT
    • 2.2.2 ELISA
    • 2.2.3  Messenger Ribonukleinsäure / Copy Desoxyribonukleinsäure
    • 2.2.4 Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
  • 2.3 Statistik
• 3.  Resultate
  • 3.1  Zellkultur der HaCaT-Zellen
    • 3.1.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen (Charakterisierung der Differenzierung durch Keratin 5 und Involukrin)
  • 3.2 Inkubation der HaCaT-Zellen mit All-Trans-Retinsäure (RA)
    • 3.2.1  Inkubation der HaCaT-Zellen mit RA für 24 Stunden
      • 3.2.1.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen
      • 3.2.1.2  SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf Proteinebene (ELISA)
      • 3.2.1.3  SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf mRNA-Ebene (PCR)
    • 3.2.2 Inkubation der HaCaT-Zellen mit RA für 11 Tage
      • 3.2.2.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen
      • 3.2.2.2 Gesamt-SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf mRNA-Ebene (PCR)
  • 3.3 Inkubation der HaCaT-Zellen mit Dexamethason
    • 3.3.1  Inkubation der HaCaT-Zellen mit Dexamethason für 24 Stunden
      • 3.3.1.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen
      • 3.3.1.2 SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf Proteinebene (ELISA)
      • 3.3.1.3 SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf mRNA-Ebene (PCR)
    • 3.3.2 Inkubation der HaCaT-Zellen mit Dexamethason für 11 Tage
      • 3.3.2.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen
      • 3.3.2.2 SCF-Produktion aus den HaCaT-Zellen auf Proteinebene (ELISA)
  • 3.4 Bestimmung des Differenzierungsmarkers Keratin 5 (K5) auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR
    • 3.4.1  Differenzierungsmarker Keratin 5 (K5)
  • 3.5 Auftrennung in Gesamt-SCF und SCF-Splicevarianten
    • 3.5.1  Gesamt-SCF (SCF 3´5´)
    • 3.5.2 sSCF/mSCF
      • 3.5.2.1  Produktion von sSCF/mSCF nach Inkubation mit RA über 11 Tage
      • 3.5.2.2 Produktion von sSCF/mSCF nach Inkubation mit Dexamethason über 24 h
  • 3.6 All-Trans-Retinsäure Rezeptoren (RAR)
    • 3.6.1  RAR-α
    • 3.6.2 RAR-β
    • 3.6.3 RAR-γ
  • 3.7 Glukokortikoid-Rezeptoren (GR)
    • 3.7.1  GR-α
    • 3.7.2 GR-β
• 4.  Diskussion
  • 4.1  Zellwachstum der HaCaT-Zellen
    • 4.1.1  Charakterisierung der Differenzierung der HaCaT-Zellen durch K5
  • 4.2 Inkubation der HaCaT-Zellen mit RA
  • 4.3 Inkubation der HaCaT-Zellen mit Dexamethason
  • 4.4 Produktion von sSCF/mSCF
  • 4.5 Expression von RAR-Rezeptoren
  • 4.6  Expression von GR-Rezeptoren
  • 4.7 Fazit
• 5.  Zusammenfassung
• Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
• Publikationen
• 6. Literaturverzeichnis
• 7. Danksagung
• 8. Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Einige wichtige entzündungsfördernde, immunmodulatorische und wachstumsmodulierende Zytokine, produziert durch Keratinozyten ( Chu AC, Morris JF: The Keratinocyte. In: Skin Immune System (SIS), Bos JD ed., CRC Press, Boca Raton, New York, 2 nd ed., 1997, pp. 43-57)
• Tabelle 2: Hautkrankheiten, bei denen eine Mastzellvermehrung und / oder Mastzellhyperplasie beobachtet worden ist (nach Grabbe et al., 1994)
• Tabelle 3:Spezifische Oligonukleotidprimer mit Annealingtemperaturen und  Zyklenzahlen
• Tab. 4: Zusammenfassung der Ergebnisse unter RA Einfluss
• Tab. 5: Zusammenfassung der Daten zur Modulation mit Dexamethason
• Tab. 6: Zusammenfassung der Daten zur K5 Expression
• Tab. 7: Zusammenfassung der Ergebnisse zur sSCF/mSCF Expression
• Tab. 8: Zusammenfassung der Ergebnisse zur mRNA Expression der RAR Rezeptoren
• Tab. 9 : Zusammenfassung der Daten zur mRNA Expression der GR-Rezeptoren

Bilder

• Abb. 1: Wachstumskurve von HaCaT-Zellen (eigene Ergebnisse)
• Abb. 2: Zeitabhängige Freisetzung von Involukrin aus normalen, über die Dauer von 20 Tagen kultivierten humanen Keratinozyten
• Abb. 3: Wachstumskurve der HaCaT-Zellen über 14 Tage. Die Aussaat der Zellen erfolgte mit jeweils 3 x 105 Zellen /ml. Zur Darstellung kommt hier ein repräsentatives Experiment.
