2.  Methoden

2.1  Chemikalien- und Geräteliste

2.1.1  Chemikalien-/Geräteliste und Zubehör der Zellkultur

2.2  Zellkultivierung

2.2.1  Kultivierung der Zelllinie HaCaT

Die Kultivierung der humanen Keratinozytenlinie HaCaT (bereit gestellt von Prof. Dr. N. E. Fusenig, Deutsches Krebs-Forschungszentrum (DKFZ) Heidelberg, Germany) (Boukamp et al., 1988) erfolgte bei 37° C, 5% Kohlendioxid (CO₂)und 100% Luftfeuchtigkeit. Die verwendeten Gewebekulturschalen waren aus Polystyrol. Zur Kultivierung wurde dem "Modified Eagle Medium" (Dulbecco´s Modified Eagle Medium, DMEM) 1% Penicillin/Streptomycin und 1% 200mM L-Glutamin zugesetzt. Da tierische Zellen zur Proliferation zusätzliche biologische Wirkstoffe benötigen, wurde dem Medium weiterhin 5% fötales Kälberserum (FCS) zugegeben. FCS enthält Hormone, Aminosäuren, organische Salze, Spurenelemente und Albumin und begünstigt die Adhärenz von Zellen und stimuliert als Proliferationsfaktor die DNA-, RNA- und Proteinsynthese. So kann eine kultivierte Zelllinie, wie in unserem Fall die Zelllinie HaCaT, über eine lange Zeit ihre Homogenität und Teilungsfähigkeit behalten.

Adhärente Zellen in Kultur wurden nach zweimaligem Waschen mit PBS (je 5 ml, ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) mit einer Mischung aus Trypsin / EDTA (0.05% / 0.02%) für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert und dadurch von der Kulturschale gelöst.

Zur Sicherung der Vitalität der Zellen erfolgte vor der eigentlichen Zählung in der Neubauer-Zählkammer die Anfärbung mit Trypanblau in einer Verdünnung von 1:2.

Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der an Proteine bindet. Der Farbstoff diffundiert ausschließlich durch die Membran toter Zellen, die dadurch blau angefärbt werden.

Die Neubauer-Zählkammer besteht aus 9 großen Quadraten, die jeweils wiederum in 16 Quadrate unterteilt sind. Ein großes Quadrat hat eine Fläche von 1 mm², dies ergibt bei einer Tiefe von 0.1 mm ein Volumen von 0.1µl. Gezählt wurden dann ausschließlich die vitalen Zellen (Auszählung aller vier Felder). Die Zellzahl pro Milliliter wurde nach folgender Formel berechnet:

Zellen / ml = (Σ lebender Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor x 10⁴

Die Berechnung der auszusäenden Milliliter Zellsuspension erfolgte nach folgender Formel:

(Gewünschte Zellzahl / Platte) / (Errechnete Zellzahl / ml)

Zur Probengewinnung haben wir nach Ermittlung der Zellzahl jeweils die Überstände der Zellkulturen gewonnen, zentrifugiert (1200 U / min), portioniert und bei -80 °C eingefroren. Zur späteren RNA-Analyse wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS in sterilen Eppendorf-Hütchen mit Lysepuffer "Buffer-RLT®" behandelt und ebenfalls bei -80 °C eingefroren.

Die Inkubation der HaCaT-Zellen mit All-Trans-Retinsäure und Dexamethason erfolgte durch Zugabe der beiden Stoffe zu obiger Kultur in das Medium in Konzentrationen von 10^-9 bis 10^-5 M; als Lösungsmittel (vor allem für RA) und Kontrollmedium diente DMSO in einer Konzentration von 10^-5 M.

Ab etwa Tag 10 haben die Zellen die Proliferation beendet und differenzieren. Aufgrund dieser Wachstumseigenschaften der HaCaT-Zellen haben wir zwei unterschiedliche Zeiteinheiten für die Inkubation gewählt: Zum einen erfolgte die Zugabe von RA bzw. Dexamethason über 24 Stunden (von Tag 4 auf Tag 5 und von Tag 11 auf Tag 12), zum anderen wurden die beiden Stoffe über die gesamte Dauer von 11 Tagen dem Medium beigegeben, dementsprechend erfolgte hier bei erforderlichem Wechsel des Mediums die erneute Zugabe der entsprechenden Konzentrationen.

