1.  Einleitung

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Da sich die folgende Arbeit mit der Beeinflussung der Stammzellfaktor (SCF)-Produktion aus Keratinozyten durch Vitamin A Derivate (Retinoide) und Glukokortikoide beschäftigt, soll der Leser zunächst mit Grundlagen der Keratinozytenbiologie und Pathologie vertraut gemacht werden. Ferner sollen die zwei in der Haut residierenden und aufgrund ihrer selektiven Rezeptorbestückung wesentlich durch SCF regulierten Zelltypen, Melanozyten und Mastzellen, kurz vorgestellt werden. Schließlich soll auf für die vorliegenden Untersuchungen relevanten Aspekte der Biologie von Retinoiden und Glukokortikosteroiden eingegangen werden.

1.1  Keratinozyten

1.1.1  Vorkommen von Keratinozyten

Die menschliche Haut ist aus 3 Schichten aufgebaut: Die Epidermis, die Dermis und die Subkutis. Die Epidermis besteht zu 90% aus Keratinozyten, die restlichen 10% der Zellen sind mit den Keratinozyten physiologisch eng verbunden, so z. B. Langerhans-Zellen, Melanozyten und Merkelzellen (Fritsch 2004). Die verschiedenen Zelltypen weisen ein unterschiedliches Verteilungsmuster in den einzelnen Schichten der Epidermis auf. Im Falle der Keratinozyten ist dies mit einem unterschiedlichen Differenzierungsgrad der einzelnen Zellen assoziiert.

1.1.2 Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten

Keratinozyten durchlaufen auf ihrem Weg von der Basalschicht zum Stratum corneum der Epidermis an der Hautoberflächeverschiedene Differenzierungsstufen, die mit einer Änderung ihrer Morphologie und ihrer Physiologie einhergehen. Die komplette Differenzierung dauert bei humanen Keratinozyten ca. 28 Tage. Es kommt dabei zu einer Größenzunahme und zu einer Abflachung der Keratinozyten, sowie zu einer Änderung ihres Metabolismus. Weiterhin werden zu Beginn der Differenzierung neue Zellorganellen eingefügt und diese teils neu angeordnet. Bei der weiteren Differenzierung der Keratinozyten kommt es in einer späten Phase zum Übergang von granulierten zu verhornenden Zellen, zum Verlust sämtlicher Organellen bei gleichzeitiger Akkumulation von Keratinen innerhalb der Zelle, so dass die komplett keratinisierte Zelle nur noch 45 bis 86% des ursprünglichen Trockengewichtes hat.

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Im Stratum basale finden intensive Interaktionen der Keratinozyten mit dem Mesenchym statt, das für die Zufuhr von lebenswichtigen Stoffen sorgt und zugleich für die Kontrolle von Wachstum und Funktion der epidermalen Zellen (Olsen et al., 1995). Dabei spielen eine Reihe von Wachstumsfaktoren und Zytokine eine Rolle, die sowohl von Basalzellen als auch von Zellen des Mesenchyms (Dermis) gebildet werden.

Wichtigste Produkte der Keratinozyten im Laufe ihrer Differenzierung sind Keratine (oder auch Keratinfilamente), darunter die Keratine I und II, die in saure (Keratin I) und basisch-neutrale Keratine (Keratin II) unterteilt werden. Man unterscheidet Keratine in Abhängigkeit von ihrer elektrischen Ladung, ihrer Immunreaktivität und ihrenSequenzhomologien mit den Wollkeratinen I und II. Keratinfilamente (=Zytokeratine) sind analoge Polypeptide. Die oben erwähnten Untergruppen I und II sind Dimere, die sich zu Tetrameren zusammenlagern. Durch Elongation dieser Tetramereentstehen dann die eigentlichen Keratinfilamente (Fritsch 2004). Die Keratine 5 und 14 (K5 und K14) sind wichtige Differenzierungsmarker der Basalzellschicht bzw. des Stratum spinosum der Epidermis (s.u.).

1.1.3 Zytokine / Zelltypen und deren Funktion

Keratinozyten produzieren diverse Zytokine, die sowohl proinflammatorische, immunmodulierende und wachstumsfördernde Funktionen haben (Tab. 1). Der Transforming Growth Factor α (TGF-α), der auch von Keratinozyten produziert wird, fördert ebenso wie der von Fibroblasten produzierte Epidermal Growth Factor (EGF) die Proliferation der Keratinozyten. TGF-β hingegen fördert primär die Differenzierung und kann selbst durch Kalzium stimuliert werden.

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Tabelle 1: Einige wichtige entzündungsfördernde, immunmodulatorische und wachstumsmodulierende Zytokine, produziert durch Keratinozyten ( Chu AC, Morris JF: The Keratinocyte. In: Skin Immune System (SIS), Bos JD ed., CRC Press, Boca Raton, New York, 2 nd ed., 1997, pp. 43-57)

IL-1α

TNF-α

IL-1β

GM-SCF

IL-6

TGF-α

IL-7

TGF-β

IL-8

FGF

IL-10

PDGF

IL-12

SCF

IL-1ra

NGF

α-MSH

VEGF

1.2 HaCaT-Zellen

1.2.1  Herkunft und Wachstum der HaCaT-Zelllinie

Die HaCaT-Zelllinie entstammt gesunder Haut eines männlichen Patienten. Bei dem Patienten wurde aufgrund eines Melanoms eine Nachoperation („Sicherheitsabstand“) durchgeführt. Aus diesem Präparat wurde nach histologisch gesicherter Benignität die HaCaT-Zelllinie etabliert (Boukamp P 1988). Die aus humanen, nicht malignen Keratinozyten (= Normalhaut) gewonnene Zelllinie HaCaT (spontan immortalisiert) unterliegt einem festen Wachstumszyklus (Wanner et al., 1999). Dabei wird eine konstante Zellteilung nach 7 Tagen erreicht. Dies bestätigte sich in unseren Nachweisen (s. Abb. 1).

