Aus der Klinik für Pädiatrie, Abteilung Hämatologie/ Onkologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Nachweis von TEL- Genrekombinationen mittels Southern Blot bei Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie.

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Blanka Kothe
aus Berlin

Gutachter:
1. Herr Prof. Dr. med. h.c. G. Henze
2. Frau Prof. Dr. med. R. Arnold
3. Herr Prof. Dr. med. U. Bode

Eingereicht am:18.09.2002 Datum der Promotion: 30.06.2003

ABSTRACT:

Das in der vorliegenden Arbeit vorgestellte Verfahren der nicht- radioaktiven Southern Blot Hybridisierung unter Verwendung einer Digoxigenin Markierung hat sich für die Darstellung von Rekombinationen im TEL- Genlokus genomischer DNA als sensitive Vergleichsmethode bewiesen.

Es wurden insgesamt 122 Kinder mit dieser Methode auf das Vorliegen der Translokation t(12;21) untersucht. Bei einer nur relevante Faktoren berücksichtigenden Beschränkung des PatientInnenkollektivs auf protokollgerecht nach ALL- REZ BFM behandelte B- Vorläufer- Zell- ALL und Erstrezidive konnte eine Rekombination von TEL in 5 von 65 PatientInnen (7,7%) nachgewiesen werden. Lässt man die Einschlusskriterien der ALL- REZ BFM Studie unberücksichtigt, handelt es sich sogar um 7 von 71 (9,9%) PatientInnen. Damit bestätigen die hier vorliegenden Ergebnisse den Trend der aktuellen Diskussion über die Häufigkeit des Vorliegens des Fusionsgenes TEL- AML1 bei Erstrezidiven, die eine kumulative Inzidenz bei einem 10- jährigen Untersuchungszeitraum von 9 ± 5% angeben.

Weiterhin konnte mit ereignisfreien Beobachtungszeiträumen nach dem 1. Rezidiv im Median von 8,6 Jahren ein Trend zu späten Rezidiven und somit eine mittelfristig günstige Prognose für die TEL- Rearrangement positiven Rezidivfälle konstatiert werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass TEL- AML1 positive PatientInnen eine Subgruppe darstellen, die lange erkrankungsfreie Intervalle mit zur Zeit üblichen Therapieprotokollen erreichen, nach Therapie der Ersterkrankung aber auch nach dem ersten Rezidiv.

Auf Grund der sich aus dem retrospektiven PatientInnekollektiv ergebenen Selektion war es nicht möglich, statistisch signifikante Aussagen zur unabhängigen prognostischen Bedeutung für die langfristige Prognose von ALL im Kindesalter mit TEL- Rekombinationen zu treffen.

Eigene Schlagworte: Akute lymphatische Leukämie (ALL) im Kindesalter , Translokation TEL- AML1 (ETV6- CBFa2) , Transkriptionsfaktor , ALL- Rezidiv , nicht- radioaktiver Southern Blot , ALL- REZ BFM Studie

ABSTRACT:

The presence of TEL/AML1 fusion gene in childhood acute lymphoblastic leukaemia (ALL) defines a subgroup of patients with better than average outcome. Around 20% of the patient at point of initial ALL diagnosis are characterised by this fusion transcript from translocation t(12;21)(p12;q22). However, the prognostic significance of this aberration has recently been disputed by the Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) study group due to its relatively high incidence found in relapsed patients (19.6% and 21.9%, in two cohorts). Here we wanted to get more data in a long term follow up retrospect investigation by analysing DNA from frozen conserved bone marrow samples of 65 children. In the study presented here only five out of 65 (7.7%) patients selected as childhood B cell precursor acute lymphoblastic leukaemia only treated according to Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) ALL relapse trial protocols (ALL-REZ BFM 82-96) (excluding T-lineage and Philadelphia chromosome (Ph)-positive leukaemia) carry this fusion. The detection was done due to a new developed non- radioactive Southern blotting with a Digoxigenin marked template. We could confirm the still good middle term prognosis in the relapsed TEL- AML1 positive subgroup. The TEL-AML1-positive and negative patients differed with respect to duration of last remission and age at initial diagnosis. At a median follow-up time of 8.6 years, children positive for TEL-AML1 had a higher probability of disease-free survival. Because of the small number of patients in this study it was not possible to get statistical significant facts about the independent prognostic impact for the long term prognosis of ALL in childhood with TEL rearrangement.