Der ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay) ist ein standardisiertes Verfahren in der physiologischen Chemie zum Nachweis von Immunkomplexen. Dabei wird ein in diesem Fall für SCF spezifischer monoklonaler Antikörper verwendet. Nach dem Binden dieses Antikörpers an das in der Probe vorliegende SCF (beide Splicevarianten, s.o.) wird ein weiterer Enzym-gebundener polyklonaler Antikörper zugegeben, der ebenfalls spezifisch für SCF ist (sog. Sandwich-ELISA). Durch eine Farbreaktion mit Streptavidin kann die entsprechende Menge an SCF photometrisch bei 450 bzw. 540 nm bestimmt werden.

Das für diese Versuche benutzte ELISA-Kit ist kalibriert gegen eine von E. coli produzierte, hoch aufgereinigte Variante des löslichen humanen SCF. Die Sensitivität ist im typischen Fall geringer als 4.0 pg/ml, die Spezifität erfaßt sowohl beide Splicevarianten des humanen SCF als auch rekombinantes humanes SCF.

2.2.3  Messenger Ribonukleinsäure / Copy Desoxyribonukleinsäure

Nach Isolierung der RNA mittels kommerziell erhältlichem RNA-Isolierungskit (RNeasy, Quiagen) wurde mit Hilfe des cDNA Cycle® Kit (s. o.) die mRNA mittels der Affen-Myeloblastosis-Virus (AMV) Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben.

In einem ersten Schritt werden dazu steriles Wasser und 2 µl mRNA zu einem Gesamtvolumen von 11,5 µl zusammen pipettiert. Nach Zugabe von 1 µl eines Oligo-Desoxy-Thymidin (dT)-Primers erfolgt die Inkubation im Wasserbad bei 65 °C für 10 Minuten, um die Sekundärstruktur zu lösen, anschl. Abkühlung bei Raumtemperatur für 2 min. Im Anschluss an kurzes Anzentrifugieren werden folgende Reagenzien zugegeben:

• 1 µl RNAse Inhibitor
• 4 µl 5fach RT Buffer
• 1 µl 100 mM dNTPs
• 1 µl 80 mM Sodium Pyrophosphate
• 0,5 µl AMV Reverse Transkriptase

Anschl. erneutes Anzentrifugieren und Inkubation im Wasserbad bei 42 °c für 60 min. Danach Inkubation bei 95 °C für 5 min., um die entstandenen RNA-cDNA Hybride zu denaturieren und um die für die weitere Verarbeitung erforderliche cDNA zu gewinnen.

Die PCR (Polymerase -Kettenreaktion/Polymerase chain reaction) wurde erstmalig 1984 durch Kary B. Mullis, Kalifornien, als Verfahren beschrieben (Mullis et al., 1992). Sie beruht auf doppelt-helikalen Struktur der DNA und ermöglicht die Amplifizierung beliebiger DNA-Abschnitte und damit den Nachweis bestimmter Gensequenzen bzw. auch ganzer Gene.

Heute stellt die Reverse-Transkriptase PCR das meist verbreitete Verfahren zur Charakterisierung und zum Nachweis von mRNA (quantitativ) in verschiedenen Proben dar (Orlando et al., 1998).

Im ersten Schritt wird durch Erhitzen des Doppelstranges der DNA auf 94° C dieser zunächst in Einzelstränge aufgespalten (Denaturierung). An diese Einzelstränge binden nach Abkühlung auf 60° C nun die zugegebenen Primer (= synthetische Oligonukleotide für den Start der PCR) und verhindern damit eine Rückbildung der alten Doppelstrangstruktur. Dieser Schritt der PCR wird als Annealing bezeichnet. Durch die DNA Polymerase (Taq-Polymerase aus dem hitzestabilen Bakterium Thermophilus aquaticus) erfolgt nun die Synthese einer Kopie der ursprünglichen DNA Sequenz vom freien 3´-OH-Ende aus. Im weiteren Verlauf dienen sowohl die ursprüngliche DNA als auch die Kopie als Template (= Matrize zur weiteren Kopie), so dass schließlich durch die Wiederholung obiger Schritte eine exponentielle Vermehrung der ursprünglich vorhandenen DNA Sequenz stattfindet.