Abb. 1: Wachstumskurve von HaCaT-Zellen (eigene Ergebnisse)

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HaCaT-Zellen dienen als gutes Modell für humane Keratinozyten (Boukamp P 1988) ( Ryle CM 1989). Im Gegensatz zu normalen Keratinozyten wachsen die HaCaT-Zellen in konventioneller Kultur, d. h. ohne organotypische Co-Kulturbedingungen mit z. B. Fibroblasten.

1.2.2 Eigenschaften der HaCaT-Zellen

Besonders die stark erhaltene Fähigkeit zur Differenzierung bietet die HaCaT-Zelllinie für Untersuchungen des Einflusses von z. B. Zytokinen auf die Differenzierung an ( Schoop VM 1999). HaCaT-Zellen weisen im wesentlichen die Eigenschaften von basalen epidermalen Keratinozyten auf (Boukamp P 1988). Phänotypisch verhalten sich HaCaT-Zellen wie normale Keratinozyten (in Kultur), was Wachstum und Differenzierung anbelangt (Boukamp P 1988). Bei Transplantation auf Nacktmäuse oder bei Kultur mit humanen Fibroblasten bilden HaCaT-Zellen eine nahezu normale Epidermis, deren Architektur der von adulten humanen Keratinozyten gleich ist ( Schoop VM 1999). Im Unterschied zu humanen Keratinozyten beträgt die Bildung einer solchen Epidermis in vitro aber nicht 6 Tage, sondern dauert zwischen 2 und 3 Wochen.

HaCaT-Zellen sind frei von Simian Virus 40 (SV 40) und frei von onkogenen Typen der Humanen Papillom-Viren (HPV). Diese sind normalerweise bei Immortalisierung von Zellen nachzuweisen. Weiterhin tragen HaCaT-Zellen typischerweise durch UV-Licht induzierte Mutationen auf beiden Allelen von TP53 (Lehman, Modali et al. 1993), wie sie bei vielen Formen von Hautkarzinomen (z. B. Basalzellkarzinomen (BCC) und Plattenepithelkarzinomen (SCC)) und prämalignen Hautveränderungen (z.B. aktinische Keratosen) gefunden werden (Ziegler, Leffell et al. 1993) (Ziegler, Jonason et al. 1994). Boukamp et al. konnten zeigen, dass HaCaT-Zellen selbst bei sehr hohen Passagezahlen (>300) zwar zahlreiche Translokationen und Deletionen aufweisen (Boukamp, Popp et al. 1997), dass aber keine maligne Transformation zu beobachten ist (in vitro und in vivo).

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Eine Rolle bei der Regulation von Proliferation und Differenzierung bei HaCaT-Zellen spielt u. a. das alpha-5-Integrin (α5-Integrin) (Pivarcsi, Szell et al. 2001). Die Keratine K4 und K13 korrelieren mit der Stratifizierung der HaCaT-Zellen, während für K1 und K10 diesbezüglich keine Korrelation gezeigt werden konnte (Breitkreutz, Stark et al. 1993).

1.2.3 HaCaT-Zellen und Retinoide

HaCaT-Zellen besitzen verschiedene Retinsäure(RA)-Rezeptoren, so werden RAR-alpha, -beta, -gamma und RXR-alpha exprimiert. Im Gegensatz dazu werden von humanen Keratinozyten die Rezeptoren RAR-alpha, -gamma und RXR-alpha exprimiert ( Törmä H 1999). Über diese Rezeptoren sind HaCaT-Zellen dazu befähigt, Retinsäure zu metabolisieren; so ist die Aufnahme und Metabolisierung radioaktiven Retinols zu 3,4-Didehydro-Retinol, Retinsäure (RA) und Didehydro-Retinsäure möglich ( Törmä H 1999).

Die Differenzierungsmarker K1 und K10 werden unter physiologischen Retinsäurekonzentrationen von HaCaT-Zellen weiterhin unverändert produziert (Törma et al., 1999).

1.2.4 HaCaT-Zellen und Glukokortikoide

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Serres et al. konnten zeigen, dass die Glukokortikoid-Rezeptoren (GR) von der Mehrheit frisch isolierter humaner epidermaler Zellen exprimiert werden. Dabei lag die Expressionsrate in basalen Keratinozyten bei mehr als 90%, suprabasale Keratinozyten waren ebenfalls positiv für GR. HaCaT Zellen exprimierten GR in ähnlicher Höhe wie frisch isolierte basale Keratinozyten. Mit zunehmender Differenzierung (Str. granulosum) der Zellen konnte GR allerdings kaum noch nachgewiesen werden (Serres et al., 1996). Diese vermehrte Expression von GR in proliferierenden versus differenzierenden Zellen konnte auch in vivo mittels Gefrierbiopsien von normaler humaner Haut bestätigt werden.

1.3  Differenzierungsmarker Keratin 5 (K5)

Keratine sind Gewebe- und Zelltyp-spezifische Bestandteile von epithelialen Intermediärfilamenten (Wanner et al., 1993). Im humanen Organismus sind mehr als 20 verschiedene Keratine bekannt (Moll, Franke et al. 1982) (Fuchs 1988). Man unterscheidet die sog. sauren Typ-I Keratine (K9 – K19) von den neutral-basischen Typ-II Keratinen (K1 – K8).