Keywords: radioactive Southern blotting, TEL-AML1 fusion transcript (t(12;21)(p12;q22) translocation) CBF alpha2 ETV6-AML1, chromosomal translocations, childhood B cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (ALL), Gene Rearrangement

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 ALL im Kindesalter
    • 1.1.1 Therapie und Prognose der ALL im Kindesalter
      • 1.1.1.1  Klassifizierungssysteme der ALL
      • 1.1.1.2 Einfluss der Klassifizierung auf die Therapie
  • 1.2 Leukämogenese
    • 1.2.1 Transkriptionsfaktoren: Funktion und Beteiligung an der Leukämogenese
  • 1.3 Die Bedeutung der Transkriptionsfaktoren TEL, AML1 und TEL- AML1 - ihre Funktion und Beteiligung an der Leukämogenese
    • 1.3.1 Transkriptionsfaktor TEL
      • 1.3.1.1  TEL- Gen
      • 1.3.1.2  TEL - Protein und Funktion
      • 1.3.1.3  TEL- Veränderungen und Einfluss auf die Leukämogenese
    • 1.3.2 Transkriptionsfaktor AML1
      • 1.3.2.1  AML1- Gen
      • 1.3.2.2  AML1 - Protein und Funktion
      • 1.3.2.3  AML1- Veränderungen und Einfluss auf die Leukämogenese
    • 1.3.3  TEL- AML1- Fusionstranskript
      • 1.3.3.1  TEL- AML1- Gen
      • 1.3.3.2  TEL- AML1- Protein
      • 1.3.3.3 Hypothesen und bisheriges Wissen über Funktion und Einfluss von TEL- AML1 auf die Leukämogenese
  • 1.4  Translokation t(12;21) TEL- AML1 als häufigste genetische Veränderung bei ALL im Kindesalter
• 2  Fragestellung und Zielsetzung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 PatientInnenkollektiv
  • 3.2 Molekularbiologische Arbeitstechniken
    • 3.2.1 DNA- Isolierung
    • 3.2.2 Gewinnung der Plasmid- DNA von TEL
      • 3.2.2.1 Beschreibung des Prinzips der Einklonierung von Genabschnitten
      • 3.2.2.2 Durchführung der Klonierung
      • 3.2.2.3 Aufreinigung der Plasmid- DNA
      • 3.2.2.4 Ausschneiden der klonierten TEL - Sequenz/ Aufreinigung der Template- DNA
    • 3.2.3 Beschreibung der Digoxigenin- markierten TEL- Sonde
    • 3.2.4  Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung der nicht- radioaktiv- markierten TEL- Sonde
      • 3.2.4.1 Beschreibung des Verfahrens der Polymerasekettenreaktion (PCR)
      • 3.2.4.2 Bedingungen für die Durchführung der externen und internen PCR
      • 3.2.4.3 RT - Reverse Transkription
    • 3.2.5 Agarosegelelektrophorese zur Darstellung der PCR- Produkte
    • 3.2.6 Dot Blot Analyse
    • 3.2.7  Positiv- Kontrolle: Zellinie REH
      • 3.2.7.1 Kultivierung der Zellinie
    • 3.2.8 DNA- Restriktion
    • 3.2.9 Gelelektrophorese der geschnittenen DNA
    • 3.2.10 Southern Blot
      • 3.2.10.1 Beschreibung des Versuchsaufbaus
      • 3.2.10.2 Hybridisierung mit der Digoxigenin- markierten Sonde
    • 3.2.11 Überprüfung der Southern Blot Ergebnisse mittels der PCR
      • 3.2.11.1  nested- PCR
  • 3.3 Statistische Auswertung
  • 3.4 Materialien
    • 3.4.1 Chemikalien
    • 3.4.2 Nukleinsäuren
    • 3.4.3 Enzyme
    • 3.4.4 Klonierung
    • 3.4.5 Reinigung der PCR- Produkte
    • 3.4.6 Kultivierung von Zellinien
    • 3.4.7 Isolierung von DNA
    • 3.4.8 Filme
    • 3.4.9 Puffer und Lösungen
      • 3.4.9.1 Lösungen für die Elektrophorese
      • 3.4.9.2 Standardlösungen (Southern Blot)
      • 3.4.9.3 Wash and Buffer Kit
    • 3.4.10 RNA- Isolierung
    • 3.4.11 Geräte
    • 3.4.12 Software
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Methodische Aspekte - Konzeption und Optimierung einer nicht- radioaktiven Southern Blot Hybridisierungsanalyse zum Nachweis von TEL- Genrekombinationen
    • 4.1.1 Konzeption und Optimierung der Hybridisierung
      • 4.1.1.1 Aufreinigung der Template- DNA
      • 4.1.1.2 Southern Transfer, Hybridisierung und Chemolumineszenz