• Abb. 4: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit RA über 24 h am Tag 5.  * = p<0.05, im Vergleich zum Kontrollwert.
• Abb. 5: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit RA über 24 h am Tag 12.
• Abb. 6: SCF-Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit RA über 24 h am Tag 5.
• Abb. 7: SCF-Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit RA über 24 h am Tag 12. * = p<0.05; ** = p<0.01
• Abb. 8: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach kontinuierlicher Inkubation mit RA über 11 Tage am Tag 4. ** = p<0.01
• Abb. 9: Zellzahl der HaCaT-Zellen am Tag 11, nach kontinuierlicher Inkubation mit RA über 11 Tage. * = p<0.05; ** = p<0.01
• Abb. 10: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen am Tag 4, bei Inkubation mit RA über 11 Tage. * = p <0.05
• Abb. 11: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen am Tag 11, bei Inkubation mit RA über 11 Tage. * = p<0.05
• Abb. 12: Resultate der molekularen Analyse der Expression von SCF 3´5´ während der Inkubation mit RA über jeweils 11 Tage. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: DMSO Tag 4; Reihe 4: RA Tag 11; Reihe 5: DMSO Tag 11.
• Abb. 13: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason (10-6 M) über 24 h am Tag 5.
• Abb. 14: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason (10-6 M) über 24 h am Tag 12. * = p<0.05
• Abb. 15: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason (10-6 M) über 24 h am Tag 5. * = p<0.05
• Abb. 16: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason (10-6 M) über 24 h am Tag 12. ** p<0.01
• Abb. 17: Resultate der molekularen Analyse der Expression von SCF 3´5´ während der Inkubation mit Dexamethason über jeweils 24 Stunden. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: Dex. Tag 5; Reihe 4: DMSO Tag 5; Reihe 5: Dex. Tag 12; Reihe 6: DMSO Tag 12.
• Abb. 18: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason über 11 Tage am Tag 4.
• Abb. 19: Zellzahl der HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason über 11 Tage am Tag 11. * = p<0.05
• Abb. 20: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason über 11 Tage am Tag 4. * = p<0.05
• Abb. 21: SCF Produktion aus HaCaT-Zellen nach Inkubation mit Dexamethason über 11 Tage am Tag 11. * = p<0.05; ** = p<0.01
• Abb. 22: Resultate der molekularen Analyse der Expression von K5 unter Inkubation mit RA über 11 Tage. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: RA Tag 4; Reihe 4: DMSO Tag 4; Reihe 5: RA Tag 11; Reihe 6: DMSO Tag 11.
• Abb. 23: Resultate der molekularen Analyse der Expression von sSCF/mSCF (359/275bp) während der Inkubation mit RA über jeweils 11 Tage. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: RA Tag 4; Reihe 4: DMSO Tag 4; Reihe 5: RA Tag 11; Reihe 6: DMSO Tag 11. Obere Bande: mSCF; untere Bande: sSCF.
• Abb. 24: Resultate der molekularen Analyse der Expression von sSCF/mSCF während der Inkubation mit Dexamethason über jeweils 24 Stunden. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: Dex. Tag 5; Reihe 4: DMSO Tag 5; Reihe 5: Dex. Tag 12; Reihe 6: DMSO Tag 12. Obere Bande: mSCF; untere Bande: sSCF.
• Abb. 25: Resultate der molekularen Analyse der Expression von RAR-α während der Inkubation mit RA über jeweils 11 Tage. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: DMSO Tag 4; Reihe 4: RA Tag 11; Reihe 5: DMSO Tag 11.
• Abb. 26: Resultate der molekularen Analyse der Expression von RAR-α während der Inkubation mit Dexamethason über jeweils 24 Stunden. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: Dex. Tag 5; Reihe 4: DMSO Tag 5; Reihe 5: Dex. Tag 12; Reihe 6: DMSO Tag 12.
• Abb. 27: Resultate der molekularen Expression von RAR-γ während der Inkubation mit RA über jeweils 11 Tage. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: RA Tag 4; Reihe 4: DMSO Tag 4; Reihe 5: RA Tag 11; Reihe 6: DMSO Tag 11.
• Abb. 28: Resultate der molekularen Analyse der Expression von GR-α während der Inkubation mit Dexamethason über jeweils 24 Stunden. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: Dex. Tag 5; Reihe 4: DMSO Tag 5; Reihe 5: Dex. Tag 12; Reihe 6: DMSO Tag 12.
• Abb. 29: Resultate der molekularen Analyse der Expression von GCR-β während der Inkubation mit Dexamethason über jeweils 24 Stunden. Reihe 1: 1-kb-Leiter; Reihe 2: Wasserkontrolle; Reihe 3: Dex. Tag 5; Reihe 4: DMSO Tag 5; Reihe 5: Dex. Tag 12; Reihe 6: DMSO Tag 12.