Keratin 5 ist ein basisches Keratin der basalen Epidermis und weist ein Molekulargewicht von 60 kDa auf. Es dient als Differenzierungsmarker u.a. für humane Keratinozyten. Mit zunehmender Differenzierung nimmt der Gehalt an K5 ab. Dies ist u.a. auf den Ersatz des Keratinpaares K5 / K14 durch das Paar K1 / K10 mit fortschreitender Differenzierung zurückzuführen (Steinert et al., 1993). K5 konnte in HaCaT-Zellen deutlich nachgewiesen werden (Boukamp P 1988). Wir haben in unseren Untersuchungen deswegen Keratin 5 unter den verschiedenen Bedingungen (Inkubation von HaCaT-Zellen mit RA und Dexamethason für jeweils 24 Stunden bzw. 12 Tage) auf mRNA-Ebene bestimmt.

1.4 Involukrin

1.4.1  Vorkommen und Eigenschaften

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Involukrin ist ein zystinreiches unlösliches Protein (Fritsch 2004) mit einem Molekulargewicht von ca. 70 bis 80 kDa. Kodiert wird es, wie auch die Keratine, auf dem Chromosom I. Das zentrale Segment der kodierenden Region enthält 39 Wiederholungen einer aus 30 Nukleotiden bestehenden Sequenz (Eckert and Green 1986). Diese Sequenz wird durch 10 Aminosäuren kodiert, davon 3 Glutamine und 2 Glutaminsäuren. Zusammen mit den Keratinen (und u.a. Profilaggrin, Loricrin) bildet es die Struktur der Hornzellen.

Involukrin ist nicht spezifisch für die Epidermis und kommt generell in mehrschichtigem Epithel und verhornten bzw. verhornenden Zellen vor. Es wird im Zytoplasma der Stachelzellen (Str. spinosum) produziert. Basalzellen der Epidermis produzieren sehr geringe Mengen an Involukrin. Während des Differenzierungsprozesses der Keratinozyten und damit dem „Wandern“ in höhere Schichten erfolgt eine immer stärkere Expression von Involukrin auf Proteinebene ( Younus J 1992).

1.4.2 Wirkung auf Keratinozyten

Involukrin spielt eine bedeutende Rolle für den Differenzierungsprozess der Keratinozyten. Nach Freisetzung aus dem Zytoplasma der Stachelzellen lagert sich das Involukrin am Übergang des Str. granulosum zum Str. corneum an die Innenseite der Zellmembran an und wird dort durch eine kalziumabhängige membrangebundene Transglutaminase (spezifisch für Keratinozyten) quervernetzt. Diese Quervernetzung führt zu hoher Rigidität der Hornzellen mit Ausbildung eines unlöslichen Zellverbandes, der resistent ist gegen Denaturierung und den Einfluss von Chemikalien.

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Kalzium selbst erhöht die Involukrin Promoter Aktivität und die endogene Involukrin Gen-Expression (Deucher, Efimova et al. 2002).

Laut Watt und Green (Watt and Green 1981) korreliert die Involukrinsynthese mit der Zellgrösse von Keratinozyten in vitro und in vivo. Bei in Kultur befindlichen Keratinozyten konnten sie zeigen, dass erst ab einer durchschnittlichen Grösse der Keratinozyten von etwa 14 Mikrometer Involukrin nachweisbar ist. Ab dieser Grösse beginnt in Keratinozyten die für Involukrin spezifische mRNA zu akkumulieren und die entsprechende Proteinsynthese. Involukrin wird mit zunehmender Differenzierung der Keratinozyten vermehrt exprimiert (s. Abb. 2,eigene Daten).

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Abb. 2: Zeitabhängige Freisetzung von Involukrin aus normalen, über die Dauer von 20 Tagen kultivierten humanen Keratinozyten

(Aus dem Labor von Prof. Henz, mit freundlicher Erlaubnis).

Ghahary et al. konnten ebenfalls die Bedeutung von Involukrin als Differenzierungsmarker in ihren Versuchen zeigen. Die quantitativ höchste mRNA Expression von Involukrin wurde in späteren Stadien der Zelldifferenzierung von Keratinozyten nachgewiesen ( Ghahary, Marcoux et al. 2001).

Olsen et al. konnten ebenfalls die vermehrte Freisetzung (11.1-fach) von Involukrin aus (frisch isolierten) humanen Keratinozyten unter ähnlichen Kulturbedingungen wie in diesen Untersuchungen nachweisen (Olsen, Rasmussen et al. 1995), ähnlich wie Kehe et al., die in einem Hautmodell (HaCaT-Zellen in Co-Kultur mit Fibroblasten) auch einen entsprechenden Anstieg von Involukrin verzeichnen konnten ( Kehe K 1999). Dies spricht insgesamt für eine ausreichende Differenzierung der HaCaT-Zellen, um sie als Modell u. a. auch für unsere Untersuchungen zu verwenden.

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Durch die Zugabe von Tretinoin zu kultivierten Keratinozyten tritt eine verminderte Expression von verschiedenen terminalen Differenzierungsmarkern auf, u. a. von Involukrin (Motta, Monti et al. 1998) ( Tur , Hohl et al. 1995).

In unseren Versuchen haben wir Involukrin aufgrund obiger Eigenschaften als Differenzierungsmarker eingesetzt. Dabei ist mit zunehmender Differenzierung Involukrin vermehrt nachweisbar.

1.5 Stem Cell Factor (SCF)

1.5.1  SCF und seine Herkunft

Stem Cell Factor (SCF) wurde 1985 erstmals ursprünglich als muriner Leukämie-Antikörper und später dann 1990 von 3 Gruppen als neuer Faktor abstammend von humanen Fibroblasten und Leberzellen beschrieben ( Gadd and Ashman 1985) (Copeland, Gilbert et al. 1990) (Zsebo, Wypych et al. 1990) (Huang, Nocka et al. 1990). Gebräuchliche Synonyme sind Mast Cell Growth Factor (MGF), Stem Cell Factor (SCF), Steel Factor (SLF) und c-Kit Ligand.