    • 4.1.2 Auswertungskriterien/ Optionen der Beurteilung und Vergleich der DNA- Hybridisierungsergebnisse mit Ergebnissen einer RNA- basierten nested- PCR
    • 4.1.3 Auswertung der PatientInnenfilter
    • 4.1.4 Ergebnissen einer RNA- basierten nested- PCR
  • 4.2 Ermittlung der Häufigkeit der TEL - Rekombination
  • 4.3 Klinische Verläufe
    • 4.3.1 Charakterisierung klinischer Merkmale der PatientInnen
  • 4.4 Korrelation der Ergebnisse bezüglich der prognostischen Aussage  - Charakterisierung des Behandlungserfolgs der PatientInnen mit einem Genrearrangement im TEL- Lokus  - ereignisfreie Überlebenswahrscheinlichkeiten
• 5  Diskussion
  • 5.1 Methodische Umsetzung – Konzeption der Southern Blot Analyse
    • 5.1.1 Wahl der Methoden
    • 5.1.2 Konzeption und Optimierung der Sonde
    • 5.1.3 Vergleich der Methoden
  • 5.2 Prävalenz und Prognostische Bedeutung von TEL- AML1
    • 5.2.1 Prävalenz von TEL- AML1 bei ALL im Kindesalter
    • 5.2.2  TEL- AML1 als prognostischer Faktor in verschiedenen Studien. Vergleich der Ergebnisse, PatientInnencharakteristika
    • 5.2.3 Diskussion der prognostischen Bedeutsamkeit von TEL- AML1 - Einfluss auf die Therapie
• 6  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1: Verteilungsmuster bestimmter je nach Reifestadium exprimierter Oberflächenmarker bei den verschiedenen Subtypen der ALL.(CD - cluster of differentiation; TdT – terminale Desoxynukleotidyltransferase; cy IgM – cytoplasmatisches IgM; S Ig – surface IgM)
• Tabelle 2: Verteilung häufiger Translokationen bei den verschiedenen Subtypen der ALL des Kindesalters. (BVZ- ALL = B- Vorläuferzell- ALL = prä- prä- B- ALL + common- ALL + prä- B- ALL)
• Tabelle 3: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease EcoRI.
• Tabelle 4: Externe PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.
• Tabelle 5: Interne PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.
• Tabelle 6: RT- PCR – Reagenzien eines Reaktionsansatzes von 20µl und Amplifikationsbedingungen.
• Tabelle 7: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease BamHI.
• Tabelle 8: Externe PCR – Reagenzien. Interne PCR – Reagenzien.
• Tabelle 9: Amplifikationsbedingungen für externe und interne PCR.
• Tabelle 10: Vergleich der TEL- Rearrangement Southern Blot Analyse Ergebnisse mit den TEL- AML1 RNA basierten PCR- Ergebnissen.
• Tabelle 11: Zusammensetzung des untersuchten PatientInnenkollektivs, eingeteilt nach Erkrankungsstadium und Immunphänotyp. („gesamt“ entspricht n = PatientInnenzahl)
• Tabelle 12: Ergebnisse mittels Southern Blot Analyse nachgewiesener TEL- Genrearrangements der untersuchten 122 PatientInnen. (BVZ- ALL schließt ein: prä- prä- B- ALL, common- ALL, prä- B- ALL und My+ ALL ) („gesamt“ entspricht n = PatientInnenzahl)
• Tabelle 13: Median und Interquartilsabstand der Variablen bei dem auf TEL- Rekombinationen getesteten und nicht getesteten RezidivpatientInnenkollektiv („gesamt“ entspricht n= PatientInnenzahl; die PatientInnenzahl beträgt insgesamt 378).
• Tabelle 14: Angaben zu Geschlecht, Rezidivzeitpunkt- und lokalisation von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95.
• Tabelle 15: Angaben zur Therapie von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95.
• Tabelle 16: Klinischer Verlauf von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95. (CR = complete remission; CCR = continuous complete remission)
• Tabelle 17: Median und Interquartilsabstand der Variablen bei dem auf TEL- Rekombinationen getesteten und nicht getesteten RezidivpatientInnenkollektiv („gesamt“ entspricht n= PatientInnenzahl; die PatientInnenzahl beträgt insgesamt 378).