In unserem Fall kommt ein besonderes Verfahren der PCR, die sogenannte semi-quantitative PCR, zur Anwendung. Dabei wird die gewonnene cDNA (s.o.) zur weiteren Verwendung erst mittels eines bekannten Primers, GAPDH (s. o.), so eingestellt, dass sich das PCR-Produkt aus der Sättigung heraus im linearen Bereich befindet. Dies ist anhand einer Verdünnungsreihe (1:2, 1:4, 1:8) nachweisbar, der Verdünnung entsprechend halbiert sich jeweils das PCR-Produkt.

Zu je 1 µl cDNA bzw. 1 µl Aqua. dest. als Negativkontrolle wurden pipettiert:

• 0.1 µl Taq-Polymerase
• 16.9 µl Aqua. bidest.
• 2.0 µl dNTP
• 2.5 µl PCR-Puffer (10x)
• 1.25 µl 3`-Primer
• 1.25 µl 5`-Primer

Bei Benutzung des PCR-Gerätes von Perkin Elmer konnten wir auf die Überschichtung der Proben mit Öl verzichten, da eine Deckelheizung das Verdunsten der Probe verhindert.

Zur Quantifizierung der mRNA-Produkte mittels PCR wurden die einzelnen Proben jeweils in einer Konzentration von 10 ^–6 M (Dexamethason, RA, Ra) und 10 ^–5 M benutzt. Als Basisprogramm der PCR für die Einstellung mit GAPDH wurde der folgende Zyklus gewählt: 5 min. bei 94 °C als einmaliger Anfang des PCR-Zyklus, 1 min. bei 94 °C, 1 min. bei der jeweiligen Annealing-Temperatur (s. Tab. 1), 1 min. bei 72 °C, 10 min. bei 60 °C, und abschließend der Abkühlmodus bei 4 °C im Endlosbetrieb.

Dieser Zyklus ist für die jeweiligen Primer mit der Annealing-Temperatur und/oder der Zyklenzahl angepasst worden.

Die im folgenden angegebenen Werte gelten für die mit Retinoiden behandelten HaCaT-Zellen: Die Einstellung der cDNA mit GAPDH erfolgte mit 28 Zyklen, die erwartete Fragmentgröße des spezifischen Primers beträgt 197 bp (Grabbe et al., 1996).

Als Kontrolle für die Differenzierung der Zellen haben wir den bereits beschriebenen, für Keratin 5 spezifischen Primer (K5) verwendet. Dieser ist ein Maß für den Reifungsgrad der Zellen, er wird mit zunehmender Differenzierung schwächer exprimiert. Hierbei wurde der Basiszyklus der PCR mit einer Annealing-Temperatur von 60° C und 35 Zyklen angepasst.

Für den für das Gesamt-SCF spezifischen Primer (SCF 3`5`), der sowohl die membrangebundene als auch die lösliche Splicevariante erfasst, wurde die Annealing-Temperatur auf 58° C bei 31 Zyklen gewählt.

Der für die beiden Splicevarianten spezifische Primer (SCF 2/3) wurde bei einer Annealing-Temperatur von ebenfalls 58° C und 32 Zyklen zugegeben.

Zu den verwendeten Primerpaaren s. Tab. 3.

Aus jeweils 5 Experimenten wurden mit Hilfe der Software Microsoft Excel^® für Windows 2000^® die Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Als statistischer Test wurde der zweiseitige t-Test für paarige Stichproben mit Hilfe der Software T-Ease 2.0 von Harvey J. Motulski ISI^® durchgeführt.

Die in der folgenden Arbeit dargestellten PCR-Abbildungen sind immer repräsentativ für 1 von 5 Experimenten.

Tabelle 3:Spezifische Oligonukleotidprimer mit Annealingtemperaturen und
Zyklenzahlen