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Humanes SCF wird durch ein Gen auf Chromosom 12q22-24 kodiert und besteht aus 248 Aminosäuren, während das SCF der Ratte bzw. Maus (Chromosom 10) nur aus 164 Aminosäuren gebildet wird. SCF wird in erster Linie, aber nicht ausschließlich, durch Stromazellen produziert. Nur wenige Zellen, in der Haut nur Mastzellen und Melanozyten, besitzen einen Rezeptor für SCF, der dem c-Kit, einem Produkt eines Protoonkogens entspricht. Dieser Rezeptor (c-Kit) ist auf dem W-Locus lokalisiert, beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosoms 4, bei Mäusen auf dem Chromosom 5 ((Grabbe, Welker et al. 1994.

SCF wird von vielen Zellen des menschlichen Körpers produziert, so u.a. von Fibroblasten, Hepatozyten, Keratinozyten, Endothelzellen, Langerhans Zellen, Thymus-Stroma Zellen, Knochenmarkstromazellen, „small cell lung cancer cells“ und Mastzellen. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte auch gezeigt werden, dass Keratinozyten der Zelllinie HaCaT SCF in vitro produzieren (Grabbe, Welker et al. 1994) (Grabbe et al., 1996).

SCF liegt in zwei Splicevarianten vor, deren Proteine eine lösliche Form, das sSCF (soluble Stem Cell Factor, sSCF, 20-35 kDa), und eine an der Oberfläche von Stromazellen gebundene Form, das mSCF (membrane-bound Stem Cell Factor, mSCF, 37-42 kDa) bilden. Diese beiden Splicevarianten wurden von uns in der vorliegenden Arbeit untersucht und auch quantifiziert. In der normalen menschlichen Haut kommt SCF hauptsächlich intrazellulär bzw. membrangebunden vor (Ratio mSCF zu sSCF z. B. im Hirn 10:1, im Knochenmark 4:1, im Hoden 0.4:1) (Broudy 1997).

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Es gibt zwei mRNAs für SCF. Die eine enthält Exon 6, bei der anderen ist Exon 6 durch Splicing herausgeschnitten. Die längere Form enthält dann auf Proteinebene eine Proteaseschnittstelle. Die lösliche Form des SCF kann abgeschnitten werden. Die Form ohne Exon 6 enthält diese nicht. Sie bleibt in der Membran.

1.5.2 Wirkung und Funktion von SCF

Für die Wirkung von SCF ist meist die Kooperation mit anderen Faktoren erforderlich, u.a. deshalb, weil nur wenige Zellen einen Rezeptor für SCF besitzen, so sind z. B. nur 2,1 % der Knochenmarkzellen positiv für c-Kit, im Nabelschnurblut sind es sogar nur 0,7 %. Reife Lymphozyten sind negativ für c-Kit, hier erfolgt die Expression durch B-Zell Vorstufen. Dieser Rezeptor besteht aus einer membrangebundenen Tyrosin-Kinase, die homolog ist für PDGF, CSF-1 und FGF. Bei der Reaktion von c-Kit Ligand mit dem c-Kit Rezeptor kommt es zur einer Phosphorylierung einer 145 kDa Protein-Kinase (bei Melanozyten) und Dimerbildung des Rezeptors, anschl. zur Internalisation des Rezeptor-Ligand-Komplexes (gleicher Reaktionsweg bei IL-3). SCF selber führt zu einer Herab-Regulation des Rezeptors ((Smith, Court et al. 2001.

Die Funktionen des SCF beinhalten u. a. das Wachstum sowie das Überleben der einzelnen Zielzellen durch eine Inhibierung der Apoptose. In vivo wird außerdem durch eine Prä-Inkubation mit SCF eine erhöhte IgE-vermittelte Histamin- und Serotoninfreisetzung beobachtet. Bei Melanozyten kommt es zu vermehrter Melaninsynthese. Als Protein für sich alleine bewirkt SCF, ähnlich wie IL-3 und IL-4, das Überleben von unreifen Vorläuferzellen. Zudem kommt es durch SCF zur Induktion bzw. Verstärkung von Sekretion, Adhäsion und Migration der Zellen ((Grabbe, Welker et al. 1994.

1.5.3 SCF und Pathologie

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In der Pathologie spielt SCF eine Rolle bei Mastzellvermehrungen im Sinne der reaktiven und idiopathischen Mastozytose. Die idiopathische Mastozytose ist entweder angeboren (15%) bzw. entsteht kurz nach der Geburt im Kindesalter, mit zumeist spontaner Rückbildung bis zur Pubertät, oder tritt spontan im Erwachsenenalter auf. Bei der Kindheitsform wird eine verstärkte Sekretion von SCF in der Epidermis diskutiert. Unumstritten sind jedoch aktivierende Mutationen im c-Kit bei praktisch allen Formen der Erkrankung von Erwachsenen (Hartmann and Henz 2001), die auch den chronischen Verlauf erklären können und die möglicherweise zur malignen Entartung bei einigen Patienten beitragen. Bei reaktiven Mastzellvermehrungen im Rahmen von Entzündungserkrankungen (s. Tab. 2) konnte am Beispiel der Wundheilung eine verstärkte Expression von SCF sowie eine Modulation der c-Kit Expression in Mastzellen und Melanozyten nachgewiesen werden (Hermes, Feldmann-Boddeker et al. 2000) (Hermes, Welker et al. 2001).

SCF ist auch an der Ätiologie von Pigmentstörungen (z.B. der Piebaldismus als genetisch bedingter Defekt im c-kit-Gen) und der Tumorgenese insbesondere beim malignen Melanom und bei Nävuszellnävi beteiligt, wobei ein Rezeptordefekt in Form verminderter Expression des Rezeptors nachgewiesen wurde (Dippel, Haas et al. 1995) (Welker P 2000).