Bilder

• Abbildung 1: In der Abbildung sind die Enhancer, die vor oder hinter dem Gen liegen können, quer gestreift dargestellt, der Promotor kariert, die TATA- Box gepunktet und das Gen, das transkribiert werden soll gestreift. Die TATA- Box bildet gemeinsam mit Proteinen, den Transkriptionsfaktoren, den Startpunkt für die RNA- Polymerase. Enhancer und Promotor bilden Bindungsstellen für weitere Proteine (andere Transkriptionsfaktoren), die die Transkription verstärken.
• Abbildung 2: cDNA: TEL- Gen EXON 1 – EXON 8: schematische Darstellung der Exonstruktur mit Angabe der jeweils letzten Base im Exon.
• Abbildung 3: Translokationen, an denen TEL bei Leukämien beteiligt ist.
• Abbildung 4: Der heterodimere AML1/ CBFβ Transkriptionsfaktor.
• Abbildung 5: Translokationen, in die AML1bei Leukämien und MDS (Myelodysplastisches Syndrom) involviert ist.
• Abbildung 6: Vereinfachtes Schema von TEL, AML1 und TEL- AML1. TEL fusioniert fast mit dem gesamten AML1.
• Abbildung 7: Vektorskizze.
• Abbildung 8: Veranschaulichung der Southern Blot Analyse.
• Abbildung 9: Prinzip der 11- UTP- Digoxigenin Chemolumineszenz Markierung.
• Abbildung 10: Schematisch dargestellte Ergebnisse der Southern Blot Hybridisierungsanalyse für Rearrangements des TEL- Gens. Da für jedes Gen zwei Allele vorhanden sein sollten, ergeben sich unterschiedliche Kombinationen der Konfiguration des TEL- Genlokus (G/G; G/R; R/R; R/D).(G = germline, R = Rearrangement, D = Deletion)
• Abbildung 11: Southern Blot Hybridisierungsanalyse zum Nachweis eines TEL- Genrearrangements in genomischer DNA. Die DNA wurde mit BamHI verdaut und die Hybridisierung erfolgte mit der Digoxigenin markierten Sonde TEL487. In Slot Nr.1 befindet sich ein Längenstandard (1 Kb Marker), der nur auf dem UV- Transiluminator sichtbar ist. Slot Nr.2 und 20 stellen die germline (G) Konfiguration von TEL Buffy coat DNA dar; Slot Nr.7 und Nr.14 zeigen Rekombinationen im TEL- Genlokus.
• Abbildung 12: Elektrophoretische Auftrennung der RNA basierten TEL- AML1 PCR-. Ergebnisse Nummer 2, 5 und 6 sind TEL- AML1 positiv und Nummer 12 stellt die als Positivkontrolle verwendete Zellinie REH dar, Slot 1, 3, 4 und 7 bis 10 sind TEL- AML1 negativ. Probe 11 ist nicht zu verwerten. Probe 13 und 14 stellen Mastermix 1 und 2 dar, also das Pipettiergemisch ohne RNA. Die bei 1 bis 10 und REH vorhandene untere Bande stellt die RNA- Materialkontrolle von dem Gen ABL dar.
• Abbildung 13: Life- Table- Untersuchung nach Kaplan Meier. Überlebenswahrscheinlichkeit von Kindern mit 1. Rezidiv von B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95 (Chemotherapie) in Abhängigkeit vom TEL- AML1 Status.