1.6 Die Mastzelle

1.6.1  Herkunft und Heterogenität

Die Mastzelle ist eine im menschlichen Körper in allen durchbluteten Geweben ubiquitär vorkommende Zelle und hauptsächlich in der Umgebung von Blutgefässen und Nerven sowie in der Nähe von Epithelien zu finden. Nach ihrer Entdeckung im Jahre 1878 aufgrund ihrer Färbeeigenschaften (zytoplasmatische Granula färben sich dabei metachromatisch an) durch Paul Ehrlich (Ehrlich 1877) (Metcalfe DD 1997) liegt die Zelle heute im besonderen Interesse u.a. der molekularbiologischen Forschung.

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Die Mastzelle ist den basophilen Granulozyten ähnlich, mit Fragment-crystallizable (Fc)-Rezeptoren für Immunglobulin E (IgE) versehen, und sie ist die Schlüsselzelle allergischer Reaktionen (Typ I-Überempfindlichkeitsreaktionen) ( Staines et al., 1994).

Als Ursprung der Mastzelle gelten pluripotente hämatopoetische Zellen des Knochenmarks (Metcalfe DD 1997), im Falle von humanen Mastzellen CD34 positive Stammzellen. Im sogenannten WBB6F1-W/WV Mausmodell (Kitamura, Go et al. 1978) (Metcalfe DD 1997) werden etwa 10 - 68 Vorstufen auf 105 Knochenmarkszellen angenommen (Metcalfe DD 1997). Durch Proliferation und Differenzierung bilden sich verschiedene Reifungsformen in Abhängigkeit vom jeweiligen Mikromilieu aus. Dabei spielen diverse Zytokine und Wachstumsfaktoren, insbesondere SCF, ebenso wie die Adhäsion an Matrixkomponenten eine Rolle (Metcalfe DD 1997).

1.6.2 Reifung, Adhäsion, Aktivierung und Mediatorfreisetzung der Mastzelle

Im Mausmodell wurde die pluripotente Stammzelle (Knochenmark) der Mastzelle als nicht granuliert, mit einer Dichte von 1.060 – 1.070 g/ml identifiziert. Es konnten diverse Zytokine identifiziert werden, welche die Mastzellproliferation in verschiedenen Spezies und Organismen auf unterschiedliche Weise induzieren bzw. verstärken: Interleukin (IL)-1α, IL-3, IL-4, IL-9, IL-10 und Nerve Growth Factor (NGF) (Metcalfe DD 1997). IL-3 im speziellen fördert die Reifung aller hämatopoetischen Zellreihen, die durch Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), GCSF und Interferon (IFN)-γ allerdings blockiert werden kann. Den gleichen Effekt zeigt Transforming Growth Factor (TGF)-β. IL-4 dagegen benötigt für die Reifung der Mastzellen als Kofaktor das IL-3. IL-9 verstärkt in Kombination mit IL-3 die Proliferation von Mastzellen (Metcalfe DD 1997). IL-10 wirkt in Kombination mit IL-3 oder IL-4 ähnlich wie IL-9, für sich gesehen hat es keine signifikante Auswirkung weder auf IL-3 abhängige Maus Knochenmarkszellreihen noch auf andere Mastzellvorstufen.

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Die Proliferation der Mastzellen ist abhängig von der FcεRI Aggregation in Anwesenheit von IL-3. Auch nach der Degranulierung bleibt die Fähigkeit zur Proliferation erhalten (Metcalfe et al., 1997).

1.6.3 Mediatoren und biologische Funktionen der Mastzelle

Mastzellen phagozytieren, prozessieren Antigene, produzieren Zytokine und setzen vasoaktive Substanzen frei, und damit sind nur einige der biologischen Aktivitäten der Mastzellen genannt. Als neue biologische Funktion der Mastzellen wurde eine protektive Wirkung im Rahmen einer Sepsis beschrieben, dabei kommt es zur Förderung der Homöostase durch eine Limitierung der Toxizität in Assoziation mit einem endogenen Faktor (Endothelin-1) (Maurer, Wedemeyer et al. 2004).

Mastzellen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Angiogenese. So produzieren humane Mastzellen bioaktives VEGF (Vascular endothelial Growth Factor) ( Grützkau, Krüger-Krasagakes et al. 1998).

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1.6.4 Pathophysiologie der Mastzelle

Die Funktion der Mastzellen im pathologischen Geschehen ist bisher primär am Beispiel der allergischen Reaktion vom Typ I (Sofortreaktion) weitgehend erforscht worden. Mastzellen stellen die Gewebe-gebundenen Effektorzellen für allergische Reaktionen dar (Metcalfe DD 1997) (Artuc, Hermes et al. 1999). Man nimmt jedoch auch bei anderen pathophysiologischen Vorgängen eine zentrale Rolle der Mastzellen und ihrer Mediatoren bzw. Zytokine an, u.a. bei der allergischen Reaktion vom Typ IV (Reaktion vom Spättyp) (Henz, Maurer et al. 2001).

Bei praktisch allen entzündlichen Hauterkrankungen (s. Tab. 2), aber auch bei diversen Tumoren, kommt es zu einer ausgeprägten Mastzellhyperplasie ( Kameyoshi Y 2000). Pathogenetisch kommt dies durch Mediatoren aus der entzündlichen Läsion bzw. den Tumorzellen zustande, die ein entsprechendes Mikromilieu für das Mastzellwachstum bereiten.

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Tabelle 2: Hautkrankheiten, bei denen eine Mastzellvermehrung und / oder Mastzellhyperplasie beobachtet worden ist
(nach Grabbe et al., 1994)

  • Allergische Kontaktdermatitis

  • Atopische Dermatitis

  • Bullöses Pemphigoid

  • Chronische Ekzeme

  • Chronische Urtikaria

  • Chronischer Lichen simplex

  • Epitheliale Tumoren

  • Fibrome

  • Graft-versus-host Reaktion

  • Granulationsgewebe im Wundheilungsprozess

  • Hämangiome

  • Karzinome

  • Keloide

  • Lichen planus

  • Lichen ruber planus

  • Lichen sclerosus et atrophicus

  • M. Behcet

  • Malignes Melanom

  • Mastozytose

  • Neurofibrome

  • Pemphigus vulgaris

  • Prurigo nodularis

  • Psoriasis

  • Sklerodermie

  • Urtikaria pigmentosa

  • Vaskulitis

1.6.5 SCF und Mastzellen

Proliferation, Differenzierung von Mastzellen und deren Überleben hängen essentiell von der Interaktion zwischen SCF und seinem Rezeptor ab (Feger, Ribadeau Dumas et al. 2002). SCF ist der entscheidende Wachstumsfaktor für Mastzellen. So erfolgt die extramedulläre Reifung der Mastzellen unter dem Einfluss von SCF (und anderen Zytokinen, s.o.).

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SCF ist bei einigen Erkrankungen im menschlichen Blut nachweisbar. SCF ist einer der wichtigsten bisher identifizierten Wachstumsfaktoren für Mastzellen; IL-3 dagegen spielt im Gegensatz zum Mausmodell beim Menschen praktisch keine Rolle ( Kameyoshi Y 2000).

Darüber hinaus konnte noch gezeigt werden, dass der bekannte Hemmeffekt von SCF auf die Apoptose weder durch Dexamethason noch durch Cyclosporin A inhibiert wird, wohl aber durch TGF-β1 (Metcalfe DD 1997).

1.7  Der Melanozyt

Melanozyten sind Bestandteil der unteren Schichten der Epidermis und üben eine wichtige Funktion im Schutz der Haut gegen UV-Licht sowie in der Interaktion mit Keratinozyten aus. In einer funktionellen Melanineinheit coexistieren ca. 36 Keratinozyten mit jedem einzelnen Melanozyten (Fitzpatrick TB 1999). Aufgrund von in vitro Beobachtungen geht man davon aus, dass die Keratinozyten lösliche Faktoren produzieren, die für die Proliferation, die Ausbildung von Dendriten und die Melaninsynthese der Melanozyten verantwortlich sind. Zu diesen Faktoren gehören FGF, EGF, Endothelin-1, LTC4, LTD4 und SCF (s. auch Tab. 1).

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Unter dem Einfluss von SCF kommt es zu einer Einwanderung von Melanozyten in die Haut sowie einer erhöhten Proliferation der Zellen und einer verstärkten Melaninsynthese (in vivo durch Prä-Inkubation mit SCF).

Wegen der räumlichen Nähe und der intensiven Interaktion von Melanozyten und Keratinozyten, die am augenscheinlichsten im dauernd erfolgenden direkten physischen Transfer von Melanin aus Melanozyten zu Keratinozyten erfolgt, gibt es zahlreiche weitere Zell-Zell Interaktionen in diesem Mikromilieu. Dies wird von in vitro erhobenen Befunden unterstrichen, die ein Wachstum isolierter Melanozyten in Anwesenheit von Keratinozyten zeigten (Morita E 1994), wobei der mSCF eine Rolle spielen mag.

1.8 Glukokortikoide

Glukokortikoide sind eine von drei Gruppen von Steroidhormonen, die in der Nebennierenrinde (Zona fasciculata und Zona reticularis) gebildet werden. Die wichtigsten natürlichen Glukokortikoide sind Kortisol (Hydrokortison), Kortison und Kortikosteron.

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Die Regulation der Glukokortikoide erfolgt vom Hypothalamus aus über das Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH), welches im Hypophysenvorderlappen die Sekretion vom Adrenokortikotropen Hormon (ACTH) bewirkt. Dieses wiederum stimuliert in der Nebennierenrinde in erster Linie die Sekretion von Glukokortikoiden. Bei dieser Regulation der Glukokortikoide ist ein Tag-Nacht-Rhythmus zu beobachten: Der Kortisol-Spiegel hat ein Minimum um Mitternacht und ein Maximum um ca. 9 Uhr morgens. Besonders gesteigert ist die Kortikoid-Ausschüttung bei starken körperlichen und seelischen Belastungen, sog. Stress-Situationen.

1.8.1  Physiologie und Pathophysiologie von Glukokortikoiden (Dexamethason)

Glukokortikoide sind in vivo potente Inhibitoren physiologischer DNA Synthese in Keratinozyten (Spiegelman, Budunova et al. 1997).

Bei der topischen Applikation von Glukokortikoiden kommt es zu einem vielfach belegten Abfall der Mastzellzahl. Es wird angenommen, dass die Anzahl der Gewebemastzellen hauptsächlich durch SCF reguliert wird. Der Abfall der Mastzellzahl ist vermutlich über eine verminderte SCF Produktion vermittelt, in vitro durch Fibroblasten, in vivo durch ortsständige Bindegewebszellen, und nicht durch eine Beeinflussung der Apoptose, da es nach Zugabe des Glukokortikoids Dexamethason zu einer SCF-abhängigen Mastzellkultur nämlich nicht zu einer erhöhten Absterberate von Mastzellen kam (Finotto et al., 1997).

1.8.2 Rezeptoren von Glukokortikoiden

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Die Wirkung der Glukokortikoide wird über den Glukokortikoid-Rezeptor (GR) vermittelt. Dieser Rezeptor gehört zu einer Steroidrezeptor Superfamilie (Fuller 1991) (Evans 1988) und ist im Cytosol, aber auch im Nukleus der meisten menschlichen Zellen vorhanden (Serres M 1996). Die Expression des GR ist das Ergebnis alternativen Splicings von prä-mRNA des GR, der in zwei homologen mRNAs und Protein Isoformen vorliegt. Diese Isoformen sind GR-α und GR-β. In der Western blot Analyse bei frisch isolierten basalen Keratinozyten zeigte sich eine Hauptbande des GR bei 97 kDa und eine Doppelbande bei etwa 59-56 kDa (gleiches Resultat bei kultivierten Keratinozyten).

Nach Vorbehandlung der Zellen mit Dexamethason in einer Konzentration von 10-6 M für 16 Stunden bei 37 °C war der Nachweis der 59 kDa Bande des Doublets nicht mehr möglich, was Serres et al. auf den aktivierten Glukokortikoid Rezeptor in Anwesenheit des Liganden Dexamethason (nach Translokation in den Nukleus) zurückführen (Serres et al., 1996). Diese Translokation des GR vom Zytoplasma in den Zellnukleus steht unter hormoneller Kontrolle (Muller and Renkawitz 1991). In ungebundenem Zustand befindet sich GR hauptsächlich im Zytoplasma in Assoziation mit Hitzeschock Proteinen. Nach Bindung des Rezeptors mit Glukokortikoiden dissoziiert GR von den Hitzeschock Proteinen, formt ein Homodimer und transloziert in den Nukleus, wo er an spezifische DNA Sequenzen bindet. Diese Sequenzen nennt man Glukokortikoid Response Elemente (GRE) (Spiegelman et al., 1997).

Taylor et al. haben eine SCF Promoterregion beschrieben, die dem GRE grenzwertig homolog ist (Taylor, Najmabadi et al. 1996). Neuere Untersuchungen zeigen, dass GR mit dem Transkriptionsfaktor AP-1 über direkte Protein-Protein Interaktionen interferiert (Serres et al., 1996).

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GR-β ist unfähig, Kortikoide zu binden, was in Unterschieden der Aminosäuresequenz gegenüber GR-α begründet ist. Der Rezeptor GR-β wirkt als Inhibitor von GR-α, wahrscheinlich funktioniert dies über die Bildung von antagonistischen GR-α / GR-β Heterodimeren (Strickland, Kisich et al. 2001). Dabei ändert GR-β nicht die Affinität von GR-α für dessen Liganden. Es kommt nach der Bildung von Heterodimeren (s.o.) zu deren kompetetivem Verhalten gegenüber den Bindungsdomänen an den GRE.

1.9 Retinoide / All-Trans-Retinsäure (RA)

1.9.1  Vorkommen von Retinoiden

Retinoide sind endogene Derivate des Vitamin A und stellen einen wichtigen Modulator für das Wachstum und die Differenzierung menschlicher Keratinozyten dar (Bikle et al., 1993). Die physiologische Konzentration von Retinsäure beim Menschen beträgt etwa 10-9 bis 10-8 M, pharmakologische Konzentrationen liegen bei durchschnittlich 10-6 M (Inui et al., 1999).

1.9.2 Rezeptoren der Retinoide

Die molekularen Wirkungen der Retinoide werden in erster Linie über ihre nukleären Rezeptoren (RAR-α, -β, -γ sowie die Retinoid-X-Rezeptoren (RXR, 9-cis Rezeptoren) -α, -β, -γ) vermittelt, die zur Familie der Steroidrezeptoren mit hohen Aminosäurensequenzhomologien gehören, die untereinander funktionelle Heterodimere bilden können. RA-Rezeptoren fungieren als Liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren (Shang et al., 1999). Sie zeigen ein räumlich zeitliches Expressionsmuster während der Entwicklung und weisen ein Gewebe-spezifisches Verteilungsmuster beim Adulten auf. Dies könnte nach Shang et al. (1999) ein Hinweis für unterschiedliche Aufgaben und Funktionen der verschiedenen Rezeptoren bei der Signalvermittlung der Retinoide sein. Allerdings existieren mehrere Rezeptortypen parallel in einem Gewebe, was wiederum auf eine Art von Kompensation bzw. Koordination in der Vermittlung von durch Retinsäure ausgelösten Signalen schließen lässt.

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Der Retinsäurerezeptor alpha (RAR-α) zeigt ein ubiquitäres Verteilungsmuster in adultem Gewebe, RAR-β ist vorwiegend in Epithelzellen lokalisiert, und RAR-γ wird hauptsächlich in der Haut exprimiert (Elder et al., 1991). In der Epidermis ist das Verhältnis von RAR-γ mit 90% gegenüber RAR-α mit 10% sehr einseitig (Fisher et al., 1994). Die Expression des Beta-Retinsäurerezeptors (RAR-β) kann als Reaktion auf das Vorhandensein von All-Trans-Retinsäure (RA) erfolgen (Shang et al., 1999). Diese Expression erfolgt über einen vom Alpha-Retinsäurerezeptor (RAR-α) abhängigen Signalweg.

Die Transkription des RAR-β Genes erfolgt sehr schnell nach Retinsäuretherapie, mit einem Maximum der Transkription nach ca. 6 Stunden. Darüber hinaus ist diese Transkription unabhängig von erneuter Proteinsynthese. Die Induktion der Expression von RAR-β korreliert gut mit der Wachstumsinhibierung und den apoptotischen Effekten von Retinsäure (Seewaldt, Johnson et al. 1995).

1.9.3 Physiologie / Pathophysiologie der Retinoide

Retinoide inhibieren die Differenzierung kultivierter menschlicher Keratinozyten (wie z. B. HaCaT). Dies erfolgt über die Suppression der Expression von Differenzierungsmarkern wie z. B. Keratin 1, Keratin 10, Filaggrin und Involukrin. Die Antwort der Keratinozyten auf RA ist in vitro und in vivo sehr unterschiedlich (Bikle, Gee et al. 1993). So kommt es sowohl bei systemischer als auch bei topischer Anwendung von Retinoiden meistens zu einer Verdickung der Epidermis, im Falle von Psoriasisherden und bei der Ichthyose jedoch zu einer Normalisierung der verdickten Epidermis.

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Die Metabolisierung der RA wird initiiert durch 4-Hydroxylierung (Marikar et al., 1998). Katalysiert wird diese 4-Hydroxylierung durch ein Cytochrom P-450 Isoenzym (CYP26), die RA 4-Hydroxylase. RA 4-Hydroxylase ist abhängig von RA und wird durch diese selbst induziert. Marikar et al. konnten bei HaCaT-Keratinozyten zeigen, dass in Abwesenheit von RA die RA 4-Hydroxylase sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene kaum nachzuweisen war; nach Zugabe von All-Trans RA kam es dagegen schon nach 2 h zu einem deutlichen Anstieg der mRNA-Level von 4-Hydroxylase (Marikar et al., 1998).

Retinoide induzieren Apoptosemechanismen und eine Inhibierung von Wachstum in einer Vielzahl von Tumorzellen ( Hong , Benner et al. 1994). Sowohl RAR-α als auch RAR-β sind bei der Entstehung von Tumoren beteiligt. Es wird angenommen, dass eine defekte RAR-β Expression ein frühes Ereignis in der Genese von epithelialen Karzinomen darstellt; so konnte kürzlich festgestellt werden, dass es bei vielen epithelialen Tumoren und Tumorzelllinien zu einem Verlust der Expression von RAR-β kommt.

Kligman et al. konnten im Mausversuch zeigen, dass es nach topischer Behandlung mit All-Trans RA über 4-6 Wochen zur verstärkten Expression von SCF in der Epidermis kommt. Immunhistologische Färbungen zeigen ein Überwiegen der membrangebundenen Form und in interzellulären Räumen (Kligman und Murphy 1996).

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Retinoiden konnte in mehreren experimentellen Ansätzen außerdem eine Inhibierung von Angiogenese nachgewiesen werden (Weninger et al., 1998).

Eine wichtige Rolle als negativer feedback-Regulator kommt wohl dem „orphan“ Rezeptor TR4 zu, der zur Superfamilie der Steroid- /Thyreoid-Rezeptoren gehört. Inui et al konnten zeigen, dass TR4 die RA-vermittelte Transkriptionsaktivität in HaCaT-Keratinozyten supprimiert. Weiterhin zeigten sie einen Anstieg der Expression von TR4 durch RA selbst, dies wiederum bei HaCaT-Keratinozyten.

1.10 Zielsetzung der Untersuchungen

Im vorliegenden Projekt sollte unter in-vitro Bedingungen untersucht werden, wie der bekannte Mastzelldifferenzierungsfaktor SCF durch exogene bzw. endogene Faktoren in seiner Freisetzung reguliert wird und damit die Differenzierung und Reifung menschlicher Mastzellen beeinflusst.

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Als Modell für die in-vitro Freisetzung von SCF aus Keratinozyten wurden HaCaT-Zellen ausgewählt, weil an diesen Zellen schon eine spontan und Stimulus-induzierte, differenzierungsabhängige Produktion von SCF von unserer Arbeitsgruppe nachgewiesen worden war und dieses Modell in unseren Laboren gutetabliert und standardisiert ist (Grabbe et al., 1996), auch bezüglich des Einflusses von Retinoiden auf die Keratinozytendifferenzierung (Wanner et al., 1995).

Als Modulatoren der SCF Freisetzung wurden RA und Dexamethason gewählt wegen der Bedeutung dieser Substanzen bei der Behandlung von Dermatosen, die mit einer Proliferation und einer pathologisch veränderten Differenzierung von Keratinozyten und Entzündungsprozessen einhergehen. Dabei wurde auch der Überlegung nachgegangen, dass diese endogen produzierten Substanzen bei physiologischen Regulationsprozessen der SCF Produktion aus Keratinozyten eine Rolle spielen könnten.

Ferner sollte die Spezifität der RA- und Glukokortikoid-vermittelten Effekte während der SCF Sekretion anhand der Expression der Rezeptoren für diese Substanzen untersucht werden.

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Da nach den bisherigen Untersuchungen zur Synthese des wichtigen Mastzellwachstumsfaktors SCF bislang nur wenige Daten bezüglich der Regulation dieses Prozesses vorliegen, haben wir die in-vitro Freisetzung aus HaCaT-Zellen unter dem Einfluss von All-Trans-Retinsäure und Dexamethason nach unterschiedlichen Inkubationszeiten mittels ELISA und semiquantitativer RT-PCR untersucht. Die Auswahl der auf ihre regulierende Funktion zu untersuchenden Faktoren beruhte auf folgenden Überlegungen: 1. Auf HaCaT-Keratinozyten wurden bislang nur Rezeptoren für Bradykinin und Thrombin beschrieben. 2. Retinoide stimulieren in murinen Keratinozyten die Freisetzung einer vermutlich auf SCF beruhenden, das Wachstum von Mastzellen fördernden Aktivität. 3. In vivo beeinflussen Glukokortikoide die Dichte und die Funktion kutaner Mastzellen auf direkte oder indirekte Weise.

Mit der Bestimmung der RA- und Glukokortikoid-Rezeptoren sollte auch die Spezifität der vermittelten Effekte während der SCF Sekretion untersucht werden. Ferner sollte eruiert werden, ob im Falle der HaCaT-Keratinozyten die Antwort der Zellen – wie bei der spontanen oder unspezifisch über A23187 induzierten SCF-Freisetzung – von ihrem Differenzierungsgrad abhängt.


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20.09.2006